Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (+PA) sử dụng trong điều trị

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT
HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ
Mã số K10.28/06-10







Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi

8672



HÀ NỘI - 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10



BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT
HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ
Mã số K10.28/06-10



Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì

PGS. TS. Quyền Đình Thi

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ









Hà nội, 2010


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:
9 Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban chủ nhiệm chương trình KC.10/06-10, Văn
phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước đã cấp kinh phí.
9 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài
thực hiện đúng tiến độ.
9 Các đơn v
ị phối hợp: Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sản phẩm y tế;
Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương; Trung tâm phòng chống độc – Học viện
Quân y; Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gene và Phòng Hóa sinh
protein – Viện Công nghệ sinh học
9 Các cán bộ tham gia đề tài và một số cộng sự khác.

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
TT Họ và tên Cơ quan Trách nhiệm trong đề tài

1. PGS. TS. Quyền Đình Thi Phòng CNSH Enzyme Chủ nhiệm đề tài
2. PGS. TS. Nông Văn Hải Phòng CN ADN ứng dụng Chủ nhiệm đề tài nhánh
3. PGS. TS. Hoàng Văn Lương Học viện Quân y Chủ nhiệm đề tài nhánh
4. ThS. Vũ Hồng Diệp Bộ KH&CN Thành viên
5. ThS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh Phòng CNSH Enzyme Thành viên
6. ThS. Nguyễn Thị Thảo -nt- Thành viên
7. CN. Nguyễn Thị Hiền Trang -nt- Thành viên
8. CN. Đào Thị Tuyết -nt- Thành viên
9. TS. Nguyễn Hải Hà Phòng CN ADN ứng dụng Thành viên
10. CN. Nguyễn Văn Phòng -nt- Thành viên
11.
và một số cộng sự khác


Chủ nhiệm đề tài







PGS. TS. Quyền Đình Thi




MỤC LỤC
BÁO CÁO TỔNG HỢP 1
MỞ ĐẦU 1

1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị 2
1.1.1 Bệnh nghẽn mạch 2
1.1.2 Điều trị bệnh nghẽn mạch 3
Các thuốc điều trị thế hệ 1 3
Các thuốc điều trị thế hệ 2 4
Các thuốc điều trị thế hệ 3 4
1.2 Thuốc điều trị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme 6
1.3 Tình hình nghiên cứu SK 9
1.3.1 Giới thiệu chung về SK 9
1.3.2 Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới 12
Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli 12
Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris 14
Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus 15
Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác 15
1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 16
1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hiện tPA 17
1.4.1 Chất hoạt hóa plasminogen mô người 18
1.4.2 Vai trò của tPA trong quá trình làm tan máu đông 20
1.4.3 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 21
1.4.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22
1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài 22
2 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24
2.1 Vật liệu và hóa chất 24
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24
Các chủng liên cầu khuẩn 24
Các chủng vi sinh vật chủ, vector nhân dòng và biểu hiện 24
Mẫu mô và máu 24
Các dòng tế bào động vật chủ, vector biểu hiện 24
2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25

Hóa chất 25
Thiết bị 26
2.1.3 Môi trường nuôi cấy 27
2.1.4 Dung dịch và đệm 27
2.2 Phương pháp nghiên cứu 28
2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật 28
Nuôi cấy 28
2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 29
Tinh sạch protein tái tổ hợp 29
Định tính SK 30
Đinh lượng SK bằng phương pháp so màu 30
Xây dựng đường nồng độ SK chuẩn 31
Loại bỏ và kiểm tra nội độc tố vi khuẩn 31
Điện di SDS-PAGE 31
Western blot 32
Nhận dạng protein 32
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính và độ bền SK 33
2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 33
Phân tích gene 33
Phản ứng PCR khuếch đại và dung hợp 34
Tách chiết DNA tổng số 34
Đọc trình tự và phân tích gene 34
Tinh sạch plasmid 35
Tinh sạch phân đoạn DNA 35
Điện di agarose 36
Biến nạp plasmid 36


2.2.4 Lên men và tạo chế phẩm SK thô và SK tinh sạch 37
2.2.5 Các phương pháp biểu hiện tPA ở tế bào động vật 38

Tách chiết RNA tổng số 38
RT-PCR để nhân cDNA 38
Tạo dòng và xác định trình tự gene 39
Thiết kế plasmid biểu hiện 39
Tinh chế vector biểu hiện (Kit Qiagen for maxi-prep) 40
Phần mềm phân tích DNA 40
Nuôi cấy tế bào CHO-S 41
Biểu hiện tPA ở tế bào CHO-S 41
Tinh sạch sơ bộ tPA từ E. coli 42
Xác định hoạt tính tPA 42
Sơ chế tPA 42
Tinh chế tPA 43
2.2.6 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 44
2.2.7 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu huyết học, chức năng gan thận và
các tác dụng phụ 47

3 NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 48
A. NỘI DUNG (1+3+4): NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SK TÁI TỔ HỢP 48
3.1 Phân lập chủng gây tan huyết 48
3.2 Nhân dòng, phân tích gene sk từ S. pyogenes và S. equisimilis 52
3.3 Thiết kế, biểu hiện gene sk từ S. pyogenes DT17 ở E. coli 55
3.3.1 Thiết kế, biểu hiện gene sk trong pET22b
+
55
Biểu hiện SK ở E. coli BL21 55
Biểu hiện SK ở E. coli BL21 (DE3) plysE và plysS 56
3.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp SK 58
Nhiệt độ sinh trưởng 59
Nhiệt độ sinh tổng hợp SK tối ưu 59
pH môi trường ban đầu tối ưu 60

Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 60
3.3.3 Tinh sạch và nhận dạng SK tái tổ hợp 61
Tinh sạch SK 61
Nhận dạng SK 61
3.3.4 Đánh giá tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp 65
Nhiệt độ phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ 65
pH tối ưu và độ bền pH 66
Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bền của SK tái tổ hợp 67
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên độ bền của SK tái tổ hợp 68
Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính của SK tái tổ hợp 69
Hoạt hóa SK 69
3.4 Biểu hiện đoạn msk từ S. pyogenes trong E. coli 70
3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện msk 70
3.4.2 Biểu hiện và tinh sạch mSK 71
Biểu hiện và tinh sạch mSK có đuôi 6xhis 71
Biểu hiện và tinh sạch mSK không có đuôi 6xhis 72
3.5 Biểu hiện gene msk từ S. pyogenes DT17 ở B. subtilis 73
3.5.1 Thiết kế cấu trúc biểu hiện acoAamyE-sk-T7 73
3.5.2 Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện msk 73
3.5.3 Biểu hiện và tinh sạch SK từ chủng B. subtilis tái tổ hợp 74
3.5.4 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ B. subtilis 75
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền SK 75
Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính SK 76
Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính SK 77
3.6 Biểu hiện gene sk từ S. pyogenes DT17 ở Pichia pastoris 77
3.6.1 Nhân dòng phụ sk 77
3.6.2 Thiết kế plasmid pPSK 78
3.6.3 Biểu hiện SK ở P. pastoris 79
3.6.4 Tối ưu các điều kiện biểu hiện 80
Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu 80

pH môi trường nuôi cấy tối ưu 81
Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 81


3.6.5 Tinh sạch SK từ P. pastoris 81
3.6.6 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ P. pastoris 83
Độ bền nhiệt độ 83
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền 83
Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 84
Ảnh hưởng của ion kim loại 85
3.7 Sản xuất chế phẩm SK 85
3.7.1 Lên men chủng E. coli BL21 tái tổ hợp BLSK.2 85
3.7.2 Sản xuất SK-his
+
tái tổ hợp sạch 85
Thu dịch SK và loại bỏ nội độc tố 85
Tinh sạch SK 87
3.8 So sánh một số tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp với SK thương phẩm 89
So sánh hoạt tính riêng 89
So sánh độ bền nhiệt 89
B. NỘI DUNG 2+3+4: NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM TPA TÁI TỔ HỢP 91
3.9 Nhân dòng và xác định trình tự gene mã hóa tPA người 91
3.9.1 Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa tPA người 91
RNA tổng số 91
cDNA mã hóa tPA 91
Tạo plasmid nhân dòng 91
Phân tích trình tự tPA 92
3.9.2 Sản xuất chế phẩm tPA tái tổ hợp 95
Chọn vector và dòng tế bào thích hợp 95
Quy trình nuôi cấy tế bào 96

