Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen vào lục lạp tạo ra thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứng dụng trong y dược
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (9.83 MB, 498 trang )
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
KC04/06-10
“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học”
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
ĐỀ TÀI
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN
VÀO LỤC LẠP TẠO RA THỰC VẬT SẢN XUẤT PROTEIN
TÁI TỔ HỢP ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG Y DƯỢC”
Mã số: KC.04.10/06-10
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sinh học Nhiệt đới
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Thanh
Tp.HCM - 2011
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
KC04/06-10
“ Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học”
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
ĐỀ TÀI
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN
VÀO LỤC LẠP TẠO RA THỰC VẬT SẢN XUẤT PROTEIN
TÁI TỔ HỢP ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG Y DƯỢC”
Mã số: KC.04.10/06-10
Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài
TS. Nguyễn Thị Thanh
Ban Chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
Tp.HCM - 2011
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI
Viện Sinh học Nhiệt đới – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
TT Họ tên/Học hàm học vị Chức vụ Nội dung đóng góp
trong đề tài
1 TS. Nguyễn Thị Thanh Phó Trưởng phòng Chủ nhiệm đề tài
2 PGS.TS Trần Văn Minh Phó Viện trưởng
3 TS. Nguyễn Hữu Hổ Giám đốc PTNTĐ
4 ThS. Phan Tường Lộc NCS Thư ký Khoa học
5 ThS. Phạm Đức Trí NCS
6 ThS. Võ Phan Mi Sa NCS
7 KS. Lê Tấn Đức NCV
8 CN. Mai Trường HVCH
LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu đề tài xin chân thành cảm ơn:
- Bộ Khoa học và Công nghệ
- Văn Phòng các Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước
- Ban Chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10
đã tài trợ và giúp đỡ cho đề tài này.
- Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
điều kiện và giúp đỡ để nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài.
1
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VIÊT NAM
VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2011
BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài/dự án: “ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen vào lục
lạp tạo ra thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứng dụng trong y dược
Mã số đề tài, dự án: KC.04.10/06-10
Thuộc Chương trình (tên, mã số chương trình): Chương trình KH&CN
trọng điểm cấp Nhà nước. Mã số: KC.04/06-10.
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án:
Họ và tên: Nguyễn Thị Thanh
Ngày, tháng, năm sinh: 1959 Nam/ Nữ: Nữ
Họ
c hàm, học vị: Tiến sĩ Sinh học phân tử Thực vật
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Phó Trưởng phòng
Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: (08) 38984233
Mobile: 0982157759
Fax: E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Phòng Công nghệ gen
Địa chỉ tổ chức: 9/621 Xa lộ Hà nội, P. Linh Trung, Q. Thủ Đức, Tp.HCM
Địa chỉ nhà riêng: 241 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Q. Bình Thạnh, Tp.HCM.
3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì
đề tài: Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
2
Điện thoại: (08) 22181635- 22157508 Fax: (08) 38978791
E-mail:
Website:
Địa chỉ: 9/621 Xa lô Hà nội, P. Linh Trung, Q. Thủ Đức, Tp. HCM
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Hoàng Nghĩa Sơn
Số tài khoản: 931010100085
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 1, Tp.HCM
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ ngày 28 tháng 11 năm 2007
đến tháng 10 năm 2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2007 đến tháng 10 năm 2010
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2.700 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 2.644 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế
đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
Quyết toán)
29/01/2008 560 1 Năm
2007+2008
1900
27/05/2008 770
2 Năm 2009 555 28/04/2009 787
07/04/2010 408 3 Năm 2010 245
04/10/2010 119
3
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đối với đề tài:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
850 850 815 815
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
1345 1345 1349 1349
3 Thiết bị, máy móc 40 40 40 40
4 Xây dựng, sửa
chữa nhỏ
20 20 18 18
5 Chi khác 445 445 422 422
Tổng cộng
2.700 2.700 2644 2644
- Lý do thay đổi (nếu có):
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê
duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ
chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1 1574/QĐ-BKHCN,
ngày 3/8/2007
Quyết định về việc thành lập Hội
đồng khoa học công nghệ cấp Nhà
nước tư vấn tuyển chọn tổ chức và
cá nhân chủ trì thực hiện đề tài để
thực hiện trong kế hoạch năm
2007 thuộc Chương trình “Nghiên
cứu, phát triển và ứng dụng công
nghệ sinh học”, mã số KC.04/06-
10.
