Nghiên cứu thu nhận protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Bộ giáo dục v đo tạo
ĐạI HọC Đ NẵNG




Đỗ Thị Bích Thủy






Nghiên cứu Thu nhận chế phẩm protease
từ một số nguồn khác nhau v ứng dụng
trong công nghệ thực phẩm



Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm đại cơng
Mã số : 2.11.00




Tóm tắt Luận án tiến sĩ kỹ thuật

Đà Nẵng - 2006

Công trình đợc hoàn thành tại: Đại học Đà Nẵng

Ngời hớng dẫn khoa học:
PGS. TS Trần Thị Xô
GS. TSKH Phạm Thị Trân Châu


Phản biện 1:
GS. TSKH Lu Duẫn
Phản biện 2:
GS. TS Hoàng Đình Hòa
Phản biện 3:
PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà
Luận án sẽ đợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc
tại: Đại học Đà Nẵng

Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm luận án tại:
- Th viện Quốc gia.
- Trung tâm Thông tin Học liệu Đại học Đà nẵng
- Trung tâm Học liệu Đại học Đà Nẵng
- Th viện Trờng Đại học Nông Lâm - Đại học Huế
Danh mục công trình đ công bố
của tác giả
1. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô, Phạm Thị Trân Châu (2004),
Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease cao từ
vỏ tôm, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2004), 41, tr.

611-612.
2. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), Nghiên cứu ảnh hởng của
một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis, TC
Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2004), 49: tr. 1667-1668.
3. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), ảnh hởng sự thay thế
nguồn Cacbon và Nitơ tự nhiên lên quá trình sản xuất chế phẩm
protease từ Bacillus subtilis, TC Nông nghiệp và phát triển nông
thôn (2005), 59: tr. 42-43.
4. Do Thị Bich Thuy, Tran Thi Xo (2005), Production, purification
and application of protease from Bacillus subtilis, Proceedings of
Vietnam-Korea international symposium 2005 on Biotechnology and
Bio-system-engineering, Ho chi Minh city: 47-52.
5. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô (2006), Nghiên cứu quy trình thu
nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm protease Bacillus
subtilis, , TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn 87: 41-51.
6. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Luyến (2006), Nghiên cứu nuôi cấy
trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ
phế liệu tôm, TC Khoa học Công nghệ Thủy sản 2-2006: 47-51.
7. Đỗ Thị Bích Thủy, Phạm Thị Trân Châu (2006), Nghiên cứu một
số tính chất proteinase ngoại bào của Bacillus subtilis bằng phơng
pháp điện di trên gel polyacrylamide, TC Khoa học Đại học Quốc
gia Hà Nội, KHTN & CN T. XXII 3: 1-12.


1
Mở đầu
1. Tính cấp thiết của luận án
Protease là một trong các enzyme công nghiệp quan trọng nhất,
đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Quá
trình thu nhận các chế phẩm enzyme phụ thuộc rất nhiều yếu tố nh

tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận Vì vậy
tùy từng trờng hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích
hợp để thu nhận các chế phẩm enzyme phù hợp với mục đích sử dụng.
Trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học tiến
hành nghiên cứu, đa vào ứng dụng các chế phẩm protease trong công
nghiệp chế biến thực phẩm và thơng mãi hóa chế phẩm protease. ở
Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về enzyme tuy nhiên nghiên
cứu ứng dụng vẫn còn hạn chế và hiện nay cha có cơ sở nào sản xuất
chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng để sử dụng trong các
ngành công nghiệp; hầu nh các chế phẩm enzyme sử dụng trong
nghiên cứu và sản xuất đều phải nhập ngoại.

Trớc tình hình phát triển mạnh mẽ của ngành thủy sản cũng
nh sản xuất nông sản ở trong nớc, với định hớng nghiên cứu thiết
lập quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng các chế
phẩm này trong việc xử lý phế phụ phẩm và chế biến nông sản,
chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm
protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ
thực phẩm.
2. Mục đích của luận án
- Thiết lập đợc quy trình thu nhận chế phẩm proteinase ở quy
mô phòng thí nghiệm có khả năng ứng dụng trong công nghiệp chế
biến thực phẩm.
- ứng dụng chế phẩm enzyme thu đợc để loại bỏ protein khỏi
phế liệu tôm trong quy trình sản xuất chitin và sử dụng enzyme đó để
cải tiến quy trình sản xuất nớc chấm từ đậu nành.
Để thực hiện mục đích trên, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu chọ
nguồn proteinase thích hợp, thực hiện chiết tách, thu nhận chế phẩm
enzyme, xác định tính chất và thử nghiệm ứng dụng trên các quy trình
sản xuất.

3. Nội dung nghiên cứu của luận án
- Nghiên cứu thăm dò, tuyển chọn nguồn nguyên liệu thích hợp
để thu nhận proteinase.

2
- Nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm proteinase
từ nguồn nguyên liệu đã đợc tuyển chọn.
- Khảo sát một số đặc tính của các chế phẩm proteinase thu
đợc.
- Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme này để xử lý loại bỏ
protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm trong quy trình sản xuất
chitin và cải tiến quy trình sản xuất nớc chấm từ đậu nành truyền
thống.
4. ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra nguồn proteinase từ một
số thực vật phổ biến ở Huế và tuyển chọn đợc một chủng vi khuẩn
trong phế liệu tôm có PA trong môi trờng cao, đã đợc định tên là
Bacillus subtilis (tại phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trờng và thực
phẩm Universite Catholique de Louvain Bỉ).
- Là một trong số rất ít công trình ở Việt Nam tiến hành nghiên
cứu phát hiện trực tiếp và đầy đủ hơn các proteinase của Bacillus
subtilis từ chế phẩm enzyme thô; sử dụng phơng pháp điện di SDS
PAGE có cơ chất phát hiện đợc ít nhất 6 băng PA có khối lợng
phân tử từ 20 kD đến 67 kD, đồng thời nghiên cứu ảnh hởng của các
chất ức chế, hoạt hoá và các ion kim loại hoá trị hai đến mỗi
proteinase.
- Lựa chọn đợc điều kiện thích hợp để sử dụng proteinase hoặc
nuôi cấy trực tiếp Bacillus subtilis với phế liệu tôm để tách bỏ
protein, tạo nguyên liệu sạch protein nhằm sản xuất chitin đạt tiêu
chuẩn cho sản xuất chitosan.