Các plasmid biểu hiện tPA ở tế bào động vật 97
Dòng tế bào biểu hiện tPA 99
3.9.3 Sản xuất và tinh chế tPA ở quy mô phòng thí nghiệm 100
Nuôi cấy tế bào CHO-S để sản xuất tPA 100
tPA sơ chế 100
Tinh chế tPA 101
3.10 Thử nghiệm tác dụng phân giải huyết khối của tPA trên động vật thí nghiệm 102
3.10.1 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 102
Cho điểm thần kinh 102
Thời gian chuột vận động tự do trong vòng 5 phút 103
Thời gian chuột vận động trên trục quay Rota-rod 103
Đánh giá trí nhớ không gian kết hợp vận động bằng mê lộ nước 104
3.10.2 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu toàn thân, huyết học, chức năng gan
thận và các tác dụng phụ 105

Chỉ tiêu toàn thân 106
Các chỉ số huyết học và sinh hóa máu 106
4 KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 107
4.1 Kết quả nổi bật 107
4.2 Công bố 111
Bài báo 111
Trình tự gene đã đăng ký GenBank 111
Đăng ký bản quyền 112
4.3 Đánh giá chung 112
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117
TÀI LIỆU THAM KHẢO 119
PHỤ LỤC 124


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulphate
B. subtilis Bacillus subtilis
DNA Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
IU International unit
kb Kilobase
kDa KiloDalton
LB Luria and Bertani
OD Optical density
P. pastoris Pichia pastoris
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
sak
Gene mã hóa staphylokinase
SDS Sodium dodecyl sulfate
sk
Gene mã hóa streptokinase
SK Streptokinase
SOC Super Optimal broth with Catabolite repression
Taq
Thermus aquaticus polymerase
rpm Round per minute
v/v Volume/volume
w/v Weight/volume

1

BÁO CÁO TỔNG HỢP
MỞ ĐẦU
Hiện nay, bệnh tim mạch là nguyên nhân số một gây tử vong tại nhiều quốc gia

trên thế giới. Một trong những nguyên nhân quan trọng của bệnh tim mạch là tắc
nghẽn mạch máu, với tình trạng ứ đọng mạch máu với cục máu đông, có thể dẫn tới
nhồi máu cơ tim cấp tính và đột quỵ do thiếu máu cục bộ và cả hai đều dẫn đến t
ử
vong. Trước đây, để ngăn chặn các cơn đau tim do nghẽn mạch, người ta thường sử
dụng một số thuốc có bản chất hóa học như aspirin, ticlopidine, hoặc phẫu thuật để lấy
hoặc thông tắc nghẽn, hoặc tạo ra mạch phụ để cấp mới máu. Nhưng trong những năm
gần đây, đã có một cuộc cách mạng trong liệu pháp điều trị
làm tan khối huyết do
những rối loạn tuần hoàn máu khác nhau (như nghẽn mạch phổi, nghẽn tĩnh mạch sâu,
nhồi máu cơ tim) là sử dụng các yếu tố phân giải fibrin. Những nghiên cứu đã chỉ ra
rằng các yếu tố phân giải sự nghẽn mạch là có khả năng duy nhất hoạt hóa các thành
phần bên trong hệ thống thủy phân fibrin để phá vỡ cục máu đông, khôi phục lại sự
lưu thông dòng máu trong hệ
mạch đã bị nghẽn [1]. Các yếu tố này không trực tiếp
phân giải fibrin mà hoạt hóa plasminogen có mặt trong máu thành plasmin và chính
plasmin sẽ trực tiếp phân giải fibrin. Các yếu tố hoạt hóa plasminogen thường được sử
dụng như streptokinase (SK), staphylokinase (Sak), urokinase (uPA) và yếu tố hoạt
hóa plasminogen mô (tPA). Trong số đó tPA rất được quan tâm bởi khả năng hoạt hóa
plasminogen đặc hiệu và không gây phản ứng phụ. Bên cạnh đó hai yếu tố SK và Sak
cũng là sự l
ựa chọn thích hợp vì những kết quả so sánh trong việc thử nghiệm điều trị
và hiệu quả giá thành cũng như không bị hạn chế về mặt khai thác lâm sàng của nó so
với các yếu tố hoạt hóa khác.
Mặt khác, ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên
cứu sản xuất dược phẩm còn nhiều hạn chế, nguồn nguyên liệu vẫn chủ yếu d
ựa vào
việc nhập khẩu. Do đó, việc áp dụng công nghệ sinh học, sinh học phân tử trong
nghiên cứu tạo các chế phẩm y dược là một nhiệm vụ thiết yếu và có tính khả thi cao
đối với tình hình thực tiễn ở nước ta. Xuất phát từ thực tế đó, Phòng CNSH Enzyme,

Viện Công nghệ sinh học với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của Bộ KH&CN, chương
trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nướ
c KC10-06/10 đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp
streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị.
2

1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị
1.1.1

Bệnh nghẽn mạch
Bệnh nghẽn mạch xảy ra khi huyết khối làm tắc tĩnh mạch hoặc động mạch. Tùy
thuộc vị trí nghẽn mạch, bệnh được chia thành hai thể là tắc động mạch và tắc tĩnh
mạch.
Bệnh tắc tĩnh mạch do yếu tố V: Yếu tố nguy cơ thông thường của tắc nghẽn tĩnh
mạch là xuất hiện yếu tố V Leiden, một biến thể củ
a yếu tố V của quá trình đông máu.
Biến thể này bị bất hoạt rất chậm, giảm 10 lần so với nguyên thể. Điều này làm cho nó
tồn tại lâu hơn trong máu và làm cho máu ở tình trạng quá đông. Một copy của gene
mã hóa yếu tố V Leiden sẽ làm tăng nguy cơ nghẽn mạch lên 4-8 lần, trong khi đó với
2 copy của gene này nguy cơ sẽ tăng tới 80 lần. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V
Leiden chiếm 20-40% các bệnh nghẽn mạch và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân
cư [2].
Bệnh nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin có chức năng ức chế hoạt
động của một số các yếu tố đông máu như thrombin, các yếu tố IXa, Xa thông qua
hình thành phức hợp bền vững với rất nhiều yếu tố khác nhau. Heparin và heparan
sulfat làm tăng hoạt tính của antithrombin lên gấp 1000 lần.
Sự thiếu hụt antithrombin là một trong nh
ững nguyên nhân gây nên bệnh tắc

nghẽn mạch. Khoảng 2% số người bị chứng tắc nghẽn mạch được ghi nhận là thiếu
antithrombin. Tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng là 1/2000 đến 1/5000. Bệnh mang yếu
tố di truyền thể trội trên nhiễm sắc thể thông thường. Khiếm khuyết do đột biến gene
tác động tới quá trình tổng hợp hoặc ổn định yếu tố này. Bệnh thường gặ
p là nghẽn
mạch phổi và tĩnh mạch, ít thấy tắc nghẽn động mạch. Chứng nghẽn mạch có thể xảy
ra một cách tự phát hoặc liên quan với phẫu thuật, chấn thương và thai nghén [2].
Tắc nghẽn động mạch: nguyên nhân có thể do xơ vỡ động mạch gây ra khi tăng
lượng mỡ máu. Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi. Khi mỡ và canxi lắng đọng làm dầy
thành mạ
ch, lúc này hình thành máu đông trên bề mặt của thành mạch bị biến dạng.
Đây là yếu tố kích hoạt cho con đường đông máu nội sinh.
Con đường nội sinh được kích hoạt khi các yếu tố đông máu tiếp xúc với bề mặt
điện tích âm. Đây được gọi là pha tiếp xúc, là kết quả của tương tác với phospholipid
của phần tử lipoprotein tuần hoàn như chylomicron và lipid phân tử thấp trong máu.
Đây là nền tảng của sự ti
ền nghẽn mạch do tăng mỡ máu gây nên và làm tiến triển xơ
3

vữa động mạch. Sự tiếp xúc làm hoạt hóa con đường nội sinh gây ra quá trình đông
máu [3].
Khi nghẽn động mạch xảy ra tại động mạch vành là hai mạch máu từ động mạch
chủ cung cấp máu cho cơ tim thì sẽ gây ra nhồi máu cơ tim. Khi chúng xảy ra tại hệ
tuần hoàn não, có thể gây nên đột quỵ hoặc thiếu oxi cho các cơ quan khác.
1.1.2

