Nghiên cứu sản xuất artemisinin bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thanh hao (artemisinin bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thanh hao (artemisinin annua l ) và phát triển trên quy mô pilot (giai đoạn 2007 2008)

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
MALAYSIA – VIỆT NAM






ĐỀ TÀI THỰC HIỆN NGHỊ ĐỊNH THƯ





NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ARTEMISININ
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO THANH HAO
(ARTEMISIA ANNUA L.) VÀ PHÁT TRIỂN TRÊN QUY MÔ
PILOT (GIAI ĐỌAN 2007-2008)






Cơ quan chủ quản
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Cơ quan chủ trì
VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS. TRẦN VĂN MINH






8145


Tp. Hồ Chí Minh 8-2009

1
MỤC LỤC

Bìa
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt ii
Danh sách bảng iii
Danh sách hình iv
Danh sách đồ thị v
Nhiệm vụ nghị định thư 1
Sản phẩm khoa học công nghệ 2
Đào tạo 3
Bài báo 4
Tóm tắt 5
Tổng quan tài liệu 8
Kết quả nghiên cứu 36
I. Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng và in vitro 37

1. Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng 38
2. Chọn dòng thanh hao in vitro 41
II. Nuôi cấy tế bào thanh hao 48
3. Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo thanh hao trên môi
trường bán rắn (agar)
50
4. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong môi
trường lỏng
58
5. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong
bioreactor
63
III. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao 74
6. Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ 77
7. Nuôi cấy chuyển nạp gen rễ tơ vào mô lá thanh hao 80
8. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trên môi trường bán rắn
(agar)
82
9. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong môi trường lỏng 89
10. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong bioreactor 96
IV. Phương pháp phân tích và tinh chế artemisinin 102
11. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký l
ỏng
cao áp (HPLC)
103
12. Phương pháp chiết suất và tinh chế artemisinin 110
Kết luận và Đề nghị 118
Tài liệu tham khảo 119
Phụ lục

5
TÓM TẮT

1. Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng
Trong điều kiện nhiệt đới (TPHCM), trồng thử nghiệm vào tháng
2/1-20/4/2008 (ngày ngắn), đã chọn được hai dòng TC1.8 và TC2.1 có hàm
lượng artemisinin tương ứng là 0,448% và 0,408%. Trong điều kiện vùng
cao (Đà Lạt), trồng thử nghiệm vào tháng 20/1-30/6/2009 (ngày ngắn), đã
chọn lọc được hai dòng TC1.136 và TC2.29 có hàm lượng artemisinin
tương ứng 1,470% và 1,297%.
2. Chọn dòng thanh hao in vitro
Môi trường khoáng LV thích hợp cho quá trình chọn dòng in vitro.
Hai dòng Thanh hao TC1.8 và TC2.1 thể hiện bản chất di truyền thấp cây
so với cây mẹ trên vườn ươm. Phương pháp chọn dòng in vitro đáp ứng
được yêu cầu chọn dòng nhanh hao trong điều kiện nhiệt đới. Hai dòng
Thanh hao chọn lọc thể hiện được khả năng nhân giống, tạo mô sẹo và tái
sinh mô sẹo in vitro trên cùng điều kiện môi trường nuôi cấy.
3. Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo thanh hao trên môi
trường bán rắn (agar)
Thân lá rễ được sử dụng làm mẫu nuôi cấy phát sinh mô sẹo. Môi
trường nuôi cấy thích hợp phát sinh và tăng sinh mô sẹo: LV + BA
(0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l). Môi trường thích hợp cho tái sinh mô sẹo là
LV + BA (3mg/l) + NAA (0,2mg/l). Mô sẹo có màu trắng khi để trong tối
và có màu xanh khi để dưới ánh sáng.
4. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong môi
trường lỏng
Kết quả nghiên cứu trên agar và môi trường lỏng tương thích nhau.
Môi trường thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù là LV và B5.
Môi trường dinh dưỡng khoáng B5 thích hợp cho tổ hợp NAA+kinetin: B5

+ NAA (1mg/l) + kinetin (0,5mg/l). Môi trường dinh dưỡng khoáng LV

6
thích hợp cho tổ hợp BA+NAA: môi trường thích hợp cho tăng sinh mô
sẹo và tăng sinh dịch huyền phù tế bào là LV + BA (0,5mg/l) + NAA
(0,5mg/l) + pepton (1g/l). Thời gian cấy truyền thích hợp là sau 3 tuần nuôi
cấy có tốc độ tăng sinh tế bào cao nhất (17,2).
5. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong bioreactor
Kết quả nghiên cứu cho thấy trên môi trường nuôi cấy phát sinh mô
sẹo phôi hóa, là dạng tế bào tiền phôi được nhân sinh khối, có khả năng
tổng hợp được artemisinin LV + NAA (0,5mg/l) + BA (0,5mg/l) cần phải
điều chỉnh hàm lượng các chất khoáng và bổ sung như: đường sucrose
(30g/l), đạm tổng số (40mM), tỷ lệ giữa NH
4
+
/NO
3
-
(15/60), nồng độ
KH
2
PO
4
(200mg/l), GA
3
(1mg/l), yeast extract (100mg/l) hay chitosan
(150mg/l) đã cải thiện khả năng tích tụ artemisinin trong tế bào 0,432%
6. Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ
Môi trường khoáng B5 thích hợp cho quá trình nuôi cấy phát sinh rễ.
Sự phát sinh rễ mạnh mẽ với mẫu nuôi cấy là lá và nồng độ NAA

(0,5mg/l). Cytokinin (BA, kinetin) và IAA, IBA không thích hợp cho quá
trình phát sinh rễ.

