(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá (zingiber sp ) trong điều kiện in vitro

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRIỆU MINH HUỆ

Tên ti:

Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố đến khả năng tạo
mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro

KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HäC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chun ngành
: Cơng nghệ sinh học
Lớp
: K42 - CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khoá học
: 2010 - 2014
Giảng viên hướng dẫn: ThS. Lâm Mai Tùng
Trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn
ThS. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014

n


2

LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo
mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”.
Qua 6 tháng thực tập tại phòng Kỹ thuật của Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ
Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết
quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc trung tâm cùng các
thành viên phòng Kỹ thuật đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths. Lâm Mai Tùng, Ths. Lương
Thị Thu Hường và KS. Vi Thị Minh Tâm đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong
thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lịng động viên,
giúp đỡ tạo điều kiện về vất chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và
nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh
khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các
bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Triệu Minh Huệ

n

3

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 1. Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng ......................................................6
Bảng 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2
0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ..........26
Bảng 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2
0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong
điều kiện in vitro. ......................................................................................................28
Bảng 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 -D đến khả năng tạo
mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. ......................................................30
Bảng 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả
năng hình thành mơ sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ..........................31
Bảng 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA
đến khả năng hình thành mơ sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ............33
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả
năng hình thành mơ sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ..........................35

n


4

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1. Một số hình ảnh mơ tả đặc điểm hình thái cây gừng Núi đá .........................5
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến
hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.......................27
Hình 4.1.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2
0,1% với Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều
kiện in vitro. ..............................................................................................................29
Hình 4.2.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng hình
thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ...........................................30
Hình 4.2.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến
khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ...............................34
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả
năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro .......................................36

n


5

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
AND

: Acid deoxyribonucleic

B1

: Thiamin

B3

: Nicotinic acid

B6

: Pyridoxine

BA

: 6-Benzylaminopurine

CT

: Công thức

CV

: Coefficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IAA

: Indol axetic acid

Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s

NAA

: α - Naphlene axetic acid

TN

: Thí nghiệm

2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

n


6

MỤC LỤC
Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................1
1.2. Mục đích của đề tài .........................................................................................2

1.3. Yêu cầu của đề tài ...........................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ........................................................2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .........................................................................................2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1. Tổng quan về gừng núi đá ..............................................................................3
2.1.1. Phân loại ......................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm phân bố ........................................................................................3
2.1.3. Đặc tính sinh học .........................................................................................4
2.1.4. Thành phần hóa học .....................................................................................6
2.1.5. Tác dụng ......................................................................................................8
2.2. Cơ sở khoa học của ni cấy mơ tế bào .........................................................8
2.2.1. Tính tồn năng di truyền của tế bào ............................................................8
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào .........................................................9
2.2.3. Ni cấy mơ sẹo ........................................................................................10
2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ..............................12
2.3. Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới ...............................17
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................17
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..............................................................18
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......19
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................19
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................19
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................19
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................19
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu..................................................................................19
3.2.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................19
3.3. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................19
3.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ....................................................................19
3.5. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................19

n


7

3.6. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................20
3.6.1.Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu ......................................................................20
3.6.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy ..................................................................20
3.6.3. Nuôi cấy mơ sẹo ........................................................................................20
3.6.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................20
3.7. Chỉ tiêu theo dõi ...........................................................................................24
3.8. Xử lý số liệu..................................................................................................25
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................26
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng thích hợp tạo vật
liệu sạch phục vụ nuôi cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro .......................26
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0.1%
đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro ....................26
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2
0.1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá. ............28
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro ................................................29
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô
sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. ............................................................29
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng
hình thành mơ sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ...................................31
4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến
khả năng hình thành mơ sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. ....................33
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả
năng hình thành mơ sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. ..........................35
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................37

5.1. Kết luận.........................................................................................................37
5.2. Kiến nghị ......................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................38