Điều trị bệnh nghẽn mạch
Trước đây, bệnh nghẽn mạch được kiểm soát bằng sử dụng các chất kháng đông
như heparin và coumarin để kìm hãm sự tạo thành fibrin. Mặc dù có các chất kháng
đông hóa học và các phương pháp phẫu thuật, bệnh tắc nghẽn mạch cấp tính vẫn còn

là nguyên nhân gây tử vong ở lứa tuổi trung niên và tuổi già.
Khi nhận ra rằng sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống bởi
một quá trình bao gồm s
ự chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin,
một enzyme hoạt động, người ta đã nghĩ đến cách điều trị mới là sử dụng các chất hoạt
hóa plasminogen (PA). Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng cách tiếp cận tốt nhất
để điều trị chứng nghẽn mạch (hòa tan huyết khối) là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một
enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme thường
được sử dụng nhất trong cách
điều trị này là streptokinase từ vi khuẩn và urokinase
(uPA) từ nước tiểu của người. Trong 20 năm gần đây, người ta còn sử dụng 3 enzyme
phân giải cục nghẽn mới trong một số trường hợp là arvin (từ một loài rắn độc ở Mã
Lai), reptilase (từ một loài rắn ở Nam Mỹ) và brinase (từ một loài nấm mốc
Aspergillus oryzae) [4].
Việc sử dụng và nghiên cứu thuốc làm tan huyết khối để điề
u trị các rối loạn huyết
khối gây tắc mạch bắt đầu vào nǎm 1933. Các nghiên cứu tập trung vào tác dụng phân
hủy fibrin của các chất phân lập từ cầu khuẩn tan huyết beta. Tuy nhiên do số liệu về
hiệu quả sử dụng thuốc thời gian đó không đầy đủ, nên việc dùng thuốc làm tan huyết
khối bị hạn chế. Dẫn liệu đầu tiên sử dụng trị liệu làm tan huyết kh
ối để điều trị nhồi
máu cơ tim (AMI) bắt đầu vào nǎm 1958 khi Fletcher sử dụng trị liệu streptokinase
liều cao, kéo dài [5]. Việc sử dụng các chất có bản chất protein để điều trị AMI có thể
được phân thành 3 giai đoạn theo Bachmann [6] như sau:
Các thuốc điều trị thế hệ 1
Việc thử nghiệm điều trị AMI bằng SK lần đầu tiên được nhóm nghiên cứu của
tr
ường đại học St. Louis, Mỹ thực hiện vào những năm cuối của thập kỷ 60 [5, 7, 8].
Một vài năm sau, UK được phát hiện là một chất gây tan huyết và được chính Fletcher
và sau đó là Sasahara et al. (1967) dùng điều trị tắc mạch phổi [9]. Mối quan tâm về sử

4

dụng các thuốc làm tan huyết khối trên lâm sàng bị hạn chế cho tới cuối những nǎm
1970 vì còn nghi ngờ về nguy cơ chảy máu do trị liệu đem lại. Khoảng những năm
1980, nhận thức về nguyên nhân gây tắc mạch vành là do các cục máu nghẽn được
Dewood et al. (1980) đi tiên phong nghiên cứu và được Rentrop et al. (1981) chứng
minh về tác dụng của SK trong thông tắc động mạch vành [10, 11]. Thêm vào đó, khi
DeWood et al. (1985) chứng minh tỉ lệ nút huy
ết khối trong 24 giờ đầu nhồi máu cơ
tim và đưa ra bằng chứng của "tái ngập máu tự động" trong những giờ sau nhồi máu,
hội y học vẫn dè dặt thừa nhận vai trò của huyết khối động mạch vành trong việc xảy
ra nhồi máu cơ tim [12]. Các nhà nghiên cứu khác cũng góp phần tạo bước ngoặt
nghiên cứu trong giai đoạn đầu và giữa thập niên 80, chứng minh lợi ích của trị liệu
làm tan huyết khối, mà hiện nay có vai trò cứu sống hàng nghìn người mỗi nǎm.
Các thuốc điều trị thế hệ 2
Vào cuối những năm 1980, tPA và urokinase được nhân dòng [13], [14] và
APSAC (anistreplase) được sinh tổng hợp [15]. Cả ba loại thuốc này được thử nghiệm
rộng rãi trên người. Thời kỳ này vẫn được coi là khởi đầu của các cuộc điều trị qui mô
lớn nhằm khám phá các chế độ điều trị khác nhau, bắ
t đầu với ISIS-2 một nghiên cứu
quốc tế về di chứng nhồi máu cơ tim (ISSIS-2, 1988). Trong thời kỳ này, SK được so
sánh với tPA [16, 17], APSAC, staphylokinase và urokinase [18, 19] cho thấy sự đặc
hiệu fibrin khác nhau giữa các thuốc có bản chất protein này.
Bên cạnh đó, hiệu quả của trị liệu làm tan huyết khối liên quan giữa thời điểm
dùng thuốc với thời điểm khởi phát nhồi máu cơ tim cũng được nghiên cứu. Thử
nghiệm GISSI-1 (nghiên cứu về điều trị nhồi máu cơ tim của tập đoàn Gruppo
Italiano) đã chứng minh tỉ lệ tử vong trong 21 ngày đầu giảm gần 50% ở bệnh nhân
được điều trị bằng streptokinase tĩnh mạch ngay khi triệu chứng khởi phát. Trong thử
nghiệm GSSI được công bố năm 1986, 11.806 bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính
được điều trị với streptokinase trong vòng 12 giờ đầu bằng

đường tĩnh mạch và bằng
placebo. Tỷ lệ tử vong giảm đáng kể ở những bệnh nhân được điều trị bằng
streptokinase trong vòng 6 giờ đầu. Đặc biệt, ghi nhận tỷ lệ tử vong giảm tới 50% đối
với bệnh nhận được điều trị trong vòng 1 giờ từ lúc bắt đầu triệu chứng [20].
Các thuốc điều trị thế hệ 3
Sau khi ch
ứng minh nút huyết khối là trung gian xẩy ra nhồi máu cơ tim cấp
(AMI), tính khả thi của việc dùng khẩn cấp streptokinase trong động mạch vành được
chứng minh và mang lại tác dụng có lợi cho cơ tim bệnh nhân. Thử nghiệm SK trong
mạch vành ở Western Washington, đã chứng minh giá trị của việc trị liệu này [21, 22].
5

Vào những năm 1990, qui mô điều trị được mở rộng với các thuốc gây tan huyết
khác nhau như thử nghiệm GUSTO (ứng dụng toàn cầu chất hoạt hóa plasminogen của
mô và streptokinase để điều trị nghẽn mạch vành) hay GISSI-2, ISIS-3 so sánh SK và
tPA [23, 24]. Đây là thời kỳ của những sáng tạo to lớn của loài người. Hàng trăm thể
đột biến của tPA và UK, các thể lai có chứa các tiểu phần của tPA, UK và
plasminogen đã được tạ
o ra và thử nghiệm [25, 26]. Trong khi tìm kiếm các chất có
khả năng liên kết với fibrin tốt hơn, một hợp chất hai chức năng được tạo ra gồm có
PA liên kết antifibrin hoặc kháng thể kháng tiểu cầu và các chất đặc hiệu cao với fibrin
như staphylokinase và PA từ loài dơi quỷ đã được nhân dòng và thử nghiệm trên động
vật, sau đó là trên người. Những thể đột biến của tPA có thời gian bán phân hủy dài
hơn như
reteplase và tenectaplase (TNK-tPA) được tạo ra. Những thử nghiệm lâm
sàng tiếp theo sau đó với những thuốc làm tan huyết khối gồm có streptokinase (SK),
activase (tPA), retavase (r-PA) và TNK-tPA ghi nhận có sự cải thiện về tỷ lệ sống sót
ở các bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính được điều trị tan huyết khối [24].
Cuối những nǎm 1980, các nhà khoa học đã sử dụng công nghệ sinh học và công
nghệ tái tổ hợp DNA để tạo ra nhiều thu

