nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác và nhân giống bò

VIỆN CHĂN NUÔI







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN
PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ

CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA

8245

HÀ NỘI – 2010






LI NểI U
Công nghệ Cấy truyền phôi bò đã đợc nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam từ những
năm 1978, nhng từ đó đến nay hầu nh cha có một cải tiến đáng kể nào về k thut sản
xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro ở bò sữa. Với kết quả nghiên cứu trớc đây, số lợng phôi
in-vivo trung bình thu đợc từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phôi, mặt
khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngy, nh vậy một năm chỉ tiến hành thu
phôi 4-5 lần/bò v s phụi bỡnh quõn/bũ/nm ch t 15 phụi. Nghiên cứu cải tiến rút
ngắn khoảng cách giữa các lần thu phôi từ 60-90 ngy xung 28-35 ngy/bũ/ln đã tng
s phụi thu c t 2,4-3,6 phôi/bò/lần lờn 5,5-5,7 phôi/bò/lần và tăng số phôi thu đợc
30- 45 phụi/bũ/nm. Nghiờn cu to phụi bũ in-vitro t t bo trng thu lũ m trc
õy
vi mc ớch nghiờn cu hon thin phng phỏp ch cú ý ngha trong nghiờn
cu khoa hc và không có ý ngha về giống trong sn xut. Nghiờn cu tạo phôi in-vitro
từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng phơng pháp siêu âm đã a ra c quy trỡnh thu
t bo trng vi tn xut 2 ln/ tun v ỏp xut chõn khụng 120 mmHg bũ sa 3-6 tui
cú th thu c 7-8 t bo trng/bũ/ln v to c ngun phụi in-vitro t nh
ng bũ sa
cú giá trị giống v tim nng di truyn cao.
ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã đợc nghiên cứu từ năm 1984 tại
Viện Khoa học Việt Nam. Phơng pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12
0

C/phút)
sau khi khử nớc một phần ở nhiệt độ phòng với phôi bò đã thành công (Bùi Xuân
Nguyên và cs. 1984). Năm 2003, Lu Công Khánh và cng s đã báo cáo thành công
việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol. Năm 2005 Nguyễn
Thị Thoa và cng s đã nghiên cứu phơng pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ
tinh thể) bớc đầu đã thành công nhng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh còn thấp chỉ đạt
73,24%.
Trong nghiên cứu này đã đa ra đợc quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể
(vitrification) cải tiến đã tăng tỷ lệ sống của phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên
80%. Chúng tôi đa ra các quy trình ci tin với mục tiêu cung cấp chính xác về cỏc
bc tin hnh trong quy trình cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên cú th ng dng
sn xut phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sa tại Việt Nam.


1
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2007-2010


THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo
và nhân giống bò”
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa
Học vị : Thạc sĩ .
Điện thoại: 0913321521
Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoà- Cầu Giấy- Hà Nội
Cơ quan : Viện Chă
n nuôi
Địa chỉ : Thuỵ Phương- Từ Liêm- Hà Nội Số điện thoại: 048389971

Cơ quan phối hợp:
1. Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Việt Nam
2. Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi- Viện Chăn nuôi
3. Trung tâm Nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì; Hà Tây
4. Trung tâm, Trạm trại tỉnh Thanh Hoá, Hải Dương.
Thời gian thực hiện:
Từ năm 2007-2010.
5. Kinh phí: 2.500.000.000 đồng




2
PHẦN I : MỞ ĐẦU
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi ở nước ta có vai trò quan trọng đối với nông nghiệp và phát
triển kinh tế quốc dân, giá trị ngành chăn nuôi hàng năm chiếm tỷ lệ 30% tổng
giá trị trong nông nghiệp. Trong những năm vừa qua chăn nuôi đang góp phần
quan trọng đối với chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp, tăng thu nhập
cải thiện đời sống cho nông dân. Tốc độ phát triển chăn nuôi và sả
n phẩm chăn
nuôi hàng năm tăng bình quân từ 6-8% đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước
ngày càng cao về sản phẩm chăn nuôi. Tổng sản lượng thịt sản xuất năm 2009
của nước ta đạt trên 3,7 triệu tấn thịt hơi và có tốc độ tăng trưởng bình quân năm
đạt trên 6%/năm đưa bình quân sản lượng thịt trên đầu người lên trên
43kg/người/năm.
Phát triển chăn nuôi bò thịt, bò sữa và gia súc ăn cỏ
được Bộ Nông nghiệp
và Nhà nước cũng như các địa phương quan tâm đầu tư và có chính sách khuyến
khích phát triển từ những năm cuối của thế kỷ trước và đầu thế kỷ XXI. Quyết