7. Nuôi cấy chuyển nạp gen tạo rễ tơ vào mô lá thanh hao
Lá từ chồi thực sinh in vitro được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy
chuyển gen. Phương pháp dùng agrobacterium tỏ ra hiệu quả. Đã thu nhận
được mô lá chuyển gen đã loại hẳn agrobacterium. Rễ tơ hình thành mạnh
mẽ trên môi trường MS không chất sinh trưởng và được sử dụng làm
nguyên liệu cho các nghiên cứu về sau.
8. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trên môi trường bán rắn (agar)
Cytokinin không kích thích tăng sinh rễ nhưng 2iP kích thích tích tụ
artemisinin. Auxin kích thích tăng sinh rễ nhưng không kích thích tích tụ
artemisinin. Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vào ngày thứ 14 sau cấy có
ý nghĩa kích thích tăng sinh rễ và tích tụ artemisinin với tổ hợp TH1 [B5+
GA
3
(0,01mg/l) + ABA (0,1mg/l) + NAA (5mg/l)]

7
9. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong môi trường lỏng
Môi trường MS cải tiến có đạm nitrate (30mM), tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
-

(1/5), đường sucrose 50g/l, KH
2
PO

4
(1,5mM), GA
3
(5mg/l), NAA
(0,5mg/l) cải thiện khả năng tích tụ artemisinin (1,468%).
10. Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong bioreactor
Môi trường MS cải tiến, 26+2
o
C, 16 giờ chiếu sáng /ngày, pH=6 đã
cải thiện khả năng tích tụ artemisinin (1,982%) kết hợp với bioreactor bán
chìm nổi theo chế độ ngập/nổi (15/45) đã nâng cao hiệu quả tích tụ
artemisinin rõ rệt (2,088%). Yeast extract và chitosan kích thích tích tụ
artemisinin có hiệu quả.
11. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký lỏng cao
áp (HPLC)
Đã xây dựng được phương pháp phân tích và điều chế artemisinin từ
mẫu cây Thanh hao cấy mô, mô sẹo soma, mô sẹo phôi hóa, dịch huyền
phù tế bào (nuôi cấy trên máy lắc và bioreactor), rễ (nuôi cấy trên máy lắc
và bioreactor).


8
TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1. Muỗi truyền bệnh sốt rét
Có khoảng 2.500 loài muỗi nhưng chỉ có các loài Anophele mới
truyền ký sinh trùng sốt rét Plasmodium cho loài hầu, khỉ, người (primate)
và các động vật có vú. Có hơn 60 loài, trong khoảng 400 loài Anophele đã
biết, là vector chính truyền Plasmodium ; các loài khác coi như vector phụ
tùy địa phương.

Vòng đời: Trứng muỗi nổi từng chiếc trên mặt nước, hình thon dài
khoảng 1mm, có hai phao hai bên, nở sau 2–3 ngày thành bọ gậy. Bọ gậy
ăn các hạt hữ
u cơ nhỏ. Ở vùng nhiệt đới, từ khi trứng nở tới muỗi trưởng
thành khoảng 11 – 13 ngày.
Tập tính: Muỗi Anophele hoạt động từ khi mặt trời lặn đến khi mặt
trời mọc. Mỗi loài khác nhau về giờ đốt mồi cao điểm và địa điểm đốt mồi
(trong nhà hay ngoài nhà). Muỗi thường nghỉ trong suốt thời gian cần thiết
để tiêu máu và phát triển trứng ngay trong nhà hay ở các b
ụi cây Chúng
thường đẻ trứng ở các vũng, rãnh, ruộng nước, nơi nước lặng trong suối
nước chảy chậm
Các loài Anophele khác nhau về mức độ thích đốt người hay đốt súc
vật. Một số loài đốt cả người và súc vật; một số chủ yếu đốt súc vật, số
khác chỉ đốt người. Các loài đốt người là những loài truyền sốt rét nguy
hiểm nhất.
Những
điểm phân biệt muỗi Anophele với các loài muỗi khác
• Chiều dài của pan bằng chiều dài của vòi.
• Ở tư thế nghỉ, vòi và thân muỗi thường hợp thành với mặt
phẳng muỗi đậu một góc nhọn. Góc này thay đổi tùy loài, từ nhọn đến gần
90
0
. Ngoại trừ loài Anophele culicifacies, thân hầu như song song với mặt
bằng muỗi đậu. (www.bio.ioit-hcm.ac.vn)
Bệnh có những triệu chứng nguy hiểm, người bệnh có thể chết 12
giờ sau khi có biểu hiện triệu chứng. Biểu hiện lâm sàng của bệnh với 3

9
dấu hiệu: sốt rét run vã mồ hôi, thiếu máu, gan to, lách to. Có nhiều thể lâm

sàng: sốt cách nhật do P. vivax (hay P. ovale ở Châu Phi), có thể tái phát
sau khi rời khỏi vùng dịch; sốt cách nhật ác tính do P. falciparum, không
tái phát khi rời vùng dịch; sốt cách hai ngày do P. malariae, có thể tái phát
sau khi rời vùng dịch. Sốt rét do P. falciparum thường có nhiều biến chứng
nặng: sốt rét ác tính, sốt nôn ra mật, đái ra hemoglobin gây tử vong cao.
Cơ thể những người bị bệnh sốt rét nhiều lầ
n sẽ xuầt hiện hệ thống
miễn dịch lại vi khuẩn. Tuy nhiên, hệ thống này chỉ tồn tại trong một hay
hai năm sau khi nhiễm bệnh. Vì thế, người ta không thể miễn dịch được với
vi khuẩn sốt rét dù đã nhiều lần bị bệnh. Hiện chúng ta vẫn chưa có vaccin
phòng ngừa bệnh. (
)
Ở Việt Nam đã xác định có hơn 60 loài Anophele. Các loại muỗi
Anophele minimus, A. dirus, và A. sundaicus mang hai ký sinh trùng sốt rét,
P. falciparum và P. vivax. Các loại muỗi này cũng có nhiều ở Ðông Nam
Á. Ký sinh trùng P. vivax xuất hiện giới hạn trong khu vực đồng bằng sông
Cửu Long, trong khi P. falciparum thường có ở các vùng núi và cao
nguyên như Tây nguyên, Hoàng Liên Sơn, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tĩnh
là các nơi đã xảy ra nhiều dịch sốt rét trong thập niên 1980 đến đầu những
n
ăm 1990. Một số loài muỗi khác được nghi ngờ truyền gây sốt rét ở Việt
Nam là A. campestris, A. culicifacies, A. lesteri.
2. Bệnh sốt rét và những nghiên cứu về bệnh sốt rét
Cách đây trên 10.000 năm, bệnh sốt rét đã có ở Châu Phi. Cách đây
khoảng 5.000 – 10.000 năm, bệnh có ở Mesopotamia, bán đảo Ấn Độ và
Đông Nam Á. Từ thế kỷ 19, bệnh sốt rét có mặt trên khắp thế giới. Đến đầu
thế kỷ 20, hàng tri
ệu người trên khắp thế giới đã chết vì loại bệnh này. Tuy
nhiên, vào những năm đầu thập niên 1950, bệnh sốt rét hầu như đã biến
mất khỏi Bắc Mỹ và Châu Âu, nạn nhân sốt rét hiện nay chủ yếu là ở Châu