- Lựa chọn đợc điều kiện thích hợp để sử dụng chế phẩm
enzyme thu đợc (nồng độ 0,044HP/g, nhiệt độ 50
0
C) để cải tiến
thành công ở quy mô phòng thí nghiệm quy trình sản xuất nớc chấm
từ đậu nành truyền thống; rút ngắn thời gian sản xuất xuống 6 lần và
giảm đợc 1/2 lợng HCl so với quy trình truyền thống ở Huế. Do
đó, nếu áp dụng trên quy mô lớn sẽ không chỉ có hiệu quả kinh tế mà
còn giảm thiểu ô nhiễm môi trờng.
5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 124 trang bao gồm: Mở đầu 2 trang, tổng quan
tài liệu 30 trang, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 10 trang, kết
quả và thảo luận 79 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, 153 tài liệu
tham khảo. Trong luận án có 26 bảng, 56 hình và đồ thị.

3
Chơng 1: Tổng quan ti liệu
1.1. Protease và phân loại.
1.2. Nguồn proteinase và tình hình nghiên cứu trong nớc và trên thế
giới.
1.3. Các phơng pháp thu nhận chế phẩm proteinase.
1.4. ứng dụng của proteinase.
1.5. Tổng quan về Bacillus subtilis.
1.6. Tình hình sản xuất chitin, nớc chấm trong nớc và trên thế giới.
Chơng 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng
- Các loại hạt và quả đợc dùng để nghiên cứu đợc mua trên
địa bàn Thừa Thiên Huế nh: Hạt đậu ván (Lablab vulgaris) khô, hạt
đậu ngự (Phaseolus lanatus) tơi, quả su le (Sechium edule), quả vả
(Ficus auriculata), hạt đậu nành.

- Phế liệu của quá trình chế biến tôm (PLT) đợc lấy mẫu ở
công ty chế biến thủy sản xuất khẩu Sông Hơng (Thừa Thiên Huế)
dùng để phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
proteinase cao và khảo sát quá trình loại bỏ protein.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
* Các phơng pháp vi sinh vật: Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp proteinase ngoại bào cao trên môi trờng thạch gelatin; cấy
tăng sinh và nuôi cấy để thu nhận enzyme trong môi trờng lỏng, xác
định mật độ tế bào sau thời gian nuôi cấy bằng cách đo mật độ hấp
thụ ở bớc sóng 600nm.
* Các phơng pháp phân tích hóa sinh: Xác định hoạt độ
proteinase theo phơng pháp Anson cải tiến, xác định hàm lợng
protein hòa tan theo phơng pháp Lowry, xác định hàm lợng ni tơ
tổng số bằng phơng pháp Kjeldahl, tinh sạch sơ bộ bằng phơng
pháp sắc ký lọc gel, điện di protein trên gel SDS-polyacryamide
(SDS-PAGE) theo Leammli và điện di phát hiện proteinase theo
Heusen và Dowdle.
* Phơng pháp vật lý: Xác định hàm lợng kim loại nặng bằng
phơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử.

4
* Các phơng pháp thống kê: Phơng pháp phân tích phơng sai
(Analysis of variance (ANOVA)), phơng pháp tối u hoá theo quy
hoạch thực nghiệm.
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu v thảo luận
3.1. thăm dò hoạt độ proteinase (pa) của một số
nguồn khác nhau
3.1.1. Xác định PA của một số nguồn thực vật
Thực hiện khảo sát khả năng thu nhận proteinase . Kết quả
khảo sát xác định pH của dịch đệm dùng để tách chiết proteinase

thích hợp cho thấy khi sử dụng cùng một loại đệm thì hiệu quả chiết
tách ở các pH đệm khác nhau là không giống nhau (với đậu ngự pH
thích hợp là 8; đậu ván: pH 7; su le: pH 6 và vả: pH 11).
Kết quả thăm dò sơ bộ khả năng thu nhận proteinase từ các
nguồn thực vật trên với pH thích hợp thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả thăm dò sơ bộ khả năng thu nhận proteinase
từ các nguồn thực vật
Khối lợng (g) Hoạt độ proteinase
Nguyên
liệu
thực vật
Nguyên
liệu
(tơi)
Chất
khô
HP/100
gam
tơi
Sai số
HP/100
gam
chất khô
Sai số
Đậu
ngự
100 30,200 8,366
0,06
27,7
0,20

Đậu
ván
100(*) 42,000

2,482
0,02
5,9
0,04
Su le 100 5,200 9,504
0,27
182,8
5,17
Vả 100 10,200 3,432
0,19
33,6
1,84
((*): Đối với đậu ván đợc tính trên 100g nguyên liệu ớt sau khi ngâm 50 g
nguyên liệu khô trong 6 giờ)
Từ kết quả thăm dò sơ bộ, chúng tôi tiến hành kết tủa bằng
ethanol, đông khô để thu chế phẩm và tính giá thành tơng đối.
Kết quả cho thấy giá thành tính trên 1 đơn vị hoạt độ của chế
phẩm tách từ su le là ít nhất, chỉ bằng khoảng 1/3 của đậu ván và 1/2
của vả và đậu ngự.
Nh vậy, các kết quả thăm dò hoạt độ proteinase từ các đối
tợng thực vật cho thấy su le là nguồn thu nhận có hiệu quả nhất.

