Nghiên cứu sự phân huỷ sinh học hợp chất Hydrocarbon mạch vòng ở một số vi khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam

Bộ Giáo dục và Đào tạo
Bộ Giáo dục và Đào tạoBộ Giáo dục và Đào tạo
Bộ Giáo dục và Đào tạo



Viện
ViệnViện
Viện
Khoa học và công nghệ Việt nam
Khoa học và công nghệ Việt nam Khoa học và công nghệ Việt nam
Khoa học và công nghệ Việt nam




Viện Công nghệ sinh học




Đinh Thị Thu Hằng



Nghiên cứu Sự phân hủy sinh học
hợp chất hydrocarbon mạch vòng ở
một số vi khuẩn quang hợp tía
phân lập tại việt nam

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15

Tóm tắt Luận án tiến sỹ sinh học
















Hà Nội, 200
7

Công trình đợc hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam



Ngời hớng dẫn:

PGS.TSKH. Trần Văn Nhị
PGS.TS. Trơng Nam Hải



Phản biện 1: GS.TSKH. Phạm Thị Trân Châu, Trờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phản biện 2: GS.TSKH. Lê Don Diên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: GS.TS. Đặng Thị Thu, Trờng Đại học Bách khoa Hà Nội



Luận án sẽ đợc bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sỹ cấp Nhà
nớc, tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt
Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vào hồi 9 giờ, ngày 30 tháng 11 năm 2007



Có thể tìm thấy luận án tại : - Th viện Viện Công nghệ sinh học
- Th viện Quốc Gia Hà Nội
1


Mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các hợp chất thơm rất phổ biến trong tự nhiên, đồng thời chúng

còn là những sản phẩm từ các hoạt động của con ngời. Mặc dù hợp chất
thơm tổng hợp chiếm một lợng rất nhỏ trong môi trờng nhng cấu trúc
của chúng rất khó bị phân hủy bởi các quần x vi sinh vật (Heider và
đtg, 1999). Một vài hợp chất trong số này có thể gây đột biến, quái thai
hoặc ung th (Paxeus và đtg, 1992). Tuy nhiên, nhiều hợp chất thơm có
thể đợc phân hủy bởi vi sinh vật do chúng có những hệ thống hóa sinh
khác nhau (Bosma và đtg, 2001; Zhang và đtg, 2005).
Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về phân hủy hợp chất thơm
thông qua benzoate (BA) trong điều kiện kỵ khí đợc tiến hành ở vi
khuẩn quang hợp tía (VKQHT) hoặc vi khuẩn khử nitrate. VKQHT
thuộc nhóm vi khuẩn thủy sinh có khả năng sinh trởng trong điều kiện
kỵ khí bằng cách quang hợp nhng không thải oxy. Nhóm vi khuẩn này
có các kiểu trao đổi chất rất linh hoạt nên chúng phân bố rộng ri trong
tự nhiên. Đặc biệt, VKQHT có khả năng sử dụng BA, các axit vòng no
và vòng thơm làm nguồn carbon (C) cho sinh trởng (Harwood và
Gibson, 1986; 1988). Nhiều enzym tham gia vào quá trình phân hủy kỵ
khí BA ở VKQHT và những gen m hóa cho các enzym này đ đợc
nghiên cứu (Geissler và đtg, 1988; Gibson và đtg, 1990; 1997; Larimer
và đtg, 2004; Pelletier và Harwood, 1998). Những nghiên cứu về gen đ
góp phần xác định đặc tính của các enzym tham gia vào quá trình phân
hủy kỵ khí BA, xác định đợc tính đa dạng trong loài và hiểu rõ bản chất
của những phản ứng không thông thờng xảy ra ở VKQHT (Egland và
đtg, 1997; 2001; Oda và đtg, 2004; Samanta và đtg, 2005).
ở Việt Nam, nhóm VKQHT đ và đang đợc chú trọng trong các
nghiên cứu phân loại (Vũ T.M.Đức và đtg, 2004); khử sulfur ở đáy ao
nuôi thủy sản (Võ T.Hạnh và đtg, 2004); xử lý nớc thải giàu hữu cơ
2


(Trần V.Nhị và đtg, 2000); tách chiết hoạt chất sinh học (Lê Q.Huấn và

đtg, 1999) và khả năng sinh trởng trên BA trong điều kiện kỵ khí (Đỗ
T.T.Uyên và đtg, 2002). Tuy nhiên, những nghiên cứu về sự phân hủy
các hợp chất thơm ở VKQHT vẫn cha đợc quan tâm nghiên cứu.
Vì vậy, trong luận án này chúng tôi đặt ra nhiệm vụ: Nghiên cứu
sự phân hủy sinh học hợp chất hydrocacbon mạch vòng ở một số vi
khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam nhằm góp phần tìm hiểu
về sự phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân của VKQHT và định
hớng ứng dụng chúng trong công nghệ sinh học môi trờng.
2. Mục tiêu của đề tài:
Tìm hiểu khả năng phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân ở
VKQHT phân lập từ một số khu vực ô nhiễm khác nhau.
Nghiên cứu gen m hóa enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase
(BadA) tham gia vào quá trình phân hủy BA ở VKQHT.
Nghiên cứu sự biểu hiện gen badA, tính chất của enzym tái tổ hợp.
3. Nội dung nghiên cứu:
Tuyển chọn VKQHT có khả năng tồn tại và sinh trởng trên một số
hợp chất thơm đơn nhân nh: BA, phenol và một số dẫn xuất, đồng
thời đánh giá khả năng sử dụng và phân hủy những hợp chất này ở
những chủng đợc lựa chọn.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số đại diện VKQHT.
Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng (oxi, ánh sáng,
nguồn C ) đến khả năng phân hủy BA và 4-hydroxybenzoate
(4-OHBen) ở chủng VKQHT đại diện.
Xác định sự có mặt của enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase trong
quá trình phân hủy BA ở chủng VKQHT đại diện.
Tách dòng gen badA của chủng VKQHT đại diện, biểu hiện gen
badA trong E. coli và xác định một số tính chất của enzym BadA tái
tổ hợp.
3

4. Những đóng góp mới của luận án:
Đây là công trình nghiên cứu có hệ thống đầu tiên về sự phân hủy và
sử dụng một số hợp chất thơm đơn nhân ở VKQHT phân lập ở miền
Bắc Việt Nam.
Phát hiện đợc 2 chủng VKQHT có khả năng phân hủy mạnh
3-chlorobenzoate (3-CBA) với đồng cơ chất là BA hoặc 4-OHBen,
đồng thời chúng có khả năng sử dụng 3-CBA là nguồn C duy nhất.
Xác định đợc gen badA m hóa cho enzym chìa khóa benzoate-
CoA ligase trong con đờng phân hủy kỵ khí BA ở một chủng
VKQHT đại diện có mức độ tơng đồng cao nhất 93,3% so với gen
tơng ứng đ đợc công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế.
5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 136 trang: Mở đầu (3 trang); Chơng 1. Tổng quan
tài liệu (35 trang); Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu (16
trang); Chơng 3. Kết quả (50 trang với 9 bảng và 39 hình); Chơng 4.
Bàn luận (9 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo
(21 trang gồm 13 tài liệu tiếng Việt, 194 tài liệu tiếng Anh).
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Các hợp chất thơm và sự phân hủy sinh học
1.2. Vi sinh vật phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện hiếu khí
1.3. Vi sinh vật phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện kỵ khí
1.3.1. Vi khuẩn hô hấp kỵ khí
1.3.2. Vi khuẩn lên men
1.3.3. Vi khuẩn sinh metan
1.3.4. Vi khuẩn quang hợp tía
1.4. Quá trình phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện kỵ khí
1.4.1. Các con đờng ngoại vi của quá trình phân hủy kỵ khí
1.4.2. Con đờng phân hủy kỵ khí BA trung tâm
1.5.