Phi. (www.malariasite.com)
Năm 1880, thầy thuốc người Pháp là Alphonce Laveran (1845–1922)
đã phát hiện ra vi trùng gây bệnh sốt rét (giải Nobel Năm 1907) – căn bệnh

10
làm chết người ở các nước nhiệt đới và Á nhiệt đới nhiều hơn bất kỳ bệnh
nào khác.
Năm 1897, Ronald Ross (1857 – 1932), bác sĩ người Anh nghiên cứu
về côn trùng học khi nghiên cứu muỗi truyền bệnh sốt rét, đã phát hiện ra
ký sinh trùng bệnh này trong muỗi Anophele. Năm 1902, ông đã được trao
giải Nobel về thành tựu này.
Sốt rét do ký sinh trùng sốt rét thuộc giống Plasmodium gây nên. Ở
người, do 4 loài Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae và P. ovale.
Trong đó,
P. falciparum là loại gây sốt rét ác tính, có tỉ lệ tử vong cao, nhất
là ở trẻ em ; P. vivax và P. ovale gây sốt cách nhật lành tính. Đôi khi, P.
vivax cũng gây sốt rét ác tính.
Plasmodium có thể sống quanh năm trong cơ thể muỗi. Tuy nhiên,
các quần thể muỗi Anophele lại phát triển theo mùa (phụ thuộc nhiệt độ và
lượng mưa) nên sốt rét có 2 điểm cao vào đầu và cuối hoặc trong suốt mùa
mưa. Bệnh lây truyền ở n
ơi có nhiệt độ trung bình trên 14,5
o
C. Nước ta
thuộc vùng nhiệt đới, nhiệt độ trung bình cao hơn nhiệt độ trên, do vậy
bệnh lan truyền quanh năm. Do nhiệt độ và lượng mưa dao động theo chu
kỳ mùa (mùa mưa và mùa khô) nên bệnh cũng phát triển không đều hằng
tháng mà thường có 2 đỉnh cao trong năm, đỉnh đầu năm (tháng 4 đến
tháng 6), đặc biệt đỉnh cuối năm vào mùa mưa: từ tháng 8 đến tháng 11.

Hình 1: Ký sinh trùng Plasmodium falciparum xâm nhập vào tế bào hồng cầu


11
Nhiệt độ tốt nhất để ký sinh trùng sốt rét phát triển trong cơ thể muỗi
là từ khoảng 28–30
o
C. Nếu nhiệt độ trung bình là 28
o
C thì P. falciparum
cần hơn 9 ngày, P.vivax chỉ cần hơn 7 ngày; nếu nhiệt độ trung bình là
30
o
C thì P. falciparum cần hơn 8 ngày, P. vivax cần hơn 6 ngày để hoàn
thành giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi từ thể giao bào (gametocytes)
ở dạ dày đến thể thoa trùng (sporozoites) ở tuyến nước bọt và có khả năng
truyền bệnh. Muỗi đốt máu người và truyền ký sinh trùng sốt rét sang cho
người lành để gây bệnh. (Theo Sức Khỏe & Đời Sống:

).


Hình 2: Chu trình của bệnh sốt rét ()

Hình 3: Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum phá vỡ hồng cầu


12
Bệnh sốt rét đã trở thành vấn đề toàn cầu, là căn bệnh thường thấy ở

105 quốc gia, phổ biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và
Nam Mỹ. Hàng năm, có 300 – 500 triệu người trên khắp thế giới bị nhiễm
bệnh và hơn một triệu người chết vì loại bệnh này. Tình trạng mắc bệnh và
tử vong, đặc biệt là ở trẻ em và thai phụ do sốt rét gây nên đang ở
báo động
mạnh. Du khách và dân nhập cư mang bệnh sốt rét là một trong những
nguyên nhân khiến bệnh sốt rét lan truyền khắp thế giới.
Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (thống
kê năm 2003), nghĩa là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này.
Hai loại muỗi A. gambiae và A. funesus được xem là “vô địch” trong lĩnh
vực truyền bệnh cho người tại đây. Bệnh gây thiệt h
ại khoảng 12 tỷ
USD/năm cho châu Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng
đồng. (Thanh Vân - theo Eurekalert).



Hình 4: Bản đồ tình trạng bệnh sốt rét trên thế giới
Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới. Khoảng
60 năm trước, mỗi năm nước ta có gần 1 triệu người mắc bệnh, chiếm 5%
dân số (Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20%. Chương trình Thanh toán sốt
rét được tiến hành từ năm 1960 nhưng hiện vẫn có khoảng 45 triệu dân ta

13
sống trong vùng lưu hành sốt rét. Các vùng này chiếm 3/4 diện tích cả nước
gồm vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền
Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải.
(
Liệu pháp chữa trị và kiểm soát bệnh sốt rét đang trở nên khó khăn
hơn do chiều hướng kháng thuốc của ký sinh trùng và chiều hướng kháng

thuốc diệt côn trùng của muỗi đang gia tăng. Mặc dù vậy, chỉ có 4 trong số
khoảng 1.400 loạ
i thuốc mới, được phát triển trong giai đoạn từ 1975 đến
1999 là để chống sốt rét. Vì thế, hiện nay sốt rét vẫn là một căn bệnh khó
tiêu diệt. Các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra một
loại thuốc mới điều trị sốt rét hiệu quả hơn.
Theo báo cáo của Viện Y học (IOM), bệnh sốt rét đang tái phát ở
mức độ cao, từ đó nhấn mạ
nh đến việc cần thiết phải bổ sung nguồn thuốc
cấp bách với giá thành rẻ hơn nhưng có thể thay thế các thuốc trị sốt rét cũ
đã bị đề kháng.