5
3.1.2. Thăm dò một số nguồn vi sinh vật để thu proteinase
Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập đợc, có 11 chủng có khả năng
sinh tổng hợp proteinase ngoại bào. Trong đó có 1 chủng đợc định

tên là: Bacillus subtilis, không gây bệnh và không sinh độc tố đợc
chọn để nghiên cứu thu nhận chế phẩm và so sánh hiệu quả với các
đối tợng thực vật. Chủng này tạo PA trong môi trờng lỏng thịt -
pepton (MTCB) cao nhất sau 24 giờ nuôi cấy. Chế phẩm enzyme thu
đợc sau khi kết tủa bằng cồn (ETC) từ chủng này trong MTCB có
giá thành tơng đối là 4974 đồng/1gETC và 170 đồng/HP (rẻ hơn 1,8
lần so với chế phẩm thu nhận từ su le).
3.2. Nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận chế
phẩm proteinase từ B. subtilis
3.2.1. Nghiên cứu thiết lập môi trờng tối u cho PA cao của B.
subtilis:
3.2.1.1. ảnh hởng của nguồn carbon
Bổ sung các nguồn carbon nh: tinh bột hòa tan, maltose,
lactose, saccharose, dextrose với hàm lợng 0,5% vào MTCB đồng
thời khảo sát trên mẫu đối chứng (ĐC) là MTCB. Sau khi nuôi cấy 24
giờ, tiến hành xác định PA của dịch môi trờng nuôi cấy bằng
phơng pháp Anson cải tiến (Hình 3.7).
0,096
0,156
0,052
0,016
0,016
0,016
0
0,05
0,1
0,15
0,2

(ĐC: mẫu đối chứng, MTCB; TB: Tinh bột; Mal: Maltose; Dex:
Dextrose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose)
Hoạt độ (HP/ml)
Hình 3.7: ảnh hởng của nguồn carbon lên hoạt độ proteinase trong
dịch môi trờng nuôi cấy của chủng B. subtilis
N
g
uồn C (0,5%)
ĐC TB Mal Dex Lac Sac


6
Kết quả này cho thấy khi thêm tinh bột hoà tan vào MTCB,
PA đạt đợc cao nhất so với sự bổ sung các nguồn C khác; PA của
dịch môi trờng nghiên cứu lớn hơn so với mẫu đối chứng 1,6 lần
(Hình 3.7).
3.2.1.2. ảnh hởng của nguồn ni tơ
Tiến hành bổ sung vào môi trờng cơ bản (đối chứng) các
hợp chất N vô cơ (NH
4
NO
3
, NH
4
Cl) và N hữu cơ (cao nấm men,
casein), thu dịch môi trờng nghiên cứu và tiến hành xác định PA
(Hình 3.8).
Từ kết quả ở hình 3.8 cho thấy casein là nguồn nitơ có tác

dụng làm tăng PA mạnh nhất, hoạt độ đạt cao hơn hai lần so với
mẫu đối chứng.

0,096
0,192
0,032
0,016 0,016
0
0,05
0,1
0,15
0,2





3.2.1.3. ảnh hởng của các amino acid đến hoạt độ proteinase của
dịch môi trờng nuôi cấy Bacillus subtilis
Thực hiện khảo sát sự ảnh hởng của các amino acid đến PA
Bacillus subtilis bằng cách bổ sung các amino acid khác nhau với
nồng độ 7 mmol/l vào MTCB. Sau khi nuôi cấy, hoạt độ proteinase
của dịch môi trờng nuôi cấy có bổ sung amino acid đều giảm so với
mẫu đối chứng (MTCB).
Hình 3.8: ảnh hởng của nguồn ni tơ khác nhau đến hoạt độ
proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis
ĐC Cas CN NH
4
Cl NH
4

NO
3
Hoạt độ (HP/ml)
Nguồn N (0,5%)
( ĐC: Đối chứng; Cas: Casein; CN: Caonấm)

7
3.2.1.4. Nghiên cứu thăm dò ảnh hởng của sự kết hợp đồng thời
nguồn carbon và ni tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trờng
nuôi cấy B. subtilis
* ảnh hởng của sự kết hợp một số nguồn dinh dỡng đến hoạt độ
proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis:
Thử nghiên cứu kết hợp bổ sung các nguồn dinh dỡng đã khảo
sát ở trên vào MTCB.
Các mẫu thí nghiệm đợc nuôi cấy 24 giờ và xác định PA của
dịch môi trờng nuôi cấy. Quá trình bố trí thí nghiệm và kết quả đợc
thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: ảnh hởng của sự kết hợp một số nguồn carbon và ni
tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis

Nguồn C
(%)
Nguồn N
(%)
tn
TB Mal Cas CN
PA
(HP/ml)
1 0,5 0,5 0,5 0,265

a
2 0,5 0,5 0,201
b
3 0,5 0,5 0,132
c
4 Mẫu đối chứng 0,095
d
5 0,5 0,5 0,051
e
6 0,5 0,5 0,5 0,016
f
7 0,5 0,5 0,5 0,5 0,010
f
8 0,5 0,5 0,008
f
Nếu xét về hiệu quả kinh tế chúng tôi nhận thấy việc chọn môi
trờng có tinh bột và cao nấm là thích hợp nhất. Chính vì vậy, trong các
thí nghiệm tiếp theo đã tiến hành nghiên cứu tỷ lệ phối hợp của hai thành
phần này.
* ảnh hởng của hàm lợng tinh bột và cao nấm lên hoạt độ
proteinase của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis

8
Bảng 3.9: ảnh hởng của hàm lợng tinh bột và cao nấm đến
hoạt độ của dịch môi trờng nuôi cấy B. subtilis

0,5 1 1,5 2 2,5 3
0,5 0,379
def
0,331

g
0,504
a
0,446
bc
0,461
b
0,408
cd
1 0,178
i
0,360
efg
0,341
fg
0,389
de
0,264
h
0,365
efg
1,5 0,034
lmn
0,192
i
0,120
j
0,062
klm
0,120

j
0,101
jk

2 0,005
n
0,062
klm
0,029
lmn
0,072
kl
0,010
n
0,010
n

2,5 0,010
n
0,043
lmn
0,014
n
0,038
lmn
0,005
n
0,014
n

3 0,000
n
0,010
n
0,019
mn
0,005
n
0,005
n
0,005
n

(Các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy p<0,05
(Duncan s test))
Khảo sát sơ bộ bằng cách thay đổi đồng thời hàm lợng hai
nguồn này trong khoảng rộng từ 0,5% đến 3% theo các mức: 0,5%;
1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3% (Bảng 3.9).
Kết trên bảng 3.9 cho thấy ở nồng độ cao nấm 0,5% và tinh bột
1,5%, hoạt độ enzyme thu đợc đạt cực đại (0,504 HP/ml).
Từ kết quả thu đợc ở trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát thay đổi
đồng thời hàm lợng tinh bột và cao nấm xung quanh 1,5% (1,25%;
1,5%; 1,75%; 2%; 2,25%) và 0,5% (0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%)
nhằm tìm đợc hàm lợng thích hợp nhất.
Kết quả cho thấy khi sử
dụng 0,1% cao nấm phối hợp với 1,75% tinh bột PA đạt cao nhất.
Kết quả trên cho phép xác định đợc thành phần môi trờng
thích hợp nhất (MTTƯCB) gồm: 1% Pepton, 0,3% cao thịt, 0,5%
NaCl, 0,1% cao nấm, 1,75% tinh bột hòa tan.
3.2.2. ảnh hởng của pH ban đầu và nhiệt độ lên PA của B.

subtilis khi nuôi cấy trong môi trờng tối u cơ bản
Nuôi cấy Bacillus subtilis trong MTTƯCB có điều chỉnh pH
ban đầu, đồng thời thay đổi nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.
Sau khi nuôi cấy 24, PA của dịch MTNC đợc xác định ở điều
kiện dung dịch đệm pH 7,4.
Kết quả cho thấy: Chủng B. subtilis khi đợc nuôi cấy trong
MTTƯCB tạo nên PA cao khi pH môi trờng nằm trong khoảng 6 - 8
(cao nhất ở pH 6), ở nhiệt độ 35
0
C.
Hàm lợng
tinh bột(%)
Hàm lợng
cao nấm (%)

9
3.2.3. Xác định thời điểm sinh PA cao nhất khi nuôi cấy B. subtilis
trong môi trờng tối u cơ bản ở điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp
Thực hiện khảo sát xác định thời điểm thu nhận enzyme bằng
cách xác định PA của dịch nuôi cấy ở các thời gian khác nhau (Hình 3.9)

0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
8 1624262830324048566472

Kết quả trên hình 3.9 cho thấy sau khi nuôi cấy 16 giờ, PA có
giá trị 0,588 HP/ml và không thay đổi nhiều khi kéo dài thời gian
nuôi cấy đến 40 giờ.
3.2.4. Nghiên cứu quá trình tách và tinh chế sơ bộ proteinase từ
dịch môi trờng nuôi cấy (MTNC) của B. subtilis
3.2.4.1. ảnh hởng của nồng độ ethanol và pH dịch môi trờng nuôi cấy
đến khả năng thu nhận chế phẩm proteinase kết tủa (Hình 3.10)
120.78
118.18
120.78
112.99
23.38
0
20
40
60
80
100
120
140
678910
48%
64%
72%


Hoạt độ (HP/ml)

Thời
g
ian nuôi cấ
y
(
g
iờ)
Hình 3.9: Kết quả khảo sát sự biến đổi của PA khi nuôi
B. subtilis trong môi trờng tối u cơ bản

Hình 3.10: ảnh hởng của nồng độ ethanol và pH dịch MTNC
đến hiệu suất kết tủa enzyme
p
H dịch MTN
C
Hoạt độ tơng đối
(% so với ban đầu)
Nồng độ ethanol
(% thể tích)

10
3.2.4.2. ảnh hởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
và pH dịch môi trờng
nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận chế phẩm proteinase kết tủa (Hình
3.11)

Hoạt lực enzyme thu đợc khi dùng ethanol kết tủa cao hơn
1,12 lần so với trờng hợp dùng (NH
4
)
2
SO
4
. Trong các thí nghiệm tiếp
theo, chúng tôi chọn ethanol làm tác nhân để thu nhận chế phẩm
enzyme.
3.2.4.3. Tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzyme thu đợc sau khi kết tủa
bằng ethanol (ETC) qua cột Sephadex G-100 (đã đợc cân bằng với
dung dịch đệm Tris HCl 0,05M, pH 7,6, kích thớc cột 80x15cm,
tốc độ chảy 17ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn là 2ml)
Kết quả cho thấy rằng, sau khi sắc ký qua Sephadex G 100,
ETC đợc tách thành 2 đỉnh protein nhng chỉ một đỉnh có PA, đỉnh
I (từ phân đoạn 15 đến phân đoạn 33) (hình 3.12).
Thu các phân đoạn có PA (chế phẩm enzyme thu đợc sau sắc

ký lọc gel (ESG)), xác định protein tổng số, hoạt độ proteinase, tình
hoạt độ riêng, độ sạch và hiệu suất thu hồi enzyme (Bảng 3.13)
pH dịch MTNC
Nồng độ
(NH
4
)
2
SO
4
Hình 3.11: ảnh hởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
và pH dịch
môi trờng nghiên cứu đến hiệu quả thu nhận enzyme
Hoạt độ tơng đối
(% so với ban đầu)
58.44
63.64
101.3
85.71
59.74
85.71
62.34
107.79
57.14
88.31