Các gen liên quan đến con đờng phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT
4


1.5.1. Tổ chức và sắp xếp các gen chức năng
1.5.2. So sánh con đờng phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT
Rhodopseudomonas palustris với vi khuẩn khử nitrate
1.5.3. Điều hòa quá trình phân hủy kỵ khí BA
1.6.

Phơng pháp quan trắc phân tử (molecular monitoring)
Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng, vật liệu:
các chủng VKQHT đợc phân lập từ một số
nguồn thải; các chủng E. coli DH5 và BL21; các plasmid pCR2.1
và pET32a(+); các cặp mồi fD1 và rD1, badAf và badAr.
2.2. Hóa chất:
tất cả các loại hóa chất đợc cung cấp bởi các hng có uy
tín nh Fermentas, Merck, Invitrogen, Sigma
2.3. Các phơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật: phân lập, nuôi cấy VKQHT
và nghiên cứu đặc điểm sinh học của VKQHT theo Bergey
(1989), đánh giá sinh trởng của VKQHT theo mật độ quang học
ở bớc sóng 660 nm và hàm lợng protein.
2.3.2. Phơng pháp hóa sinh: tách chiết enzym (Geissler và đtg, 1988),
tinh sạch protein bằng phơng pháp sắc kí ái lực, điện di protein,
xác định hàm lợng protein (Bradford, 1976), xác định hoạt độ
enzym (Bulaj và đtg, 1998), xác định tốc độ ban đầu V
o

(phơng
pháp Newton-Gregory), V
max
và K
m
(phơng pháp Lineweaver
Burk).
2.3.3. Phơng pháp sinh học phân tử: tách chiết DNA genom và
plasmid, kỹ thuật PCR, điện di DNA, nối ghép gen, biến nạp, tinh
sạch DNA, biểu hiện gen (Sambrook và Russell, 2001).
2.3.4. Phơng pháp phân tích hóa học: các hợp chất thơm (chiết bằng
dung môi và đo hấp thụ cực đại ở bớc sóng vùng tử ngoại), ion
Cl
-
(phơng pháp Morh).
2.3.5. Phơng pháp thống kê sinh học
5


Chơng 3. Kết quả và bàn luận
3.1. Tuyển chọn các chủng VKQHT có khả năng sinh trởng
trên môi trờng chứa benzoate
Từ nớc và trầm tích của 7 nguồn thải khác nhau, chúng tôi đ tách
và làm sạch đợc 32 chủng VKQHT có khả năng sinh trởng trên BA ở
những mức độ khác nhau. Trong đó, có 9 chủng có khả năng sinh trởng
mạnh trên hợp chất này là: NMS49, MI1, VH121, VA31, QP21, NĐ71,
NMG16, ĐG217 và ĐG218. Các chủng này đợc sử dụng trong các
nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Khả năng phân hủy và sử dụng một số hợp chất thơm đơn
nhân của VKQHT

3.2.1. Khả năng sử dụng phenol
Trong số 9 chủng, 4 chủng NMS49, MI1, VA31 và ĐG218 có khả
năng sinh trởng tốt trên môi trờng chứa phenol ở nồng độ < 2 mM sau
168 giờ. ở nồng độ phenol cao hơn, sự sinh trởng của các chủng này
bắt đầu giảm dần và bị ức chế ở nồng độ 6 mM. Trong khi đó, sinh
trởng của các chủng NĐ71; QP21; VH121; NMG16 và ĐG217 giảm
mạnh khi có mặt phenol trong môi trờng nuôi cấy ở tất cả các nồng độ.
Cả chín chủng VKQHT này đều không có khả năng sử dụng phenol là
nguồn C duy nhất cho sinh trởng trong điều kiện quang dị dỡng.
3.2.2. Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen
3.2.2.1. Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen
Khi môi trờng có bổ sung BA hoặc 4-OHBen ở nồng độ từ 2ữ10
mM, sự tích luỹ sinh khối của cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu đều tăng
lên so với đối chứng (chỉ chứa acetate - AA- là nguồn C) sau 96 hoặc 48
giờ nuôi cấy. Sự sinh trởng của chúng giảm dần và dừng lại khi nồng
độ hai hợp chất bổ sung này vợt quá 12 mM. Khi BA hoặc 4-OHBen
đợc thay thế cho các nguồn C khác nh AA, succinate và ethanol,
những chủng VKQHT này đều có khả sử dụng hai hợp chất thơm này là
nguồn C duy nhất trong điều kiện quang dỡng giống nh một số
6


VKQHT đ đợc nghiên cứu trớc đây (Gibson và Harwood, 1988,
1995; Sasikala và Ramana, 1998). Tốc độ sinh trởng của chủng đại
diện MI1 trên môi trờng chứa một số nguồn C ( 1 g/l) khác nhau
trong 9 ngày đợc trình bày ở Hình 3.1.
0
0.4
0.8
1.2

1.6
2
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
OD (nm)
Hình 3.1. Sinh trởng của chủng MI1 trên
môi trờng chứa một số nguồn C ( 1 g/l)
khác nhau: AA 17 mM (

); BA 8 mM
(

); 4-OHBen 7,25 mM (); không C (

).
Thí nghiệm đợc tiến hành trong điều kiện
quang dỡng trong 9 ngày.
3.2.2.2. Khả năng phân hủy BA và 4-OHBen
Chín chủng VKQHT nghiên cứu có khả năng phân hủy BA hoặc
4-OHBen ở những mức độ khác nhau sau 72 giờ (Bảng 3.1). Các chủng
vi khuẩn này (trừ chủng VH121) đều có khả năng phân hủy > 90%
4-OHBen có trong môi trờng nuôi cấy. Trong môi trờng chứa BA, hai
chủng NMS49 và MI1 có khả năng phân hủy 91 và 99% chất này. Kết
quả thu đợc phù hợp với các kết quả đ đợc công bố đối với các chủng
VKQHT phân lập ở các địa điểm ô nhiễm khác (Elder và đtg, 1992a;
Harwood và Gibson, 1988; Madigan và đtg, 1988).
3.2.3.