Hình 5: Bệnh nhân bệnh sốt rét ở Ethiopia

3. Tình hình nghiên cứu chống bệnh sốt rét
Trong hai thập niên 1950 – 1960, chiến dịch tiêu diệt muỗi và bệnh
sốt rét, chủ yếu dùng thuốc DDT diệt muỗi (dichloro diphenyl trichloro
ethane) và thuốc chống sốt rét chloroquinine, đã được thực hiện ở nhiều nơi
trên thế giới với sự trợ giúp của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).
Hơn 100 năm từ khi muỗi Anophele và ký sinh trùng Plasmodium
falciparum được biết đến, con người v
ẫn chưa tận diệt được các loại

14
Anophele hay trị được ký sinh trùng trong mọi trạng thái của chu kỳ sống
của nó trên người bệnh và trên vector muỗi.
Năm 1998, với sự hợp tác của Ngân hàng Thế Giới (WB), Quĩ Liên
hiệp quốc vì trẻ em (UNICEF) và Chương trình Vì sự phát triển của Liên
hiệp quốc (UNDP), WHO đã ra chương trình "Ðẩy lùi sốt sét" (RBM-Roll

Back Malaria) để đẩy mạnh nghiên cứu, hy vọng đẩy lùi được bệnh sốt rét
với mục tiêu giảm nửa số t
ử vong cho đến năm 2010. Cũng trong năm
1998, Chương trình tìm thuốc chống sốt rét (MMV-Medicines for Malaria
Venture) được thành lập tại Geneva, nhằm gây quỹ để khám phá và phát
triển được ít nhất một loại thuốc mới trị sốt rét mỗi 5 năm. Hiện MMV có 7
chương trình nghiên cứu thử nghiệm các loại thuốc mới. Ở Hoa Kỳ, năm
1999, Chương trình chế tạo thuốc chủng ngừa sốt rét (MVI-Malaria
Vaccine Initiative) được thành lập.
Tuy nhiên, với s
ự xuất hiện của muỗi kháng DDT và của ký sinh
trùng P. falciparum kháng chloroquinine bắt đầu từ Đông Nam Á và Nam
Mỹ sau đó lan ra các vùng khác, sự hữu hiệu của giải pháp trên đã giảm đi.
Hiện nay, trong 4 ký sinh trùng gây bệnh, chloroquinine chỉ còn có tác
dụng hiệu quả duy nhất với P. ovale.
Tháng 10/2002, hai tạp chí khoa học Science và Nature đã công bố
toàn bộ bộ gen (geneomes) của ký sinh trùng P. falciparum (loại ký sinh
trùng nguy hại nhất trong 4 loại (P. falciparum, P. vivax, P. malariae và P.
ovale) và của muỗ
i Anophele gambiae, loại muỗi chủ yếu ở Phi châu mang
cả 4 loại ký sinh trùng trên.
Sử dụng bản đồ gen để so sánh phản ứng của các ký sinh trùng khi
tiếp xúc với các loại thuốc chống sốt rét khác nhau, các nhà khoa học đã
xác định được một vùng gen mới lạ có liên quan rất lớn đến việc kháng lại
thuốc chloroquine. So sánh các vùng gen của các loài ký sinh trùng từ các
châu lục khác nhau, thấy rằng các mẫu ký sinh trùng sốt rét P. falciparum ở
Châu Phi có sự biến đổ
i DNA lớn hơn rất nhiều so với những các mẫu ở
Châu Á và Châu Mỹ.

15

Hình 6: Bảng giải mã chromosome 3 của Plasmodium falciparum

Hiện nay, thuốc xịt muỗi DDT vẫn được dùng ở một số nơi, hạn chế
trong xó nhà chỗ muỗi hay trú ngụ. DDT tuy không còn hiệu quả như xưa,
nhưng nó vẫn giảm được tuổi thọ của muỗi kháng thuốc. Lý do chính mà
DDT không còn được dùng rộng rãi nơi công cộng và đã bị cấm ở nhiều
nước vì DDT là một chất ô nhiễm hữu cơ bền (POP-Persistent Organic
Pollutant), không dễ dàng bị huỷ.
Để
diệt ký sinh trùng sốt rét, thuốc phổ thông được dùng từ nhiều
năm nay là các thuốc có chất hoá học dựa vào hợp chất thiên nhiên như
chloroquinine, ta vẫn gọi là ký ninh, chế tạo từ vỏ cây quina-quina gốc ở
Nam Mỹ.
Thuốc trị ký sinh trùng sốt rét: tốt và hiệu nghiệm nhất hiện nay là
artemisinin lấy từ cây Thanh hao (quinghao) mà Trung Quốc đã tìm ra đầu
thập niên 1970, áp dụng thành công trong các thử nghiệm lâm sàng và hiện
được dùng rộng rãi. Artemisinin có tác dụng diệt nhanh chóng các ký sinh
trùng l
ưu thông trong máu và khi dùng chung với các thuốc chống sốt rét
khác cho kết quả rất tốt, làm giảm nhiều xác suất tái xuất hiện của các ký
sinh trùng kháng thuốc.
Tại Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng đã
dùng Thanh hao hoa vàng trị được bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm. Từ năm
1984, Việt Nam cũng đã dùng Thanh hao để trích ra các hợp chất