n


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Gừng (Zingiber officinable Roscoe.) là một loại cây thân thảo, lấy củ, sống
lâu năm được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và thảo dược [32].
Chúng được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Bangladet,
Jaiwan, Jamaica, Nigieria, Indonesia, Ceylon, Sierraleone, Australia, Trung Quốc
và Nhật Bản [21], gồm hơn 1200 loài cây thuộc 53 chi. Chi Zingiber gồm 85 lồi
thảo mộc thơm từ Đơng Á và vùng nhiệt đới Australia [19].
Bộ phận chính được sử dụng là củ gừng (thân rễ, rhizome) [17]. Gừng có vị
cay, thơm rất giàu các hợp chất thứ cấp như nhựa dầu, dẫn xuất phenol, zingiberene,
gingerol [33]. Trong các phương pháp chữa bệnh truyền thống thường được sử
dụng để điều trị bệnh đau đầu, buồn nôn, cảm lạnh, viêm khớp, thấp khớp, nhức
mỏi cơ bắp, và viêm [20]. Ở Ấn Độ và Trung Quốc thời cổ xưa đã sử dụng gừng
điều trị bệnh trên người và gia súc [47]. Trong công nghiệp thực phẩm, gừng được
sử dụng để tạo hương vị trong sản xuất một số sản phẩm như bánh kẹo, trà, mứt,
nước giải khát,…[17]
Gừng thường được nhân giống bằng củ, nhưng hệ số nhân rất thấp. Năng suất
gừng không cao do nhiễm vi khuẩn gây héo (Pseudomonas solanacearum), thối rễ
(Pythium aphanidermatum) và tuyến trùng (Meloidgyne spp.). Những bệnh này sẽ truyền
qua củ giống vào năm sau, do vậy sản xuất những dòng sạch bệnh với tỷ lệ nhân giống

cao là cần thiết để có được vụ mùa với năng suất cao [50].
Đã có khá nhiều nghiên cứu về cây gừng trên thế giới như vi nhân giống [31],
nuôi cấy cơ quan [34], phát sinh phôi soma [41], phát sinh cơ quan [38], nuôi cấy tế bào
trần, bảo tồn phôi và một số nghiên cứu khác. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về
cây gừng Núi đá – một loại cây bản địa, quý và hiếm.
Theo quyết định 80/2005/QĐ - BNN về danh mục các nguồn gen quý hiếm
cần được bảo tồn do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày
05/12/2005, gừng Núi đá là một trong những loài cây quý hiếm cần bảo tồn.
Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng
của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.)
trong điều kiện in vitro”.

n


2

1.2. Mục đích của đề tài
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch phục vụ
cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây
gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng (thời gian khử trùng,
phương pháp khử trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây
gừng Núi đá.
- Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô
sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.
- Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô
sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Sự thành công của đề tài cùng với những nghiên cứu của các tác giả khác sẽ
tạo ra được quy trình nhân giống phù hợp cho cây gừng Núi đá trong điều kiện in
vitro và phục vụ các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất hóa học quan trọng của
gừng nói chung và gừng Núi đá nói riêng.
- Là cơ sở cho các nghiên cứu khoa học khác.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp số lượng cây gừng Núi đá trong tự nhiên góp phần bảo tồn nguồn
gen quý hiếm và khai thác triệt để những giá trị kinh tế và dược liệu của chúng.

n


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về gừng núi đá
2.1.1. Phân loại
Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây gừng Núi đá được phân loại như sau [15]:
Giới

: Plantae

Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Liliopsida

Họ

: Zingiberaceae

Bộ

: Zingiberales

Chi

: Zingiber

Loài

: Zingiber sp.

Tên Việt Nam

: Gừng Núi đá

Tên khoa học

: Zingiber sp.

Tên khác

: Gừng đá, gừng Núi đá. Tiếng Tày gọi là khing phia.

2.1.2. Đặc điểm phân bố
Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc từ
trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng đã trở thành
cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ La - tinh, Châu Phi và Đông Nam Á. Gần
50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil, Jamica.
Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao nhất (50.000
đến 80.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam [47].
Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa
phương từ Bắc vào Nam [9]. Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác ở trong các vườn hộ
gia đình [2].
Gừng Núi đá phân bố ở một số tỉnh như Lạng Sơn, Nà Rì, Bắc Cạn, Cao
Bằng, Hà Giang, Tây Bắc và miền Trung Tây Nguyên, Khánh Hòa, Gia Lai, Đắc
Lắc, cây mọc tự nhiên trên các vùng núi đá, mọc xen trong đá, ở các bờ suối nơi ẩm
mát - dưới tán rừng già , cây thường phát triển theo cụm (5,6 thân). Tên gừng Núi
đá bắt nguồn từ nơi chúng có khả năng sống và phát triển tốt nhất. Loại gừng này
thường mọc ở những dãy núi đá cao khoảng trên 1m, củ bằng đốt ngón tay, có mùi
vị thơm rất lạ lùng giống mùi bọ xít.