Khả năng sử dụng một số hợp chất chlorobenzoate
3.2.3.1. Khả năng tồn tại và sinh trởng của VKQHT trong môi trờng
chứa các hợp chất chlorobenzoate (CBA)

Sau 96 giờ nuôi cấy, sinh trởng của các chủng VKQHT bị ức chế
trong môi trờng chứa 4-CBA/ 3-CBA/ 2-CBA ở nồng độ 4 mM và hầu
Thời gian (giờ
)

Bảng 3.1. Khả năng phân hủy BA và
4-OHBen ở một số chủng VKHQT.
BA 4-OHBen Hợp
chất
thơm



Chủng
Hàm
lợng
bị phân
hủy
(mM)

Hiệu
suất
(%)
Hàm
lợng
bị phân
hủy
(mM)

Hiệu

suất
(%)
NMS49 1,82 91 1,95

97,5

VH121 1,37 68,5 1,58 79
MI1 1,98 99 1,97

98,8

NMG16 1,76 88 1,83 91,3
QP21 1,38 69 1,85 92,6
VA31 1,41 70,5 1,80 90
NĐ71 1,76 88 1,88 93,8
ĐG218 1,78 89 1,83 91,3
ĐG217 1,45 72,5 1,95 97.5
Chú thích: các hợp chất thơm đợc thử
nghiệm ở nồng độ 2 mM và đợc xác định
lợng còn lại trong môi trờng nuôi cấy sau
72 giờ.

7


nh dừng lại khi trong môi trờng chứa > 8 mM. Mặc dù sinh trởng
của các chủng VKQHT nghiên cứu không bị ức chế khi các hợp chất
CBA ở nồng độ < 2 mM nhng không quan sát đợc sự tăng sinh khối
so với môi trờng chỉ chứa AA là nguồn C. Tuy nhiên, sự tích lũy sinh
khối của 8 chủng (trừ chủng ĐG217) với BA là nguồn C đều tăng lên so

với đối chứng khi môi trờng có bổ sung thêm các hợp chất CBA ở nồng
độ từ 0,5ữ2 mM. Trong điều kiện này, các chủng VKQHT nghiên cứu
(trừ chủng ĐG217) đều có khả năng sinh trởng tốt trên 4-CBA/ 3-CBA/
2-CBA ở nồng độ 1 mM (Hình 3.2).


0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
VH121 MI1 NMS49 NMG16 QP21 N71 VA31 G218 G217
OD
660
(nm)
BA BA + 4-CBA BA + 2-CBA BA + 3-CBA

Hình 3.2. Biểu đồ sinh trởng của 9 chủng VKQHT trên môi trờng chứa hỗn hợp BA và
một trong các hợp chất CBA. BA: benzoate 2 mM; BA + 4-CBA: benzoate 2 mM +
4-chlorobenzoate 1 mM; BA + 2-CBA: benzoate 2 mM + 2-chlorobenzoate 1 mM; BA +
3-CBA: benzoate 2 mM + 3-chlorobenzoate 1 mM.
Tất cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu đợc nuôi cấy trên môi trờng
cơ bản nhng các hợp chất CBA đợc thay thế cho các nguồn C khác
nh AA, succinate hoặc ethanol đều không có khả năng sử dụng các hợp
chất CBA là nguồn C duy nhất. Tuy nhiên, sau 7ữ8 lần cấy chuyển liên
tiếp sang môi trờng chứa 3-CBA hai chủng NMS49 và VH121 có khả
năng sử dụng 3-CBA là nguồn C duy nhất cho sinh trởng quang dị

dỡng. Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu của một
số tác giả khác (Kamal và đtg, 1990; Oda và đtg, 2001, 2004; vander
Woude và đtg, 1994).
3.2.3.2. ảnh hởng của 3-CBA đến sự sinh trởng của VKQHT trên môi
trờng chứa một số nguồn carbon khác nhau
Các chủng vi khuẩn quang hợp tía

8


a. Sinh trởng trên môi trờng chứa AA
Sinh trởng của 5 chủng VKQHT (VH121, NMS49, NMG16,
QP21 và VA31) trên môi trờng bổ sung 3-CBA (1 mM) chậm nhng
vẫn đạt cực đại sau 72 giờ nuôi cấy tơng tự nh khi chúng sinh trởng
trên môi trờng chứa AA là nguồn C. Kết quả thu đợc còn cho thấy
3-CBA không những không làm tăng mà còn ức chế sinh trởng của
VKQHT ở giai đoạn đầu (từ 24ữ48 giờ) (Hình 3.3). Hiện tợng này có
thể là khi có mặt AA trong môi trờng nuôi cấy các chủng VKQHT
không sử dụng 3-CBA.
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
AA AA +

CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
Ngun C trong mụi trng
OD
660
(nm)
NMS49 VH121 NMG16 QP21 VA31

Hình 3.3. ảnh hởng của 3-CBA (CBA) đến sinh trởng của một số chủng VKQHT trên
môi trờng chứa acetate (AA).
b. Sinh trởng trên môi trờng chứa 4-OHBen
Kết quả thu đợc cho thấy 3-CBA cũng ức chế quá trình sinh
trởng của các chủng VKQHT ở giai đoạn đầu (Hình 3.4). Tuy nhiên
sau 72 giờ, hai chủng NMS49, và VH121 bắt đầu tăng sinh khối so với
đối chứng. Sự tăng sinh khối này đợc nhận thấy một cách rõ rệt ở tất cả
các vi khuẩn nghiên cứu sau 96 giờ. Sự tăng sinh khối so với đối chứng ở
các chủng khác nhau đợc thể hiện ở mức độ đồng đều 20ữ30%. Nh
vậy, sinh trởng của các chủng VKQHT cũng bị ức chế khi bổ sung
3-CBA ở giai đoạn đầu nhng sau một thời gian thích nghi, quá trình
sinh trởng của chúng đều tăng.
0

24 48

72 96
120

144 (giờ)

9


0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
HBA HBA +
CBA
Ngun C trong mụi trng

OD
660
(nm)
NMS49 VH121 NMG16 QP21 VA31

Hình 3.4. ảnh hởng của 3-CBA (CBA) đến sinh trởng của một số chủng VKQHT trên
môi trờng chứa 4-hydroxybenzoate (HBA).
c. Sinh trởng trên môi trờng chứa BA
Cũng nh trên môi trờng chứa AA hoặc 4-OHBen, sinh trởng
của 5 chủng VKQHT trên môi trờng chứa BA (2 mM) bị 3-CBA ức chế
ở giai đoạn đầu (Hình 3.5). Nhng sau 48 giờ, sinh trởng của 3 chủng
NMS49, VH121, NMG16 trong môi trờng bổ sung 3-CBA (1 mM) bắt
đầu tăng lên so với đối chứng. Tuy nhiên, các chủng khác nhau có sự
tăng sinh khối ở mức độ không giống nhau so với đối chứng, trong đó
chủng VH121 có sự tăng sinh khối cao nhất (52,8%).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA

BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
Ngun C trong mụi trng
OD
660
(nm)
NMS49 VH121 NMG16 QP21 VA31

Hình 3.5. ảnh hởng của 3-CBA (CBA) đến sinh trởng của một số chủng VKQHT trên
môi trờng chứa benzoate (BA).
Nh vậy, trên môi trờng chứa nguồn C là AA, BA hoặc 4-OHBen,
3-CBA ở nồng độ 1 mM đ ức chế sinh trởng của 5 chủng VKQHT ở
giai đoạn đầu nhng BA hoặc 4-OHBen đ tạo nên sự sinh trởng rất
0

24 48

72 96
120

144 (giờ)

0

24

48 72 96

120

144 (giờ)