định số 167 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát
triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 là một
trong những minh chứng cho sự quan tâm đó. Trong thời gian từ 2001 đến nay,
thực hiện Chương trình phát triển bò sữa theo Quyết Định 167 của Thủ tướng
Chính phủ, chăn nuôi bò sữa Việt nam đã thu được nhiều kết quả tốt đẹp, phát
triển một cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày càng cao của xã
hội. Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000
tấn năm 2001 lên 140.000 con và 290.000 tấn năm 2010. Chăn nuôi bò sữ
a đã
thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt
Nam trong thời gian 2001-2010.

3
Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là
kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân
giống bò sữa Việt Nam của các nhà khoa học trong suốt thời gian hơn 50 năm.
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo và công nghệ phôi trong đó có kỹ thuật đông lạnh
tinh, phôi là một trong những kỹ thuật sinh sản quan trọng nhất đã và đ
ang được
áp dụng trong cải tiến và nhân giống bò sữa HF Việt Nam.
Đối với bò thịt mặc dù đã có nhiều tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong công
tác lai tạo và nhân giống, nhưng chăn nuôi bò thịt tại Việt Nam vẫn chưa đáp
ứng kịp nhu cầu tiêu thụ thịt bò của thị trường nôi địa về số lượng và chất lượng.
Hầu hết các nhà hàng, khách sạn và siêu thị cao c
ấp vẫn phải nhập thịt bò từ Mỹ,
Australia, New Zealand. Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trâu, bò
hơi chỉ đạt 330 ngàn tấn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình
trên đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm là rất thấp so với mức tiêu thụ 9-10
kg/năm tại các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản.
Để phát triển chăn nuôi bò thịt, thành một ngành s

ản xuất hàng hoá, dự án
Cải tiến và nâng cao chất lượng giống bò thịt Việt Nam 2006-2010 và Chiến
lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg
của Thủ tướng Chính phủ ngày 16 tháng 1 năm 2008 đã đặt mục tiêu tăng cường
cơ cấu giống bò lai, bò thịt chất lượng cao nhằm đạt tổng sản lượng thịt bò 310
ngàn tấn vào năm 2015 và 425 ngàn tấn năm 2020. Để đạt
được mục tiêu trên
của bò thịt và bò sữa, việc cải tiến các công nghệ sinh học sinh sản, như cải tiến
công nghệ tạo phôi trong ống nghiệm (TTON-in vitro fertilisation) từ tế bào
trứng thu trên bò sống bằng kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (hay
gây siêu bài noãn) để tạo phôi in vivo, và một số kỹ thuật liên quan chúng ta có
thể khai thác được tối đa tiềm năng sinh sản của bò cái cao sản góp phần tăng

4
nhanh số lượng, chất lượng của đàn bò hạt nhân đây là biện pháp kỹ thuật then
chốt cần được quan tâm đầu tư nghiên cứu.
Căn cứ vào mục tiêu và yêu cầu cấp bách về thịt sữa cho tiêu dùng trong
nước trong những năm vừa qua, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã phê duyệt và cho
phép chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh
sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò”

II. MỤC TIÊU
Đề tài này được xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học
sinh sản tiên tiến phục vụ cho việc tạo và nhân giống bò như:Công nghệ phôi,
công nghệ đông lạnh tế bào sinh sản, để nâng cao năng xuất sinh sản và chất
lượng giống bò một cách nhanh chóng và hiệu quả.
Mục tiêu chính của đề tài là : Cải tiến và ứng dụng thành công các công
nghệ sinh sản hiện đại (công nghệ
sản xuất phôi invivo, phôi invitrro, công nghệ
đông lạnh tinh, đông lạnh phôi…) để nâng cao năng suất sinh sản và chất lượng

giống bò bò thịt, bò sữa.