n


4

2.1.3. Đặc tính sinh học
Gừng là cây thân thảo, đa niên, cao từ 50 - 100 cm tùy theo đất, có nơi cao
hơn 150 cm. Chúng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm
ngủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây. Bẹ lá ôm sát nhau phát triển
thành thân giả trên mặt đất. Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, khơng có cuống, hình
lưỡi mác, mặt bóng nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt. Trục hoa mọc từ

gốc (củ gừng), dài khoảng 20cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài
khoảng 5 cm, rộng khoảng 2 - 3cm, lá bắc hình trứng, mép lá màu vàng. Ðài hoa dài
khoảng 1cm, có 3 rãnh ngắn, có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu
tím, nhị hoa cũng màu tím [18].
Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít khi ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu hoạch
củ để bán [12].
Gừng là một loại cây ưa ấm. Sinh trưởng thích hợp ở những vùng nhiệt đới
và cận nhiệt đới,… Nhiệt độ thích hợp là 25 - 300C, khả năng sinh trưởng giảm nếu
nhiệt độ thấp hơn 240C và cao hơn 300C. Gừng phát triển tốt trong điều kiện đầy đủ
ánh sáng, nhưng cũng có thể thích nghi với kỹ thuật trồng xen [21].
Mơi trường tốt nhất cho chúng sinh trưởng là pH = 5,5 – 6,5. Gừng thường
được trồng vào khoảng tháng 3 hằng năm, có thể thu hoạch từ tháng 12 đến tháng 5
năm sau. Tuy nhiên chất lượng gừng giảm nếu như thu hoạch quá muộn vào khoảng
tháng 5. Sẽ làm giảm thẩm mĩ của gừng so với gừng thu sớm. Sau khi trồng phải
mất khoảng 6 tuần thì chúng mới bắt đầu nảy mầm. Từ đó chúng bắt đầu sinh
trưởng tối đa cho đến khi ra hoa. Sự hình thành hoa đánh dấu sự trưởng thành của
củ và bắt đầu tăng hàm lượng chất xơ trong củ [21].
Về đặc điểm sinh học của gừng Núi đá hiện này vẫn chưa có những nghiên
cứu chính thức về chúng. Dưới đây là một số hình ảnh mơ tả :

n


5

Hình 1. Một số hình ảnh mơ tả đặc điểm hình thái cây gừng Núi đá

n

6

2.1.4. Thành phần hóa học
Trong gừng có chứa hơn 400 chất khác nhau gồm 2 - 3% tinh dầu
(Zingerberen, D -camphen), 3 - 5% chất nhựa cay như zingerol, Shogaol, chất béo,
vitamin, khống (K, Ca, Fe, Zn,…).
Những hợp chất hóa học quan trọng quyết định khả năng chữa bệnh của
gừng được chia làm hai nhóm là nhóm dễ bay hơi và khơng bay hơi. Nhóm hợp
chất dễ bay hơi gồm oleoresin (nhựa dầu). Đây là yếu tố quyết định cho gừng có
khả năng làm gia vị, trong đó chủ yếu là gingerol [46].
Những hợp chất hóa học có trong tinh dầu gừng được thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1. Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng
Thành phần
Hexanal
Hexanol
Ο – xylene
Amyl acetate
α – pinene
Camphene
Heptanol
Sabinene
β – pinene
Myrcene
6-methyl-5-hepten-2-one
1,8-cineol
Limonene
(E)-β-ocimene
γ-terpinene
Trans-linalool oxide
(furanoid)

Undecane
Camphor
Menthone
Borneol
Terpinen-4-ol
Menthol
γ-terpineol
Decanal
Nerol
Neral
Geraniol
Geranial
Trans-carvone oxide

770
858
884
895
943
954
957
976
981
986
994
1027
1030
1038
1057

Tinh dầu gừng
tươi (%)
0,1
0,0
<0,1
<0,1
0,1
4,0
0,2
3,0
1,6
0,0
0,9
2,4
1,9
1,3
0,8

Tinh dầu gừng khô
(%)
T
T
0,3
1,0
0,8
0,6
2,1
1,7
1,0
-

1092

0,1

-

1100
1136
1143
1157
1170
1171
1185
1188
1218
1227
1243
1252
1260

0,4
0,2
0,2
1,2
0,2
<0,1
1,3
0,3
0,4

1,8
1,8
8,5
0,6

0,2
0,5
0,1
T
0,5
T
0,2
T
0,5
4,4
0,4

RI

n


7

1268
Bornyl acetate
1276
2-undecanote
1284
Undecanal

1359
β- cubebene
1373
α- copaene
1367
Geranyl acetate
1382
γ- elemene
1403
β- elemene
1418
β- caryophyllene
1436
Α- bergamotene
1448
β- farnesene
1469
Germacrene-D
1477
γ- muurolene
1474
Ar- curcurmene
1490
α- muurolene
1487
Zingiberene
1504
β- bisabolene
1516
β- sesquiphellandrene