2 1769/QĐ-BKHCN,
ngày 28/8/2007
Quyết định về việc duyệt các tổ
chức, cá nhân trúng tuyển chủ trì
thực hiện đề tài năm 2007 (đợt II)
thuộc Chương trình “Nghiên cứu,
4
phát triển và ứng dụng công nghệ
sinh học”, mã số KC.04/06-10.
3 2809/QĐ-BKHCN,
ngày 27/11/2007
Quyết định phê duyệt kinh phí 04
đề tài, 03 dự án sản xuất thử
nghiệm bắt đầu thực hiện năm
2007 thuộc Chương trình KH&CN
trọng điểm cấp Nhà nước giai
đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu,
phát triển và ứng dụng công nghệ
sinh học”, mã số KC.04/06-10.
4
226/VPCTTĐ-THKH Quyết định điều chỉnh dự toán
kinh phí KC.04.10/06-10.
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dung
tham gia
chủ yếu
Sản phẩm
chủ yếu
đạt được
Ghi chú*
1
….
- Lý do thay đổi (nếu có):
5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người
kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
Tên cá nhân đăng
ký theo Thuyết
minh
Tên cá nhân
đã tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia
chính
Sản phẩm
chủ yếu đạt
được
Ghi
chú
*
1 Nguyễn Thị Thanh Nguyễn Thị Thanh Chủ nhiệm đề
tài; Hợp tác
Quốc tế; Cấu
trúc vector,
chuyển gen vào
lục lạp thuốc lá,
phân tích biểu
hiện gen,
Hợp tác Quốc
tế; Cấu trúc
vector, phân
tích biểu hiện
gen, protein.
5
protein.
2 Trần Văn Minh Trần Văn Minh Nuôi cấy mô
thực vật.
Tư vấn xây
dựng hệ
thống tái sinh
thuốc lá, cà
chua.
3 Nguyễn Hữu Hổ Nguyễn Hữu Hổ Nuôi cấy mô và
chuyển gen vào
lục lạp cây cà
chua.
Xây dựng hệ
thống tái sinh
và chuyển
gen vào lục
lạp cây cà
chua
4 Phan Tường Lộc Phan Tường Lộc Chuyển gen vào
lục lạp thuốc lá,
kỹ thuật sinh học
phân tử:gen,
protein.
Thu nhận và
phân tích các
dòng thuốc lá
chuyển gen
5 Phạm Đức Trí Phạm Đức Trí Chuyển gen vào
lục lạp cà chua,
kỹ thuật sinh học
phân tử: gen,
protein.
Thu nhận và
phân tích các
dòng cà chua
chuyển gen
6 Võ Phan Mi Sa Võ Phan Mi Sa Chuyển gen vào
thực vật, bảo
quản giống
thuốc lá, cà chua
in và ex vitro.
Bảo quản
giống thuốc
lá, cà chua in
và ex vitro.
7 Lê Tấn Đức Lê Tấn Đức Bảo quản giống
chủng vi sinh
vật, kỹ thuật sinh
học phân tử.
Bảo quản
giống vi sinh
vật mang gen
trong điều
kiện tối ưu
8 Mai Trường Mai Trường Bảo quản và giữ
giống in vi tro và
ex vitro thuốc lá,
cà chua.
Bảo quản và
giữ giống in
vi tro và ex
vitro thuốc lá,
cà chua.
6
- Lý do thay đổi ( nếu có):
6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số
lượng người tham gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,
số lượng người tham gia )
Ghi
chú*
1 - Nội dung: Phương pháp xác
định protein tái tổ hợp, kiểm tra
vector lục lạp mang gen HIV-1
p24, trao đổi vật liệu và kinh
nghiệm nghiên cứu.
