Nghiên cứu sản xuất văcxin cúm a h1n1 trên tế bào vero và tế bào phôi gà một lớp

i
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ





BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC
ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC



ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN
NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP
Mã số: ĐTĐL.2009 G/54




Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế




8784

Hà Nội – 2011

ii


BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC
ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN NUÔI CẤY
TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP
Mã số: ĐTĐL.2009 G/54

Các cán bộ thực hiện đề tài
1. PGS.TS.Nguyễn Đăng Hiền
2. PGS.TS.Lê Thị Luân
3. PGS.TS.Đinh Duy Kháng
4. Ts. Nguyễn Thị Quỳ
5. Ths. Cao Xuân Thịnh
6. Ths. Đặng Mai Dung
7. Ts.Nguyễn Thúy Hường
8. Ts.Nguyễn Vân Trang
9. CN.Trần Bích Hạnh
10. CN. Lê Trung Dũng

Cơ quan thực hiện:
Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế

iii
CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO

BSA : Bovine Serum Albumin
CDC : Center for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng chống và
kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ)
DMEM : Dulbecco’s Modifiled Eagle Medium
FBS : Fetal bovine serum
HA : Hemagglutinin
HAU : Đơn vị kháng nguyên ngưng kết hồng cầu
HI : Ngăn ngưng kết hồng cầu
LH
3
E : Lactalbumin hydrolysate Eagle
LT : Ly tâm
MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby canine Kidney cell)
MEM : Medium Essential Medium Eagle
NA : Neuraminidase
NBCS : Newborn Caft Serum
NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control
PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction)
SPF : Trứng gà sạch (Specific pathogen free)
SRD : Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn
(Single Radial Immunodifution)
TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới

iv
Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3
1.1. Virút cúm A/ H1N1 3
1.1.1. Phân loại 3
1.1.2. Hình thái 3
1.1.3. Cấu trúc phân tử 4
1.1.4. Tính kháng nguyên 5
1.1.5. Sự nhân lên của virút 7
1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học 9
1.1.7. Độc lực của virút 10
1.1.8. Tính chất nuôi cấy 10
1.1.9. Khả năng gây bệnh và đặc điểm lâm sàng 11
1.1.9.1. Khả năng gây bệnh (đáp ứng miễn dịch) 11
1.1.9.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H1N1 12
1.1.10. Tình hình dịch cúm A/H1N1 tại Việt Nam 12
1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm 13
1.2.1. Vắc xin cúm mùa 13
1.2.1.1. Vắc xin cúm bất hoạt 13
1.2.1.2. Vắc xin cúm nhược độc 14
1.2.2. Vắc xin cúm cho đại dịch 14
1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên thế giới 15
1.2.3.1. Văc xin được sản xuất bởi hãng Novartis (Marburg- Đức) 15
1.2.3.2. Vắc xin từ CSL Biotherapies (Parkville-Australia) 16
1.2.3.3. Vắc xin cúm A/H1N1 do hãng Sinovac của Trung Quốc 16
1.2.3.4. Tình hình sản xuất vắc xin tại Việt Nam 17
1.3. Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 17
1.3.1. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên trứ
ng gà có phôi 17
1.3.2. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên tế bào 18
1.3.3. Tế bào sử dụng trong sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 19

1.3.3.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắc xin 19
1.3.3.2. Các loại tế bào sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 19
1.3.3.3. Chủng virút sử dụng trong sản xuất vắc xin 20
1.3.4. Các phương pháp tạo chủng sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên nuôi cấy tế bào 22
1.3.4.1. Phương pháp tạo dòng thuầ
n chủng từ đám hoại tử (Plaque) 22
1.3.4.2. Phương pháp tạo dòng bằng phương pháp nồng độ giới hạn (Limited dilution)
23
1.3.4.3. Phương pháp cấy truyền liên tiếp 23
1.3.5. Các phương pháp cô đặc và tinh chế virút 24
1.3.5.1. Các phương pháp cô đặc và sơ chế protein virút 24
1.3.5.2. Phương pháp tinh chế virút 26
CHƯƠNG II 30
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu trong sản xuất chủng và vắcxin 30
2.1.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nhân chủng vi rút X-179a trên trứng gà SPF 30
2.1.1.1. Nguyên vật liệu 30
2.1.1.2.Các bước tiến hành 30

v
2.1.2. Nguyên vật liệu và phương pháp thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên
nuôi cấy tế bào 31
2.1.2.1 Trên tế bào vero 31
2.1.2.2 Trên tế bào phôi gà một lớp 32
2.1.3. Nguyên vật liệu và các bước tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào vero 39
2.1.3.1. Qui trình sản xuất tế bào vero 39
2.1.3.2. Qui trình sản xuất hỗn dịch virút 39
2.1.3.3. Qui trình tinh sạch 40
2.1.3.4. Qui trình siêu lọc 40

2.1.3.5. Siêu ly tâm bằng TNC+40% sacharose 42
2.1.3.6. Nghiên cứu qui trình bất hoạt 42
2.1.3.7. Thẩm định hiệu quả b
ất hoạt và xác định thời gian bất hoạt 43
2.1.3.8. Qui trình loại bỏ ADN tồn dư bằng enzym benzonase 44
2.1.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm(Thử nghiệm
tiền lâm sàng) 45
2.1.4.1. Trên chuột lang và chuột nhắt 45
2.1.4.2. Trên khỉ Macaca mulatta 45
2.2. Nguyên vật liệu và phương pháp tiến hành thử nghiệm kiểm định vắc xin 53
2.2.1. Kiểm tra vi khuẩn, nấm (theo dược điển Việt Nam IV) 53
2.2.1.1. Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy 53
2.2.1.2. Ki
ểm tra vô trùng bằng thạch máu 57
2.2.2. Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy 58
2.2.3. Qui trình kiểm tra tác nhân ngoại lại tế bào sử dụng sản xuất 64
2.2.4. Qui trình kiểm tra nhận dạng cúm A/H1N1(Real time PCR) 66
2.2.5. Qui trình kiểm tra hiệu quả bất hoạt 68
2.2.6. Qui trình định lượng kháng nguyên HA( phương pháp SRD) 72
2.2.7. Qui trình xác định nội độc tố 75
2.2.8. Qui trình xác định formaldehyt tồn dư 77
2.2.9. Xác định protein toàn phần 79
2.2.10. Kiểm tra an toàn chung 79
2.2.11. Thử nghiệm đo pH 80
2.2.12. Qui trình xác định kháng thể cúm bằng phản ứng ngăn ng
ưng kết hồng cầu 81
2.2.13. Qui trình giải trình tự gen 89
2.2.14. Thử nghiệm phát hiện ADN tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc
xin bằng phương pháp lai điểm 91
2.2.15. Xác định hàm lượng hydroxit nhôm AL(OH)