0
20
40
60
80
100
120
678910
30% bh
50% bh
70% bh

11
















Bảng 3.13: Bảng tổng kết các bớc thu nhận chế phẩm enzyme

Bớc tinh
chế
Hoạt
độ tổng
(HP)
Protein
tổng
(mg)
Hoạt độ
riêng
(HP/mg)
Độ
sạch
(lần)
Hiệu suất
thu hồi
enzyme
(%)
Dịch
MTNC
8,91 104,713 0,080 1,000 100,000
ETC 11,16 47,121 0,237 2,222 125,252
ESG 7,080 0,993 7,132 89,150 79,460
3.2.5. Quy trình thu nhận proteinase từ môi trờng nuôi B.
subtilis ở quy mô phòng thí nghiệm
Chế phẩm ETC thu đợc theo các điều kiện thích hợp đã khảo
sát ở các phần trên, sau khi phân tích các chỉ tiêu về an toàn thực
phẩm và xác định hoạt độ, giá thành của sản phẩm chúng tôi có đợc
kết quả trình bày trên bảng 3.14.
0

0,05
0,1
0,15
0,2

Hình 3.12: Sắc ký đồ của chế phẩm ETC qua cột Sephadex G-100

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
Phân đoạn
Hoạt độ protease (HP/ml)
Mật độ quang
: Hoạt độ protease (HP/ml)
: Hàm lợng protein đợc biểu diễn bằng mật độ quang

12
Bảng 3.14: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của chế phẩm ETC
Chỉ tiêu phân tích Kết quả Tiêu chuẩn về độ tinh
khiết của enzyme
(luật 05/09/1989)
Cadimi 0,35 <0,5
Arsen 0,55 <3
Chì 1,13 <10
Hóa học

(ppm)
Thủy ngân 0,21 <0,5
Các mầm hiếu
khí
Dới 1.10
1
tế
bào/1gam
<50.000
Salmonella
0 tế
bào/25gam
0
Coliforms
0 tế bào/1 gam <30
Vi sinh vật
(tế bào/gam)
Staphylococus
aureus
0 tế bào/1 gam 0
Hoạt độ riêng (HP/mg protein) 0,237
Hàm lợng protein trong 1gam
chế phẩm (mg)
314,14
Hoạt độ trên 1 gam chế phẩm
(HP/g)
74,45
Độ ẩm của chế phẩm(%) 3
Giá thành tơng đối của chế
phẩm (đồng/gam)

2500

3.3. Khảo sát một số tính chất của các chế phẩm
proteinase của B. subtilis:
3.3.1. ảnh hởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của dịch MTNC,
các chế phẩm ETC, ESG (Hình 3.15)
Kết quả cho thấy rằng cả 3 chế phẩm enzyme đạt đợc hoạt độ
cực đại trong khoảng nhiệt độ 50-60
0
C

13

0
20
40
60
80
100
120
30 40 50 60 70 80
MTNC
ETC
ESG



3.3.2. ảnh hởng của pH đến PA của các chế phẩm
(Hình 3.16 và Hình 3.17)
0

20
40
60
80
100
120
345678910
MTNC
ETC
ESG



Dịch MTNC và ETC thích hợp ở pH 6-10, phần trăm hoạt độ
so với cực đại của hai loại enzyme trong khoảng pH này dao động từ
84,21% đến 100%. ESG có pH thích hợp ở pH 6-9.

Nhi
ệ
t đ
ộ

(
0
C
)
Hoạt độ tơng đối
(%so với cực đại)
Hình 3.15: ảnh hởng của nhiệt độ đến phản ứng
của các chế phẩm enzyme

Hình 3.16:. ảnh hởng của pH đến PA của các chế
phẩm enzyme
p
H
Hoạt độ tơng đối
(% so với cực đại)

14

0
20
40
60
80
100
120
6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5
MTNC
ETC
ESG



* Kết quả khảo sát ảnh hởng đồng thời pH (6-10) và nhiệt độ
(30-60
0
C) đến phản ứng của các chế phẩm enzyme cho thấy các dạng
chế phẩm có PA cao nhất ở các giá trị nhiệt độ và pH nh sau: Dịch
MTNC : nhiệt độ 50-60
0

C và pH 7; chế phẩm ETC: nhiệt độ 50-60
0
C
và pH 8; chế phẩm ESG: nhiệt độ 60
0
C, pH 7.
3.3.3. Khảo sát ảnh hởng của nhiệt và pH đến độ bền của các
chế phẩm
*Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của các chế phẩm enzyme:
khảo sát độ bền nhiệt đợc thực hiện ở hai mức 50
0
C và 60
0
C trong
hai trờng hợp có mặt Ca
2+
và không có mặt Ca
2+
(Hình 3.21 và 3.22)
Kết quả cho thấy rằng: Chế phẩm ETC có độ bền nhiệt kém
hơn so với enzyme trong dịch MTNC. ở 50
0
C , các chế phẩm enzyme
đều bền và không bị ảnh hởng bởi Ca
2+
. ở nhiệt độ 60
0
C, độ bền của
các chế phẩm enzyme này giảm hẳn và vai trò của Ca
2+

cũng đợc
thấy rõ hơn.