5
PHN II
TNG QUAN CC VN CN NGHIấN CU
I. C S KHOA HC CễNG NGH CY TRUYN PHễI Bề
1.1. Kớch thớch noón bao phỏt trin ng lot bng s tỏc ng hormone
Nhiu tỏc gi cho thy rng tim nng sinh sn ca bũ ln hn rt nhiu so
vi kh nng sinh sn thc ca chỳng. Theo Erickson (1966) cho bit bung
trng ca bũ cú trờn 70.000 noón bao nguyờn thu cú th phỏt trin thnh t bo
trng th tinh v to phụi. Nghiờn cu trờn bũ cú chu k ng d
c u
Danell(1987) cho bit trung bỡnh s t bo trng là 12636 và ở bò không hoạt
động có số tế bào trứng là 10132, sự khác nhau này không rõ ràng (P>0,05).
Nghiên cứu về tế bào và mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đã công bố rằng
bê 3 tháng tuổi có 21000 và ở bò già có 2500 tế bào trứng.
bũ, mi chu k ch rng 1 trng, nu th tinh ch c mt bờ, trong
mt i bũ cỏi ch sinh c 7-8 bờ nh vy trong thc t s noón bo c s
dng hu ớch l rt ớt, i vi mt i con cỏi cao sn tht l lóng phớ.
Nhiu nghiờn cu cho thy trong một chu kì ở bò thờng có 2 đến 3 đợt

sóng nang phát triển cá biệt có tới 4 đợt. Sóng nang là sự phát triển của một số
noãn bao ở cùng một thời gian. Nghiên cứu theo dõi v
sự phát triển của nang
trng trờn buồng trứng bũ sng bằng phong pháp siêu âm đợc nhiều tác giả
công bố. Đợt một bắt đầu diễn ra sau khi rụng trứng vào ngày thứ 3-9 của chu kì,
đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba là ngày 18-0. Mỗi đợt sóng nang có thể huy động
tới 15 nang kích thớc từ 5-7 mm phát triển, sau này có một nang phát triển
mạnh hơn gọi là nang trội (nang khống chế). Kích thớc của nang khống chế ở
đợt 1, 2, 3 có thể đạt 12-15 mm và các đỉnh kích thớc nang tơng ứng quan sát
thấy vào các ngày 6, 13, 21 (Dalin 1987, Monget 1993). Đặc điểm trong các đợt

6
phát triển nang là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang.
Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển và sự phát triển của các nang
còn lại bị kìm hãm. Tuy vậy trong khi thể vàng còn tồn tại, nang khống chế và
nang lớn sẽ bị thoái hoá, chỉ có đợt cuối cùng khi thể vàng không còn thì nang
khống chế mới phát triển tới chín và rụng. Đây là lí do giải thích tại sao mỗi chu
kì động dục của bò chỉ có một trứng chín và rụng (cá biệt có 2 trứng). Do đặc
điểm này các đợt phát triển nang còn đợc gọi là các sóng nang phát triển. Trong
mỗi đợt sóng nh vậy sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao
động từ 5-6 ngày (Ireland 1987, Fortune và cs. 1988). Riêng nang khống chế có
thể phát triển nhanh sau ngày 18 của chu kì, tốc độ phát triển của nang khống
chế vào thời điểm này có thể đạt 1,6mm một ngày (Fortune và cs.1988, Savio và
cs. 1988).
Trờn c s nghiờn cu v về quy luật phát triển của nang trờn bung trng
v những hiểu biết hormone điều khiển sinh sản, nhiều cỏc nh khoa hc đã tạo
cho trứng rụng đồng loạt trong một chu kì và to đợc nhiu phôi có chất lợng
vào điểm đợc xác định bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiu. K thut gõy rng
trng nhiu ó thu đợc nhiều kết quả khả quan. Gây rụng trứng nhiều (GRTN)
lần đầu tiờn c

nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của
Col và Miller (1933); Parker và Hammond (1940) và Casida và cs. (1944). Các
phơng pháp GRTN trong giai đoạn này bớc đầu nghiờn cu chủ yếu trên cơ sở
về mối tơng quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hocmon ECG và
estrogen ở phụ nữ có thai và ngựa chửa (Smith và Engle: 1927; Zondek và
Aschheim: 1927). Kết quả GRTN ở giai đoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ
thụ thai sau cấy phôi chỉ đạt từ 2-10%.
Nghiên cứu xây dựng các phơng pháp GRTN một cách hệ thống và trên
cơ sở hiểu biết đầy đủ về cơ chế điều khiển sự phát triển nang và rụng trứng bắt

7
đầu thực hiện từ những năm 1970. Trong giai đoạn này, s phát triển công nghệ
phôi ở quy mô lớn đối với các đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; các
phơng tiện nghiên cứu hiện đại và chính xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu
âm cũng đã đợc áp dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học sinh sản. Những
đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng các phơng pháp GRTN trong
giai đoạn này đã đợc thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang,
rụng trứng và vai trò thể vàng trong hoạt động chu kỳ tính buồng trứng. Nghiên
cứu của nhiều tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xy ra ở các nang đã phát triển
tới độ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối đa kích thớc nang và xoang chứa dịch
nang, và sự chín noãn đợc thể hiện qua các hiện tợng tan màng nhân, phân lập
cầu cực 1, và phân bố thể nhiễm sắc ở giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault
1985, Blerk Van và bell, 1986).
Điều kiện cần thiết để các quá trình chín và rụng trứng xẩy ra là sự tăng
cờng phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi. Sự chín và rụng trứng chỉ
xy ra sau khi xuất hiện đỉnh LH. Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình
thờng, sự tan màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau đỉnh LH, sự hình thành
nhiễm sắc thể M II xẩy ra khoảng 17-22 giờ sau đỉnh LH, và rụng trứng xy ra
22 giờ sau đỉnh LH (Dieleman 1993). Vào thời điểm sắp rụng trứng, sự tăng các
thể tiếp nhận LH đợc quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng

tổng hợp Progesterone và PGF. Các hocmon này có tác động gây sự vỡ nang
thông qua sự kích thích hoạt động co các cơ trơn nằm ở lớp màng ngoài buồng
trứng (Akamura và cs. 1972; Virutamanen 1972, Chaning và cs. 1980) hoặc tăng
sự tổng hợp các enzym gây tan màng nang nh plasmin, hyaluronidaza (Beer
1975; Espey 1974). Những nghiên cứu này góp phần đa ra các chỉ dẫn về vai trò
và phơng thức sử dụng LH hoặc hCG trong gây rụng trứng nhiều. Ngoài ra, đã

8
có rất nhiều tác giả nghiên cứu về các phơng pháp và sử dụng các loại hocmôn
khác nhau để GRTN ở bò cho phôi.
Theo Elsden và cs. (1974), gây rụng trứng nhiều bằng PMSG và PGF
2


trên bò cho kết quả rất tốt. Bò đợc tiêm PMSG vào giữa chu kì động dục với
liều 1500 2000 UI, sau 48h tiêm 2 liều 1,9mg PGF
2

cách nhau 12 h. Trong
tổng sối 24 bò đợc tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục trong
vòng 5 ngày kể từ khi tiêm PGF
2

. Trong số đó có 14 bò động dục vào ngày thứ
2 và 4. Bằng phơng pháp phẫu thuật để đánh giá kết quả cho thấy rằng cả 24 bò
đều có phản ứng mạnh và có số trứng rụng bình quân là 13,219, trong đó có 20
bò có noãn bao không rụng bình quân là 3,3. Thí nghiệm khác trên 35 bò với liều
2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 của chu kì động dục, kết quả chỉ có 24
bò phát hiện có phản ứng với PMSG bằng phơng pháp khám lâm sàng qua trực
tràng . Khi mổ khám có 7 bò trong số 29 bò không rụng trứng và có u nang

buồng trứng. Trên 17 bò bình quân trứng rụng là 8,01,5 có 4 bò vẫn còn noãn
bao không rụng. Một nghiên cứu nữa đợc tiến hành trên 10 bò với sự kết hợp cả
PMSG và PGF
2