16
artemether, artemisinin và artesunate, nghiên cứu trị sốt rét thành công
trong thử nghiệm và thực tiễn trên bệnh nhân sốt rét. Trong chiến tranh, dù

không phổ biến, Thanh hao cũng đã được dùng để trị sốt rét.
Dùng muỗi biến đổi gen để chữa sốt rét: Triển vọng lớn nhất và cũng
gây nhiều chú ý, tranh luận nhất là dùng kỹ thuật di truyền để tạo ra giống
muỗi mới bằng cách biến đổi gen giống muỗi gây bệnh để
chúng không thể
gây bệnh. Giống muỗi biến đổi gen này được cho ra môi trường thiên nhiên
để chúng vượt trội, cạnh tranh tiêu diệt hay làm loãng mật độ giống muỗi
truyền bệnh qua kết hợp với giống truyền bệnh. Từ đó, các thế hệ sau của
chúng sẽ có gen khiến chúng không mang ký sinh trùng bệnh sốt rét.
Đầu năm 2002, các nhà nghiên cứu ở Đại học Cleveland (Ohio) đã
cấy thành công một gen mới vào bộ gen loại muỗi A. stephensi làm nó
kháng lại được ký sinh trùng sốt rét. WHO đã đặt chương trình nghiên cứu
và áp dụng các giống muỗi biến đổi gen là một trong những ưu tiên lớn
nhất để chống sốt rét.
Dùng vi nấm 'thuần hoá' muỗi truyền bệnh sốt rét: Tại Hội thảo về
Sốt rét châu Phi lần IV, các nhà khoa học đến từ Hà Lan, Tanzania và Anh
đã trình bày kết quả nghiên cứu về một loại vi nấm có thể sử dụng làm
công cụ ng
ăn chặn muỗi truyền ký sinh trùng sốt rét sang người.
Theo đó, có một loại vi nấm tại Đông Phi, khi lây nhiễm sang một số
loại côn trùng, gồm cả muỗi Anophele, có thể phát triển và làm vòng đời
của muỗi giảm đi 2/3. GS. Willem Takken, Đại học Wageneign Hà Lan,
nói: "Ngay sau khi một con muỗi bị nhiễm nấm, nó lập tức ngừng hành vi
hút máu Nó sẽ chỉ hút nước hay các loại nước quả chứ không hút máu.
Một điều n
ữa là khi muỗi đã bị nhiễm nấm, chúng không thể nào làm cho
ký sinh trùng sốt rét phát triển được".


17

Hình 7: Muỗi được biến đổi gen có mắt màu xanh lục sáng
Năm 1979, Trung Quốc đã tiến hành một cuộc thử nghiệm lâm sàng
dùng artemisinin trên 2.099 bệnh nhân sốt rét. Một kết quả không tưởng là
tất cả đều hết bệnh. Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét
với ký sinh trùng đã nhờn thuốc chloroquine và 141 bệnh sốt rét màng não
cũng cho kết quả khả quan. Nhiều thử nghiệm lâm sàng tiếp theo ở Trung
Quốc, Đông Nam Á đều cho các kết quả tương tự.
Ở Việt Nam, trong một thử nghiệ
m năm 1993 trên 638 bệnh nhân,
dùng thuốc uống artemisinin cho thấy: trong vòng 24 tiếng, 98% ký sinh
trùng sốt rét biến mất. Nhóm bệnh nhân dùng thuốc trong 5 ngày chỉ có
10% là ký sinh trùng xuất hiện lại. Artemisinin chống được cả P.
falciparum và P.vivax. Trong một thử nghiệm khác năm 1999, kết quả tốt
nhất là dùng artemisinin và sau đó dùng quinine trong 3-5 ngày sau.
Artemisinin là hoạt chất chính của cây Thanh hao hoa vàng. Khi cây
ra nụ, lá Thanh hao được thu hoạch có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn
dễ vụn nát, mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng. Đây là lúc lá có hàm l
ượng
artemisinin cao nhất, 1,6% trong lá khô (lá xanh chỉ có 0,6% artemisinin).
Lá Thanh hao được tán nhuyễn, xay thành bột để chiết xuất hoạt chất
artemisinin.
Ngày nay, artemisinin được coi là phòng tuyến hữu hiệu cuối cùng
trong kho vũ khí chống ký sinh trùng sốt rét
4. Thanh hao hoa vàng và artemisinin
Thanh hao hoa vàng ở Việt nam được thu hoạch để sản xuất thuốc
chống sốt rét và có khả năng kháng khuẩn, kháng sâu tự nhiên. Từ trước

18
đến nay, Thanh hao được sử dụng như loài dược thảo và hiện đang được

trồng phổ biến để sản xuất artemisinin sử dụng trong lâm sàng điều trị bệnh
sốt rét ác tính. Artemisinin có tác dụng chống lại sốt rét và ký sinh trùng sốt
rét, ký sinh trong cơ thể người. Hơn nữa, artemisinin còn có tác dụng đề
kháng lâu dài. Như chúng ta đã biết, trùng bào tử là những động vật ký sinh
liên tục ở những tế bào hoặc tổ
chức của ký chủ và trong chu trình có giai
đoạn biểu hiện dạng bào tử. Trùng bào tử dinh dưỡng bằng phương pháp
thẩm thấu, sinh sản theo hai kiểu vô tính và hữu tính. Plasmodium quan
trọng nhất vì nó gây bệnh sốt rét. Có 4 loài plasmodium chính sống ký sinh
ở người là: P. falciparum, P. vivax, P. malariee, P. ovale. Mặc dù P. vivax
là loài gây bệnh sốt rét phổ biến nhất nhưng loài P. falciparum là loài độc
nhất. Artemisinin là đối tượng cần nghiên cứu và sản xuất r
ộng rãi góp
phần phòng chống bệnh sốt rét ác tính.
Thanh hao là loài cây thân thảo mọc hàng năm, gốc hóa gỗ. Cây mọc
hoang thường cao 1,5-2m, chăm bón tốt có thể cao đến 3-5m. Toàn thân có
mùi thơm nhẹ, thân có rãnh, gần như không có lông. Lá mọc cách, có phiến
xoan, 2-3 lần kép thành đoạn hẹp nhọn, không lông, lá vàng rồi chết khô,
không rụng vì cuống lá rất dai. Cụm hoa hợp thành một chùy kép, chùy cao
ở ngọn mang chùm dài, hẹp; hoa đầu cao 1,8-2m; lá bắc ngoài hẹp, có lông
xanh; lá bắc giữa và lá bắc trong, xoan rộng; hoa toàn hình ống, khoảng 15
cái; hoa ngoài cái, hoa trong lưỡng tính, mỗi cành nhỏ có 3-7 cụm hoa, mỗi
cụm hoa có 25-35 hoa, trong đó có 20-25 hoa lưỡng tính ở giữa, hoa cái có
5-8 hoa ở xung quanh, kích thước hoa rất nhỏ, vỏ có rãnh dọc có các tuyến
tinh dầu (1gram quả khô có 20.000-22.000 hạt). Quả bế nhẵn, dài 0,5mm,
không có mao lông.
Thanh hao phân bố ở Nhật bản, Triều tiên, Trung Quốc, Ấn Độ và
Việt Nam. Ở nước ta thường gặp ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc
Giang.
Trong 15 loài thuộc chi artemisia ở Việt nam, có 4 loài rấ

t giống
nhau về ngoại hình là A. apiaceae, A. capillaris, A. campetris và A. annua.