10


mạnh ở các giai đoạn tiếp theo. Kết quả thu đợc ở thí nghiệm này có
thể là VKQHT cần một chất có vai trò nh một đồng cơ chất (co-
substrate) và một giai đoạn thích nghi để chúng có thể sử dụng đợc
3-CBA cho sinh trởng. Vai trò của một đồng cơ chất trong quá trình
phân hủy một số hợp chất thơm chứa clo cũng đ đợc quan sát ở một số
vi khuẩn nh Pseudomonas sp. và R. palustris (Haigler và đtg, 1992;
Kamal và đtg, 1990; Oda và đtg, 2004).
3.2.3.3. Khả năng phân hủy 3-CBA của các chủng VKQHT
Năm chủng nghiên cứu đều có khả năng phân hủy hợp chất 3-CBA
trên môi trờng chứa nguồn C là BA hoặc 4-OHBen (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Khả năng phân hủy hợp chất
3-CBA bởi 5 chủng VKQHT.
BA 4-OHBen Nguồn
C



Chủng
Hàm
lợng

3-
CBA
còn lại
(mM)

Hiệu
suất
(%)
Hàm
lợng
3-
CBA
còn lại
(mM)

Hiệu
suất
(%)
NMS49
0,176

82,4

0,555 44,5

VH121
0,017

98,3

0,533 46,7

NMG16 0,564

43,6

0,577 42,3

QP21 0,706

29,4

0,527 47,3

VA31 0,843

15,7

0,716 28,4

Chú thích: các hợp chất thơm đợc thử
nghiệm ở nồng độ1 mM
.
Tuy nhiên, khả năng phân hủy 3-CBA trên hai nguồn cơ chất sinh
trởng BA và 4-OHBen của chúng rất khác nhau. Trong cả hai trờng
hợp, chủng phân hủy 3-CBA yếu nhất là VA31. Khả năng phân hủy
3-CBA của các chủng còn lại gần nh tơng đơng khi môi trờng có
mặt 4-OHBen. Hai chủng NMS49 và VH121 có khả năng phân hủy
mạnh hợp chất 3-CBA trong sự có mặt của BA. Trong điều kiện này,

chúng có khả năng chuyển hóa 3-CBA mạnh hơn khoảng 2 lần so với
trên môi trờng chứa 4-OHBen. Cùng với sự tăng sinh khối, hàm lợng
3-CBA giảm dần và tỷ lệ với hàm lợng ion Cl
-
đợc tích lũy trong suốt
Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa 3-
CBA của
chủng đại diện VH121. (): nồng độ 3-
CBA
(mM); (): nồng độ ion Cl
-
(mM).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 24 48 72 96 120 144
Thi gian (gi)
Nng ủ Cl- (mM)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Nng ủ 3-CBA (mM)

11


thời gian thí nghiệm (144 giờ) (Hình 3.6). Chủng VH121 có khả năng
phân hủy 50% lợng 3-CBA có trong môi trờng sau 72 giờ và 1 mM
hợp chất này đợc phân hủy hết sau 120 giờ trên môi trờng chứa BA
(1 mM).

Nh vậy, 5 chủng trong nghiên cứu này đều có khả năng sử dụng
3-CBA là nguồn C cho sinh trởng ở những mức độ khác nhau với đồng
cơ chất là BA hoặc 4-OHBen. Theo một số nghiên cứu, nhóm vi khuẩn
VKQHT không những có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đơn
giản mà còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất thơm chứa clo nh
axit halocarboxylic, chlorobiphenyl và các hợp chất CBA (Kamal và đtg,
1990; Khanna và đtg, 1992; Oda và đtg, 2001, 2004).
Tóm lại, khả năng sinh trởng trên một số hợp chất thơm đơn nhân
và sử dụng các chất này cho sinh trởng ở những chủng VKQHT trong
nghiên cứu này đ đợc xác định. Đồng thời, khả năng phân hủy BA,
4-OHBen và 3-CBA cũng đ đợc khảo sát trong điều kiện các hợp chất
này đợc sử dụng là nguồn C duy nhất hoặc đồng chuyển hóa. Tổng hợp
kết quả nghiên cứu khả năng tồn tại, sinh trởng và sử dụng các hợp chất
thơm theo các cơ chế khác nhau đợc trình bày tóm tắt ở Bảng 3.3.
3.3. Đặc điểm sinh học của một số chủng đại diện
Tế bào của các chủng NMS49, VH121 và MI1 có một số đặc điểm
hình thái nh những loài thuộc chi Rhodopseudomonas: có dạng hình
gậy, kích thớc 0,6ì1,7 ữ 1,25ì2,6 àm; chuyển động tịnh tiến, phân
cực, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và phân chia tế bào bất đối xứng;
dịch huyền phù của các chủng này có màu đỏ và có phổ hấp thụ cực đại
ở: 375, 468, 493, 520-545, 589, 803-805, 862-868 nm. Chúng có khả
năng sinh trởng hiếu khí trong tối nhng khi đó khả năng tổng hợp

bacteriochlorophyll a của chúng bị ức chế mạnh. Trong môi trờng nuôi
cấy, tế bào của ba chủng NMS49, VH121 và MI1 thờng tạo thành các
cụm tế bào giống hình bông hoa nh đ đợc mô tả đối với một vài
12


Bảng 3.3. Khả năng sinh trởng và sử dụng một số hợp chất thơm đơn nhân ở những chủng VKQHT đợc lựa chọn.

Sinh trởng trên môi trờng chứa một số nguồn carbon
a
Có thể sử dụng
3-CBA với
đồng cơ chất
b
Sử dụng nguồn C duy nhất
c
3-CBA 2-CBA 4-CBA
Nguồn
C



Chủng
Phenol

+
AA
BA
+
AA

4-OHBen

+
AA
+
AA

+
BA
+
AA

+
BA
+
AA

+
BA
BA 4-
OHBen
Phenol

BA 4-
OHBen

3-
CBA

Nguồn phân lập

NMS49 +++ ++++

++++ - +++ - +++ - ++ +++ ++ - ++ +++ +
*

Nhà máy sơn Cầu Diễn, Hà Nội
MI1 +++ ++++

++++ - ++ - +++ - ++ KXĐ

KXĐ - +++ +++ - Nhà máy Hóa chất Đức Giang và Cty
Xăng dầu KVI, HN
VH121 - +++ +++ - ++++

- ++++

- ++++

++++

++ - + ++ +
*

Cảng B12, Hạ Long, Quảng Ninh
VA31 ++ +++ ++++ - ++ - - - ++ ++ + - + ++ - nt
QP21 - ++++

+++ - +++ - ++ - ++ ++ ++ - ++ ++ - Kho Vũ khí, Bộ Quốc phòng
NĐ71 ++ ++++

++++ - ++ - + - - KXĐ

KXĐ - ++ ++ - Nhà máy Dệt Nam Định, Nam Định
NMG16

- ++++

++++ - ++ - ++ - + +++ ++ - +++ +++ - Nhà máy Giấy Phú Thọ, Phú Thọ
ĐG217 - +++ +++ - - - - - - KXĐ