3
trong vắc xin 94
CHƯƠNG III 96
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 96
3.1. Kết quả nhân chủng vi rút X-179A trên trứng gà SPF 96
3.2. Kết quả thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào 99
3.2.1. Kết quả thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát 99
3.2.2. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105
3.2.2.1. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105
3.2.2.2. Kết quả Sản xuất và kiểm định chủng cúm A/H1N1 giống gốc trên tế bào vero

.107
3.2.3. Kết quả thích nghi trên tế bào phôi gà một lớp 119
3.2.3.1 Môi trường cho tế bào phôi gà P1 119
3.2.3.2. Kết quả thích nghi chủng H1N1 trên tế bào phôi gà Po và P1 128
3.3. Kết quả nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 131

vi
3.3.1. Kết quả nghiên cứu nghiên cứu qui trình 131
3.3.2. Kết quả sản xuất vắc xin theo qui trình 138
3.3.2.1. Qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin 138
3.3.2.2. Sản xuất và kiểm định 10.000 liều vắc xin theo qui trình 140
3.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm (Tiền lâm sàng)
145
3.4.1. Kết quả an toàn trên chuột lang 145
3.4.2. Kết quả an toàn trên chuột nhắt 148
3.5. Kết quả an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ Macaca Mulatta 151
3.5.1. Kết qu
ả an toàn vắc xin 151
3.5.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin trên khỉ thử nghiệm 153

3.5.2.1 Kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) 153
3.5.2.2. Hiệu giá kháng thể trung hòa 162
3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin cúm A/ H1N1 trên tế bào vero 170
KẾT LUẬN 171
KIẾN NGHỊ 174
TÀI LIỆU THAM KHẢO 175


vii
Danh mục các bảng
Bảng 2.1. Sơ đồ lấy mẫu 44
Bảng 3.1. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10
-2
96
Bảng 3.2 Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10
-3
96
Bảng 3.3. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10
-4
97
Bảng 3.4. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10
-5
97
Bảng 3.5. So sánh hiệu giá HA tại các nồng độ gây nhiễm 98
Bảng 3.6. Sự phát triển của chủng virút X-179A-C trên tế bào thận khỉ tiên phát lần 1 99
Bảng 3.7. Hiệu giá HA của các chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát tại môi trường gây nhiễm
khác nhau 100
Bảng 3.8. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/4 100
Bảng 3.9. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/10 101
Bảng 3.10. Kết quả nhân chủng lần 4 trên t

ế bào thận khỉ tiên phát 102
Bảng 3.11. Hiệu giá HA sau cấy truyền lần 5 trên tế bào thận khỉ tiên phát 102
Bảng 3.12.Tóm tắt kết quả thích nghi chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát 104
Bảng 3.13. Hiệu giá HA của chủng cúm A/H1N1 trên tế bào vero 105
Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu nồng độ trypsin thích hợp trên chủng D1V3 105
Bảng 3.15. Liều gây nhiễm tối ưu với chủng sản xuất 109
Bảng 3.16. Kết quả nhận dạng hỗn dị
ch virút thu được 110
Bảng 3.17. Tóm tắt kết quả sản xuất, kiểm định chủng vi rút 110
Bảng 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen HA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number 063211) 112
Bảng 3.19. So sánh trình tự axit amin của protein HA giữa 5 chủng virút với chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY063211) 114
Bảng 3.20. So sánh trình tự nucleotide của gen NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL/2010 (Accession number CY063213) 115
Bảng 3.21. So sánh trình tự axit amin của protein NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY0632 117
Bảng 3.22. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng
virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 117
B
ảng 3.23. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng
vắc xin X179 và các chủng khác (179M, 179W, HV4 và AV4) 118
Bảng 3.24. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein NA giữa chủng
virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 118
Bảng 3.25. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường 199 với 5% huyết
thanh 119
Bảng 3.26. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường 199 với huyết
thanh khác nhau trên chai 25 cm
2
120

Bảng 3.27. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường MEM với 5% huyết
thanh 120
Bảng 3.28. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MEM với huyết
thanh khác nhau trên chai 25 cm
2
121
Bảng 3.29. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường LH với 5% huyết
thanh 122
Bảng 3.30. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường LH với huyết
thanh khác nhau trên chai 25 cm
2
122
Bảng 3.31. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường DMEM với 5% huyết
thanh 123
Bảng 3.32. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường DMEM với huyết
thanh khác nhau trên chai 25 cm
2
124

viii
Bảng 3.33. Hiệu giá HA của chủng gốc X-179A-C gây nhiễm trên tế bào với các loại môi
trường gây nhiễm 128
Bảng 3.34. Hiệu giá HA của chủng X-179A-V gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi
trường gây nhiễm 128
Bảng 3.35. Hiệu giá HA của chủng X-179A-M gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi
trường gây nhiễm 129
Bảng 3.36. Hiệu giá HA nghiên cứu chủng X-179A-M trên môi trường DMEM glucosa cao
với nồng độ trypsin khác nhau 129
Bảng 3.37. Hiệu giá HA trong thời gian theo dõi 130
Bảng 3.38. Hiệu giá HA trong quá trình cấ