19
Trong đó chỉ có A. annua có artemisinin và tinh dầu. Bộ phận dùng là lá
Thanh hao. Thu hoạch vào thời kỳ có nụ là lúc hàm lượng artemisinin cao
nhất (1.6% trong lá khô). Trong khi nếu thu hoạch khi lá còn xanh thì hàm
lượng artemisinin chí có 0.6%. Cây nở hoa cho hàm lượng artemisinin còn
1%.
Hiện nay các nhà nghiên cứu đã chọn được giống Thanh hao hoa
vàng có hàm lượng artemisinin cao, có thể thu được 3,5-5kg artemisinin
trên một tấn lá khô nguyên liệu. Việt Nam cũng đã sản xuất được các mặt
hàng dược phẩm có chứa artemisinin trong điều trị bệnh sốt rét ác tính. Để
có
được sản lượng lá khô cao nhất là thu lá làm nhiều lần. Bắt đầu từ lúc lá
chuyển sang màu vàng là thu lá ngay, cho đến khi ngọn chớm có nụ là cắt
toàn bộ cây, rồi tuốt lá phơi và sấy khô.
Artemisinin là đối tượng nghiên cứu nhiều ở Việt Nam tại Viện
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Bộ Y Tế, Bộ Công Nghiệp, Bộ Quốc
Phòng và đã nhận được giải thưởng Hồ Chí Minh (2004). Artemisinin cũng
đã được nghiên cứu nhiều v
ề kỹ thuật tách chiết va trồng trọt và chọn dòng
Thanh hao hoa vàng có hàm lượng artemisinin cao ở Viện Nghiên Cứu
Dược Liệu Trung Ương. Ngoài ra quy trình tách chiết sản xuất artemisinin
từ cây Thanh hao hoa vàng cũng đã được hoàn thiện tại Viện Sinh Học
Nhiệt Đới và Viện Nghiên Cứu Dược Liệu Trung Ương. Chọn dòng Thanh
hao giàu hoạt chất artemisinin đã được Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu
Cam Ly (Công ty Dược liệu TW TPHCM) đang được thực hiện tại Đ
à Lạt
nhiều năm nay. Cây Thanh hao là đối tượng được nhiều cơ quan nghiên

cứu đầu ngành quan tâm và hoàn thiện công nghệ chiết xuất chủ yếu từ cây
Thanh hao trồng trọt.
“Công trình nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao hoa
vàng Việt nam và chuyển hóa các chất dẫn xuất có hoạt tính mạnh hơn
chữa sốt rét” (Giải thưởng Hồ Chí Minh 2004). Theo Quyết định số
105/2003/QĐ/CTN của Chủ tịch nước Trần Đức Lươ
ng ký ngày 28/2/2003
đã quyết định trao giải thưởng Hồ Chí Minh cho công trình y tế trên cho 16

20
đơn vị: Bộ Y Tế (11 đơn vị), Bộ Quốc Phòng (2 đơn vị), Bộ Công Nghiệp
(1 đơn vị) và Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam (2 đơn vị).
Nghiên cứu sản xuất artemisinin trong nước từ cây Thanh hao trồng
trọt đã được hoàn thiện ở quy mô pilot. Trang thiết bị ở các cơ sở nghiên
cứu được đầu tư đầy đủ và hiện đại có khả năng phân tích và chiết xuất s
ản
phẩm tinh khiết. Thời gian sản xuất Thanh hao trồng trọt thì ngắn (từ tháng
7 dương lịch – tháng 12 dương lịch ở phía Bắc và từ tháng 7 dương lịch –
tháng 12 dương lịch ở Đà Lạt), được thu hái trước khi cây ra hoa và mỗi
năm chỉ trồng được một vụ. Khu vực trồng Thanh hao có giới hạn chủ yếu
ở khu vực phía Bắc (thời gian có khí hậu lạnh tháng 12dương lịch – tháng
2dương l
ịch) và vùng Đà Lạt (có khí hậu lạnh quanh năm). Hiện nay giống
Thanh hao giàu hoạt chất vẫn còn đang tiến hành nghiên cứu chọn dòng do
có những dòng Thanh hao giàu hoạt chất từ lá và có những dòng giàu hoạt
chất từ rễ. Giá thành chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao trồng trọt là
quá đắt và thời gian sản xuất rất ngắn trong năm (GS. Nguyễn Lân Dũng,
2007) là giới hạn phát triển artemisinin
Phần trên mặt đất của Thanh hao hoa vàng chứa artemisinin (thành
phần chính), acid artemisinic, quinghaosu I (artennuin A), quinghaosu II

(artennuin B), quinghaosu III (desoxyartemisinin), quinghaosu IV,
quinghaosu V (artennuin E), artemisininlacton (artennuin F), artemisiten
(dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester, artennuin C,
artemisinin G, artemisino, 11 R – (-) – dihydroartenuin epoxyartemisinic,
dihydroepideoxyartennuin B, epideoxyartennuin B. Ngoài ra, còn có 1,1%
tinh dầu gồm 47 thành phần, trong đó artemisiaceton (52,5%), 1 – 8 cineol
(11,66%) và camphor (10,9%).
Cây còn chứa lipid, flavonoid, coumarin, polyacetylen, tinh dầu
serol.
- Các lipid gồm : nonacosanol, 2 – methyltricosan – 8 – on – 23 – ol,
hentriacontanyl – tricontanoat và 2, 29 – dimethyltriacontan.
- Các hợp chất flavonoid gồm quercetagetin – 3 – methylether;