1523
γ- cadinene
1524
(Z)- nerolidol
1540
Elemol
1553
(E)- nerolidol
1542
Eudesma- 3,7(11)diene
1560
Cubernol
1598
β- guiacol
1609
Epi- α- cedrenol
1605
Sesquisabinene hydrate
1620
Zingibernol
1625
Zingernone
1630
α- murrolol
1650
β- eusdesmol
1659
β- bisabolol
1660
β- eudesmol

1692
Z- α- bergamotol
1693
(Z,Z)farnesol
1699
(Z,E)farnesol
1701
α- eusdesmol
1718
(E,Z)- farnesol
1749
(E,E)- farnesol
1763
(Z)- lanceol
Tổng
Tổng các thành phần oxygenase
Tổng các thành phần hydrate

0,2
0,1
0,2
0,1
0,5
0,4
1,3
0,1
1,3
1,2
5,6
1,028,6

5,8
2,5
2,2
1,5
1,2
1,4
0,1
0,1
0,6
0,2
0,1
0,3
0,5
0,0
0,1
0,6
1,4
0,2
<0,1
92,2
29,2
63

Tr
Tr
240
1,50
1,30
1,00
1,40

1,90
1,50
4,20
3,40
11,0
2,20
30,3
7,20
6,60
3,50
0,20
0,20
1,20
0,20
0,20
T
T
T
0,30
0,10
0,10
0,10
0,10
92,3
14,4
77,9

Nguồn: Sasid tharan et al. (2010)

n

8

2.1.5. Tác dụng
Gừng (Zingiber officinale Roscoe.) đã được sử dụng làm dược phẩm từ thời
cổ xưa. Trong y học thực nghiệm ở Đông Nam Á, gừng khô được sử dụng trong
điều trị chứng khó tiêu, tiêu chảy và buồn nơn. Cả chống oxy hóa và hoạt động
androgenic của Z. Officinale đã được báo cáo trên các mơ hình động vật. Những
hoạt động này được phản ánh bởi sự tăng lượng tinh hoàn và mức độ cholesterol
trong huyết thanh, các thành phần chính của Z. Officinale như gingeron, gingidiol,
Zingiberene và đặc biệt là gingerol và shogarol có hoạt tính chống oxy hóa. Z.
Officinale được biết đến là có tác động đến tim mạch như hạ huyết áp, nhịp tim và
hàm lượng đường máu. Có hai hợp chất được tìm thấy là chịu trách nhiệm về hoạt
tính giảm đau, chống nơn, hạ sốt và ức chế tổng hợp prostaglandin. Trong điều trị
ung thư, gừng có thể sản xuất những hợp chất kháng u hiệu quả bằng cách gây
appotosis. Chúng còn được biết đến với gingerol có hoạt tính chống khuẩn mạnh cả
in vivo và in vitro. Ngồi ra cịn có tác dụng chống viêm và chống lại sự chết theo
chu trình [46].
Theo tài liệu cổ: Sinh khương vị cay, tính hơi ơn, vào ba kinh phế, tỳ và vị.
Có tác dụng phát biểu tính hàn, ơn trung, làm hết nơn, tiêu đờm, hành thủy giải độc.
Dùng chữa ngoại cảm, biểu chứng, bụng đầy trướng, giải độc bán hạ, chống nôn
mửa, nam tinh, cua cá, đờm ẩm sinh ho. Can khương vị cay, tinh ôn, bào khương
(can khương bào chế rồi) vị cay đắng tính đại nhiệt. Vào sáu kinh tâm, phế, tỳ, vị,
thận và đại tràng. Có tác dụng ơn trung tán hàn, hồi dương thông mạch, dùng chữa
thổ tả, bụn đau, chân tay lạnh, mạch nhỏ, hàn ẩm xuyễn ho, phong hàn thấp tỳ [7].
2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mơ tế bào
2.2.1. Tính tồn năng di truyền của tế bào
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mơ tế bào là tính tồn năng di
truyền của tế bào thực vật. Hanberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm

rằng mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh [3].
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều có mang tồn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome)
của thực vật đó. Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi cơ quan, mô, tế bào đều có thể
phát triển thành một cơ thể mới mang hồn chỉnh những đặc tính di truyền giống
như cây mẹ [3].

n


9

2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan
chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên ở tất
cả các loại tế bào đều có nguồn gốc từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai
đoạn đầu, tế bào tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng
chuyên biệt (chưa chun hóa). Sau đó, từ các tế bào phơi sinh này chúng tiếp tục
được biến đổi thành các tế bào chun hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có chức năng
khác nhau [5].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mơ
chun hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Q trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hố có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chun,
chúng khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phơi sinh và phân
chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân
hóa tế bào.