- Thời gian: 60 ngày
- Kinh phí: 108 triệu,
- Địa điểm: Maynooy- Ireland
- Tên tổ chức hợp tác: Trường
Đại học Quốc gia Maynooth,
Ireland
- Số đoàn 1
- Số lượng người tham gia:1.
- Nội dung: Tham gia Hội
nghị khoa học sinh học;
phương pháp cấu trúc vector
lục lạp mang gen biểu hiện
trong lục lạ
p; phương pháp
tinh sạch protein tái tổ hợp.
- Thời gian: 26 ngày
- Kinh phí:
- Địa điểm: Maynooy- Ireland
- Tên tổ chức: Trường Đại
học Quốc gia Maynooth,
Ireland
- Số đoàn 1
- Số lượng người tham gia: 1.
2 Nội dung: Tham dự Hội nghị
Quốc tế
- Thời gian: 20 ngày
- Kinh phí: 92 triệu
- Địa điểm: Hoa Kỳ
- Số đoàn 1
- Số người 2
- Nội dung: Tham dự Hội
nghị Quốc tế về Sinh học
phân tử thực vật lần thứ 9
năm 2009.
- Thời gian: 10 ngày
- Kinh phí:
- Địa điểm: Tp. S.Louis,
Missouri, Hoa Kỳ
- Tên tổ chức: International
Society for Plant Molecular
Biology 9
th
IPMB Congress.
- Số đoàn: 1
- Số người: 1
3 Nội dung: Tham dự Hội nghị
Quốc tế
- Thời gian: 10 ngày
- Nội dung: Hội nghị Công
nghệ Thực vật lần thứ 12 năm
2010
7
- Kinh phí: 70 triệu
- Địa điểm: Hoa Kỳ
- Số đoàn 1
- Số người 1
- Thời gian: 10 ngày
- Kinh phí: 70 triệu
- Địa điểm: Tp. S.Louis,
Missouri, Hoa Kỳ
- Tên tổ chức: International
Association for Plant
Biotechnology 12
th
IAPB
Congress.
- Số đoàn: 1
- Số người: 1
- Lý do thay đổi (nếu có):
8
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm )
Ghi chú*
1 Tham dự và đăng bài
báo tại Hội nghị BIO-
Hà nội 2010
2
- Lý do thay đổi (nếu có):
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong
nước và nước ngoài)
Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc:tháng
11 năm 2007 đến
10/2010)
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Người,
cơ quan
thực hiện
1 Thiết kế vector lục lạp, tạo
dòng vi khuẩn E.coli mang
các gen biểu hiện trong lục
lạp
11/2007-
6/2008
6/2008
2 Xây dựng quy trình chuyển
gen, tái sinh cây thuốc lá, cà
chua biến nạp gen
12/2007-
1/2010
1/2010
3 Phân tích và xác định cây cà
chua, thuốc lá chuyển nạp
gen
12/2008-
4/2010
4/2010
4 Thu nhận, tách chiết tinh
sạch protein p24 từ cây thuốc
lá, cà chua biến đổi gen
12/2008-
3/2010
3/2010
5 Đánh giá hoạt tính của
protein kháng nguyên p24 từ
cây cà chua, thuốc lá biến đổi
gen
11/2008-
3/2010
8/2010
Nguyễn Thị Thanh
Trần văn Minh
Nguyễn Hữu Hổ
Phan Tường Lộc
Phạm Đức Trí
Võ Phan Mi Sa
Lê Tấn Đức
Mai Trường
Viện Sinh học Nhiệt
đới - Viện Khoa học
và Công nghệ Việt
Nam
9
- Lý do thay đổi (nếu có):
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất
lượng chủ yếu
Đơn
vị đo
Số
lượng
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
1 Vector biểu hiện trong lục lạp vector 2 2 2
2 Các dòng thuốc lá chuyển gen
HIV-1 p24
dòng 2-4 2-4 15
3 Các dòng cà chua chuyển gen
HIV-1 p24
dòng 1-3 1-3 1
4 Protein kháng nguyên HIV-1
p24 tinh sạch từ cà chua và
thuốc lá chuyển gen vào lục lạp
protein 1-2 1-2 2
5 Hoạt tính của protein kháng
nguyên HIV-1 p24
Kháng
nguyên
đặc
hiệu
Gram
(Phân
tích)
Gram
(Phân tích)
Gram
(Phân tích)
- Lý do thay đổi (nếu có):
b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần đạt
Số
TT
Tên sản phẩm
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
1 Quy trình chuyển gen tạo protein tái tổ