Hình 3.17: ảnh hởng của pH (6,5-9,5) đến PA của các chế
phẩm enzyme
pH
Hoạt độ tơng đối
(% so với cực đại)

15

0
20
40
60
80
100
120
ĐC 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100




* Độ bền của cả hai chế phẩm enzyme không khác nhau ở pH 7
và pH 8.

0
20
40
60

80
100
120
ĐC 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100



50
o
C (Không có Ca
2+
)
60
o
C (Không có Ca
2+
)
50
o
C ( Có Ca
2+
)
60
o
C (Có Ca
2+
)
Thời
g
ian (

p
hút)
Hình 3.21 : Độ bền nhiệt của dịch môi trờng nuôi cấy
Hoạt độ còn lại (% so với ĐC)
50
o
C (Không có Ca
2+
)
60
o
C (Không có Ca
2+
)
50
o
C ( Có Ca
2+
)
60
o
C (Có Ca
2+
)
Thời
g
ian (
p
hút)
Hình 3.22 : Độ bền nhiệt của chế phẩm ETC

Hoạt độ còn lại (% so với ĐC)

16
3.3.4. Nghiên cứu xác định phân tử lợng và một số tính chất của
các proteinase B. subtilis bằng phơng pháp điện di trên SDS-
PAGE (Hình 3.27, Hình 3.28; Hình 3.30 và Hình 3.31)
Điện di chế phẩm ESG trên SDS-PAGE có casein 0,1% đã phát
hiện đợc 6 băng PA (PA-1, PA-2, PA-3, PA-4, PA-5 và PA-6) (Băng
sáng trên nền tím) có khối lợng phân tử tơng ứng là: 20 kD (PA-1) ,
30kD (PA- 2), ~ 43 kD (PA-3 và PA-4), ~ 67 kD (PA-5 và PA-6) và
một vùng sáng PA có khối lợng phân tử lớn hơn 67 kD. Đồng thời,
để làm rõ hơn tính chất của các proteinase trong 7 băng trên, chúng
tôi tiếp tục khảo sát ảnh hởng của pH , các chất kìm hãm đặc hiệu
(I) và một số ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ chúng. Kết quả cho
thấy tất cả các PA đều đợc hoạt hóa bởi Ca
2+
và bị kìm hãm bởi Zn
2+

và Cu
2+
. EDTA chỉ kìm hãm nhẹ PA-5 và PA-6, STI đậu tơng kìm
hãm PA-6. PA-2 là một proteinase kiềm (hoạt động mạnh ở pH 9),
các PA còn lại là những proteinase trung tính.

Hình 3.28: ảnh hởng của pH
đến hoạt độ của các băng PA
trên gel SDS-PAGE
(a. pH 3,0; b. pH 7,4; c. pH 9)
Hình 3.27: Phổ điện di PA của chế

phẩm ESG
(a. Các băng protein chuẩn;
b. Các băng PA của ESG)
94 kD
67 kD
43 kD
30 kD
20,1 kD
14,4 kD
1
2
3
4
5
a b
b
6
7
a b c

17

3.4. Kết quả nghiên cứu ứng dụng :
3.4.1. ứng dụng chế phẩm ETC trong sản xuất chitin:
- Nhiệt độ thích hợp để loại bỏ protein từ PLT bằng ETC là 50
0
C
(Hình 3.32).

0,297
0,328
0,331
0,413
0,259
0,369
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
40 50 60
20
60



-Kết quả khảo sát ảnh hởng đồng thời thời gian xử lý và nồng
độ enzyme đến quá trình loại bỏ protein từ PLT cho thấy với thời gian

xử lý từ 4 đến 6 giờ nồng độ của tyrosine tăng mạnh. Khi xử lý đợc
Nồng độ tyrosin(mol/ml)
Nhiệt độ(
0
C)
Hình 3.32: ảnh hởng của nhiệt độ xử lý đến khả năng loại bỏ
protein từ phế liệu tôm
Thời gian
(phút)
Hình 3.31: ảnh hởng của các ion
kim loại đến hoạt độ của enzyme (nồng độ
ion kim loại trong dung dịch là 10
-3

(a. Đối chứng; b. Ca
2+
; c. Cu
2+
; d. Zn
2+
)
a b c d
Hình 3.30: ảnh hởng của các chất kìm hãm
đến hoạt độ của các băng PA trên SDS-PAGE
(a. EDTA; b. STI đậu nành; c. Đối chứng pH 7,6;
d. PCMB; e.1,10-Phenanthronine)
5
a b c d e

18
5 giờ, nồng độ tyrosine ở tất cả các nồng độ enzyme đều cao hơn so
với các mức thời gian khác. Để tìm đợc thông số phù hợp với yêu
cầu công nghệ, chúng tôi tiếp tục thực hiện tối u hóa thực nghiệm
trong khoảng thời gian từ 4 giờ đến 6 giờ và khoảng nồng độ enzyme
từ 0,024 HP/g đến 0,041 HP/g.
-Chọn phơng án quy hoạch quay cấp 2 cấu trúc có tâm, chúng
tôi nhận đợc phơng trình hồi quy có dạng:
Y= 0,806774+ 0,040548X
1
+ 0,034797X
2
-0,00483X
1
2
-0,01455X
2
2