Phân hóa tế bào
Tế bào phơi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chun hóa

Phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt hóa, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hóa (mà vốn trước bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, cịn một số
gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được
mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh
trưởng phát triển của cơ thể thực vật ln được hài hịa [3].
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi
các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối
mơ sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [5].

n


10

2.2.3. Ni cấy mơ sẹo
2.2.3.1. Sự hình thành mơ sẹo
Mơ sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, khơng có hình dạng nhất định,
do khơng có lớp nhu mơ. Mơ sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao
gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây. Mơ sẹo hình thành ở hầu hết các bộ
phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt. Điều quan trọng được nhận thấy ở
đặc tính của mơ sẹo là mơ sẹo phát triển khơng theo quy luật nhưng có khả năng biệt

hóa thành rễ, chồi hoặc phơi để có thể hình thành cây hồn chỉnh.
Đặc điểm sinh trưởng của mơ sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mơ sẹo,
thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mơ sẹo được
chia ra làm 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
- Trong pha phát sinh mơ sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân
chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa
vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
-Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
- Tế bào đi vào q trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện con
đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [8].
Mơ sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa tế bào
hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, tế bào rây,… hơn nữa hình thành
vùng mơ phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi hay rễ.
Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những cơ quan có chứa
diệp lục có khả năng quang tự dưỡng. Theo Hilderbrandt và cs. (1963) [30] cho rằng,
mơ sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong mơi trường và
cường độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng quang tự dưỡng của
những tế bào có chứa diệp lục (tế bào màu xanh) như: cường độ ánh sáng mạnh, ánh
sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, đường
thấp, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lượng photphate, và những tế bào quang tự
dưỡng này có khả năng cố định CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện
của các acid hữu cơ 4 cacbon. Một vấn đề cần quan tâm trong nuôi cấy mơ sẹo là sự
biến tính tế bào. Sự biến tính này sảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất
của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo,
điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hoormon [8].

n


11

Để tạo mơ sẹo trong mơi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng, đơi
khi có dịch chiết [8]. Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất kích thích sinh
trưởng bổ sung vào có khác nhau [8]. Chất hoormon thường tổ hợp thành 4 nhóm:
- Auxin
- Cytokinine
- Auxin + Cytokinine
- Dịch chiết
Sau khi mơ sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyển. Môi trưởng cấy chuyển
cũng giống như môi trường tạo mô sẹo những giảm nồng độ chất kích thích sinh
trưởng. Kích thước tách mơ sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường
cụm mơ sẹo có trọng lượng 20 - 100g, thời gian giữa hai lần cấy chuyển là 20 - 30
ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Theo Vũ Văn Vụ (1993) [13], mơ sẹo hình
thành có hai loại tế bào:
- Loại tế bào xốp, có khơng bào to, nhân nhỏ và tế bào chất lỗng.
- Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc.
Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mô. Khả
năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp những vẫn duy trì ở mơ sẹo cứng.
Ngun nhân có thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng sinh ra một số chất
thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyển tăng lên. Vì vậy, khi ni cấy
mơ sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, phải cố gắng tìm điều kiện ni cấy thích hợp
cho sự hình thành các khối mơ sẹo cứng, chắc; các mô sẹo xốp cần được loại bỏ
trong các lần cấy chuyển vì đơi khi dạng mơ sẹo này phát triển rất nhanh và lấn át
các mơ sẹo cứng có khả năng sinh phôi. Mô sẹo cấy chuyển càng nhiều lần thì khả
năng tái sinh càng giảm. Ngồi ra, nếu thời gian dài khơng cấy chuyển thì mơ sẹo sẽ
hóa nâu và chết.
2.2.3.2. Sự phát triển của tế bào mô sẹo
Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh cơ quan là cây
thuốc lá [40]. Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô sẹo. Mô nuôi cấy cho
thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt của tế bào và sự hình

thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn. Sự hình thành mơ sẹo từ mơ nuôi
cấy cho thấy sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính chun biệt và mất khả năng
hình thành cấu trúc cơ quan [8].
Khi cấy chuyển mô sẹo trên mơi trường có agar, tế bào mơ sẹo phát triển theo
hình chữ S. Có 5 pha trong sự phát triển của mô sẹo:

n


12

- Pha lag: Tế bào chuẩn bị phân chia
- Pha Exponetial: Tốc độ phân chia tế bào cao nhất
- Pha Linear: tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước
- Pha Deceleration: tốc độ phân chia tế bào và phát triển kích thước giảm
- Pha Stationary: Số lượng và kích thước tế bào ổn định.
Sự phát triển của mơ sẹo có thể đo được trọng lượng tươi. Đo trọng lượng khơ
cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất. Đo đếm
sự phân bào nguyên nhiễm.
2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân
hố tế bào và cơ quan ni cấy.
2.2.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều
kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vơ
trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hố
học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết

định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng
thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thơng thường hay
sử dụng một số hố chất như: HgCl2 0,1%, nước Clofox, cồn 700, Ca(ClO)2…để
khử trùng [5].
- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
+ Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến q trình phát triển của mơ ni cấy. Thời gian chiếu sáng thích
hợp với đa số các lồi cây là 12-18 h/ngày.
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mơ sẹo. Ngược lại, cường
độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích
hợp cho mơ ni cấy là 1000 - 7000 lux, ngồi ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh
hưởng tới sự phát sinh hình thái của mơ thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng

n


13

chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mơ ni cấy trong ánh
sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng
của mô sẹo. Hiện nay trong các phịng thí nghiệm ni cấy mơ để cung cấp
nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh
quang đặt cách bình ni cấy từ 35 - 40 cm [3].
+ Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới
sự phân chia tế bào và các q trình sinh hố trong cây. Tuỳ thuộc vào nguồn gốc của
mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất

cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [3].
2.2.4.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hố học của mơi trường đóng vai trị quyết định đến sự thành
công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác
nhau có những địi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu
một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một
loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra mơi trường ni cấy thực vật,
cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này,
trong đó có một số mơi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, B5, WPM.
Tuy có nhiều loại mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau [3]:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
+ Nguồn cacbon.
+ Các vitamin và amino acid.
+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường.
+ Các chất điều hồ sinh trưởng.
- Các muối khống đa lượng và vi lượng
Đối với cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trị rất
quan trọng. Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào,
nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết
cho hoạt động sống của tế bào.

n


14

Muối khống là thành phần khơng thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế
bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym.
Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của mơi trường
trong tế bào, duy trì điện thế hoá của thực vật. Các yếu tố như: K, Ca rất quan trọng
trong điều hồ tính thấm lọc của tế bào [13].
- Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường khơng có khả năng quang hợp,
do đó địi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào.
Nguồn cacbon được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường
saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose
nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật.
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian
để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng
dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [13].
- Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở
các lồi khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào ni cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ
bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mơ có thể sinh trưởng, tốt nhất phải
bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid. Trong các
loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực
vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [3].
- Các chất bổ sung
+ Agarose
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hố
mơi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6 - 1% đây là loại tinh bột đặc chế
từ rong biển để tránh hiện tượng mơ chìm trong mơi trường hoặc bị chết vì thiếu O2
nếu ni trong môi trường lỏng và tĩnh [5].

+ pH môi trường
Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của
môi trường thường là 5,6 - 6,0 [14]. pH ảnh hưởng đến sự chuyển của các ion, sự hấp
thụ chất dinh dưỡng giữa các mô tế bào thực vật với môi trường. Dougall (1980) [27]
đã thông qua các tài liệu liên quan đến sự thay đổi pH in vitro và tác giả cho rằng, sự