21
quercetagetin –6,7 – tetramethylether; quercetagetin –6,7 – 4’ – trimethyl
ether; 3,5 – dihydroxy –3’,4’ – 6,7 – tetramethoxyflavon; 3,3’,5’ –
dioxyflavon; kaempferol; quercetin; 6 - methoxy kaempferol, artemetin;
casticin; chrysopletin.
- Các dẫn chất polyacetylen là anuadiepoxyd và ponticaepoxyd.
- Tinh dầu cây Thanh hao hoa vàng Việt Nam chứa α - pinen, camphen,
sabinen, β - pinen, β - myrcen 4,38%, p. cymen, 1 – 8 cineol 15,44%,
artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 –
terpineol, 2 – methylen – 5 – isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat, β -
cubeben, α - cubebon - β - caryophylen 6,29%, β - farnesen, ∆ - cadinen.
(Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1990).
Theo Woerdenbag và cs (1994), lá Thanh hao hoa vàng cho các hàm
lượng cao nhất về artemisinin (0,86%), acid artemisinic (0,16%) và
artennuin B (0,08%) vào thời điểm cây được 5 tháng tuổi. Sau đó, hàm
lượng các chất này đều giảm đi. Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước
khi cây ra hoa. Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquiterpen

45%.
N
ăm 1967, dịch chiết từ cây Thanh hao được khoa học xác định có
hoạt tính chống sốt rét. Năm 1971, các nhà khoa học đã tách từ cây này một
hợp chất chữa lành cho chuột nhiễm ký sinh trùng Plasmodium berghei.
Năm 1972, tinh chất kết tinh của hợp chất trên được Trung Quốc cô
lập và xác định cấu trúc: là một chất sesquiterpene lactone với một cầu nối
peroxide bên trong. Đây là artemisinin, hoạt chất chính của cây Thanh hao.
1979 : xác định được cấu trúc artemisinin bằng tia X.
Tại Việ
t Nam, năm 1989 Đinh Huỳnh Kiệt và cộng sự công bố kết
quả phân tích thành phần hóa học của Thanh hao hoa vàng mọc hoang và
chiết suất artemisinin để chữa sốt rét cho bộ đội.


22

Hình 8: Cấu trúc của artemisinin

Ký sinh trùng sốt rét xâm nhập tế bào máu hồng huyết cầu và tiêu
thụ 25% chất hemoglobin trong hồng huyết cầu, tuy vậy chúng không phân
hóa phân tử heme (chứa sắt) mà chứa phân tử sắt ở môt dạng polymer gọi
là hemozoin. Khi artemisinin phản ứng với sắt ở hemozoin, chất sắt biến
artemisinin thành một độc tố, sinh ra các gốc hóa học tự do phản ứng nhanh
chóng giết chết ký sinh trùng.


Hình 8: Cấu trúc của các dẫn xuất từ artemisinin
Mặc dù artemisinin đã được dùng khá lâu ở Trung Quốc và Đông
Nam Á nhưng vẫn chưa thấy sự xuất hiện của ký sinh trùng nhờn thuốc

artemisinin. Lý do có thể là sự phá huỷ rất nhanh chóng và triệt để ký sinh

23
trùng sốt rét của artemisinin khi tiếp xúc với phân tử sắt (Fe) trong ký sinh
trùng đã không cho chúng nhiều cơ hội đột biến.












Hình 9: Cơ chế hoạt động của artemisinin

Wang và cs (2004) nghiên cứu về sự ảnh hưởng của gen fpf1
(flowering promoting factor 1) ở thời điểm Thanh hao ra hoa, mối liên hệ
giữa việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin nhận thấy sự ra hoa
không là yếu tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm
thu hoạch tốt nhất là lúc cây ở cuối giai đoạn sinh trưởng và có sự tạo chồi.
Artemisinin là một endoperoxide sesquiterpene lactone thuộc nhóm
isoprenoid. Một trong những con đườ
ng sinh tổng hợp quan trọng nhất ở
thực vật là con đường isoprenoid. Terpenoid được tạo nên bởi isopentenyl
diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Ở thực vật cấp
cao hơn có hai con đường sinh tổng hợp độc lập nhau dẫn đến việc hình

thành IPP: con đường mevalonate trong cytosol và con đường mevalonate
trong thể hạt (Liu và cs, 2005)
Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy-Dxylulose-5-phosphate synthase
(DXPS) và deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPR) được
tách từ rễ cây Thanh hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường

24
sinh tổng hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và cs, 2003; Souret
và cs, 2002). Do đó, con đường mevalonate không phải là con đường duy
nhất để tổng hợp artemisinin trong cây Thanh hao. Akhila và cs (1987) đề
nghị con đường sinh tổng hợp artemisinin hoàn chỉnh bắt đầu từ mevalonic
acid và IPP. Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP),
germacrane skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B, và
artemisinin. Hàm lượng của artemisinic acid gấp 8–10 lần so với
artemisinin ở cây Thanh hao. Vì thế, có giả thuyết cho rằng artemisinic
acid là tiền chất cho sự sinh tổng hợp artemisinin B và artemisinin.
Sangwan và cs (1993) cho rằng có sự biến
đổi artemisinic acid thành
artemisinin B và artemisinin cả ở cây tự nhiên và trong tế bào nuôi cấy.
Bertea và cs (2005) đã nhận biết được chất trung gian và các enzyme
liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh hao. Một số enzyme liên
quan đến sự tổng hợp artemisinin như 3-hydroxy-3-methylglutaryl
coenzyme A reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS),
and sesquiterpene synthase (SES). HMGR catalyzed HMG-CoA to yield
MVA (Liu và cs 2006).
CMK: 4-(Cytidine 5
’
-diphospho)-2-Cmethyl- D-erythritol kinase
CMS: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase
DXR: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase

DXS: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase
FPPS: farnesyl diphosphate synthetase
GPPS: geranyl diphosphate synthase
HMGR: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMGCoA) reductase
HMGS: HMG-CoA synthase; IDS isopentenyl diphosphate synthase
MVÀ CS: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase
MDD: mevalonate diphosphate decarboxylase
MK: mevalonate kinase
MPK: mevalonate-5-phosphate kinase
SES: sesquiterpene synthase

25

Hình 10: Con đường sinh tổng hợp artemisinin (Liu và cs. 2005; Bertea và cs. 2005).