KXĐ - + ++ - Nông trờng Đồng Giao, Ninh Bình
ĐG218 ++ ++++

++++ - +++ - +++ - +++ KXĐ

KXĐ - ++ ++ - nt
Chú thích: (a): nồng độ các hợp chất thơm: 1 mM phenol, 2 mM BA/4-OHBen; 1 mM 3-CBA/2-CBA/4-CBA; 8 mM acetate (AA). Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng chỉ
chứa nguồn C là AA hoặc BA: (-): < 0; (+): 1ữ5%; (++): 5ữ20%; (+++): 20ữ40%; (++++): 40ữ50%.
(b): sử dụng 1 mM 3-CBA trong môi trờng chứa 2 mM BA hoặc 4-OHBen là nguồn carbon sau 144 giờ. Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng chỉ chứa nguồn C
là BA hoặc 4-OHBen: (-): < 0; (+): 1ữ 5%; (++): 5ữ20%; (+++): 20ữ40%; (++++): 40ữ50%.
(c): sử dụng 2 mM các hợp chất thơm là nguồn C duy nhất sau 144 giờ. Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng không C: (+++): > 1; (++): 0,75ữ1; (+): 0,5ữ0,75.
(*): 3-CBA đuợc sử dụng nh nguồn C duy nhất sau 7ữ8 lần cấy chuyển liên tiếp.
13

loài thuộc chi Rhodopseudomonas (R. palustris, R. viridis,

R. sulfoviridis và R. rhenobacensis). Đặc biệt, chúng có khả năng sử
dụng BA là nguồn C duy nhất cho sinh trởng trong điều kiện quang dị
dỡng. Đây là một đặc tính riêng và mang tính chìa khóa của
R. palustris để phân biệt với các loài khác trong cùng một chi (Hougardy
và đtg, 2000; Imhoff và Trỹper, 1989). Các kết quả phân tích trình tự
gen m hóa 16S rRNA cũng đ chỉ ra rằng 3 chủng vi khuẩn trên có mối
quan hệ gần nhất với loài R. palustris (Hình 3.7).








Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng NMS49, VH121, MI1.
Tuy nhiên, chúng vẫn có những khác biệt về trình tự gen m hóa
16S rRNA so với loài R. palustris chủng ATCC17001 với độ tơng đồng
từ 97 đến 99%. Chủng MI1 đợc phân lập từ nguồn thải hỗn hợp của nhà
máy hóa chất và công ty xăng dầu (Gia Lâm, Hà Nội) và chủng VH121
đợc phân lập từ kho xăng dầu (Hạ Long, Quảng Ninh) nhng chúng có
khoảng cách rất gần nhau theo tỷ lệ tơng đồng về nucleotide của gen
m hóa 16S rRNA so với loài R. palustris chủng ATCC17001 là 97,7%
và 97,3%. Chủng NMS49 đợc phân lập từ nguồn thải nhà máy sơn (Cầu
Diễn, Hà Nội) lại nằm ở một nhánh tách biệt và có tỷ lệ tơng đồng về
gen m hóa 16S rRNA với loài R. palustris cao hơn (98,6%) (Hình 3.7).

Rhodopseudomonas palustris ATCC17001
Rhodopseudomonas palustris DSM 126

MI1

VH121

Blastobater denitrificans

Bradyrhizobium japonicum

Rhodopseudomonas palustris DSM 123

Rhodopseudomonas rhenobacensis

Rhodoblastus acidophilus

Rhodoplanes roseus


Blastochloris viridis

Rhodomicrobium vannielii

Rhodobacter capsulatus

Rhodobacter sphaeroides

Rhodobium marinum

Rhodospir
illum rubrum

Rhodopseudomonas palustris T

Afipia felis

Nitrobacter winogradskyi

N
MS49

14


Do đó, cả ba chủng VKQHT trong nghiên cứu này đều có thể đợc xếp
vào chi Rhodopseudomonas và đợc đặt tên là Rhodopseudomonas sp.
chủng NMS49, VH121 và MI1.
3.4. ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng đến sự phân hủy
BA và 4-OHBen ở VKQHT
3.4.1. ảnh hởng của oxy và ánh sáng
Chủng MI1 chỉ có khả năng sinh trởng trên môi trờng chứa BA
là nguồn C duy nhất trong điều kiện kỵ khí ngoài sáng, còn trong các
điều kiện khác thì sinh trởng của chủng này rất yếu và hầu nh dừng lại
sau 72 giờ (Hình 3.8). Khác với BA, 4-OHBen đợc chủng MI1 sử dụng
là nguồn C duy nhất trong cả hai điều kiện quang dị dỡng và hiếu khí
trong tối.

Hình 3.8. Sinh trởng của chủng MI1 trên môi trờng chứa BA (A) và 4-OHBen (B)
trong các điều kiện k khí ngoài sáng (); k khí trong tối (); hiếu khí ngoài sáng ()
và hiếu khí trong tối (ì). Nồng độ các hợp chất thơm đợc thử nghiệm ở nồng độ 2 mM.
3.4.2. ảnh hởng của nồng độ BA và 4-OHBen
Mức độ tích lũy sinh khối của chủng MI1 phụ thuộc nhiều vào
nồng độ BA hoặc 4-OHBen có mặt trong môi trờng nuôi cấy sau 96 giờ
(Hình 3.9). Chủng này sinh trởng cực đại trên môi trờng chứa BA từ
4ữ8 mM hoặc 4-OHBen từ 6ữ8 mM. Sinh trởng của chủng MI1 bắt đầu
giảm mạnh khi nồng độ BA hoặc 4-OHBen vợt quá 8 mM. Theo một số
nghiên cứu đ đợc công bố (Harwood và đtg, 1988; Sasikala và đtg,
0
0.4
0.8
1.2
0 24 48 72 96 120
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
0 24 48 72 96 120
OD (nm)

A

Thời gian (h)

B

Thời gian (h)

15


1998) sinh trởng của VKQHT bị ức chế khi BA và 4-OHBen ở nồng
độ lớn hơn 8,9 mM và 8,5 mM.
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
0 4 8 12 16
Nng ủ hp cht thm (mM)
OD (nm)

Hình 3.9. Mức độ tích lũy sinh khối của
chủng MI1 sau 144 giờ trên môi trờng
chứa BA () và 4-OHBen () với các nồng
độ khác nhau.
Thi gian (h)
0
0.4
0.8
1.2
0 24 48 72 96 120 144
OD

660
(nm)
Hình 3.10. Động thái tích lũy sinh khối
của chủng MI1 trên môi trờng chứa BA
là nguồn C duy nhất khi không () và có
() bổ sung NaHCO
3
.
3.4.3. ảnh hởng của NaHCO
3

