Cơ chế phân tử của sao chép DNA docx

Cơ chế phân tử của sao chép DNA
1. Nguyên tắc chung

- DNA sao chép theo khuôn.

Ưu điểm:
+ Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính xác hơn
+ Tiết kiệm được ezyme

+ Đạt hiệu quả nhanh

- Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử DNA
mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới tổng hợp

- Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer)

- Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5' - 3'.



2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA

Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong quá trình
tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid
triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít
DNA làm khuôn mẫu.

3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn

Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn. Nuôi
E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N15. Như

vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình
thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu
các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết tách
DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại
DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra.


Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một lần phân
chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N15

và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới
chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số
phân tử DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng
định giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra,
mỗi cái làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung.

4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli

Quá trình sao chép DNA ở E.Coli diễn ra qua hai giai đoạn:

4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation)

+ Mở xoắn:

Ở E.coliquá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự
sao chép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt đó. Tiếp
theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn ở
2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển động
ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase tham gia
tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP làm đứt

các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau.

+ Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein) gắn
vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho
chập lại hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng.

+ Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá trình kéo dài chuỗi là

DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi

thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể
là DNA hoặc ARN.

4.2. Giai đoạn nối dài (elongation)

Do tính chất đối song song nên khi tách ra thành 2 mạch đơn khuôn thì một
mạch có đầu 3’, mạch kia có đầu 5’ nên để đảm bảo hướng sao chép của
DNA theo chiều 5’ -3’ thì sự polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA diễn
ra khác nhau.

Mạch khuôn có đầu 3’ được DNA polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay
mạch bổ sung 5’-3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này được gọi là
mạch khuôn trước, còn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước (leading
strand).

Ở mạch có đầu 5’ (mạch khuôn sau) việc tổng hợp phức tạp hơn và thực hiện
từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5’-3’. Khi mạch
kép tách ra ở gần chẻ ba sao chép , enzyme primase gắn mồi
(primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình tự bổ sung với mạch
khuôn. DNA-polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ

ba sao chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các đoạn
Okazaki (người phát hiện là Reiji Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn
Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục
tổng hợp từ ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba sao chép.
Tiếp theo DNA-polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ
mồi ARN, lắp các nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện
polymer hóa hướng 5’-3’. Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2
đầu, chỗ hở được nối nhờ enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ
chẻ ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau
(lagging strand).

Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến
50.000 nucleotid/phút.