hợp vào lục lạp cây thuốc lá
1 1 Đạt
2 Quy trình chuyển gen tạo protein tái tổ
hợp vào lục lạp cây cà chua
1 1 Đạt
3 Phương pháp thu nhận và tinh sạch
protein kháng nguyên p24 từ cây chuyển
gen
1 1 Đạt
4 Phương pháp đánh giá hoạt tính của
protein kháng nguyên
1 1 Đạt
10
- Lý do thay đổi (nếu có):
c) Sản phẩm Dạng III:
Yêu cầu khoa học
Cần đạt
Số
TT
Tên sản phẩm
Theo
kế hoạch
Thực tế
đạt được
Số lượng, nơi
công bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1 Báo cáo khoa học 3 9
Trong nước: 7 bài
Quốc tế: 2 bài
Tên bài báo, tên tạp chí (Hội nghị) đã đăng
Trong nước
1 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Võ Phan Mi Sa, Phạm Đức Trí
(2009) Nghiên cứu chuyển gen vào lục lạp cây thuốc lá tạo protein kháng
nguyên HIV-1 p24. Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.49-54.
2 Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2009) Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống
nuôi cấy mô định hướng việc chuyển gen vào plastid cà chua (Solanum
lycopersicum L.). Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.183-188.
3 Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Phan tường Lộc, Nguyễn Thị Phương
Nam, Lê Tán đức, Phạm đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Tâm,
Võ Phan Mi Sa, Mai Trường (2009) Kết quả bước đầu trong nghiên cứu
chuyển gen HbsAg vào cây cà chua, gen ipt vào cây hoa cúc và gen tạo
ferritin vào cây ngô. Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.189-197.
11
4 Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2010) Bước đầu nghiên cứu chuyển
nạp gien vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum L.) bằng phương
pháp bắn gien. Tạp chí Nông nghiệp & phát triển Nông thôn 9: Tr. 22-26.
5 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Tôn Thất Huân, Phạm Đức Trí,
Hoàng Văn Dương (2010) Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen vào lục
lạp bằng phương pháp bắn gen. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8 (3A) : 619-
624.
6 Nguyễn Thị Thanh, Matthew S. McCabe, Philip John Dix (2010) Thiết kế
vector lục lạp mang gien HIV ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gien ở
cây trồng bằng phương pháp bắn gien. Tạp chí Nông nghiệp & phát triển
Nông thôn 9: Tr. 5-8.
7 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Tôn Thất Huân, Phạm Đức Trí
(2010) Nghiên cứu chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp cây thuốc lá tạo
protein kháng nguyên tái tổ hợp để ưng dụng trong y dược. Tạp chí Nông
nghiệp & phát triển Nông thôn 9: Tr. 9-14.
Quốc tế
1 Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ và đồng tác giả
(2009) Study on transformation of tomato plant (Lycopersicon esculentum
L.) with HIV-1 p24 and HBV genes. Proceedings of the 9th International
Congress of Plant Molecular Biology, St. Louis, Missouri, USA. October
25-30, 2009. p-1044.
2 Thanh Nguyen, Tuong-Loc Phan, Đuc-Tri Pham (2010) Biolistic
transformation of tobacco (Nicotiana tabacum L.) with antigen gene.
Proceedings of the 12
th
Congress of International Association for Plant
Biotechnology and 2010 In Vitro Biology Meeting of the SIVB, St. Louis,
12
Missouri, USA. June 6-11, 2010. p-123.