ốc tan huyết khối đặc hiệu. Tại Cuba, Trung
tâm Công nghệ và kỹ thuật gene Cuban đã sản xuất streptokinase dưới tên thương mại
là Herberkinasa và đã tiến hành nhiều nghiên cứu điều trị thử nghiệm AMI. Thử
nghiệm đầu tiên được tiến hành vào 1992-1995 với 2923 bệnh nhân bị AMI. Kết quả
cho thấy tỷ lệ tử vong giảm 28,3% với 179 bệnh nhân được cứu sống thêm hàng năm.
Trong đó tỷ lệ ch
ảy máu chỉ ghi nhận ở 9 bệnh nhân, chiếm khoảng 0,3% [27]. Cũng
trong thời kỳ này, các nhà ngiên cứu về tim mạch đã nhận thấy giá trị ngày càng tăng
của việc trị liệu bằng thuốc kết hợp với các chất ức chế thrombin như hirudin,
argatroban và chất ức chế thụ thể GpIIb/IIIa (các chất ức chế glycoprotein tiểu cầu)
như các kháng thể đơn dòng abciximab và các chất ức chế dạng tổ
ng hợp. Một số thử
nghiệm qui lâm sàng mô lớn được tiến hành trên các bệnh nhân phẫu thuật tim mở,
ghép gan, chảy máu không kiểm soát và ung thư máu thể nguyên bào tủy ở qui mô nhỏ
hơn.
Theo Vyas et al. (2007), trong số các chất có khả năng phân hủy huyết khối được
sử dụng điều trị thì dường như SK là được sử dụng thường xuyên nhất do giá thành
thấp hơn so với tPA và UK. Ngoài ra, việc lựa chọn ch
ế phẩm điều trị còn phụ thuộc
vào hàng loạt các yếu tố ngoài giá cả như các phản ứng phụ và mức độ nghiêm trọng
của chúng, tốc độ đào thải, ái lực với fibrin, phản ứng miễn dịch v.v. SK, một chất
hoạt hóa plasminogen có hiệu lực cao, thời gian bán phân hủy trong huyết tương tương
đối dài là một lợi thế cho việc lựa chọn để điều tr
ị so với các loại thuốc khác [28].
6

Song do không đặc hiệu với fibrin nên việc sử dụng các liều điều trị hiệu quả lại
thường gây ra hoạt hóa một cách hệ thống plasminogen và kết quả là gây chảy máu do
phân hủy các yếu tố đông máu dưới tác dụng của plasmin trong hệ tuần hoàn. Tuy
nhiên, nếu tạo cho phân tử SK một ái lực với fibrin sẽ làm tăng đáng kể hiệu quả điều

trị. Một trong các giải pháp hữ
u hiệu được áp dụng là anisoyl hóa phức hợp chất hoạt
hóa plasmin streptokinase (APSAC) với tên thương mại là Eminase của Tập đoàn
thương mại Beecham. Trong đó, gốc serine của plasmin, một vị trí quan trọng đối với
phản ứng xúc tác, bị acyl hóa thuận nghịch. Kết quả điều trị bằng APSAC là sự hoạt
hóa plasminogen diễn ra chậm hơn do việc khử acyl cho serine trong phức hợp xảy ra
rất chậm trong hệ th
ống mạch máu [15]. Điều này cũng dẫn tới việc giảm lượng
plasmin tự do trong hệ tuần hoàn và kết quả là quá trình thủy phân fibrin trở nên hiệu
quả hơn với các liều điều trị thấp hơn.
Rõ ràng, hiểu biết và chuyên môn trong dùng thuốc đã được mở ra trong giai đoạn
chừng 15 nǎm và có thay đổi đáng kể trong điều trị và tiên lượng AMI.
1.2 Thuốc điều tr
ị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme
Có 5 thuốc tan huyết khối được phép dùng ở Mỹ: alteplase (tPA tái tổ hợp);
streptokinase (SK), tách chiết từ cầu khuẩn tan máu beta; urokinase (UK), có nguồn
gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa streptokinase plasminogen
anisoylat hóa (APSAC); và tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hoạt hóa
plasminogen của mô người (tPA) gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành
plasmin.
Streptokinase (SK) là một loại thuốc rất hi
ệu quả và rẻ, do nó là một sản phẩm
của vi khuẩn. SK bám vào plasminogen tạo nên phức enzyme. Phức này xúc tác
chuyển hóa plasminogen thành dạng hoạt động là plasmin có khả năng phân hủy fibrin
làm tan huyết khối trong lòng mạch. Nghiên cứu trên các bệnh nhân tình nguyện chỉ ra
rằng, huyết khối tĩnh mạch bị hòa tan khi được tiêm streptokinase vào tĩnh mạch. Do
đó, enzyme này được lựa chọn sử dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn tĩnh mạch sâu và
t
ắc mạch phổi [29].
tPA, yếu tố hoạt hóa của tổ chức, được sản xuất bằng con đường tái tổ hợp cũng

rất hiệu quả nhưng lại rất đắt. Nó không có vấn đề miễn dịch như đối với
streptokinase. Đầu tiên nó gắn với fibrin, sau đó phức này bán vào plasminogen tạo
nên phức 3 và từ đó hoạt hóa plasminogen để phân hủy fibrin [30].
7

Urokinase phân cắt trực tiếp plasminogen tuần hoàn trong máu thành plasmin
thông quan cắt liên kết L-arginyl-L-valyl. Urokinase an toàn hơn so với streptokinase,
nhưng rất đắt do việc sản xuất và khai thác lâm sàng bị hạn chế. Urokinase được dùng
chủ yếu để điều trị huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch
catheter, trong khi 3 thuốc khác được chỉ định điều trị AMI. Do kết quả trực tiếp của
việc dùng thuốc tan huyế
t khối nên tỉ lệ tử vong sau AMI giảm rõ rệt, và hiểu biết về
dùng hợp lý thuốc phụ trợ khác nhau đã phát triển.
Urokinase và streptokinase thuộc cùng loại thuốc, nhưng urokinase đắt hơn nhiều,
vì vậy streptokinase thường là thuốc được sử dụng hàng đầu để điều trị AMI.
Urokinase được dùng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu, và hay
dùng nhất là tiêu hủy huyế
t khối tại chỗ (nghĩa là thông huyết khối bằng catheter
IV) [31].
Altepase (tPA) theo lý thuyết có tác dụng là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (nghĩa
là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với fibrin). Plasmin được tạo ra chủ
yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy toàn thân. Tuy
nhiên, điều quan trọng là cần có suy nghĩ rằng hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối,
và vớ
i liều cao hơn vẫn ảnh hưởng tới toàn thân.
Sử dụng tiến bộ công nghệ sinh học đã tạo ra alteplase, APSAC được triển khai để
cố gắng tránh tình trạng phân hủy toàn thân tiến triển nhanh sau khi dùng
streptokinase. APSAC chỉ là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ
sinh học tạo ra một phức streptokinase plasminogen chất này bị khử acyl hóa thành
streptokinase chậm ở tốc độ có thể không gây tình trạng phân hủy. Điều không may là

liều APSAC cần thi
ết để làm tan huyết khối gây tình trạng phân hủy toàn thân [15].
Tenecteplase là chất hoạt hóa plasminogen dạng mô TNK tái tổ hợp đặc hiệu tiêu
fibrin, chúng có tác dụng tiêu huyết khối trên hệ thống phân hủy fibrin nội sinh để biến
plasminogen thành plasmin. Không giống streptokinase hoặc urokinase, phần lớn tác
dụng của alteplase hoặc tenecteplase phụ thuộc vào sự có mặt fibrin. Chúng chỉ
chuyển hóa một lượng tối thiểu plasminogen thành plasmin khi không có fibrin.
Tenecteplase làm tǎng tính đặc hiệu fibrin so với alteplase, tuy nhiên ý nghĩa lâm sàng
của đặc hi
ệu fibrin vẫn chưa được xác định [31].
Ngoài 5 thuốc như kể trên, hiện nay nattokinase cũng được ứng dụng rộng rãi để
điều trị các trường hợp có trạng thái đông máu cao. Nattokinase có các tác dụng hòa
tan trực tiếp fibrin, ngăn cản sự đông máu và sự tạo thành huyết khối bằng cách làm
tăng quá trình sản xuất plasmin và các yếu tố hòa tan cục nghẽn khác của cơ thể, bao
8