y truyền liên tiếp 130
Bảng 3.39. Thể tích và hiệu giá vắc xin thô 131
Bảng 3.40. Kết quả nghiên cứu tinh sạch kháng nguyên 131
Bảng 3.41. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV06 132
Bảng 3.42. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV07 133
Bảng 3.43. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV08 134
Bảng 3.44. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô
đặc bằng siêu ly tâm 135
Bảng 3.45. Kết quả nghiên cứu hiệu quả bất hoạt 136
Bảng 3.46. Kết quả nghiên cứu sử dụng enzym cắt ADN tồn dư của tế bào 138
Bảng 3.47. Kết quả sản xuất loạt FV06 140
Bảng 3.48 Kết quả sản xuất loạt FV07 141
Bảng 3.49. Kết quả sản xuất loạt FV08 141
Bảng 3.50. Kết quả sản xuất loạt FV09 142
Bảng 3.51. Kết qu
ả sản xuất 4 loạt vắc xin thô 142
Bảng 3.52. Chất lượng tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin 143
Bảng 3.53. Kết quả formaldehyde trong bán thành phẩm 143
Bảng 3.54. Kết quả Protein toàn phần trong bán thành phẩm 144
Bảng 3.55. Kết quả ADN tồn dư trong bán thành phẩm 144
Bảng 3.56. Kết quả vắc xin thành phẩm 144
Bảng 3.57. Kết quả định lượng kháng nguyên và mức chuyển đổi đơn vị HA 145
Bảng 3.58. Kết quả th
ử an toàn trên chuột lang 145
Bảng 3.59. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trưởng thành 148
Bảng 3.60. Trọng lượng khỉ (kg) 151
Bảng 3.61. Trọng lượng khỉ trong quá trình thử nghiệm 152
Bảng 3.62. Triệu chứng khỉ trong quá trình thử nghiệm 153
Bảng 3.63. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 153
Bảng 3.64. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 154

Bảng 3.65 Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 155
Bảng 3.66. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử
dụng kháng nguyên 7,5µg/liều .156
Bảng 3.67. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 157
Bảng 3.68. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và
Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 158
Bảng 3.69. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và
Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 159
Bảng 3.70. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và
Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 160
Bảng 3.71. Hiệu giá kháng thể HI khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và
không có Al(OH)3 161
Bảng 3.72. Hiệ
u giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30ug/liều 162
Bảng 3.73. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15ug/liều 163
Bảng 3.74. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 164

ix
Bảng 3.75. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5ug/liều 165
Bảng 3.76. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 166
Bảng 3.77. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 167
Bảng 3.78. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 167
Bảng 3.79. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 168
Bảng 3.80. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi v
ắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và không có Al(OH)3 169

x
Danh mục các hình
Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử (A) và mô
hình hạt virút (B) 4
Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào 6
Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ 8
Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-) 9
Hình 2.1. Trứng gà sạch SPF 30
Hình 2.2. Kiểm tra chất lượng trứng 30
Hình 2.3. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI 88
Hình 3.1. Hiệu giá HA gây nhiễm trên trứng tại các nồng
độ khác nhau 98
Hình 3.2. Hiệu giá HA khi gặt và sau khi đông băng 106
Hình 3.3. Hình ảnh nhân lên của virút cúm A/H1N1 trên tế bào dưới kính hiển vi điện tử 107
Hình 3.4. Hình ảnh kiểm tra hiệu giá HA của cúm A/H1N1 108
Hình 3.5. Liều gây nhiễm tối ưu 109
Hình 3.6. Chủng vi rút được bảo quản tại tủ âm sâu 111
Hình 3.7. Môi trường 199 nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 120
Hình 3.8. Môi trường MEM nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 121
Hình 3.9. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà mộ
t lớp 123
Hình 3.10. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 125
Hình 3.11. Tỷ lệ tách tế bào sử dụng các loại môi trường với huyết thanh bê bào thai 125
Hình 3.12. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường M199 126
Hình 3.13. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường MEM 127
Hình 3.14. So sánh hiệu giá HA với các màng lọc khác nhau 132
Hình 3.15. Hiệu suất cô đặc loạt FV06 tại các mức độ cô đặc khác nhau 133
Hình 3.16. Hiệu suất cô đặc loạt FV07 tại các mức độ cô đặc khác nhau 134
Hình 3.17. Hi

ệu suất cô đặc loạt FV 08 tại các mức độ cô đặc khác nhau 135
Hình 3.18. Hiệu xuất siêu ly tâm bằng đường và không đường 136
Hình 3.19. Hiệu quả bất hoạt 137
Hình 3.20. Hình ảnh vắc xin pFluvac 142
Hình 3.21. Hình ảnh kết quả định lượng kháng nguyên HA loạt FV-06 (BTP) 145
Hình 3.22. Trọng lượng chuột lang trong thời gian cách ly 146
Hình 3.23. Tăng trọng chuột lang trong thời gian cách ly 146
Hình 3.24. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 147
Hình 3.25. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 147
Hình 3.26. Tăng trọng chuột sau khi tiêm v
ắc xin loạt F-0310 147
Hình 3.27. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F- 0111 148
Hình 3.28. Trọng lượng chuột nhắt trong thời gian cách ly 149
Hình 3.29. Tăng trọng chuột nhắt trong thời gian cách ly 149
Hình 3.30. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 150
Hình 3.31. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 150
Hình 3.32. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0310 150
Hình 3.33. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0111 150
Hình 3.34. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 154
Hình 3.35. Hi
ệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 155
Hình 3.36. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 156
Hình 3.37. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều 157
Hình 3.38. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 158
Hình 3.39. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3
với nồng độ 300µg/liều 159

xi
Hình 3.40. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3
với nồng độ 600µg/liều 160

Hình 3.41. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3
với nồng độ 900µg/liều 161
Hình 3.42. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 162
Hình 3.43. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 163
Hình 3.44. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 164
Hình 3.45. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều 165
Hình 3.46. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 166
Hình 3.47. Hiệu giá kháng thể
trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 167
Hình 3.48. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 168
Hình 3.49. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 169
Hình 3.50. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và không có Al(OH)3 169


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch cúm luôn là mối quan tâm hàng đầu của nhân loại. Trong lịch sử đã ghi
nhận nhiều vụ đại dịch cúm xảy ra với số người thiệt mạng lên đến hàng chục triệu
người. Tác nhân gây bệnh của mỗi vụ dịch là khác nhau, như dịch cúm Tây Ban Nha
1918-1919 do H1N1, cúm Hồng Kông 1968-1969 do H3N2 v.v. Từ năm 1997, dịch
cúm A/H5N1 xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và có tỷ lệ tử vong cao.
Tháng 4 năm 2009, dịch cúm A/H1N1 xuất hiện
đầu tiên ở Mehicô. Sau đó đã lan
nhanh ra toàn thế giới trong một thời gian ngắn. Đây là một chủng H1N1 mới do sự
tái tổ hợp từ virút cúm lợn, cúm gia cầm và cúm người tạo thành. Ngày 11 tháng 6
năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới đã tuyên bố dịch ở cấp độ cảnh báo cao nhất, cấp độ

6 - Đại dịch cúm. Sau 41 năm kể từ đại dịch cúm Hồng Kông lại có một đại dị
ch cúm
xảy ra. Tính đến tháng 8/2009 đã có trên 112 nước và vùng lãnh thổ có dịch với trên
209.000 người mắc và trên 2000 người tử vong.