3 Chloroplast transformation in tobacco variety V2 to producing
recombinant protein antigen for Human Health. In press.
- Lý do thay đổi (nếu có):
d) Kết quả đào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Tiến sỹ 1 2 2011
- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
Đăng ký
Theo
Kế hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1
Thuốc lá và cà chua chuyển
gen HIV-1 p24
2 0
- Lý do thay đổi (nếu có):
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, quy trình đăng ký sở hữu trí tuệ thường kéo
dài từ 1-2 năm.
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Tên kết quả
đã được ứng dụng
Thời gian
Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa
chỉ nơi ứng dụng)
Kết quả
sơ bộ
1
2
13
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so
với khu vực và thế giới…)
- Về trình độ khoa học:
Sản phẩm của đề tài là protein kháng nguyên tái tổ hợp được tạo ra từ cây
biến đổi gen trong lục lạp làm nguyên liệu để tạo kít chẩn đoán và vắcxin để
phòng bệnh nguy hiểm ở người (HIV/AIDS). Công nghệ chuyển gen hữu ích vào
lục lạp hiện nay được xem là công nghệ tiến bộ nhất, là công nghệ đỉnh cao của
lai tạo giống cây trồng bằng công nghệ sinh học hiệ
n đại. Vì có nhiều ưu điểm
vượt trội so với phương pháp chuyển gen vào nhân tế bào: có kiểu di truyền theo
mẹ, mức độ biểu hiện gen cao (10.000 bản sao/tế bào), cây chuyển nạp gen đồng
nhất và bền vững, hàm lượng protein ở cây chuyển gen thu nhận được rất cao (70
% trên lượng protein hoà tan tổng số), độc tính protein lạ (ngoại lai) có thể được
giảm thiểu, bởi sự phân ngăn của lục lạ
p và ở lục lạp, có sự hình thành nối liên
kết (desulfide bond). Điều này làm cho lục lạp nơi lý tưởng sản xuất vắcxin,
dược sinh học, kháng nguyên, kháng thể, protein tái tổ hợp và như vậy, cây
chuyển gen lục lạp được xem như nhà máy sinh học (Bioreactor) trong tương lai.
Đề tài đã xây dựng được qui trình công nghệ chuyển gen vào lục lạp thực vật để
sản xuất protein HIV-1 p24 bao gồm đầy đủ các bước thiết kế vector l
ục lạp
chứa gen HIV-1 p24 ứng dụng chuyển gen vào lục lạp cây trồng, chuyển gen vào
HIV-1 p24 vào lục lạp các đối tượng thuốc lá, cà chua bằng phương pháp bắn
gen, tái sinh và thu nhận các dòng chuyển gen lục lạp đồng nhất, thu nhận
protein và xác định biểu hiện protein bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như
PCR, Southern blot, SDS-PAGE, Western blot, ELISA. Ngoài ra, qui trình này
14
sẽ làm cơ sở trong việc xây dựng qui trình chuyển gen hữu ích khác vào các loại
cây trồng chính trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam.
- Về trình độ công nghệ:
Đề tài đạt trình độ của của công nghệ tương đương trên thế giới và là một
hướng nghiên cứu mới ở nước ta, nhằm tạo ra cây trồng vừa là thực phẩm vừa là
dược phẩm (vắcxin, protein kháng nguyên có thể ăn được), để
phục vụ đời sống
đòi hỏi của con người ngày một cao. Ứng dụng công nghệ gen lục lạp là thành
tựu khoa học tiên tiến nhất trên thế giới hiện nay vào công cuộc tạo ra giống cây
trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt và có thể phòng và điều trị bệnh ở người
và vật nuôi, nhằm giảm bớt đói nghèo và bệnh tật ở Việt Nam.