gồm urokinase nội sinh; kìm hãm ACE, enzyme chuyển hóa angiotensin, vì vậy làm
giảm áp lực của máu. Enzyme tự nhiên này có nhiều hứa hẹn trong việc điều trị các
bệnh tim mạch. Nattokinase được dùng như một chế độ bổ sung dinh dưỡng giúp duy
trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị
và phòng ngừa các bệnh lý có liên quan tới huyết khối như viêm động-tĩnh mạ
ch, bệnh
tim thiếu máu, đau thắt ngực, suy giảm trí nhớ ở người già, đột quỵ… [32, 33].
Ngoài ra, một số thuốc khác đang trong giai đoạn thử nghiệm như arvin, brinase,
reptilase v.v. Arvin, brinase và reptilase được sử dụng kém thường xuyên hơn nhưng
có khả năng thay thế cho heparin như là chất kháng đông. Tuy nhiên chúng chưa được
chấp nhận rộng rãi do các nghiên cứu lâm sàng của chúng còn hạn chế.
Reptilase, một enzyme có khả năng cắt chuỗi peptit A trên fibrinogen,
được tách
chiết từ nọc rắn Nam Mỹ Bothrops atrox. Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng

reptilase thay thế heparin hoặc discoumarol trong việc ngăn ngừa sự tái tạo huyết khối
ở các bệnh nhân trải qua phẫu thuật tĩnh mạch rất ít gây biến chứng chảy máu. Enzyme
này thủy phân trực tiếp fibrin và không có hoạt tính hoạt hóa plasminogen [3].
Brinase, một enzyme thủy phân fibrin giống plasmin, được tìm thấy trong dịch
chiết của mốc
Aspergillus oryzae, có khả năng thủy phân fibrin và fibrinogen [4]. Đã
có các nghiên cứu chỉ ra rằng các bệnh nhân bị tắc mạch có thể được phục hồi trong
vài phút sau khi điều trị bằng brinase. Các bất lợi của việc điều trị bằng brinase là
trước đó phải sử dụng chất kìm hãm protease huyết tương và có các ảnh hưởng phụ
khác như: chứng phù nề, hematoma và đau tại vùng được điều trị.
Serrapeptase (Serratia peptidase)
, là một enzyme thủy phân fibrin do các chủng
vi khuẩn trong ruột Serratia E15 sinh ra. Khi được uống dưới dạng viên không được
bảo vệ hoặc dưới dạng viên nang, enzyme này bị phá hủy bởi axit trong dạ dày. Tuy
nhiên, các viên thuốc có lớp bảo vệ cho phép enzyme đi qua dạ dày mà không bị thay
đổi, và được hấp thụ vào ruột. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng serepeptase có
tính thủy phân fibrin, kháng viêm và chống phù nề trong một số mô và rằng các ảnh
hưởng kháng viêm của nó hiệu quả hơ
n so với các enzyme thủy phân protein khác.
Bên cạnh khả năng làm giảm viêm, nó còn có thể giảm đau bởi vì nó có khả năng ngăn
chặn sự giải phóng các amin gây đau từ các mô sưng tấy. Các bác sỹ ở khắp châu Âu
và châu Á đã ghi nhận tính kháng viêm và giảm đau của thuốc này và đang sử dụng
như một chất thay thế cho salicylate. Liều lượng của serapeptase cho một ngày là 10-
30 mg, chia làm 3 lần [34].
9

Boluoke là một sản phẩm mới (tên thương mại của Lumbrokinase) có thể hòa tan
huyết khối mà không có nguy cơ làm xuất huyết. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra
rằng các bệnh nhân sử dụng lumbrokinase trong một tháng thì bệnh được cải thiện
đáng kể. Bolouke rất an toàn và hiệu quả. Một trong những thành phần của

Lumbrokinase là bột giun đất Lumbricus rubellus, enzyme thủy phân fibrin. Do có ái
lực cao với fibrin nên Lumbrokinase khắc phục được những ảnh hưởng bất l
ợi gây
chảy máu. Chế phẩm này có thể có một ảnh hưởng đáng kể trong việc ngăn ngừa và
điều trị bệnh thiếu máu não cục bộ. Bolouke có thể được áp dụng rộng rãi trong việc
điều trị bệnh nhồi máu cơ tim, nhồi máu phổi, điếc và mù lòa do tắc mạch. Boluoke rất
dễ sử dụng có thể được sử dụng trường diễn làm một tác nhân chống đ
ông. Boluoke
không phản ứng ở trong dạ dày, ruột, nó có thể được sử dụng như là một chất thay thế
đối với bệnh nhân không thể dùng aspirin. Boluoke cũng có thể được sử dụng trong
việc ngăn ngừa và điều trị tình trạng đông máu cao ở bệnh nhân mắc các bệnh mạn
tính như bệnh tiểu đường, bệnh tim phổi, u ác tính, bệnh lupus ban đỏ, bệnh tăng hồng
cầu, nghẽn m
ạch, viêm thận tiểu cầu, bệnh thiếu máu do chảy máu và bệnh gan. Là
thuốc chống đông máu và nghẽn mạch duy nhất dưới dạng thuốc uống mà có hoạt tính
như urokinase và tPA, Boluoke có thể được áp dụng trong điều trị bệnh nghẽn mạch
phối hợp với các thuốc chống đông máu khác. Từ năm 1990, bệnh viện Xuanwu của
trường y Jiangxi Medical College đã nghiên cứu phản ứng lâm sàng và đặc tính đông
máu của 453 b
ệnh nhân bị bệnh thiếu máu não. Kết quả chỉ ra rằng thuốc có hiệu quả
với 93% bệnh nhân, trong đó, đáp ứng tốt đạt tỷ lệ 73% [35].
1.3 Tình hình nghiên cứu SK
1.3.1

Giới thiệu chung về SK
Streptokinase (SK) (EC 3.4.99.22) là một protein ngoại bào do SK do các chủng
Streptococcus nhóm A, C và G sinh ra. SK được coi là độc tố nguy hiểm của
Streptococcus do nó tạo ra plasmin, một chất làm lan truyền vi khuẩn từ nơi tập trung
ban đầu thành tình trạng nhiễm trùng bởi hiện tượng tiêu sợi huyết và thoái hóa dịch
ngoại bào và các cấu thành của màng cơ sở.

Streptokinase tự nhiên gồm 440 amino acid, trong đó 26 amino acid đầu N là
peptide tín hiệu sẽ bị cắt bỏ trong quá trình tiết protein ra ngoài môi trường thành
protein trưởng thành với 414 amino acid, không có cầu nối disulfide. Phân t
ử SK
trưởng thành là một chuỗi đơn, khối lượng phân tử khoảng 47 kDa với điểm đẳng điện
tại pH 4,7 và pH tối ưu là 7,3-7,6 [36], được chia thành 3 vùng: alpha, beta và gama.
Mỗi vùng đều liên kết với plasminogen, mặc dù không vùng nào có thể hoạt hóa
10

plasminogen một cách độc lập. Vùng α (từ amino acid 1 đến 150), β (từ amino acid
151 đến 287) và γ (từ amino acid 288 đến 414) (hình 1.1) [37]. Trong đó, theo Fabian
et al. (1992), cấu trúc dạng xoắn α chiếm 17%, dạng dải β chiếm 28%, dạng vòng
chiếm 21% và các cấu trúc ngẫu nhiên khoảng 34%.
A
B
Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử streptokinase.
A: Cấu trúc 3D (SK (vàng + xanh) liên kết với plasmin (tím))[38];
B: Cấu trúc tinh thể vùng beta của SK [39].
Vùng bảo thủ cao α và γ (có độ tương đồng đến trên 85%) chiếm hầu hết các vị trí
tiếp xúc với plasmin và có tác động hiệp lực trong hoạt hóa plasminogen.
Vùng alpha nằm ở đầu N của phân tử streptokinase, chứa 1vòng di động duy nhất
do các gốc 45-70 tạo thành. Vòng di động này được cho là không xuất hiện ở vùng
tương ứng của các chất hoạt hóa plasminogen khác. Vòng này có tác dụng nhận biết
plasminogen, không có chức năng hình thành trung tâm hoạt động trong phức hợp ch
ất
hoạt hóa-cơ chất. Song việc gắn kết này lại gây ra sự biến đổi của trung tâm hoạt động
trong plasminogen [40].
Vùng β không tiếp xúc trực tiếp với vị trí hoạt động của plasmin, song nó lại cần
thiết để hỗ trợ cắt ngắn phân tử plasminogen thông qua vòng hình kẹp tóc lộ trên bề
mặt (vòng 250) được tạo giữa các gốc 251 và 262 (hình 1.1B) [39]. Trong khi đó, vùng