Sinh trởng của chủng MI1 đạt cực đại sau 72 giờ trong môi
trờng có NaHCO
3
(10 mM) (Hình 3.10). Trong môi trờng không chứa
NaHCO
3
,

thời gian đạt cực đại của chủng MI1 chậm hơn và kéo dài đến
120 giờ (Hình 3.10). Theo một số nhà nghiên cứu (Elder và đtg, 1992a;
Imhoff và đtg, 1989; Sasikala và đtg, 1998) VKQHT cần CO
2
ở dạng
bicacbonate (NaHCO
3
) để giữ cân bằng thế oxi hóa khử trong suốt quá
trình sinh trởng của chúng trên môi trờng chứa một số hợp chất thơm.
NaHCO
3

còn có ảnh hởng rõ rệt đến khả năng phân hủy BA của
VKQHT nghiên cứu. ở các công thức có và không bổ sung NaHCO
3
,
hàm lợng BA trong môi trờng nuôi cấy cũng giảm khoảng 50% sau 24
giờ (Hình 3.11). Tuy nhiên, ở giai đoạn tiếp theo, BA ở nồng độ 2 mM
đợc chủng MI1 phân hủy hoàn toàn chỉ sau 72 giờ khi có mặt NaHCO
3
,
còn trong môi trờng không chứa NaHCO
3
quá trình phân hủy BA
(2 mM) kéo dài đến 120 giờ.
3.4.4. ảnh hởng của Na
2
S
Khác với NaHCO
3
, Na
2
S (0,1 mM) đ có tác dụng không chỉ tăng
sinh trởng mà còn tăng khả năng phân hủy BA hoặc 4-OHBen của
16


chủng MI1. Chủng MI1 phân hủy hoàn toàn 2 mM BA sau 72 giờ ở
môi trờng có bổ sung Na
2
S, trong khi đó ở môi trờng không chứa Na
2

S
sự phân hủy BA diễn ra chậm hơn và BA (2 mM) chỉ đợc phân hủy
hoàn toàn sau 120 giờ (Hình 3.12).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
0 24 48 72 96 120
Thi gian (gi)
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
N ng ủ b enzoate (m M)

Hình 3.11. Biến động tích lũy sinh khối
của chủng MI1 ( và ) và hàm lợng BA
(

và

) trong môi trờng khi không (hình
rỗng) và có (hình đặc) bổ sung NaHCO
3

trong 120 giờ.
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
0 24 48 72 96 120
Thi gian (gi)
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Nng ủ benzoate (m M)

Hình 3.12. Biến động tích lũy sinh khối

của chủng MI1 ( và

) và hàm lợng BA
( và ) trong môi trờng khi không (hình
rỗng) và có (hình đặc) bổ sung Na
2
S trong
120 giờ.
3.4.5. ảnh hởng của succinate và acetate
Bổ sung AA (4 mM) hoặc succinate (3 mM) vào môi trờng chứa

BA đ làm tăng tốc độ tích lũy sinh khối của chủng MI1 (Hình 3.13).
Tuy nhiên, khác với NaHCO
3
và Na
2
S, bổ sung hai nguồn C này lại làm
giảm khả năng phân hủy BA của chủng MI1 (Hình 3.13).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 24 48 72 96 120
Thi gian (gi)
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Nng ủ benzoate (mM)


Hình 3.13. Động thái tích lũy sinh
khối của chủng MI1 và hàm lợng BA
trong môi trờng có bổ sung acetate
hoặc succinate. Sinh khối tế bào

không () và có acetate () hoặc
succinate (). Hàm lợng BA trong
môi trờng không () và có acetate
() hoặc succinate ().

Khả năng phân hủy 4-OHBen của chủng MI1 cũng bị giảm khi AA
hoặc succinate có mặt trong môi trờng nuôi cấy. Nh vậy, chủng MI1
17


đ u tiên sử dụng AA và succinate là hai nguồn C cho sinh trởng, sau
đó mới là quá trình phân hủy và sử dụng BA hoặc 4-OHBen.
3.5. Hoạt độ enzym benzoate-CoA ligase trong dịch chiết tế bào
của chủng MI1
Enzym benzoate-CoA ligase đợc phát hiện trong dịch chiết tế bào
của chủng MI1 sinh trởng trên môi trờng chứa BA nhng không phát
hiện đợc khi sinh trởng trên AA (Bảng 3.4). Kết quả này cũng giống
nh một số nghiên cứu trớc đây về hoạt độ benzoate-CoA ligase trong
dịch chiết tế bào của R. palustris (Geissler và đtg, 1988; Kim và
Harwood, 1991). Qua đó, chủng MI1 có mang gen m hóa cho
benzoate-CoA ligase và gen này sẽ đợc tách dòng và thăm dò khả năng
biểu hiện trong vector phù hợp.
Bảng 3.4. Hoạt độ enzym benzoate-CoA ligase trong dịch chiết tế bào của chủng MI1
sinh trởng trên môi trờng chứa BA và acetate trong điều kiện quang dị dỡng.
Nguồn C
(mM)
V
(ml)
Protein tổng
số (mg)

Hoạt độ tổng
số (U)
Hoạt độ riêng
(U/mg)
BA (6) 50 34,5 1,2 0,035
Acetate (12) 50 38,4 - -
Chú thích: dấu (-): không xác định đợc. Hàm lợng protein tham gia phản ứng là 14 àg.
3.6. Tách dòng gen m hóa enzym BadA từ chủng MI1
Trong nghiên cứu này, gen badA m hóa cho enzyme chìa khóa
tham gia vào quá trình phân hủy BA của chủng MI1 đ đợc tách dòng
và biểu hiện để từ đó có thể tạo tiền đề cho khả năng ứng dụng enzym
BadA tái tổ hợp trong quá trình đánh giá và xa hơn nữa là xử l ý ô nhiễm
hợp chất thơm.
Gen badA từ DNA genom của chủng MI1 đợc nhân lên bằng kỹ
thuật PCR với cặp mồi đợc thiết kế là badAf và badAr. Sản phẩm PCR
đợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1 và đợc biến nạp vào tế
bào E. coli DH5. Để có thể kết luận chính xác đoạn DNA ngoại lai
chèn vào vector có phải là gen đích, các plasmid tái tổ hợp đợc sử dụng
18


làm khuôn để nhân gen mong muốn bằng phản ứng PCR với cặp mồi
badAf và badAr và đợc cắt kiểm tra bằng các enzym hạn chế.
Kết quả phân tích trình tự cho thấy đoạn gen đ đợc nhân lên có
kích thớc 1575 nucleotide (đợc ký hiệu là badA/MI1) với bộ ba mở
đầu là ATG. Một gen với kích thớc nh vậy có thể m hóa cho một
protein với 523 axit amin có khối lợng phân tử ớc tính khoảng 57.530
Da. Kích thớc này gần giống với kích thớc của enzym benzoate-CoA
ligase (58.000 Da) đợc tinh sạch từ R. palustris (Geissler và đtg, 1988).
Trình tự nucleotide của gen badA ở chủng MI1 đợc so sánh với trình tự

nucleotide của một số gen m hóa CoA ligase ở R. palustris và một số vi
khuẩn khác (Hình 3.14).













Hình 3.14. Mối quan hệ của badA/MI1 và một số gen m hóa các CoA ligase khác.
Gen badA/MI1 có mối quan hệ gần gũi với các gen m hóa
benzoate-CoA ligase từ R. palustris, Thauera aromatica, Azoacus
evansii và Silicibacter pomeroyi (Hình 3.14). Benzoate-CoA ligase suy
diễn từ gen badA/MI1 tạo thành một nhánh cùng với các enzym
benzoate-CoA ligase ở R. palustris, T. aromatica và A. evansii (Hình
3.15). Mức độ tơng đồng cao nhất của gen badA/MI1 với gen badA ở R.
palustris chủng DCP3 (Oda và đtg, 2004) là 93,3% và mức độ tơng
đồng của sản phẩm axit amin của gen là 97% (Hình 3.16).