đã phối giống trong thời gian động dục. Trong tổng số 141 trứng
rụng đã thu đợc 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), trong đó có 88% phôi thụ
tinh. Từ những kết quả thu đợc tác giả có nhận xét rằng kết hợp PMSG với
PGF
2

cho kết quả tốt hơn khi dùng một mình PMSG để gây rụng trứng nhiều
trên bò. Boland và cs. 1978; Chupin và Procureur, 1982; Newcomb và cs. 11976)
cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN ở bò thờng kèm theo các hạn chế có thể
ảnh hởng âm tính lên kết quả thụ tinh và sự phát triển phôi nh thời điểm xuất
hiện động dục không chính xác, động dục kéo dài. Trong các trờng hợp này tỷ
lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% cú phản ứng), nhng chỉ có hơn 44% bò
có trên 5phôi/1 lần, và chỉ có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt. Trong thực tiễn khả
năng gây rụng trứng nhiều lặp lại trên cùng một cá thể cho phôi.

9
Hasler và cs (1983) đã làm thí nghiệm so sánh kết quả gây rụng trứng
nhiều bằng eCG lặp lại nhiều lần trến bò sữa Holstein cho thấy số trứng rụng
không giảm (10 thể vàng), nhng tỷ lệ thu phôi và tỷ lệ trứng thụ tinh có thể
giảm từ 30-40% ở những lần GRTN lặp lại. Savage và Maletoft (1984) đã sử
dụng Estradiol 17 hoặc GnRH với FSH-P .Với số bò là 54 đợc gây rụng
trứng nhiều từ ngày 10-12 của chu kì động dục với liều 28 FSH-P, mỗi ngày
tiêm hai lần với liều giảm dần, trong 4 ngày liên tục. Sau khi tiêm 48h mỗi bò
đợc tiêm 500mg PGF
2

. Số trứng rụng trung bình là 12,32.3, số phôi thu đợc
là 0,352,7, số trứng đợc thụ tinh là 6,35,4 trên tất cả bò thí nghiệm .
Boland và cộng sự (1986)

thông báo kết quả gây rụng trứng nhiều trên 30
bò cái tơ với liều 2500UI PMSG tiêm vào ngày thứ 9-12 của chu kì động dục.
Sau khi tiêm PMSG 48h, mỗi bò đợc tiêm 1mg Fenprostalene và đã có 27 bò đã
động dục sau khi tiêm Fenprotalen từ 2-5 ngày. Trung bình số trứng rụng là 11,5
(từ 1-25 trong đó có 17 bò có số trứng rụng lớn hơn 10). Trong số trứng phôi thu
đợc có 72% trứng đã thụ tinh và 74% trong số đó phát triển bình thờng .
Gây rụng trứng nhiều bằng Norgestomet và FSH đã đợc Hill vcs (1986)
tiến hành. Thí nghiệm đợc chia thành 5 ô kí hiệu từ A tới E và Norgestomet đã
đợc cấy vào các thời gian khác nhau của chu kì động dục: ngày 0-3 (A); ngày
4-8 (B); ngày 8-11(C); Ngày 16-20 (D); Còn FSH (37mg) tiêm vào ngày thứ 7
sau khi cấy Norgestomet với liều giảm dần trong 4 ngày, mỗi ngày 2 lần.
Norgestomet đợc lấy ra sau khi cấy đợc 9 ngày. Nhóm đối chứng (F) cũng
đợc tiêm 37mg FSH vào ngày thứ 8-13 của chu kì động dục. PGF
2

liều 25mg
đợc tiêm cho tất cả bò thí nghiệm và đối chứng sau khi tiêm FSH 48h và 60h.
Trung bình số trứng rụng và phôi đảm bảo chất lợng cho tất cả bò thí nghiệm là
10,31.8 và 6,51,9. Còn các lô đối chứng là 8,81,4 và 5,41,0 tơng ứng.
Không có sự khác nhau đáng kể trong các lô thí nghiệm từ A tới E. Các tác giả