Nhiệm vụ cấp bách của thế giới và mỗi quốc gia là làm sao nhanh chóng có
được vắc xin phòng bệnh. Ngay giữa tháng 5/2009, TCYTTG đã nhóm họp có sự
tham gia của các hãng sản xuất vắc xin lớn trên thế giới để bàn kế hoạch sản xuất vắc
xin. 32 nhà sản xuất đã được TCYTTG gửi yêu cầu sản xuất. 24 trong số họ đã chấp
thuận yêu cầu và lên kế hoạch sản xuất. Một số
phòng thí nghiệm chuẩn về cúm của
TCYTTG đã nhanh chóng phân lập, tạo chủng để cung cấp cho các nhà sản xuất tiến

2
hành sản xuất vắc xin như CDC Mỹ với chủng X-179a, NIBSC của Anh với chủng
NIBRG-121, Úc với chủng IVR-153 v.v. Theo ước tính, năng lực sản xuất tối đa hiện
nay của toàn thế giới cũng chỉ đáp ứng được khoảng 10% dân số nếu có đại dịch xảy
ra. Do đó, tất cả các nước cần chủ động nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm để cung cấp
cho cộng
đồng khi có đại dịch.
Cuối tháng 5/2009 dịch cúm A/H1N1 xuất hiện ở Việt Nam. Đến đầu tháng 9
dịch đã lan ra cả 4 khu vực miền Bắc, miền Nam, miền Trung và Tây nguyên với 3201
ca mắc và 2 ca tử vong. Chính phủ đã lập ban chỉ đạo quốc gia phòng chống đại dịch
cúm A/H1N1 và giao Bộ Y tế là thường trực. Ban chỉ đạo đã thực hiện một số nhiệm
vụ cấp bách nhằm giảm thiểu kh
ả năng lây lan dịch bệnh, giảm tỷ lệ tử vong, liên hệ
với các tổ chức quốc tế để nhập vắc xin phòng bệnh. Tới thời điểm tháng 10/2009 có
một số hãng đã sản xuất thành công vắc xin này nhưng số lượng rất hạn chế. Những
nước này đưa ra chính sách ưu tiên cho quốc gia của họ trước. Tiếp theo đó là một số
nước giàu sẵn sàng mua vớ

i giá cao để có được vắc xin. Việt Nam chúng ta không
nhận được sự trợ giúp nào về vắc xin. Chúng ta cũng chưa sản xuất được vắc xin cúm,
kể cả cúm thông thường. Trước tình hình đó, Ban chỉ đạo quốc gia đã huy động toàn
bộ các nhà sản xuất vắc xin trong nước tập trung lực lượng để nghiên cứu tự sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1. Mỗi đơn vị với thế mạnh của mình sẽ nghiên c
ứu nhằm nhanh
chóng tạo ra được vắc xin. POLYVAC được giao nhiệm vụ “Nghiên cứu sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO và tế bào phôi gà một lớp”. Với mục tiêu
là “Sản xuất được vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO hoặc tế bào phôi gà
một lớp”.
Nội dung cần đạt được:
- Nhân chủng virút X-179a trên trứng gà SPF
- Thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào
- Sản xuất vắc xin cúm A/H1N1
-
Đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vắc xin trên khỉ



3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Virút cúm A/ H1N1
1.1.1. Phân loại
Virút cúm H1N1 thuộc type A chi Influenza virút thuộc họ Orthomyxoviridae bắt
nguồn từ hai từ gốc Hy Lạp “Orthos” là “trực tiếp” “myxo” là “tuyến”, bao gồm các
virút tấn công trực tiếp vào tuyến đường hô hấp. Có 5 nhóm (týp) virút được xếp vào
họ Orthomyxoviridae, gồm: Nhóm virút cúm A (týp A), nhóm virút cúm B (týp B),
nhóm virút cúm C (týp C), nhóm virút Isa và nhóm virút Thogoto. Sự phân nhóm virút
dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên Nucleoprotein (Kháng nguyên NP). Ngoài
ra, dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên M (Matrix protein) người ta cũng có thể

định týp được virút cúm.
Phân týp của virút cúm chỉ có ở virút cúm týp A, được xác định bằng m
ức độ phản
ứng chéo của kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA), khi thực hiện phản ứng ức chế
ngưng kết hồng cầu (HI) và kháng nguyên có hoạt tính emzyme neuraminidase (NA),
khi thực hiện phản ứng ức chế neuraminidase (NI). Cho tới nay, người ta đã xác định
được 16 phân týp HA (H1 – H16) và 9 phân týp NA (N1 – N9). Giới hạn vật chủ của
các phân týp virút cúm A là rất khác nhau. Vì tất cả các phân týp đều có nguồn gốc lây
nhiễm từ các loài chim cho nên tất cả các phân týp HA và NA đều đ
ã được tìm thấy
trên các loài chim. Tuy nhiên, đối với các loài động vật có vú thì giới hạn vật chủ rất
khác nhau.
1.1.2. Hình thái
Hạt virút có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình oval có đường kính trung bình
từ 80-120 nm, hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm (hình 1.1).

4

Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử
(A) và mô hình hạt virút (B)
Các hạt virion của virút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ virút có bản chất là protein
có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hoá và
một số protein dạng trần không được glycosyl hoá. Trên vỏ đính các gai glycoprotein,
đó là các kháng nguyên Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Tỉ lệ HA/NA
là 4/1. Virút cúm C chỉ có một gai glycoprotein.
1.1.3. Cấu trúc phân tử
Genome của virút cúm A là ARN 1 sợi đơn âm có chiều dài tổng số
khoảng
13500 nucleotide, gồm 8 phân đoạn mã hoá cho 8 protein: Phân đoạn 1- 3 mã hoá cho
các protein không cấu trúc (enzyme polymerase - protein sớm phục vụ cho sao chép