Sử dụng chơng trình Excel-solver để giải tìm nghiệm tối u
của phơng trình trên, sau đó tiến hành làm thí nghiệm để kiểm tra và
đánh giá kết quả thu đợc cho thấy điều kiện thích hợp để tiến hành
loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm là: Nồng độ enzyme:
0,044 HP/g;thời gian thủy phân: 6,2 giờ; nhiệt độ thủy phân 50
0
C.
áp dụng các thông số trên vào quy trình sản xuất chitin để loại
bỏ protein từ PLT chúng tôi thu đợc sản phẩm với các chỉ tiêu đã
đợc phân tích (Bảng 3.22).
3.4.2. Nghiên cứu sản xuất chitin bằng cách nuôi cấy trực tiếp vi

khuẩn B. subtilis để loại protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu
tôm (PLT)
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nghiên cứu loại bỏ protein ra
khỏi PLT bởi vi khuẩn trong sản xuất chitin qua hai giai đoạn:
- Giai đoạn nuôi cấy nhân giống sản xuất tạo canh trờng thích
hợp.
- Giai đoạn loại bỏ protein bởi vi khuẩn bằng cách nuôi cấy
hỗn hợp gồm canh trờng thu đợc với PLT.
3.4.2.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống sản xuất:
*Nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho
quá trình nhân giống sản xuất:
+ Nghiên cứu tìm thành phần môi trờng với mục đích giúp vi
khuẩn thích nghi dần với môi trờng thử nghiệm sản xuất và tạo PA
cao trong canh trờng.
- Từ MTTƯCB, nguồn tinh bột và một phần protein đợc thay
thế bởi các nguồn dinh dỡng tự nhiên. Trong đó, bột sắn và bột PLT
là nguồn tự nhiên đợc chọn để thay thế vừa có ý nghĩa kinh tế và ý
nghĩa khoa học. Môi trờng mới đợc chọn gọi là môi trờng tự

19
nhiên (MTTN) có thành phần nh sau: 0,5% pepton; 0,15% cao thịt;
0,1% cao nấm; 0,5% NaCl; 5,5% bột sắn và 1,3% bột PLT.
+ Khảo sát tìm điều kiện nhiệt độ và pH ban đầu của môi
trờng nuôi cấy thích hợp
- Vi khuẩn B. subtilis đợc nuôi cấy trong MTTN tạo PA cao
nhất ở pH 10 và nhiệt độ 35
0
C .
* Xác định thời gian nhân giống sản xuất:
Quá trình nhân giống sản xuất kết thúc khi canh trờng thu

đợc có PA cao. Vì vậy, chúng tôi tiến hành theo dõi sự thay đổi của
PA tại các thời điểm khác nhau.
Kết quả cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy, giá trị PA tăng lên một
cách nhanh chóng (0,555 HP/ml), gấp 6,38 lần so với thời điểm 16
giờ (0,087 HP/ml). Nh vậy, có thể kết thúc quá trình nhân giống sản
xuất sau 24 giờ nuôi cấy. PA tiếp tục tăng lên khi kéo dài thời gian
nhân giống sau 24 giờ có thể có tác dụng tăng cờng khả năng loại bỏ
protein khỏi PLT đồng thời bù đắp phần enzyme bị bất hoạt trong
suốt quá trình sản xuất.
3.4.2.2. Xác định thời điểm kết thúc quá trình loại bỏ protein từ phế
liệu tôm bởi vi khuẩn B. subtilis:
Kết thúc quá trình nhân giống sản xuất, canh trờng thu đợc
phối trộn với PLT đã đợc vô trùng (20ml canh trờng + 20g PLT +
160ml nớc) và nuôi cấy để khảo sát thời gian thủy phân thích hợp
nhất bằng cách lấy mẫu ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Tiến
hành lọc và rửa để thu hồi phần PLT đã đợc loại bỏ protein, sấy khô
và xác định hàm lợng protein còn lại bằng phơng pháp Kjeldahl.
100
12,99
11,86
11,29
11,25
0
20
40
60
80
100
0 24487296

Phần trăm protein còn lại so
với ban đầu (%)
Thời
g
ian xử l
ý
(
g
iờ)
Hình 3.40: Kết quả khảo sát quá trình loại bỏ protein từ phế liệu
tôm bởi vi khuẩn B. subtilis


20
Kết quả cho thấy rằng, sau khi xử lý 24 giờ, phần trăm protein
còn lại trong PLT so với mẫu cha xử lý giảm hẳn.
Nh vậy, quá trình xử lý PLT để loại bỏ protein ra khỏi phần chitin
có thể kết thúc sau 24 giờ
3.4.2.3. Thử nghiệm sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng sử dụng
vi khuẩn B. subtilis ở công đoạn loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ:
Từ các kết quả khảo sát điều kiện môi trờng, pH ban đầu,
nhiệt độ nuôi cấy và thời gian loại bỏ protein của vi khuẩn, chúng tôi
đã thử nghiệm sản xuất chitin bằng cách nuôi cấy trực tiếp B. subtilis
theo các thông số đã khảo sát ở trên. Sản phẩm chitin đợc phân tích
các chỉ tiêu chất lợng thể hiện trên bảng 3.22. Theo kết quả phân
tích (Bảng 3.22) cho thấy rằng, các mẫu chitin đợc sản xuất có xử lý
bằng phơng pháp sinh học có chỉ tiêu cảm quan giống nh trờng
hợp xử lý hóa học. Các chỉ tiêu hóa học của các mẫu xử lý sinh học
có cao hơn chút ít. Theo nhận xét của trờng Đại học thuỷ sản Nha