10
đã rút ra kết luận rằng dùng Norgestomet kết hợp với FSH để gây rụng trứng
nhiều cho bò cần quan tâm ngày của chu kì động dục của bò và đây là một
phơng pháp tốt và có hiệu quả. Bằng phơng phơng pháp này chúng ta không

mất nhiều thời gian phát hiện động dục và tạo động dục đồng pha đối với bò cho
phôi trong kỹ thuật cấy truyền phôi bò.
Năm 1986, tác giả Kostov và cs đã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò
bằng Synchromate B và Estradiol, PMSG và PGF
2

. Kết quả bò đã động dục sau
tiêm 96h và có 17,6% số bò không động dục. Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10; 11-
15 và trên 15 tơng ứng là 3; 6; 2 và 4 con. Sau khi gây rụng trứng nhiều bằng
FSH và Estradiol. Dieleman và cs. (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ở
bò bằng sử dụng PMSG, PGF
2

và anti-PMSG. Bình quân số trứng rụng và noãn
bao tơng ứng là 15,72.5 và 15,41,6 cho mỗi bò thí nghiệm. Kết quả ở bò thí
nghiệm cao gấp 2 lần so với bò đối chứng về số lợng trứng rụng và độ tin cậy
(P<0,05).
Kim và cộng sự (1987) đã công bố kết quả của việc sử dụng PMSG và
antiPMSG. Thí nghiệm đã tiến hành trên 80 bò và chia làm 3 lô: lô A : PMSG
và antiPMSG; lô B: PMSG +monoantiPMSG và lô C: FSH tiêm 4 ngày mỗi
ngày 2 lần. Bình quân số thể vàng trên bò là:12,4; 11,9 và 4,4, bìmh quân noãn
bao không rụng là 1,2; 2,2 và 0,4 tơng ứng cho các lô A; B; C. Số phôi tơng
ứng cho các loại A, B và C là 8,2 (66,1%);7,3(61,3%) và 3,9(88,6%). Trong đó tỷ
lệ phôi có khả năng cấy trên các phôi thu đợc là 5,9(71,9% ; 5,11(69,8%0; và
3,6 (92,3%) tơng ứng cho các lô A; B; C. Kết qủ tơng tự cũng đợc Kostov
thông báo (1986) về gây rụng trứng nhiều ở bò dùng PMSG và anti-PMSG .
Bergfelt và cs. (1994) đã thông báo nh sau: bò tơ Simental từ 17 đến 22
tháng sau khi gây rụng trứng nhiều đã động dục 100%, số trứng rụng và phôi

11

tơng ứng là 16,41,89 và 10,11,79, trong đó số phôi cấy đợc bình quân cho
mỗi bò là 5,31,09.
Theo Crister và cs. (1988) sử dụng FSH và eCG để GRTN tuy không dẫn
tới sự khác nhau về số trứng rụng (10 thể vàng) nhng có thể ảnh hởng dơng
tính lên chất lợng phôi. Tỷ lệ phôi có thể cấy đợc ở lô bò đợc xử lý FSH cao
hơn so với lô bò đợc xử lý eCG (58% so với 42%. Tuy vậy, Alcivar và cs (1983)
trong thí nghiệm so sánh sử dụng FSHp (26mg, kiều giảm dần) và Pergonal
(1500IU) tiêm vào ngày 9-11 của chu kỳ, đã thông báo những kết quả ngợc lại :
số thể vàng và số phôi thu đợc ở lô bò đợc xử lý FSH (11 thể vàng, 9 phôi) cao
hơn so với lô dùng Pergonal (10 thể vàng, 7,5 phôi), song số phôi cấy đợc
không khác nhau giữa 2 lô (5 phôi cấy đợc). Theo Aoygi và cs (1987) sự biến
đổi nồng độ hocmon Progesterone và estradiol trong máu ngoại vi của bò đợc
gây rụng trứng nhiều bằng FSH và eCG không khác nhau rõ rệt.
Theo Yadav và cs (1985), Ellington và cs (1987) việc sử dụng
Progesterone và PGF trong gây rụng trứng nhiều để khống chế thời điểm, thời
gian và mức độ động dục có thể đem lại những cải tiến về số trứng rụng và chất
lợng phôi. Trong trờng hợp bò cho phôi có hoạt động sinh sản kém, kết quả
gây rụng trứng nhiều thấp, thì việc sử dụng PGF (50mg) tiêm nhiều lần (3 lần,
cách nhau 6 giờ thay vì tiêm 2 lần cách nhau 12 giờ) có thể tăng đáng kể tỷ lệ
động dục (96% so với 86 %), tỷ lệ phôi thụ tinh (62% so với 51%), số phôi tốt
thu đợc (5,4 so với 3,8) (Donaldson 1986).
Estradiol cũng có ảnh hởng quan trọng lên kết quả gây rụng trứng nhiều.
Bổ xung 20mg estradiol-17 vào ngày thứ 1-2 sau khi xử lý eCG, làm tăng số
nang phát triển và tăng số trứng thụ tinh. Kết quả sử dụng estradiol-17 bổ xung
vào FSH hoặc eCG để gây rụng trứng nhiều ở bò Simental đợc Broadbent và cs