ARN) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa); phân đoạn 4 mã hoá cho
hemagglutin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế bào, gây ngưng kết hồng cầu)
(63 kDa khi chưa được glycosyl hoá và 77 kDa nếu được glycosyl hoá); phân đoạn 5
mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein muộn đóng vai trò cấu trúc dưới đơn vị
nucleocapsid) (56 kDa); phân đoạn 6 mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân
đoạn 7 mã hoá cho protein đệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và
M2 (11 kDa); phân đoạn 8 mã hoá cho protein không cấ
u trúc (NS) (non - structural
protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14 kDa).
ARN và protein của virút sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung quanh một trục tạo
nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu (đường kính 89 - 120 nm) hoặc hình sợi kéo dài
Kênh dẫn truyền ion
Vỏ lipid

A B

5
(tới vài µm) của virion. Một hạt virion có trọng lượng phân tử khoảng 250 kilo Dalton.
Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid
kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu
trúc của virút. Lớp vỏ ngoài của virút còn có các glycoprotein (protein đã được
glycosyl hoá). Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã được
biệt hoá để gắn protein màng của virút vào, gồm: protein M2 đâm xuyên và nhô ra
khỏi vỏ
ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA).
Virút cúm A được chia thành các phân typ (subtype), phân biệt nhau bởi các
kháng nguyên bề mặt hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Có 16 phân typ
HA và 9 phân typ NA đã được xác định [3]. Có tất cả 9 biến thể gen NA (N1Æ N9)
đã được phân lập từ hạt virút cúm A. Tuy nhiên, chỉ có type N1 và N2 là được phân
lập từ chủng virút gây bệnh cho người. Năm 1983, nhờ kỹ thuật X quang tinh thể, các

nhà khoa học đã khám phá ra cấu trúc của NA. NA bao gồm 4 dưới đơn vị giống nhau
có vùng hoạt động ở phần đầu c
ủa enzym này. Nếu không có NA, HA của một virút
mới tạo thành sẽ dính vào axit sialic trên bề mặt của tế bào chủ và bề mặt của các hạt
virút mới làm virút bất động và không còn khả năng xâm nhiễm vào tế bào khác. Vì
vậy, NA có vai trò quyết định trong việc virút mới tạo thành có xâm nhập được vào tế
bào khác hay không.
1.1.4. Tính kháng nguyên
Các kháng nguyên quan trọng của virút cúm gồm các kháng nguyên đặc hiệu
nhóm (typ) và các kháng nguyên đặc hiệu phân typ. Các kháng nguyên đặc hiệu typ
bao gồm: Kháng nguyên nucleoprotein (NP) và protein màng M1. Các kháng nguyên
đặc hiệu phân typ bao gồm hai kháng nguyên quan tr
ọng nhất của virút là kháng
nguyên ngưng kết hồng cầu HA và kháng nguyên có hoạt tính enzym NA.
- Kháng nguyên nucleoprotein (NP): Là protein bao bọc xung quanh các sợi ARN
của virút cúm, xuất hiện trong các tế bào nhiễm virút. Sử dụng kháng nguyên này để
chẩn đoán cúm bằng phản ứng kết hợp bổ thể (CF) sẽ phát hiện được kháng thể kháng
tất cả các phân typ cúm trong cùng một typ nhưng phân biệt được virút cúm thuộc các
typ khác nhau (cúm A, B và C). Ngoài ra, kháng nguyên NP còn có vai trò như một

6
kháng nguyên hướng đích chủ yếu tới tế bào lympho T CD8 gây độc tế bào hình
thành nên đáp ứng miễn dịch chống nhiễm trùng virút.
- Kháng nguyên màng M1: Có vai trò chủ yếu là giữ tính ổn định cho các virion,
kiểm soát hoạt tính phiên mã và có vai trò trong lắp ráp các protein mới tổng hợp để
hình thành các virion. Kháng nguyên này cũng có thể được sử dụng để chẩn đoán hoặc
xác định typ virút cúm A, B, C bằng phản ứng kết hợp bổ thể hoặc khuếch tán miễn
dịch hai chiều (DID).
- Kháng nguyên HA: Đây là một trong hai glycoprotein quan trọng nằm trên bề
mặt của hạt virút và có nhiều chức năng cần thiết: khởi đầu quá trình xâm nhiễm của

virút bằng việc gắn lên các thụ thể axit neuraminic trên bề mặt tế bào vật chủ. Sau khi
xâm nhập vào tế bào, HA khởi đầu cho quá trình dung hợp để giải phóng phức hợp
RNP vào bào tương. Sự phân cắt HA nhờ enzym phân cắt protein là một quá trình
quan trọng quyết đị
nh độc lực của virút. Kháng nguyên HA tạo ra đáp ứng miễn dịch
sinh kháng thể HI, đồng thời cũng là kháng thể trung hòa virút.
- Kháng nguyên NA: Là glycoprotein quan trọng thứ hai nằm trên bề mặt của hạt
virút. NA vừa có tính chất kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. NA cắt các thụ thể
gắn HA trên các phân tử mucin của tế bào biểu mô, tạo điều kiện cho virút nhanh
chóng lan tỏa ra khắp các tế bào đường hô hấp của vật chủ nhiễm virút. Ngoài ra, hoạt
tính enzym c
ủa NA còn giúp giải phóng các hạt virút mới tổng hợp ra khỏi tế vào vật
chủ (hình 1.2).

Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút
ra khỏi tế bào
Sự thay đổi kháng nguyên HA và NA của virút cúm tạo điều kiện cho sự lưu
hành của chúng trong quần thể người và không thể dự báo được sự thay đổi đó. Sự
thay đổi từ từ của kháng nguyên được gọi là sự trôi kháng nguyên - “antigennic

7
drift”. Đó là kết quả của tích lũy dần các đột biến điểm tại các gen mã hoá cho HA và
NA. Sự thay đổi các axit amin liên tiếp trong vùng gen quan trọng được tích lũy từ
năm này qua năm khác. Đối với virút cúm A, những kết quả từ áp lực chọn lọc của sự
tăng cấp độ miễn dịch trong quần thể người là nguyên nhân của sự trôi kháng nguyên
và dẫn tới sự biến đổi đáng kể v
ề kháng nguyên theo chu kỳ từ 2 đến 3 năm. Axit
amin thay đổi tại protein HA và NA là khoảng 0,5 đến 1% trong 1 năm. Sự trôi kháng
nguyên tạo ra chủng virút gây dịch thường có đột biến tại hai hoặc nhiều vùng của
kháng nguyên HA.