- Về đ
ào tạo và nâng cao trình độ nhân lực KH&CN:
Đề tài góp phần nâng cao tiềm lực nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các
công nghệ nền của công nghệ sinh học như công nghệ gen thực vật, công nghệ
protein, phát triển công nghệ sinh học có giá trị cao, góp phần phát triển nền
công nghiệp sinh học ở Việt Nam, tiếp cận trình độ tiên tiến của thế giới. Đã đào
tạo cán bộ nghiên cứu của đơn vị, đã và
đang đào tạo sinh viên và 02 tiến sĩ về
kiến thức kinh nghiệm trong công tác nghiên cứu sinh học phân tử, nhất là
hướng nghiên cứu, phát triển công nghệ gen lục lạp nhằm tạo ra giống cây trồng
mang những đặc tính hữu ích phục vụ đời sống và sức khoẻ con người.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm
cùng loại trên thị trường…)
Đề tài chưa có sản phẩm có thể thương mại được ngay, nhưng đã tạo ra
được cây trồng có khả năng tạo protein kháng nguyên tái tổ hợp HIV-1 p24 để
ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất kit chẩn đoán và vắcxin phòng bệnh lây
15
nhiễm nguy hiểm HIV/AIDS có chiều hướng ngày càng gia tăng ở nước ta, góp
phần đóng góp cho sự phát triển nền công nghiệp sinh phẩm dược tại Việt Nam.
Nghiên cứu chuyển gen hữu ích vào lục lạp, để tạo ra các giống cây trồng
có năng suất cao, phẩm chất tốt và thân thiện với môi trường. Cây chuyển gen
lục lạp có nhiều điều thú vị nhất: vì có kiểu di truyền mẹ (maternal inheritance),
ngăn chặn đượ
c tình trạng giao phấn chéo đối với các cây trồng hoang dại khác,
vượt trội hơn hẳn ở trường hợp chuyển gen vào nhân tế bào. Hàm lượng protein
biểu hiện cao, độc tính của protein lạ có thể giảm tối thiểu đối với cây, bởi sự
phân ngăn của lục lạp, cây chuyển gen bền vững và đồng nhất, ở lục lạp có sự
hình thành nối liên kết (desulfide bond). Cây chuyển gen lục lạp đáp
ứng được
nhu cầu của con người và đất nước nông nghiệp Việt Nam.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
Lần 1:
Thiết kế vector lục lạp;
Xây dựng qui trình tái sinh cây
thuốc lá;
Xây dựng qui trình tái sinh cây
cà chua
5/2008 - 02 vector lục lạp;
- Qui trình tái sinh cây
thuốc lá;
- Qui trình tái sinh cây cà
chua
Lần 2
Nghiên cứu xây dựng qui trình
chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
thuốc lá bằng phương pháp bắn
gen;
Nghiên cứu xây dựng qui trình
chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
cà chua bằng phương pháp bắn
gen
11/2008 - Qui trình chuyển gen
HIV-1 p24 vào cây thuốc
lá bằng phương pháp bắn
gen;
- Qui trình chuyển gen
HIV-1 p24 vào cây cà
chua bằng phương pháp
bắn gen
16
Lần 3:
Phân tích và xác định cây cà
chua, thuốc lá chuyển gen;
Thu nhận, tách chiết và tinh
sạch protein p24 từ cây thuốc lá,
cà chua biến đổi gen
7/2009 Xác định các dòng thuốc
lá chuyển gen HIV-1 p24
bằng các phương pháp
sinh học phân tử;
Xác định dòng cà chua
chuyển gen HIV-1 p24
bằng các phương pháp
sinh học phân tử;
Protein HIV-1 p24 tái tổ
hợp từ cây biến nạp gen
Lần 4:
Nghiên cứu xây dựng qui trình
chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
cà chua bằng phương pháp bắn
gen; Phân tích và xác định cây
cà chua, thuốc lá chuyển gen
(tiếp theo kỳ II).