n


15

thay đổi này là do hấp thụ amoniac và nitrate từ môi trường nuôi cấy. Dougall đã
chứng minh pH ban đầu của mơi trường ni cấy có thể ảnh hưởng đến pH của môi
trường sau khi nuôi cấy do ảnh hưởng đến tốc độ hấp thụ amoni và nitrate. Khi tế bào
hấp thụ amoni, một ion H+ được giải phóng làm cho pH môi trường giảm. Sự thay đổi
pH môi trường rắn và môi trường lỏng cũng khác nhau. Môi trường rắn và mơi trường
lỏng có pH ở 5,7 thì sau khi hấp 1 tuần, pH có giá trị lần lượt là 4,6 và 4,4 Sau 6 tuần
thì giảm cịn 4,4 đối với môi trường rắn và 4,1 với môi trường lỏng [51]. Do vậy, sau
khi hấp giá trị pH thay đổi nhiều hơn trong môi trường lỏng, môi trường rắn trở nên
acid hơn. Sự thay đổi pH cũng có khả năng gây ra sự xâm nhập tự do của ion H+ vào
thành tế bào, tạo pH tối ưu cho hoạt động của enzyme nới lỏng thành tế bào [51], ion
H+ trong môi trường sẽ thâm nhập vào thành tế bào hoạt hóa enzyme phân hủy các liên
kết polysaccharide liên kết giữa các sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều
kiện cho thành tế bào giãn dưới tác động của áp suất thẩm thấu của không bào trung
tâm, kích thích sự sinh trưởng của tế bào.
pH mơi trường quá cao hoặc quá thấp làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh
dưỡng của tế bào từ môi trường, dẫn tới tế bào sinh trưởng chậm.
Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến
trạng thái của môi trường nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng.
- Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế. Trong nhân
giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để kích thích
sự phát sinh cơ quan.
+ Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA).
IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngồi IAA cịn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid
(NAA) và 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid (2,4 - D). Các chất này cũng đóng
vai trị quan trọng trong sự phân chia của mơ và trong q trình hình thành rễ.
NAA có tác dụng tăng hơ hấp của tế bào và mơ ni cấy, tăng hoạt tính
enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử
dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn
auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trị quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ.
NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất:

n


16

NAA gắn với phân tử enzym và kích thích enzym hoạt động. Tác dụng của auxin
là kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: auxin tác động vào gen và các
enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: auxin tác động thơng qua sự thay đổi
tính thẩm thấu của màng. Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA
dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra
ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh
trưởng. Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [14].
Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng
đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây.
- Cytokinin

Cytokinin là chất điều hồ sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào do chúng hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein. Các cytokinin
thường gặp là kinetine, BAP.
Kinetine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic.
Kinetine thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BAP là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetine. Kinetine và BAP cùng
có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân
sinh và làm hạn chế sự già hố của tế bào. Ngồi ra các chất này có tác dụng lên q
trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường
hoạt tính của một số enzym. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế
bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối
liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA [14].
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) [40] đã cho thấy khơng phải
các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng
nội sinh. Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động
tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và
cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào
và mơ. Những nghiên cứu của Skoog [40] cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì
thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho q trình phát sinh chồi.
Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus).
Giai đoạn đầu của q trình phân bào được cảm ứng bởi auxin cịn giai đoạn
tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích sinh trưởng. Skoog và
Miller (1957) [40], đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế

n


17

bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá

trình này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang
phát triển [14].
2.3. Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Gừng Núi đá là một loại cây mới mang tính địa phương do vậy hiện nay
chưa có nhiều nghiên cứu về chúng. Tuy nhiên, các nghiên cứu về gừng nói chung
đã được rất nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu.
K.Nirmal Babu và cs (1991) [47] đã nghiên cứu tái sinh cây gừng (Zingiber
officinale Rose.) từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá. Mảnh lá non của gừng được nuôi
cấy trên môi trường MS với nồng độ khác nhau của chất kích thích sinh trưởng. Sự
có mặt của 2,4 - D trong môi trường từ 9,0 - 22,6 µM kết quả thu được mơ sẹo sinh
trưởng tốt. Sự hình thành cây và cơ quan xảy ra khi nồng độ của 2,4 - D giảm xuống
0,9 µM và với sự tăng thêm 44,4 µM BA vào mơi trường. Tỷ lệ tái sinh cây tăng
chất điều hòa sinh trưởng loại bỏ hồn tồn mơi trường ni cấy trong những lần
nuôi cấy tiếp theo. Cây con kéo dài rễ khi đặt trong mơi trường MS lỏng với 5,4 µM
NAA. Khả năng phát triển của những cây con này trong đất là khoảng 80%.
Faridah và cs (2011) [28], đã nghiên cứu thành cơng hiệu quả tái sinh in vitro
lồi gừng Gió - Zingiber zerumbet từ thân rễ. Mơi trường thích hợp nhân nhanh chồi
gừng Gió là mơi trường MS bổ sung kết hợp BAP 3,0 mg/l và IAA 0,5 mg/l cho số
lượng chồi trung bình cao nhất (5,6 chồi) cho mỗi mẫu cấy so với các nồng độ khác.
Các chồi tốt nhất chiều dài (9,44 cm) thu được trên môi trường có chứa BAP 1,0mg/l
và IAA 2,0 mg/l. Như vậy, tác động tổng hợp của BAP và IAA cải thiện đáng kể sự
phát triển chồi. Mơi trường thích hợp ra rễ là môi trường MS bổ sung kết hợp với BAP
5,0mg/l và IAA 2,0mg/l cho số lượng rễ cao nhất (17 rễ). Tuy nhiên, rễ dài nhất mỗi
mẫu cấy thu được trong môi trường MS bổ sung BAP 1,0mg/l riêng rẽ. Các chồi nở rộ
là màu xanh lá cây và trông khỏe. Cuối cùng, cây khỏe mạnh và hoàn chỉnh với rễ phát
triển tốt, cứng và được ra cây thành công với tỷ lệ sống sót là 80%.
Tamil.C.M.Sundram và cs (2012) [52] đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều
kiện ni cấy cảm ứng tạo mô sẹo từ mầm chồi phục vụ cho thiết lập hệ thống nuôi
cấy dịch huyền phù tế bào của Mango Ginger (Curcuma Mangga). Các phản ứng