12
(1995) thông báo gần đây là 15 thể vàng với số bò đợc xử lý FSH, và 16 thể
vàng với bò đợc xử lý eCG.
Theo Dieleman và cs (1993) dùng anti-eCG bổ xung vào thời điểm động

dục là phơng pháp hiệu quả và đơn giản để tăng hiệu quả của eCG và chất lợng
phôi thu đợc. Tuy vậy, anti-eCG có thể cho những kết quả khác nhau tuỳ theo
phơng pháp sử dụng. Chất lợng phôi sẽ giảm sút khi anti-eCG đợc đa vào
trớc khi xuất hiện đỉnh LH.
Trạng thái buồng trứng của bò cho vào thời điểm gây rụng trứng nhiều là
yếu tố ảnh hởng quan trọng đến kết quả gây rụng trứng nhiều. Theo Lindell và
cs. (1986), xử lý FSH vào ngày thứ 9 của chu kỳ của bò cho kết quả rụng trứng
và chất lợng phôi cao hơn hẳn so với xử lý vào ngày thứ 3 hoặc 6. Gouding và
cs. (1990) cũng thông báo kết quả tơng tự trên đối tợng bò thịt.
Về góc độ sinh lý và môi trờng, các nghiên cứu đã đợc công bố cho thấy
các yếu tố cá thể, giống, mùa vụ đề ảnh hởng rất lớn tới kết quả gây rụng trứng
nhiều ở bò. Kết quả thí nghiệm của Foote và Onuma (1976) cho thấy tuỳ thuộc
theo trạng thái cá thể phản ứng rụng trứng ở bò có thể dao động từ 0-104 trứng
rụng/con. Trong trờng hợp gây rụng trứng nhiều nằng cùng một quy trình, bò có
trạng thái sinh sản bình thờng cho 10 trứng rụng trong đó có 6,4 trứng tốt, trong
khi bò vô sinh chỉ cho 6 trứng rụng và 2,4 trứng dùng đợc. Phản ứng rụng trứng
ở bò có chu kỳ ngắn hơn 15 ngày cũng kém hơn so với bò có chu kỳ dài 15-27
ngày (Crister và cs (1988).
Tuổi bò lúc xử lý gây rụng trứng nhiều cũng ảnh hởng quan trọng đến kết
quả tạo phôi. Phản ứng rụng trứng nhiều ở bò tơ cha đẻ và bò đẻ 1-5 lần thờng
cao hơn so với bò đã đẻ trên 6 lần (Grevet 1982). Chất lợng phôi thu đợc sau
gây rụng trứng nhiều ở bò sữa 12 tháng tuổi kém hơn so với bò sữa đã đẻ 1-2 lứa;
trong trờng hợp bò tơ, số trứng rụng có xu h
ớng cao hơn (22 thể vàng/con/lần),