3/2010 Xác định và thu nhận 15
dòng thuốc lá chuyển gen
HIV-1 p24 trong lục lạp;
Xác định và thu nhận 01
dòng cà chua bi chuyển
gen trong lục lạp;
Phân tích và xác định cây
cà chua, thuốc lá chuyển
gen (PCR, Southern blot,
Western blot)
Lần 5:
Kiểm tra và đánh giá các dòng
thuốc lá và dòng cà chua
chuyển gen trong lục lạp;
Thu nhận và tinh sạch protein
p24 từ cây biến nạp gen;
Định lượng hoạt tính
8/2010 Thu nhận và tinh sạch
protein p24 từ cây biến
nạp gen;
Định lượng hoạt tính
protein kháng nguyên
HIV-1 p24 từ cây biến
nạp gen (ELISA)
II Kiểm tra định kỳ
Lần 1:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
5/2008 Đề tài đã triển khai các
nội dung 2008 và tiến độ
đúng như Hợp đồng và
thuyết minh;
Lần 2:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
11/2008 Đề tài đã triển khai các
nội dung 2008 và tiến độ
đúng như Hợp đồng và
thuyết minh;
Lần 3:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
7/2009 Đề tài tích cực thực hiện
các nội dung.;
17
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
Chậm tiến độ giải ngân.
Lần 4:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
3/2010 Đề tài thực hiện các nội
dung và giải ngân chậm.
Lần 5:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
8/2010 Đề tài cần hoàn thành tất
cả các nội dung và tiến
độ giải ngân để nghiệm
thu đề tài đúng thời gian
đăng ký (tháng 10/2010).
III Nghiệm thu cơ sở 12/2010 Đạt (đủ điều kiện đánh
giá kết quả đề tài cấp
Nhà nước).
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)
Nguyễn Thị Thanh
MỤC LỤC
THÔNG TIN CHUNG 1
Phần I:
MỞ ĐẦU………………………………………………… 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7
Phần II:
BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ THỰC HIỆN CÁC
NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI………… 34
Các nội dung Khoa học Công nghệ đã thực hiện 35
Chương I: THIẾT KẾ VECTOR LỤC LẠP VÀ TẠO DÒNG VI
KHUẨN E. COLI BIỂU HIỆN GEN HIV-1 P24…………………… … 38
I. Giới thiệu chung…………………………………………………… 39
II. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 43
1. Lưu giữ và tạo các dòng E. coli mang các gen lục lạp và gen
HIV-1 p24………………………………………………….……………… 44
2. Thiết kế vector biểu hiện gen trong lục lạp thuố
c lá và cà chua……… 62
3. Phân tích biểu hiện protein HIV-1 p24 của chủng E. coli chứa plasmid
Vector pIBT-HIV-1 p24………………………………………… 86
Chương II : XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN, TÁI SINH
CÂY THUỐC LÁ, CÀ CHUA CHUYỂN GEN……………………… 108
Phần A:
Xây dựng quy trình chuyển gen, tái sinh cây thuốc lá,
chuyển gen……………………………………………………………. …. 109
I. Giới hiệu chung………………………………………………………… 110
II. Nội dung nghiên cứu……………………………………………………. 113
1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây thuốc lá ứng dụng cho chuyển
gen……………………………………………………………………… 114
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
thuốc lá bằng phương pháp bắn gen………………………………… 126
Nội dung nghiên cứu 127
2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất chọn lọc lên các mẫu mô lá, chồi
và tối ưu hoá các điều kiện bắn gen…………………………………… … 128
2.2 Nuôi cấy vi khuẩn mang gen, tách chiết và tinh sạch plasmid DNA
dùng cho bắn gen……………………………………………………… 140
2.3 Phương pháp bọc plasmid DNA vào hạt vàng và các điều kiện tối ưu,
ứng dụng cho bắn gen…………………………………………………… 147
2.4 Chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp bằng phương pháp bắn gen…… 158