khác nhau thu được từ chồi mầm nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung
2,4 - D, NAA, IAA riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau. Nồng độ succrose
cũng được thử nghiệm. Mô sẹo xốp sinh trưởng nhanh từ chồi mầm nuôi cấy trên

n


18

môi trường MS với 1mg/l 2,4 - D + 30 g/l succrose + 2 g/l gelite được chọn lọc để
bắt đầu nuôi cấy huyền phù tế bào. Với những môi trường nuôi cấy khác nhau, nuôi
cấy dịch huyền phù được thành lập từ môi trường MS lỏng bổ sung 0,3 mg/l 2,4 - D
+ 0,1mg/l NAA + 30 g/l succrose + 0,1 g/l chiết xuất của malt + 0,5 mg/l biotin +
100 mg /l glutamine + 5mg/l acid ascorbic và acid citric tương ứng. Các hợp chất
phenolic sản xuất ra được kiểm soát một cách chặt chẽ bởi sự kết hợp của ascorbic
và acid citric là chất chống oxy hóa .
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) [11], đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sa
nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ gừng (Zingiberacae) từ đỉnh sinh
trưởng và đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ của cây tự nhiên. Kết quả nghiên cứu cho
thấy thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% là 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt
91,11% đối với đỉnh sinh trưởng và 86,67% đối với đoạn thân. Mẫu được nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetine. Sau 8 tuần
nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l
(1,36 chồi/đỉnh sinh trưởng, 1,40 chồi/đỉnh sinh trưởng bổ đôi, 1,04 chồi/đoạn thân).
Đoạn thân in vitro được cấy lên môi trường nhân nhanh bổ sung riêng lẻ hay kết hợp các
chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetine và NAA. Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trường bổ
sung BAP 1,5mg/l kết hợp NAA 0,25mg/l cho số chồi lớn nhất đạt 7,40 chồi/mẫu. Chồi
in vitro được cảm ứng rễ trên mơi trường MS có bổ sung riêng rẽ NAA và IBA. Rễ được
cảm ứng tốt nhất trên mơi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (18,42 rễ/chồi). Cây con

in vitro được huấn luyện thích nghi và trồng ở vườn ươm với tỷ lệ sống sót 93,14%.
Võ Châu Tuấn (2014) [17], đã trình bày phương thức nuôi cấy mô sẹo và tế bào
huyền phù của cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe). Môi trường MS bổ sung 2%
sucrose; 1,0 mg/l 2,4 - D và 1,0 mg/l BA thích hợp cho ni cấy mơ sẹo từ bẹ lá của cây
nghệ đen in vitro. Trong q trình ni cấy, các mô sẹo thứ cấp được tạo thành từ mơ sẹo
sơ cấp trên mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 - D và 0,5 mg/l BA. Các mơ sẹo này
có màu vàng, rắn và rời rạc. Ni cấy tế bào huyền phù được thiết lập với 3 g sinh khối
mơ sẹo tươi ni trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml mơi trường MS có bổ
sung 3% sucrose; 1,5 mg/l 2,4 - D và 0,5 mg/l BA với tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sinh
khối cao nhất đạt 10,44 g trọng lượng tươi (0,66 g trọng lượng khô) sau 14 ngày nuôi
cấy. Các kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về cây nghệ đen nhằm
cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp ở qui mô lớn.

n