Trang, các mẫu chitin này có thể đợc xử lý hoá học sơ bộ để sử dụng
sản xuất chitosan.
Bảng 3.22: Bảng kết quả phân tích một số chỉ tiêu của chitin
Các chỉ tiêu
Hoá học Cảm quan
Mẫu chitin
Hàm lợng
protein
(%)
Hàm lợng
khoáng
(%)
Độ
ẩm
(%)
Màu
sắc
Trạng thái
Chi phí
loại bỏ
protein
(đồng/kg
PLT khô)
Đợc xử lý
bằng hoá chất
0,90 0,70 12,0 Sáng
bóng
Dạng vẩy,
độ dai cao
8000

Đợc xử lý bởi
ETC
1,20 1,10 12,5 Sáng
bóng
Dạng vẩy,
độ dai cao
14775
Đợc xử lý bởi
B.subtilis
1,05 0,92 12,5 Sáng
bóng
Dạng vẩy,
độ dai cao
6500
3.4.3. ứng dụng chế phẩm ETC vào việc sản xuất nớc chấm từ
đậu nành theo phơng pháp truyền thống:
Quá trình nghiên cứu thủy phân protein đậu nành trong quy
trình sản xuất nớc chấm theo phơng pháp truyền thống đợc tiến
hành theo hai giai đoạn (thủy phân bằng enzyme và thủy phân bằng
acid) nh sau: Sử dụng chế phẩm ETC để thủy phân sơ bộ protein
trong bột đậu nành theo tỉ lệ enzyme : bột đậu nành : nớc =
365 HP : 1 kg : 12 lít, giữ 50
0
C trong 6 giờ. Ly tâm tách dịch,

21
bã tiếp tục đợc ngâm trong dung dịch HCl 15% theo tỉ lệ 1 :
1(w : v) trong 2 giờ, thủy phân tiếp 6 giờ ở 90
0
C. Nớc chấm

thu đợc đạt TCVN : 1763-75 (Bảng 3.25). So với quy trình
truyền thống, phơng pháp này đã rút ngắn thời gian sản xuất 6
lần và giảm lợng HCl 2 lần.
Bảng 3.25: Kết quả phân tích chỉ tiêu chất lợng của nớc chấm sản
xuất theo phơng pháp kết hợp enzyme - acid
Kết quả
Yêu cầu kỹ thuật
TCVN: 1763-75
Tên chỉ tiêu
M1 M2
Đặc biệt
Loại
I
Loại
II
Hàm lợng Nitơ toàn phần
(g/l)
16,15 14,72
20 16 12
Hàm lợng Nitơ amoniac
(g/l)
0,11 1,55
3 2,5 2
Hàm lợng muối NaCl 177,84 192,87 230-250
Hàm lợng acid tính theo
ml mẫu/ml NaOH 0,1N
1,25 2,08 1,8 1,6 1,3
Hàm lợng Nitơ foocmon
(g/l)
15,05 18,81 >10 >8 >6

Hàm lợng kim loại nặng

TCVN:867-1998 của Bộ Y tế
Hàm lợng Cd (mg/l) 13,5.10
-3
Không
phát hiện
1
Hàm lợng Pb (mg/l) 9,79.10
-3
14,19.10
-3
2
Giá thành (đồng/l) 2500
*
6000
M1: Mẫu nớc chấm sản xuất bằng phơng pháp kết hợp enzyme - acid,
M2: Mẫu nớc chấm sản xuất bằng phơng pháp acid đợc bán trên
thị trờng
*: Giá thành của mẫu M1 chỉ đợc tính trên chi phí nguyên liệu,
enzyme và acid.

22
Kết luận v kiến nghị

1. Kết luận:
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết
luận nh sau:
1) Phân lập và tuyển chọn đợc một chủng vi khuẩn có PA
trong môi trờng nuôi cao hơn hẳn PA của 4 đối tợng thực vật đã

nghiên cứu. Kết quả định tên ở phòng thí nghiệm vi sinh vật môi
trờng và thực phẩm Universite Catholique de Louvain Bỉ đã xác định
là Bacillus subtilis.
2) Đã thiết lập đợc quy trình nuôi Bacillus subtilis đạt PA cao
nhất trong môi trờng lỏng có 1% pepton, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl,
0,1% cao nấm, 1,75% tinh bột hòa tan với pH ban đầu bằng 6, ở nhiệt
độ 35
0
C, trong thời gian 24 giờ trên máy lắc 220 vòng/phút.
3) Tinh chế sơ bộ các proteinase ngoại bào của Bacillus subtilis
bằng cách kết tủa với ethanol (ETC) (nồng độ cuối cùng 64% thể
tích), pH 7, sắc ký qua cột Sephadex G-100 (ESG) (đệm Tris HCl
pH 7,4) làm tăng hoạt độ riêng lên 89,15 lần, đạt hiệu suất 79,46%.
4) PA tổng số của dịch môi trờng nuôi đã tách tế bào
(MTNC) cũng nh ETC, ESG cao nhất trong khoảng pH 6-8,5, nhiệt
độ 50ữ60
0
C.
5) Độ bền nhiệt ở 60
0
C (pH 7,4) của MTNC và ETC đều tăng
lên khi có mặt Ca
2+
; t
1/2
ở 60
0
C của MTNC và ETC theo thứ tự là
16,98 phút và 5,99 phút; khi có Ca
2+

t
1/2
tăng lên rõ rệt 40,65 phút
(MTNC) và 28,31 phút (ETC).
6) Sử dụng điện di trên SDS - PAGE có cơ chất casein đã phát
hiện đợc ít nhất 6 băng PA (PA-1, PA-2, PA-3, PA-4, PA-5 và PA-
6) có khối lợng phân tử tơng ứng là: 20 kD (PA-1) , 30kD (PA- 2),
~ 43 kD (PA-3 và PA-4), ~ 67 kD (PA-5 và PA-6) và một vùng sáng
PA có khối lợng phân tử lớn hơn 67 kD.