Một sự thay đổi về kháng nguyên của virút cúm cũng rất được quan tâm đó là
sự trượt kháng nguyên -“antigennic shift”. Kết quả thu được là một tổ hợp gen mới
(chủ yếu gặp trong gen HA) được hình thành. Hiện tượng này có thể xả
y ra khi virút
cúm người và virút cúm gia cầm đồng nhiễm trên một tế bào cảm nhiễm hoặc trực tiếp
lây truyền từ loài này sang loài khác. Khi virút có sự trượt kháng nguyên – thay đổi cơ
bản về kháng nguyên - sẽ dễ dàng lan truyền trong cộng đồng người và đó chính là
nguyên nhân gây ra đại dịch mới. Sự trượt kháng nguyên chỉ xảy ra ở virút cúm týp A
trong khi sự trôi kháng nguyên xảy ở cả virút cúm týp A và B.
Danh pháp
Để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các chủng cúm sau khi
phân lập phải được đặt tên theo danh pháp quy định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).
Đối với các chủng virút cúm phân lập từ động vật, trật tự tên được qui định như sau:
Týp huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình
phân typ theo kháng nguyên HA (H) và NA (N). Đối với các chủng virút cúm phân
lập từ người, trật tự tên được qui định như sau: Týp huyết thanh/nơi phân lập/số hiệ
u
chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA (H) và NA (N). Ví
dụ: A/Taiwan/T1773/2009(H1N1) là chủng virút cúm A phân lập từ người tại Đài
Loan, ký hiệu chủng là T1773, năm phân lập là năm 2009, có kháng nguyên HA là H1
và NA là N1.
1.1.5. Sự nhân lên của virút
Đầu tiên, virút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào nhờ gai
glycoprotein HA. Màng tế bào bao lấy virút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế

8
bào chất. Bơm proton trong endosome làm pH giảm xuống 5, tạo điều kiện cho màng
virút dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sau
khi hợp nhất màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân
sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ

sung [cARN (+)] nhờ enzym ARN - polymeraza phụ thuộc ARN. Chính các cARN
(+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu
di truyền của virút. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã t
ạo ra các mARN
(+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác
nhau xảy ra ở tế bào chất. Một số protein được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi
ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó, được vận chuyển ra tế
bào chất. Tại đây, một số các protein khác được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy
Golgi, tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việ
c nảy chồi của virút.
Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA
phân cắt axit sialic giải phóng virút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây
nhiễm mới (Hình 1.3).

Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ

9

Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-)
Sau khi xâm nhập và cởi vỏ một phần (bước 1), RNA tiến hành phiên mã nhờ
RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) do virút mang theo để tạo mRNA (bước 2)
cho tổng hợp protein cấu trúc và không cấu trúc (bước 3). Enzyme RdRp tiến hành sao
chép RNA thông qua bước trung gian là tạo RNA chuỗi dương (đối genome) có chiều
dài đủ (bước 4 và 5). Đối genome được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA
genome (bước 5). Một phần RNA genome được dùng để phiên mã mạnh, tạo ra
mRNA cần cho t
ổng hợp protein (bước 6 và 7), một phần để lắp ráp với protein để tạo
virút mới (bước 8).
1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học
Virút cúm tương đối mẫn cảm với nhiệt độ. Khả năng lây nhiễm của virút bị

phá huỷ ở 56
o
C trong 30 phút hoặc chiếu tia cực tím hay bức xạ gamma. Hiệu giá của
virút giảm sau một thời gian bảo quản ở - 20
o
C hoặc đông tan băng nhiều lần. Virút
bền vững hơn nếu cho thêm protein như gelatin hoặc albumin huyết thanh bò và bảo
quản ở - 70
o
C. Virút cúm cũng có thể bảo quản bằng cách đông khô, sau đó cất ở 4
o
C.
Khả năng lây nhiễm của virút cũng bị phá huỷ nếu xử lý virút bằng diethyl ether 20%
trong 18 giờ ở 4
o
C, bằng formalin nồng độ 1/4000, Triton X–100 1%, sodium
deoxycholate 1% và sodium dodecyl sulfate (SDS) 0,1%.

10
1.1.7. Độc lực của virút
Độc lực của virút cúm phụ thuộc chủ yếu vào hai thành phần kháng nguyên
quan trọng nhất của virút đó là HA và NA. Khả năng phân cắt phân tử HA thành hai
tiểu phần HA1 và HA2 nhờ proteaza là một trong số các yếu tố quyết định độc lực của
virút cúm A. Khả năng này phụ thuộc vào số axit amin mang tính kiềm là arginine (R)
và lysine (K) tại vị trí phân cắt. Đặc tính này cho phép sự nhận biết và phân tách phân
tử HA bởi các loại proteaza có mặ
t ở các loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự xâm nhập
và lan tỏa nhanh chóng của virút trong mô bị nhiễm. Dựa vào đặc tính này, ngày nay
người ta có thể tạo ra chủng virút cúm độc lực thấp từ chủng lưu hành có độc lực cao
bằng việc cắt bỏ các axit amin mang tính kiềm ở vị trí phân cắt trên phân tử HA nhờ

kỹ thuật di truyền. Một đặc tính nữa của phân tử HA quyết định độc tính của virút là
tác độ
ng lên các gốc không chứa oxy, hoạt hóa yếu tố nhân tăng cường chuỗi nhẹ kapa
của các tế bào lympho B hoạt hóa (NF-κB), kích hoạt các gen tổng hợp yếu tố hoại tử
mô α (TNFα), interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2) và interleukin-6 (IL-6) dẫn
đến sốt cao, phá hủy tế bào, suy kiệt và sốc. Độc tính của virút còn phụ thuộc vào hoạt
tính enzym neuraminidase (NA) của virút. Nhờ có hoạt tính NA, mối liên kết giữa axit
sialic trên bề mặt tế bào và HA của virút được phá vỡ và virút sẽ đượ
c giải phóng ra
khỏi tế bào để xâm nhiễm sang tế bào khác.
1.1.8. Tính chất nuôi cấy
Virút cúm có khả năng thích ứng trên tế bào thận khỉ tiên phát (PMK), thận
chó thường trực (Madin-Darby Canine kidney cells, MDCK), tế bào thận khỉ Rhesus
thường trực (LLCM-K2), tế bào thận khỉ xanh châu phi (Vero), tế bào phôi gà, Virút
có mặt trong tế bào có thể được quan sát dựa trên sự hay đổi hình dạng tế bào (sự huỷ
hoại tế bào-CPE). Tuy nhiên, nhiều chủng virút cúm không tạo CPE, trong trường hợp
này, phản ứng h
ấp phụ hồng cầu chuột lang trên bề mặt tế bào thường được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của virút trong tế bào. Phôi gà 9-10 ngày tuổi là tốt nhất cho
phân lập virút cúm A và B. Tuy nhiên, đối với virút cúm C thì nên dùng phôi 7-8 ngày
tuổi. Khi phân lập virút nên cấy vào cả khoang niệu và khoang ối. Khi virút đã thích
ứng thì chỉ cần cấy vào khoang niệu. Virút có mặt trong dịch nuôi cấy tế bào, trong
dịch ối và dịch niệu được phát hiện bằng phản ứ
ng ngưng kết hồng cầu (HA). Có thể