giữa amino acid 144 và 218 tạo thành vòng thứ hai (vòng 170) lại thể hiện s
ự không
đồng nhất trong trình tự. Nghiên cứu của Sergio và Kenneth (2005) chỉ ra rằng các
chuỗi bên của các amino acid không bảo thủ nằm trong vòng 170 được định vị trên bề
mặt, nằm cách xa nửa tiếp xúc với plasmin của SK, không có ảnh hưởng đến hoạt hóa
plasminogen. Điều này cho thấy rằng tính đa hình của SK không liên quan trực tiếp
đến liên kết và hoạt hóa plasminogen, song thay vào đó, có thể quyết định đặc điểm
sinh học liên quan đến bệnh lý củ
a chủng vi sinh vật [39]. Có thể khẳng định rằng,
vùng cấu trúc β của phân tử streptokinase (SK) rất cần thiết cho việc hoạt hóa
plasminogen và là một vùng có trình tự đa dạng liên quan đến sự viêm nhiễm và bệnh
11

tật của các chủng Streptococcus nhóm A. Quá trình sinh đột biến của vùng đa hình này
không làm biến đổi khả năng hoạt hóa plasminogen của protein này mà có thể coi như
biến đổi chức năng đối với bệnh do Streptococcus gây nên [41].
Streptokinase có khả năng liên kết và hoạt hóa plasminogne người và có thể đóng
vai trò quan trọng trong độc tính của Streptococcus do tạo ra hoạt tính phân giải
protein trên bề mặt tế bào vi khuẩn và làm cho việc xâm nhập các tổ chức củ
a vật chủ
được dễ dàng hơn [37].
Từ những năm 1933, Tillet và Garner đã khám phá khả năng phân hủy huyết
khối của SK và cho rằng nó có hoạt tính enzyme trực tiếp đối với fibrin và gọi là
fibrinolysin [42]. Song cho đến năm 1941, Milestone đã chứng minh được tác động
gián tiếp của SK đối với fibrin thông qua việc hoạt hóa plasminogen - một chất ức chế
quá trình đông máu [43]. Năm 1945, Christensen sau khi nghiên cứu SK từ các dịch
chiết vi khuẩn Streptococcus đã chính th
ức đặt tên cho nó như được gọi ngày nay [44].
Cơ chế hoạt hóa và ức chế plasminogen trong quá trình phân hủy fibrin được mô
tả trong hình 1.2 [45, 46]. Theo đó, các chất hoạt hóa (CHH) kết hợp với plasminogen

tại vị trí liên kết tạo thành phức hợp plasminogen-CHH tạo thuận lợi cho phức hợp này
sau đó liên kết với fibrin để phân hủy nó. Ngược lại, các chất ức chế kết hợp với
plasminogen tại vị trí liên kết chất ức ch
ế để tạo thành phức hợp plasminogen-chất ức
chế. Phức hợp này không có khả năng liên kết với fibrin do vị trí liên kết đã bị chiếm
mất, do vậy không thể phân hủy fibrin.

Hình 1.2. Sự hoạt hóa và ức chế quá trình tan huyết
Streptokinase hoạt hóa plasminogen theo con đường gián tiếp như một chất hoạt
hóa. Ban đầu, SK liên kết với plasminogen theo tỷ lệ 1:1, tạo thành phức hợp đẳng
phân tử ái lực cao (high-affinity equimolar complex) hay còn được gọi là phức hợp
chất hoạt hóa [47]. Do sự liên kết này, phức hợp tạo thành bị biến dạng và trở thành
một enzyme với trung tâm hoạt động nằm trên nửa plasminogen. Enzyme này sau đó
có khả năng cắt các liên kết peptide L-arginyl-L-valyl trên các phân tử plasminogen
Vùng liên kết
lysine
Phân hủy
Không phân
hủy
Hoạt hóa
Vùng enzyme
tiềm năng
Aminocaproic
acid
12

khác (giữa gốc 560 và 561) để tạo ra plasmin, một enzyme thuộc họ serine protease.
Các enzyme đã được hoạt hóa này tiếp đến có khả năng phân hủy fibrin thành các sản
phẩm thoái hóa dạng hòa tan [47-50].
1.3.2

Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới
SK được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh nghẽn mạch. Tuy nhiên SK được
tách chiết từ những chủng tự nhiên gây bệnh cho con người và năng suất thấp là những
lý do chính để tiến hành nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp. Có 3 loài được sử dụng
phổ biến trong việc nhân dòng và biểu hiện gene là Streptococcus pyogenes,
S. equisimilis và S. uberis. Hiện có 142 trình tự gene mã hóa SK (sk) được đăng ký
trong GenBank, trong đó có 115 gene từ các chủng
Streptococcus pyogenes, 23 gene
từ các chủng S. equisimilis và 4 gene mã hóa SK từ các chủng S. uberis.
Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli
Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng
S. equisimilis H46A, biểu hiện trong E. coli và S. sanguis thu được SK có đặc tính sinh
học như chủng tự nhiên. Để biểu hiện trong E. coli, tác giả đã sử dụng vector
pACYC184 và pBR322. Kết quả nghiên cứu cho thấy SK có mặt cả ngoại bào 17%,
nội bào 52% và thể vùi 30% với hoạt tính thu được dao động từ 8 đến 100 U/ml d
ịch
nổi môi trường.
Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng S. pyogenes type
1 và được Estrada et al. (1992) biểu hiện trong E. coli W3110 cho SK có hoạt tính như
SK tự nhiên. Hiệu suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số [51].
Ko et al. (1995) đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong
E. coli. Họ đã thay thế trình tự peptide tín hiệu của SK bằng peptide tín hiệu ompA, sử
dụng vector biểu hiện pKK223-3 dưới sự kiểm soát củ
a tac promoter làm vector biểu
hiện trong E. coli JM109. Chủng tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong môi trường LB
thông thường ở 30°C. Hoạt tính của dịch nuôi cấy đạt 5.000 U/ml sau 12 giờ cảm ứng
bằng IPTG, trong đó, 95% SK biểu hiện được tiết ra ngoại bào và thể nội màng. Đặc
biệt, hoạt tính SK trong dịch nổi môi trường tăng mạnh sau 4 giờ cảm ứng và đạt cực
đại sau 10 giờ cảm ứng [52]. Cũng vào năm này, Kubo

et al. đã nghiên cứu hoạt hóa
SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả đã xử lý bằng nhiệt độ để tái cuộn xoắn cấu trúc
cho SK bị biến tính do tác dụng của guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C tỏ ra
hiệu quả hơn so với hoạt hóa thông thường ở 25°C, tăng 10% hoạt tính enzyme và
25% hoạt tính riêng. Các tác giả cũng nhận thấy rằng, hoạt tính enzyme tăng lên cùng
với độ pha loãng dịch hồi tính [53].
13