2.5 Tái sinh và thu nhận các dòng thuốc lá chuyển gen………………. … 170
Phần B:
Xây dựng quy trình chuyển gen, tái sinh cây cà chua chuyển
gen………………………………………………………………………… 182
I. Giới thiệu chung 183
II. Nội dung nghiên cứu 189
1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây cà chua dùng cho chuyển nạp
gen……………………………………………………………………… 190
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen HIV-1 p24 vào cây cà chua
(Lycopersicon esculentum) bằng phương pháp bắn gen……………… 200
2.1 Thử ảnh hưởng của spectinomycin và streptomycin lên sự hình thành mô
sẹo cà chua
(Lycopersicon esculentum)…………………………… 202
2.2 Nuôi cấy vi khuẩn mang gen, tách chiết và tinh sạch plasmid DNA,
xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA, cuẩn bị cho bắn gen ………… 211
2.3 Phương pháp coating vàng với plasmid DNA, xác định khoảng cách, độ tuổi
mẫu mô, ảnh hưởng của áp lực khí lên mẫu mô, tìm ra chỉ số không gây ảnh
hưởng đến mô……………………………………………………………… 217
2.4 Chuyển gen HIV-1 p24 vào lạp thể cà chua (Lycopersicon esculentum)
bằng phương pháp bắn gen………………………………………………. 228
3. Tái sinh và thu nhận các dòng cà chua chuyển gen…………………… 243
4. Kiểm tra các dòng cà chua chuyển gen trong tiêu chuẩn cơ sở………. 248
Chương III : PHÂN TÍCH VÀ XÁC ĐỊNH CÂY CÀ CHUA, THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN……………………………………………………………. 256
3.1 Phân tích và xác định cây thuốc lá chuyển gen……………………… 257
I. Giới thiệu chung………………………………………………………… 258
II. Nội dung nghiên cứu 264
1. Phương pháp PCR, phát hiện gen HIV-1 p24 trong mô thuốc lá 265
2. Xác định gen HIV-1 p24 trong bộ gen lục lạp thuốc lá 275
3. Giải trình tự gen HIV-1 p24 từ các dòng thuốc lá chuyển gen 287
4. Phương pháp Southern blot xác định các dòng thuốc lá chuyển gen trong
lục lạp 301
3.2 Phân tích và xác định cây cà chua chuyển gen 315
I. Giới thiệu chung………………………………………………………… 316
II. Nội dung nghiên cứu 319
1. Phương pháp PCR, phát hiện gen HIV-1 p24 trong mô cà chua 320
2. Xác định gen HIV-1 p24 trong bộ gen lục lạp cà chua 328
3. Giải trình tự gen HIV-1 p24 chu từ dòng cà chua chuyển gen 336
4. Phương pháp Southern blot xác định các dòng cà chua chuyển gen trong
lục l
ạp 347
Chương IV: THU NHẬN, TÁCH CHIẾT TINH SẠCH PROTEIN P24 TỪ
CÂY BIẾN ĐỔI GEN TRONG LỤC LẠP 357
Thu nhận và tinh sạch protein HIV-1 p24 từ cây thuốc lá chuyển
gen 358
I. Giới thiệu chung ………………………………………………………… 359
II. Nội dung nghiên cứu.…………………………………………… 372
1. Thu nhận và tinh sạch protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ cây chuyển
gen………………………………………………………………………… 373
2. Phương pháp phân tích biểu hiện protein bằng Bioanalyser……………. 388
3. Phương pháp kiểm nghiệm protein bằng Western blot…………………. 412
Chương V: ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KHÁNG NGUYÊN
HIV-1 P24 TỪ CÂY BIẾN ĐỔI GEN………………………………… 424
Định lượng hoạt tinh c
ủa protein HIV-1 p24 từ cây thuốc lá chuyển
gen…………………………………………………………………… 425
Phương pháp miễn dịch học ELISA………………………………………. 426
1. Giới thiệu………………………………………………………………. 427
2. Vật liệu và phương pháp………………………………………………. 431
3. Kết quả và thảo luận…………………………………………………… 436
4. Kết luận………………………………………………………………… 443
Phần III:
CÁC KẾT QUẢ VÀ SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
ĐẠT ĐƯỢC CẢU ĐỀ TÀI……………………………………. 444
Sản phẩm Dạng I…………………………………………………………… 445
Sản phẩm Dạng II………………………………………………………… 446