11
sử dụng hồng cầu gà, hồng cầu chuột lang hoặc hồng cầu người nhóm máu O để tiến
hành phản ứng HA. Tuy nhiên, virút cúm C không ngưng kết hồng cầu chuột lang.
1.1.9. Khả năng gây bệnh và đặc điểm lâm sàng
1.1.9.1. Khả năng gây bệnh (đáp ứng miễn dịch)

Virút cúm được xếp vào nhóm các virút đường hô hấp. Thường bắt đầu từ viêm
đường hô hấp trên. Virút phát triển ở tế bào biểu mô đường hô h
ấp và phá huỷ nhung
mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống
hô hấp. Kèm theo sự nhân lên của virút, trong một số trường hợp ở giai đoạn cấp tính,
cytokine được tổng hợp quá mức (hypercytokinemia) trong một thời gian ngắn hay
còn gọi là bão cytokine (cytokine storm) là nguyên nhân gây nên sự nguy hiểm cho
bệnh nhân, có thể dẫn đến tử vong. Thông thường, nhiễm virút đường hô hấp dưới
trên nền viêm phổi c
ấp có tỷ lệ tử vong cao. Viêm phổi thường là tình trạng bội nhiễm
hay gặp trong đó Staphyloccus aureus là nguyên nhân thường gặp và rất nguy hiểm,
gây nên suy hô hấp, thiếu oxy và diễn biến nặng trong vòng 2-3 ngày sau khi nhiễm
bệnh. Các công trình nghiên cứu cho thấy, sự suy hô hấp là do tế bào phế nang bị phá
huỷ bởi sự thâm nhiễm của virút và tạo điều kiện cho sự xâm nhập của Staphyloccus
aureus. Chủng Staphyloccus aureus sản sinh ra protease phân tách HA thành HA1 và
HA2 làm t
ăng khả năng lây nhiễm của một số chủng virút cúm A. Vì vậy, sự đồng
nhiễm của virút cúm và vi khuẩn làm tăng tốc độ lây nhiễm tế bào chủ. Một số trường
hợp biến chứng ít gặp ở nhiễm trùng cúm bao gồm: Viêm cơ do nhiễm virút cúm B ở
trẻ em, hội chứng sốc, viêm não cấp, hội chứng Reye.
Đáp ứng miễn dịch của cơ thể với nhiễm trùng virút
được nhận biết thông qua
kháng thể có trong huyết thanh hoặc trong dịch tiết của tuyến đường hô hấp. Virút
được loại trừ khỏi đường hô hấp trước hết do sự hình thành interferon và các đáp ứng
gây độc tế bào qua trung gian tế bào (cell-mediated cytotoxic responses). Sau đó là
các đáp ứng hình thành kháng thể, các tế bào giết tự nhiên và các tế bào T. Hầu hết sự
gây độc tế bào nhờ tế bào T đặc hiệu kháng nguyên đều được qua trung gian bởi các tế
bào lympho T CD8 và hướng t
ới các kháng nguyên bên ngoài của virút. Khi xuất hiện
kháng thể, virút sẽ bị loại bỏ hoàn toàn.

12
Trong quá trình bị nhiễm virút cúm, kháng thể kháng glycoprotein HA và NA
đóng vai trò rất quan trọng: (1) Kháng thể hemagglutinin (HA) ngăn cản virút xâm
nhập vào tế bào chủ; (2) Kháng thể neuraminidase (NA) ngăn cản sự giải phóng của
virút ra khỏi tế bào chủ. Nhiều nghiên cứu xác định, trong nhiễm trùng tiên phát, các
kháng thể đặc hiệu với hemagglutinin như IgA, IgM và IgG xuất hiện ở dịch mũi được
tiết ra một cách tích cực. Kháng thể IgA có vai trò quan trọng trong ngăn chặn sự
nhiễm virút, hoạt động củ
a nó diễn ra tại bề mặt màng nhày của bộ máy hô hấp. Trong
nhiễm virút cấp tính, kháng thể IgG hạn chế sự nhân lên của virút và interferon cũng
giúp cho sự hồi phục có hiệu quả. Ngoài ra, những sự ức chế không đặc hiệu đối virút
cúm cũng được biết tới, đó không phải là kháng thể nhưng có vai trò trong việc ngăn
chặn sự nhiễm bệnh cũng như hồi phục sau nhiễm virút, tuy nhiên, vai trò của nó cũng
chưa được nghiên cứu rõ.
1.1.9.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H1N1
Virút cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp thông qua cơ chế
trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào được trong tế bào biểu mô đường hô hấp,
virút nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào để chui ra và xâm nhập vào các tế
bào lành khác [6]. Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virút cúm bị các yếu tố miễn dịch
không đặc hiệu của cơ thể như d
ịch mũi họng, dịch phế nang và IgA chống lại. Khi
virút cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm xuống cơ quan hô hấp
dưới, đó là phổi. Tại đây chúng nhân lên rất nhanh và phá huỷ các tế bào.
Triệu chứng lâm sàng: thời gian ủ bệnh là 1-4 ngày, các triệu chứng bắt đầu
xuất hiện một ngày sau khi virút phá vỡ tế bào chui ra. Bệnh nhân cúm A có hiện
tượng sốt liên tục trên 38
0
C, đau đầu, đau cơ, ho, đau họng, bệnh nhân khó thở (nhịp
thở có lúc chỉ còn 30-40 lần/phút), độ bão hoà oxy giảm, tụt huyết áp, bạch cầu giảm.