Avilan et al. (1997) đã nhân dòng gene sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong
E. coli JM105. Thu được SK tương ứng với SK tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu được là
các protein với khối lượng phân tử là 47,5; 45 và 33 kDa [54].
Johnsen et al. (1999) nhân dòng SK từ chủng S. uberis NCTC 3858 và đọc trình tự
cho thấy SK của chủng này tương đồng khoảng 26% với SK của S. pyogenes và S.
equisimilis [55]. Protein suy diễn có 286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25
amino acid. So sánh trình tự amino acid với các SK từ S. pyogenes và S. equisimilis
cho thấy SK t
ừ S. uberis thiếu các amino acid đầu C.
Năm 1999, Caballero et al. sử dụng vector pQE30 (Qiagen) để biểu hiện SK trong
E. coli cho protein có hoạt tính tương đương với protein tự nhiên [56]. Cũng trong thời
gian này, Pupo et al. (1999) đã biểu hiện nội bào đối với gene sk từ S. equisimilis sử
dụng vector biểu hiện pTrp tương tự như của Estrada. Hiệu suất biểu hiện đạt 15%
protein tổng số [57]. Tuy hiệu suất biểu hiệ
n thấp hơn so với Estrada (25% protein
tổng số), song SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn.
Để nghiên cứu sự khác biệt giữa các SK của S. equisimilis được phân lập từ ngựa,
lợn và người, Caballero et al. (1999) đã nhân dòng và biểu hiện sk của các chủng vi
khuẩn này trong E. coli với vector pQE30. Kết quả cho thấy SK nguồn gốc từ ngựa
tương đồng ít với các SK từ lợn và người. Trong khi
đó, SK từ lợn được cho là có một
phần cấu trúc và chức năng tương tự như của người [56]. Họ cũng khám phá rằng tuy

có sự khác biệt như vậy, nhưng các SK này cùng có một cách thức tương tác với
plasminogen như nhau và các plasminogen của người, ngựa, lợn đều bị cắt cùng tại
một vị trí bảo thủ cao.
Năm 2007, Reza et al. đã sử dụng vector pGEX-4T-2 để biểu hiệ
n SK trong
E. coli với mức biểu hiện 50% protein tổng số. Đây là vector sử dụng tac promoter và
mang gene mã hóa glutatione S transferase (GST). GST kết hợp với SK được cho là
làm tăng độ bền của SK. Nhóm nghiên cứu đã biểu hiện trong 3 dòng tế bào E. coli
BL21 là E. coli BL21 (DE3); E. coli BL21 (DE3) plysS và E. coli BL21 (DE3)
CodonPlus. Các dòng tế bào E. coli BL21 này thiếu hụt các sản phẩm gene protease
trong bào tương như Lon, OmpT, DegP và HtpR với mục đích tạo năng suất biểu hiện
cao cho protein hội nhập. K
ết quả nghiên cứu cho thấy tế bào E. coli BL21 (DE3)
plysS cho năng suất cao nhất tới 15000 U/ml dịch nuôi cấy [58].
Để nâng cao năng suất biểu hiện của chủng E. coli tái tổ hợp, nhiều tác giả đã cải
tiến điều kiện nuôi cấy. Năm 1999, Zhang et al. sử dụng nuôi lắc bổ sung dưỡng chất
để tăng năng suất biểu hiện SK trong E. coli. Năng suất biểu hiệ
n đạt
14

12,9 g cho 20 lít dịch nuôi cấy (0,65 g/L). Mới đây, Goyal et al. (2009) đã nghiên cứu
phương pháp nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất kết hợp với tối ưu các điều kiện nuôi cấy
để biểu hiện cao sản SK tái tổ hợp trong E. coli [59]. Các tác giả đã khảo sát nồng độ
oxy hòa tan, nguồn nitơ và pH môi trường đến sinh trưởng tế bào và biểu hiện nội bào
của SK trong E. coli BL21 (DE3). Tăng nồng độ oxy hòa tan từ 30% lên 50% không
thấy có ảnh hưởng đáng kể tới nuôi lắc, song đối với nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất
thì năng suất biểu hiện tăng vượt bậc, từ 188 mg/L lên 720 mg/L. Việc bổ sung cao
nấm men và tryptone vào môi trường nuôi cấy, đồng thời kiểm soát pH môi trường
bằng NaOH cũng làm tăng đáng kể năng suất biểu hiện (gấp tới 2 lần). Tổng hợp các
điều kiện nuôi cấy, nă

ng suất biểu hiện đạt 1120 mg SK/L dịch nuôi cấy, tăng gấp 14
lần so với ban đầu. Đây là số liệu cao nhất được báo cáo đến thời điểm hiện nay.
Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris
Năm 1989, Hagenson et al. đã biểu hiện sk trong nấm men, sử dụng promoter của
alcohol oxidase từ P. pastoris, cảm ứng bằng methanol. Gene sk được hội nhập vào
genome của nấm men và nuôi biểu hiện cho năng suấ
t 77 mg protein/L và hoạt tính
SK đạt 3000 U/ml [60].
Năm 2000, Pratap et al. đã nhân dòng sk từ S. equisimilis và biểu hiện trong Pichia
pastoris. Họ đã sử dụng peptide tín hiệu của yếu tố α và oxidase promoter của chính
P. pastoris để kiểm soát biểu hiện của cấu trúc hội nhập. Các tác giả đã thu được SK
với khối lượng phân tử 55 kDa lớn hơn SK gốc chỉ 47 kDa song có hoạt tính tương
đương với SK tự nhiên. Thông thường, SK dễ dàng b
ị phân hủy trong môi trường sinh
tổng hợp dưới tác dụng của các protease do trạng thái không gấp khúc của phân tử.
Pratap et al. đã sử dụng phương pháp lai Western để nhận diện SK. Kết quả cho thấy
SK có kích thước 55 kDa do bị glycosyl hóa trong tế bào chủ. SK thu được có có ưu
điểm là tăng độ bền nhiệt ở 25°C và 37°C và tăng độ bền từ 30-40% so với các dạng
không bị glycosyl hóa trước tác động của các protease trong môi trường. Hoạt tính SK
đạt 3200 U/ml dị
ch nuôi cấy [61].
Năm 2009, Vellanki et al. đã biểu hiện sk trong P. pastoris. Gene sk được nối ghép
xuôi chiều với promoter của glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase và được đưa
vàp P. pastoris. Chủng tái tổ hợp được biểu hiện cho hoạt tính 1120 U/ml. Các nguồn
nitơ, nguồn carbon được khảo sát sử dụng thiết kế thống kê Plackett–Burman cho thấy
dextrose và peptone là nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp với chủng
P. pastoris. Các điề
u kiện tối ưu được dự đoán là 2,9% dextrose; 2,49% peptone;
15

pH 7,2; nhiệt độ 30,4°C và năng suất đạt 2136 U/ml. Tuy nhiên các nghiên cứu thực tế
cho năng suất đạt 2089 U/ml, tăng 95% so với năng suất ban đầu [62].
Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus
Năm 1986, Klessen et al. lại tiếp tục biểu hiện gene sk trong Bacillus subtilis, tuy
nhiên hoạt tính SK lại bị giảm ở cuối pha sinh trưởng do các protease của chính
B. subtilis tiết ra làm bất hoạt [63].
Năm 1994, Wong et al. đã sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biể
u hiện trong
chủng B. subtilis WB600 là chủng đã đột biến mất 6 protease ngoại bào. Các nhà
nghiên cứu thấy rằng trong quá trình tiết SK ra môi trường, 10-20% SK bị thoái hóa từ
dạng 47 kDa thành dạng 44 kDa. Dạng SK này có trình tự đầu N như nhau, song bị cắt
ngắn 31 hoặc 32 gốc amino acid đầu C. Điều này làm giảm hoạt tính sinh học của
protein. Nguyên nhân của sự thoái hóa được cho là do một số gốc amino acid kỵ nước
trong phân tử SK là đích của chymotrypsin-một protease được t
ế bào tiết ra. Để giải
quyết vấn đề này, nhóm nghiên cứu đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamine tại
vị trí 29 được thay bằng lysine. Kết quả thu được SK có hoạt tính tăng 2,5 lần [64].
Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác
Năm 1985, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng ery, chlo, tet) để biểu hiện
SK vào S. sanguis (nhóm H) thu được protein có tính chất sinh học như SK tự nhiên.
Tuy nhiên, khối lượng phân tử của protein thu được chỉ là 42 kDa, thấp hơn so v
ới
SK tự nhiên có thể là kết quả của quá trình hậu dịch mã [65].
Năm 2004, Kumar và Singh đã sử dụng một dạng nấm men Sz. Pombe bị đột biến
mất hoạt tính protese ngoại bào, một loài có nhiều tính chất như các tế bào nhân chuẩn
bậc cao để biểu hiện SK. Họ đã sử dụng promoter điều hòa bằng thiamine và peptide
tín hiệu Plus pheromone của tế bào chủ. Kết quả thu được SK hầu như không b
ị biến
đổi và được tiết ngoại bào với hiệu suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu
suất biểu hiện đạt 24,5 mg/L và hoạt tính riêng là 1581 U/mg protein có thể so sánh