R. palustris DCP3
R. palustris CGA009 benzoate-CoA ligase
Chng MI1
C. testosterone /aryl-CoA ligase

A. evansii
T. aromatica benzoate-CoA ligase
S. pomeroyi
R. palustris /4-hydroxybenzoate-CoA ligase
A. evansii /2-aminobenzoate-CoA ligase
N. crassa /acetate-CoA ligase
B. thetaiotaomicron /acetate-CoA ligase
M. acetivorans /axit béo chuỗi dài CoA ligase



19











Hình 3.15. Mối quan hệ giữa các trình tự axit amin của benzoate-CoA ligase ở MI1 và
một số CoA ligase: benzoate-CoA ligase (BA.lig); 4-hydroxybenzoate-CoA ligase
(HBA.lig); 2-aminobenzoate-CoA ligase (2AB.lig); acetate-CoA ligase (acet.lig); axit béo
chuỗi dài CoA ligase (f.a.lig) từ các loài Comamonas testosteroni (Coma), R. palustris
(Rhodo), T. aromatica (Thau), A. evansii (Azoa), Silicibacter pomeroyi (Sili),
Neurospora crassa (Neur), Bacteroides thetaotaomicron (Bact), Methanosarcina
acetivorans (Metha).

DCP3 1 NAAAVTPPPEKFNFAEHLLQTNRVRPDKTAFVDDISSLSFAQLEAQTRQLAAALRAIGVK 60
MI1 1 V VKA S 60
DCP3 61 REERVLLLMLDGTDWPVAFLGTIYAGIVPVAVNTLLTADDYAYMLEHSRAQAVLVSGALH 120
MI1 61 S A 120
DCP3 121 PVLKAALTKSDHEVQRVIVSRPAAPLEPGEVDFAEFVGAHAPLEKPAATQADDPAFWLYS 180
MI1 121 V A Q 180
DCP3 181 SGSTGRPKGVVHTHANPYWTSELYGRNTLHLREDDVCFSAAKLFFAYGLGNALTFPMTVG 240
MI1 181 P H 240
DCP3 241 ATTLLMGERPTPDAVFKRWLGGVGGVKPTVFYGAPTGYAGMLAAPNLPSRDQVALRLASS 300
MI1 241 S S A. 300
DCP3 301 AGEALPAEIGQRFQRHFGLDIVDGIGSTEMLHIFLSNLPGRVRYGTTGWPVPGYQIELRG 360
MI1 301 I D 360
DCP3 361 DGGGPVADGEPGDLYIHGPSSATMYWGNRAKSRDTFQGGWTKSGDKYVRNDDGSYTYAGR 420
MI1 361 420
DCP3 421 TDDMLKVSGIYVSPFEIEATLVQHPGVLEAAVVGVADEHGLTKPKAYVVPRPGQTLSETE 480
MI1 421 A 480
DCP3 481 LKTFIKDRLAPYKYPRSTVFVAELPKTATGKIQRFKLREGVL 522
MI1 481 A 522
Nh vậy, gen badA đ đợc tách dòng và cặp mồi đợc thiết kế
ban đầu là đặc hiệu. Theo một số nhà nghiên cứu (Dar và đtg, 2005;
Hendrick và đtg, 2006; Hosoda và đtg, 2005), những gen chức năng chìa
khóa nh vậy đợc ứng dụng trong việc quan trắc phân tử. Do đó,
phơng pháp này có thể đợc sử dụng để phát hiện gen chức năng badA
của VKQHT trong một tập đoàn vi khuẩn k khí phân hủy hợp chất
thơm. Qua đó, có thể nghiên cứu đợc tính đa dạng của VKQHT, đồng
thời có thể xác định đợc có quá trình phân hủy k khí hợp chất thơm
xảy ra. Đây chính là đặc điểm u việt của các kỹ thuật gen di truyền so
với các phơng pháp nuôi cấy truyền thống (Mesarch và đtg, 2000).
3.7. Biểu hiện gen badA trong tế bào E. coli BL21

Coma.Aryl.lig

Rhodo MI1.BA.lig
Rhodo DCP3.BA.lig
Rhodo CGA009.BA.lig

Rhodo.HBA.lig

Azoa.BA.lig

Thau.BA.lig

Sili.BA.lig

Azoa.2AB.lig

Bact.acet.lig

Neur.acet.lig

Metha.f.a.lig

Hình 3.16.
So sánh
trình tự axit amin suy
diễn của benzoate-
CoA ligase ở chủng
MI1 với R. palustris
chủng
DCP3 (số

đăng ký AF355195).
Dấu (.) biểu thị giống
với trình tự của
DCP3.

20


Với mục đích ứng dụng BadA tái tổ hợp trong công nghệ sinh học
môi trờng, gen badA đợc biểu hiện trong E. coli bằng vector
pET32a(+) và một số tính chất của BadA tái tổ hợp đ đợc nghiên cứu.
Vector biểu hiện có trình tự tín hiệu tiết ra ngoài khoang chu chất và
đợc thiết kế sẵn đuôi polyhistidin giúp cho quá trình tinh sạch protein
tái tổ hợp đợc dễ dàng. Các plasmid đ chọn đợc cắt kiểm tra bằng
EcoRI và NcoI.












Hình 3.17. Điện di đồ protein
tổng số của chủng E. coli BL21
mang gen badA trên gel

polyacrylamide 12,6%. Đờng
chạy 1: dòng tế bào không mang
gen badA; M: thang protein
chuẩn (Fermentas); 2, 3: dòng tế
bào mang gen badA.
Hình 3.18. Hàm lợng protein BadA theo thời
gian cảm ứng trên gel polyacrylamide 12,6% có
SDS. Đờng chạy 1: không cảm ứng (0 giờ);
2ữ4: sau 1ữ3 giờ cảm ứng; M: thang protein
chuẩn (Fermentas); 5 và 6: sau 4 và 5 giờ cảm
ứng.

Gen badA trong vector tái tổ hợp đợc điều khiển phiên m bởi
promoter T7 và đợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG có trong
môi trờng. Do đó, để kiểm tra khả năng biểu hiện của badA, các thể
biến nạp đ đợc nuôi cấy ở 30
o
C trong môi trờng có nhân tố chọn lọc
là Amp với chất cảm ứng IPTG (Hình 3.17). Protein BadA tái tổ hợp
đợc tổng hợp ngay sau khi IPTG đợc bổ sung vào môi trờng và sau 4
giờ thì lợng protein thu đợc là đủ lớn để phục vụ cho các nghiên cứu
tiếp theo (Hình 3.18).
1
2

3
4 M

5
6


kDa
116

66
45
35
25

18
14


1 M 2 3
kDa


116

66

45

35

25

18

14


BadA

21


Protein BadA dạng tan chiếm đa số (khoảng 90%) trong tổng số
protein tái tổ hợp thu đợc (Hình 3.19). Protein BadA tái tổ hợp dạng tan
đợc tinh chế bằng cột sắc ký ái lực His-tag và đợc kiểm tra trên gel
polyacrylamide 12,6% có SDS (Hình 3.20).