5. Artemisinin và công nghệ sinh học
Ở nhiều nước đang phát triển như Châu Phi, các nước Châu Á như
Malaysia, Việt Nam… bệnh sốt rét đã lấy đi nhiều sinh mạng con người,
rất tốn kém về chi phí y tế và lao động. Bệnh sốt rét đã đánh mất khoảng 1
triệu người hàng năm (Schellenberg và cs, 2001). Bệnh sốt rét gây ra tính
suy giảm đề kháng, gây ra trạng thái nóng lạnh ở người bệnh và là nhân tố
chính ở các nước có bệnh sốt rét cao. Sự
giao lưu giữa các dân tộc ngày
càng cao sẽ dẫn đến sự lây lan nhất là trong khu vực các nước đang phát
triển.


26
Tổng hợp thuốc chống bệnh sốt rét pamaquine được đầu tiên sử dụng
để điều trị bệnh sốt rét và từ đó dẫn đến nhiều dẫn xuất 8-aminoquinoline,

chloroquine và mefloquine. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc với liều cao
(300-600mg) và kéo dài (hơn 3 tháng) đã phát hiện dẫn đến suy nhược hệ
thần kinh (Bruce-Chwatt và cs, 1981). P. falciparum phát triển rất nhanh
tính kháng thuốc chống bệnh sốt rét bao gồm cả chloroquine, sulfa
pyrimethmine k
ết hợp và quinine (White và cs, 1999). Công cuộc tìm kiếm
thuốc kháng bệnh sốt rét hiện đang diễn ra cấp thiết và khẩn trương để ngăn
chận sự kháng thuốc chống sốt rét không hiệu quả trong tương lai.
Một trong những dẫn xuất quan trọng có khả năng chống bệnh sốt rét
là artemisinin được chiết xuất từ Artemisia annua (cây Thanh hao hoa
vàng). Thanh hao hoa vàng được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện
năm 1972. Artemisinin được phát hiện có hiệu quả
hơn so với chloroquine
và mefloquine kháng lại các dòng ký sinh Plasmodium. Artemisinin được
phát hiện gần đây hơn so với chloroquine và cho phản ứng nhanh với tính
chống chịu bệnh sốt rét. Hơn nữa, độc tính phản ứng phụ cho thấy ít xuất
hiện hơn so với chloroquine (Klayman, 1985)
Artemisinin và các dẫn xuất của nó có lẽ đã được tổng hợp nhưng
các chất chống bệnh sốt rét tổng hợp hiện nay cho thấy không hiệu quả
kinh tế so với chiết xuất từ cây Thanh hao. Malaysia là một trong nhiều
nước đang đi tìm kiếm chloroquine kháng bệnh cho các vùng có bệnh sốt
rét đang hoành hành, và artemisinin được khuyến cáo cho điều trị bệnh
hiệu quả. Artemisinin annua được trồng nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc.
Cây Thanh hao được thu hoạch trước khi ra hoa để sản xuất artemisinin chỉ
sản xuất được 2-3kg trên 1 tấn lá khô. Tuy nhiên giá thành chiết xuất lại
quá cao. Artemisin có hiệu quả cao trong phòng chố
ng bệnh sốt rét, nhưng
giá thành sản xuất cao và theo mùa vụ (Keasling, 2006). Hiện nay các nước
trên thế giới đi tìm các phương pháp khác nhau để sản xuất artemisinin có
hiệu quả với giá thành thấp.

27
Tại Trường Đại học Berkeley, các nhà khoa học (Dae-Kyu Ro và cs,
2006) đã tiến hành tách được 2 gen từ cây này liên quan đến việc tổng hợp
ra artemisinic acid. Acid này chỉ qua vài phản ứng hóa học sẽ chuyển thành
artemisinin. Sau đó các nhà khoa học đã chuyển thành công 2 gen này vào
tế bào men rượu (Saccharomyces cereviseae). Việc đưa chủng nấm men
mang gen tái tổ hợp sinh artemisinin vào sản xuất trong các nồi lên men
(bioreactor) với hy vọng làm giảm giá thành so với phương pháp tách chiết
từ Thanh hao trồng trọt.
Hi
ện nay công trình này đang được đưa vào sản xuất thử nghiệm tại
Institute for One World Health hợp tác với Amyris Biotechnologies dưới sự
tài trợ của quỹ Bill and Melinda Gates Foundation với kinh phí 42,6 triệu
USD (Hale, 2006). Nhóm tác giả hy vọng khi đi vào sản xuất trên quy mô
công nghiệp thì nhiều bệnh nhân ở các nước nghèo có cơ hội chữa bệnh.
Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp: giai đoạn đầu là thay đổi một
số gen của nấm men bằng phươ
ng pháp gây đột biến để gia tăng việc sản
xuất farnesyl pyrophosphate (FPP); giai đoạn hai là đưa gen amorphadiene
synthase (ADS) của cây Thanh hao hoa vàng vào tế bào nấm men để tổng
hợp FPP thành amorphadiene; và giai đoạn cuối là đưa gen P450 của cây
Thanh hao hoa vàng vào nấm men để oxy hóa 3 bậc chuyển amorphadien
thành artemisinic acid. Công cuộc nghiên cứu đang diễn ra phía trước, và
vấn đề đặt ra là sản phẩm artemisinin chuyển gen có ảnh hưởng đến người
bệnh và vấn đề phòng chống bệnh sốt rét trên ngườ
i bệnh.
Đi theo hướng này Parshikov và cs (2004) đã nuôi cấy dòng
Cunningham elegans tái tổ hợp sản xuất artemisinin bằng con đường biến

đổi sinh học 7-O-hydroxyartemisinin
Các nhà khoa học tại Trường Đại học Quốc Gia Đài Loan (Yuan-Tay
Shyu, 2005) đề xuất phương pháp nuôi cấy rễ Thanh hao in vitro để chiết
xuất artemisinin. Nhưng công cuộc nghiên cứu còn đang tiến hành. Đi theo
hướng này còn có các nhà khoa học Trung Quốc (Liu và cs, 2005) đã tìm
được điều kiện nuôi cấy thích hợp in vitro sản xuất
được 233,3mg/l môi