được với biểu hiện trong E. coli và P. pastoris [66].
Năm 2006, Sriraman et al. đã sử dụng chủng Lactococcus lactis để biểu hiện gene
sk với promoter P170. SK thu được bị thủy phân do tác động của môi trường nuôi cấy,
vì vậy hiệu suất biểu hiệ
n thấp. Tác giả nhận thấy dưới điều kiện nuôi cấy ở pH thấp,
trong môi trường có glucose, lactic acid sẽ tích tụ và làm gây đáp ứng kháng acid cho
tế bào. Điều này ảnh hưởng tới khả năng sản xuất streptokinase tái tổ hợp. Khi cải tiến
điều kiện nuôi cấy, tăng pH và nồng độ phosphate ban đầu, hiệu suất sinh SK tăng
2,5 lần [67].
16

Năm 2007, Pimienta et al. đã biểu hiện SK của chủng S. equisimilis ATCC9542
trong Streptomyces lividans rất thành công. SK thu được với hiệu suất cao và hoạt tính
tốt. Các tác giả đã gắn gene sk với peptid tín hiệu của chất ức chế subtilisin từ chủng
Streptomyces venezuelae CBS762.70 (vsi) và peptide tín hiệu của xylanase C từ chủng
Streptomyces lividans (xlnC). Kết quả là hiệu suất biểu hiện ở S. lividans cao hơn khi
sử dụng peptide tín hiệu của vsi và đạt 15 mg SK/L dịch nuôi c
ấy. Nhóm nghiên cứu
đã sử dụng sắc ký lỏng DEAE-sephacel để tinh sạch dịch nổi nuôi cấy, thu được hai
dạng SK trưởng thành với kích thước là 44 kDa và 47 kDa có trình tự đầu N tương tự
nhau. Hoạt tính riêng của protein tinh sạch đạt 2661 U/mg protein [68].
1.3.3

Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong nước chưa có một công bố nào về nghiên cứu các chủng sinh tổng hợp
streptokinase, mặc dù thế giới đã phát triển thành thuốc từ khoảng hai chục năm trở lại
đây. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về SK tái tổ hợp ở Việt Nam.
Trước đây, đã có một số đề tài nghiên cứu trong nước về việc đánh giá hiệu quả sử
dụng thuốc SK để điề
u trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp. Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu

nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng dụng điều trị
bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng” (Sở
khoa h
ọc và Công nghệ Hải Phòng).
Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung (2003) đã nghiên cứu cách điều trị huyết khối
trong tai biến mạch máu não. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã đưa ra công thức và
phác đồ điều trị huyết khối. Các thuốc làm phân hủy huyết khối đã được thành lập
trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số tác động qua cơ chế kích hoạt plasmin và
chính plasmin sẽ làm phân giải huyết khối. Các thuốc ly giải huyết kh
ối gồm
streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA [69].
Năm 2004, Trần Minh Tâm et al. đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Điều trị tiêu sợi
huyết bằng streptokinase trong nhồi máu cơ tim cấp”. Tác giả đã nêu một số nhận xét
bước đầu về việc sử dụng thuốc streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị
nhồi máu cơ tim ở BV đa khoa tỉnh Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 [70]. Tiêu sợi
huyế
t bằng streptokinase trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành công là 63%. Theo dõi
trong 30 ngày, bệnh nhân phục hồi tốt, ít bị biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận
được.
Các nghiên cứu khác liên quan tới các enzyme tương tự như tPA, nattokinase,
urokinase, lumbrokinase cũng rất hạn chế. Đa số là các nghiên cứu sử dụng các
17

enzyme này như thế nào trong điều trị bệnh nhồi máu như “Áp dụng thuốc rTPA trị
liệu bốn trường hợp thiếu máu não cấp tại bệnh viện Nhân dân Gia Định” của Phan
Công Tân, Nguyễn Cảnh Nam và Nguyễn Văn Mừng.
Lê Thị Thu Hiền et al. (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ bản (mã số 614206, Số: 1851/QĐ
-

BKHCN) “Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue plasminogen
activator, TPA) tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y-dược” trong thời gian 2006-2008.
Đây là nhóm đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về sản xuất tPA.
Nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Ngọc Dao (Viện Công nghệ sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế
phẩm tương tự như Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có tên khoc
h
ọc Lumbricus rubellus) từ giun quế Việt Nam (tên khoa học Perionyx escavatus) có
tác dụng làm tan cục máu đông trong nghẽn mạch [71-73]. Sau khi thử nghiệm trên
động vật, chế phẩm đã được thử nghiệm trên 30 bệnh nhân tình nguyện tại Hà Nội bị
tai biến mạch máu do viêm tắc động mạch đã cho kết quả tốt. Nhóm nghiên cứu đã
phát hiện loại giun quế nói trên tại Trung tâm dê thỏ Ba Vì (Hà Nội), có đặc điểm gần
giố
ng loài giun mà Trung Quốc (Eisenia fetida), Nhật Bản (L. rubellus), Hàn Quốc (L.
rubellus) đang dùng để sản xuất Lumbrokinase. Loài giun này được trung tâm nuôi
dùng làm thức ăn cung cấp đạm cho động vật. Các nhà khoa học đã loại bỏ đất, cát, tạp
chất ở giun rồi sau đó đưa vào sấy khô giun ở nhiệt độ thấp để không làm biến mất
enzyme cần thiết. Sau đó, giun được nghiền thành bột rồi pha chế với một số ph
ụ gia
để cho thành phẩm dưới dạng bột [74].
Thời gian qua, nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Ngọc Dao cũng đang
nghiên cứu tạo enzyme này bằng công nghệ tái tổ hợp gene để thu được enzyme tinh
khiết hơn, thuận lợi cho việc làm thuốc chữa bệnh.
Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã nhân dòng thành công gene mã hóa subtilisin
từ hai chủng Bacillus subtilis có độ tương đồng 99% với trình tự amino acid của một
enzyme khác đã được làm thuốc chống t
ắc nghẽn mạch máu là Nattokinase. Trình tự
gene mã hóa subtilisin của hai chủng Bacillus subtilis phân lập ở Việt Nam đã được
đăng ký trên GenBank với mã số EF061457 và EF061456 lần lượt cho chủng G1 và
DR23 [75]. Gene mã hóa subtilisin đã được biểu hiện thành công trong Bacillus

subtilis WB800 với một hệ promoter mạnh (chủng đã được chấp nhận đơn đăng ký
bản quyền tại Cục sở hữu trí tuệ với mã số đơn 1-2009-00749 SC).
1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hi
ện tPA
18

1.4.1

Chất hoạt hóa plasminogen mô người
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh
của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành
mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách
nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu
[76]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết kh
ối về phương diện
lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [77].
Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc
biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen.
Ở người, gene mã hóa h-tPA là một gene đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên nhiễm
sắc thể số 8 [78]. Ở chuột, gene này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị trí
24p22. C
ấu trúc và chức năng của gene mã hóa h-tPA được xác định bằng kết hợp
nhân bản in vitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập được các
dòng từ thư viện gene người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ enzyme hạn
chế, lai Southern và giải trình tự DNA [79, 80]. Gene tPA dài 36.594 bp, bao gồm
32.720 bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenylate, có thêm 353 và 344 bp của
hai đầu 5’ và 3’, 13 intron xen giữa 14 exon, kích thước trung bình của các exon là 914
bp, trong khi của intron từ 111 đến 14.257 bp [78, 81, 82].
Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc hai
chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (chuỗi A, 39 kDa) được xác định ở đầu amino, còn chuỗi

nhẹ (chuỗi B, 33 kDa) ở đầu carboxyl. Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng
“ngón tay” (F, vùng finger ) gồm 47 aa ở vị trí 4-50, người ta cũng thấy cấu trúc tương
tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal growth factor region,
EGF) ở vị trí 51-87; vùng thứ ba bao gồm hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1,
kringle one region) ở vị
trí 88-176, vùng kringle 2 (K2, kingle two region) ở vị trí 177-
262. Các cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase
và nhân tố XII [78, 80, 83, 84]. Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm hoạt động (gồm 5
exon + 4 intron), vùng serine protease (P, serine protease domain) ở vị trí 267-527 và
tương đồng với chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [84, 85].