Chụp X quang thấy phổi tổn thương nhanh hơn theo từng ngày, dẫn đến sốc rồi gây tử
vong. Những trường hợp nhiễm cúm nặng được đặc trưng bởi sốt cao, đột ngột và tử
vong nhanh với tỷ lệ chết có th
ể lên đến 100% do suy hô hấp. Tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều
nhất là ở trẻ em, nhưng tỷ lệ nhiễm cúm nặng và tỷ lệ tử vong cao nhất là ở người già
trên 65 tuổi.
1.1.10. Tình hình dịch cúm A/H1N1 tại Việt Nam

13
Ngày 31/5 Sở Y tế TP HCM đã chính thức công bố trường hợp nhiễm cúm
A/H1N1 đầu tiên tại Việt Nam là một du học sinh nam, 23 tuổi ở bang Wisconsin của
Mỹ vừa từ Chicago về. Việt Nam là quốc gia thứ 54 công bố có cúm A/H1N1 [2]. Đến
nay, theo Cục Y tế dự phòng và Môi trường, Bộ Y tế, ngày 03/9/2009, Việt Nam đã
ghi nhận thêm 180 trường hợp dương tính với cúm (H1N1) (khu vực phía Nam: 135
ca, khu vực miền Bắc: 14 ca, khu vực miền Trung: 23 ca, khu vực Tây Nguyên: 08
ca). Như vậy, tính
đến 17h00 ngày 03/9/2009, sau 3 tháng, Việt Nam đã ghi nhận
3201 trường hợp dương tính, 02 ca tử vong. Số bệnh nhân đã khỏi ra viện là 1473, 2
trường hợp tử vong, 1726 trường hợp còn lại hiện đang được cách ly, điều trị tại các
bệnh viện, cơ sở điều trị [4].
1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm
1.2.1. Vắc xin cúm mùa
Việc sản xuất vắc xin cúm mùa luôn theo chu kỳ hàng năm, được tổ chức Y t
ế
thế giới và các cơ quan chức năng giám sát chặt chẽ, chu kỳ này bao gồm: Giám sát
dịch tễ học virút cúm, chọn lựa chủng giống, đưa chủng giống vào sản xuất, kiểm tra
chất lượng và xác định đặc điểm kháng nguyên, đánh giá tiền lâm sàng và lâm sàng,
phân phối đến người dân. Ngay khi chủng vắc xin được quyết định, các công ty vắc
xin có 6 tháng để sản xuất và phân phối vắc xin cho người dân
1.2.1.1. Vắc xin cúm bấ

t hoạt
Các vắc xin cúm mùa thường ở dạng vắc xin đa giá, gồm chủng A/H1N1,
A/H3N2 và 1 chủng cúm B mỗi liều chứa 15µg kháng nguyên mỗi loại. Hiện nay có 3
loạt vắc xin chủ yếu: vắc xin cúm toàn phần, tiểu phần và vắc xin kháng nguyên bề
mặt.
Vắc xin cúm toàn phần: Chế phẩm vắc xin cúm toàn phần trong nhiều trường
hợp chỉ qua một bước tinh sạch bằng siêu ly tâm trước khi được bất hoạt. Vắc xin này
chiếm chưa tới 1/3 tổng số vắc xin cúm được sản xuất hiện nay.
Vắc xin cúm tiểu phần: Phần lớn các vắc xin hiện nay là vắc xin tiểu phần,
được sản xuất từ virút tinh sạch kết hợp với xử lý hóa chất. Quá trình phân mảnh tách
rời virút cho phép các kháng nguyên được tinh sạch từng phần, loại bỏ một số thành

14
phần của virút tạo vắc xin ít gây dị ứng. Quá trình bất hoạt ít nghiêm ngặt so với vắc
xin toàn phần do quá trình phân tách cũng được xem như đã bất hoạt một phần.
Vắc xin cúm kháng nguyên bề mặt: Được sản xuất như vắc xin tiểu phần nhưng
quá trình tinh sạch nghiêm ngặt hơn, Do đó, vắc xin chỉ chứa 2 kháng nguyên HA và
NA. Các kháng nguyên tinh sạch này sau đó được hoàn nguyên với lớp đôi lipit tổng
hợp và hình thành các thể virút. các thể
virút vắc xin cúm được cấp phép tại châu Âu.
1.2.1.2. Vắc xin cúm nhược độc
Vắc xin cúm dạng này đước sử dụng ở Liên xô cũ trước đây, nhưng việc sử
dụng đã trở nên giảm do vấn đề kinh tế và sụp đổ của Liên xô cũ. Gần đây chúng lại
được phát triển trở lại ở Mỹ nhằm thay thế vắc xin cúm bất hoạt do chúng có những
ưu điểm: Không yêu cầ
u nghiêm ngặt quá trình sau thu hoạch; năng xuất cao gấp 10-
15 lần so với vắc xin bất hoạt; không cần tiêm trích mà chỉ cần qua đường nhỏ mũi;
kích thích đáp ứng miễn dịch rộng bao gồm đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng
qua trung gian tế bào và hệ thống; Có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch chỉ sau
01 liều sử dụng. Vắc xin tái tổ hợp này được tạo ra b

ằng tái tổ hợp 2 gen HA và NA từ
các virút đang lưu hành với 6 gen còn lại từ các chủng nhân lên tốt. Các chủng gồm 2
loại: Chủng cho nhạy cảm nhiệt độ và chủng thích ứng lạnh.
Vắc xin thích ứng lạnh và sống nhược độc từ chủng virúts A/Leningrad/134/57
(H2N2) và B/USSR/60/69 đã được cấp phép tại Nga. Chủng LAIV (Flumist,
MedImmune vaccine) với kiểu hình sống nhược độc ts và ca dựa trên các chủng cho
A/Ann Arbor/6/60 và B/Ann Arbor/1/66 đã được cấp phép ở mỹ nă
m 2003.
LAIV hiện nay được sản xuất trên trứng gà có phôi, Tuy nhiên, một vài nhóm
nghiên cứu đang phát triển chúng trên hệ thống nuôi tế bào.
1.2.2. Vắc xin cúm cho đại dịch
Vắc xin chống lại virút gây đại dịch thường đơn giá, chỉ chứa kháng nguyên
của virút có khả năng gây đại dịch. Trên lý thuyết vắc xin chỉ cần 15µg HA trong một
liều thay bằng 45 µg HA trong một liều vắc xin đa giá dùng cho cúm mùa.
Các dữ liệu từ thử nghiệ
m giai đoạn 1, 2 cho thấy rằng vắc xin cúm A/H1N1 có
khả năng gây đáp ứng miễn dịch kém hơn vắc xin cúm thông thường. vắc xin không