Hình 3.19. Protein tan và không tan của
E. coli BL21 mang gen badA trên gel
polyacrylamide 12,6%. Đờng chạy 1:
pha tan; 2: pha không tan; M: thang
protein chuẩn (Fermentas).

Hình 3.20. BadA tái tổ hợp sau khi tinh
chế bằng cột sắc ký ái lực His-tag. Đờng
chạy M: thang protein chuẩn (Fermentas);
1ữ3: BadA tinh chế; 4: protein tổng số.
Sản phẩm protein tinh chế là một băng có kích thớc khoảng 70
kDa tơng đơng với kích thớc của protein BadA tái tổ hợp dung hợp
với thioredoxine trong vector biểu hiện (Hình 3.20).
3.8. Hoạt độ enzym BadA tái tổ hợp
Cũng giống nh việc xác định hoạt độ enzym BadA của chủng
MI1, hoạt độ ligase của protein tái tổ hợp tinh sạch đợc kiểm tra bằng
phản ứng Ellman (Bulaj và đtg, 1998) (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Hoạt độ enzym BadA tái tổ hợp.

V
(ml)
Protein tổng số
(mg)
Hoạt độ tổng số
(U)
Hoạt độ riêng
(U/mg)
Dịch chiết tế bào 15 8,5 0,85 0,1
Protein tinh sạch 5 0,4 0,745 1,97
Chú thích: hàm lợng protein tham gia phản ứng là 5,6 àg (đối với dịch chiết tế bào) và 0,76 àg (đối với
protein tinh sạch); hoạt độ enzym đợc xác định sau 10 phút ở 30
o
C.
Hoạt độ riêng của BadA tái tổ hợp ở dạng tinh sạch cao gấp
khoảng 20 lần so với enzym trong dịch chiết tế bào sau 10 phút tham gia
phản ứng. Hoạt độ riêng của BadA tái tổ hợp trong dịch chiết tế bào

kDa


116

66

45

35

25


18

14


M


1



2

3

4

BadA

BadA


1



2

M


kDa

116
66

45
35
25

18
14
22

E. coli cao gấp khoảng 3 lần so với dịch chiết tế bào chủng MI1 sinh
trởng trên BA (Bảng 3.4).
3.9. ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng đến hoạt động
của enzym BadA tái tổ hợp
Enzym BadA tái tổ hợp có hoạt động thích hợp ở nhiệt độ
30ữ35
o
C; pH 8,0ữ9,5 với sự có mặt của ion Mg
2+
hoặc Mn
2+
nhng hoạt
độ enzym khi có sự tham gia của Mn
2+
chỉ đạt 90% so với khi có mặt
của ion Mg
2+
. Theo Geissler và đtg (1988), ion Mg
2+
cần cho cho hoạt
động xúc tác của enzym BadA ở R. palustris và vai trò hoạt hóa của nó
có thể đợc thay thế bằng ion Mn
2+
. BadA tái tổ hợp có hoạt tính cao đối
với BA và 2-fluorobenzoate. Tuy nhiên, 2-fluorobenzoate không phải là
cơ chất sinh trởng của R. palustris (Harwood và Gibson, 1988). BadA
tái tổ hợp hầu nh không có hoạt tính đối với các cơ chất sinh trởng của
R. palustris trong điều kiện quang dỡng nh 4-OHBen,

cyclohexanecarboxylate, succinate và AA. Theo Geissler và đtg (1988),
BadA của R. palustris có tốc độ phản ứng với 2-fluorobenzoate gần
giống nh đối với BA. Các tác giả này cũng không nhận thấy mối liên
quan giữa các chất có vai trò làm cơ chất cho phản ứng ligase với khả
năng làm nguồn C cho sinh trởng của R. palustris.
Giống nh enzyme BadA của R. palustris (Geissler và đtg, 1988;
Gibson và đtg, 1990), động học của BadA tái tổ hợp trong nghiên cứu
này cũng tuân theo phơng trình của Michaelis-Menten. Giá trị K
m
của
BadA tái tổ hợp đợc xác định là 1,6.10
-1
mM, nghĩa là ái lực của nó
thấp hơn so với BadA tự nhiên ở R. palustris (K
m
= 0,6ữ2,0.10
-3
mM). Sự
khác biệt về thông số K
m
của BadA tái tổ hợp đ dẫn đến sự sai khác về
vận tốc phản ứng enzym (V
max
= 0,133 àmol/phút) so với BadA tự nhiên
ở R. palustris (16,7 àmol/phút) (Geissler và đtg, 1988; Gibson và đtg,
1990). Những sự sai khác này có thể do enzym BadA ở dạng dung hợp
với thioredoxin khi biểu hiện bằng vector pET32a(+). Do ở dạng dung
23

hợp nh vậy cho nên cấu hình không gian của enzym phần nào đ bị
thay đổi và làm ảnh hởng đến tính chất của nó. Tuy nhiên, để có thể
nghiên cứu chính xác hoạt tính xúc tác của BadA tái tổ hợp sau khi tách
khỏi protein thioredoxin thì cần phải có những nghiên cứu sâu hơn tiếp
theo. Mặc dù có những sai khác về các thông số K
m
và V
max
nh vậy
nhng BadA tái tổ hợp vẫn có tính đặc hiệu cao đối với BA. Do đó,
BadA tái tổ hợp có thể đợc ứng dụng để đánh giá tiềm năng phân hủy
kỵ khí của hệ thống xử lý nớc thải hoặc trong bùn đất ô nhiễm hợp chất
thơm nhằm đa ra biện pháp xử lý thích hợp thông qua việc tạo các kit
phát hiện nhanh sự hiện diện của chất trung gian trung tâm của quá trình
này.
Kết luận
1. Đ tuyển chọn đợc 9 chủng vi khuẩn quang hợp tía (NMS49, MI1,
VH121, VA31, QP21, NĐ71, NMG16, ĐG217 và ĐG218) có khả
năng sử dụng benzoate và 4-hydroxybenzoate là nguồn carbon duy
nhất cho sinh trởng trong điều kiện quang dỡng. Trong đó, hai
chủng NMS49 và VH121 còn có thể sử dụng đợc 3-chlorobenzoate
là nguồn carbon duy nhất và 5 chủng NMS49, VH121, NMG16,
QP21, VA31 có khả năng phân hủy 3-chlorobenzoate khi có mặt
benzoate hoặc 4-hydroxybenzoate.
2. Chủng MI1 có thể sử dụng benzoate chỉ trong điều kiện k khí sáng
và sử dụng 4-hydroxybenzoate trong cả hai điều kiện k khí sáng và
hiếu khí trong tối. Bicarbonate (NaHCO
3
) chỉ làm tăng khả năng phân
hủy benzoate nhng sulfide natri (Na

2
S) có thể làm tăng khả năng
phân hủy cả benzoate và 4-hydroxybenzoate bởi chủng MI1, còn
succinate hoặc acetate làm giảm khả năng phân hủy hai hợp chất
thơm này.
3. Bằng phơng pháp định loại truyền thống kết hợp kỹ thuật phân tử đ
định loại đợc 3 chủng vi khuẩn quang hợp tía NMS49, VH121 và