13
nhng tỷ lệ phôi đạt tiêu chuẩn cấy phôi rất thấp (2/22 phôi) (Schilling và cs
1981). Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về tỷ lệ thu phôi và chất lợng của
phôi sau khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000 IU) trên bò thịt tơ và bò thịt
đang cho bú cho thấy ở bò tơ tỷ lệ thu phôi chỉ đạt 15% và tỷ lệ phôi phát triển

bình thờng là 40%, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ thu phôi đạt 39% và tỷ lệ phôi
phát triển bình thờng 67% ở bò đang cho bú.
Phản ứng rụng trứng nhiều cũng rất khác nhau giữa các giống bò. Theo
Gauthier (1983), số trứng rụng trung bình trong các xử lý gây rụng trứng nhiều
bằng eCG là 2,9 ở bò Pir noir, 6,2 ở bò Charolaise, 4,9 trứng ở bò lai Holstein-
Fresian, và 8,2 trứng ở bò Holstein. Kết quả gây rụng trứng nhiều cũng có thể
thay đổi do ảnh hởng của các điều kiện địa lý khí hậu khác nhau. Phản ứng
buồng trứng và chất lợng phôi thu đợc trong mùa Đông -Xuân thờng tốt hơn
so với mùa Hè- Thu.
Theo thông báo của Hasler và cs (1983) phản ứng rụng trứng nhiều của bò
Holstein nuôi trong điều kiện ôn đới là 11 thể vàng nếu đợc xử lý vào mùa
đông-xuân, và 9,5 thể vàng nếu đợc xử lý vào mùa hè-thu. Tơng tự, kết quả
rụng trứng nhiều và thu tinh ở bò Holstein nuôi tại điều kiện nhiệt đới Châu phi
là 12 thể vàng, 73% phôi tốt, 95% trứng thụ tinh đối với bò đợc xử lý eCG vào
mùa đông, và 7 thể vàng, 46% phôi tốt, 85% trứng thụ tinh đối với bò đợc xử lý
vào mùa hè (Gordon và cs 1987).
Qua kt qu nghiờn cu v ng dụng GRTN trong cấy truyền phôi ca
nhiu tỏc gi, có thể đa ra nhận xét rằng hầu hết các phơng pháp GRTN đợc
sử dụng phổ biến hiện nay, đều đợc sử dụng các hocmon sinh sản và ở mức độ
các cơ chế điều khiển nội tiết-thần kinh thể dịch.
Nguyên tắc chung của các phơng pháp này là:

14
1) Khống chế thể vàng bằng các hocmon có hoạt tính làm tiêu thể vàng nh
oestrogen, prostaglandin và dẫn xuất của chúng.
2) Khống chế hoặc làm mất nang khống chế bằng các hocmon Estradiol,
hCG.
3) Tăng khả năng huy động nang mới phát triển, và khả năng phát triển các
nang đã đợc huy động bằng FSH, eCG.
4) Tạo sự chín đều và rụng trứng cùng lúc cho các nang ở con cho, hoặc giữa

con cho và con nhận, bằng cách sử dụng kết hợp progestin và PGF.
1.2. Gõy ng dc ng pha v cy phụi cho bũ nhn
Gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là quá trình kích thích cho cái nhận
phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi. Đồng pha giữa cái
nhận phôi và cái cho phôi còn có ý nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục ở cái nhận
phôi phù hợp với tuổi của phôi. Nh vậy nếu tiến hành cấy phôi tơi, cái cho phôi
và cái nhận phôi phải đồng thời động dục. Khi cấy phôi đông lạnh, cái nhận phôi
đã động dục trớc đấy một thời gian, thờng là 7 ngày (đúng với tuổi của phôi).
Chu kỳ động dục của bò bình quân 21 ngày, dao động 17-24 ngày. Chu kỳ
này đợc phân thành các thời kỳ nhỏ kế tiếp nhau. Trớc động đực, động đực,
sau động đực và yên tĩnh. Nó đợc đặc trng bởi hai pha: pha noãn nang và pha
thể vàng. Mỗi thời kỳ, mỗi pha đều có những đặc điểm và biểu hiện riêng biệt, có
thể nhận thấy hoặc không thể nhận thấy đợc. Sự thay đổi về trạng thái sinh lý
của cơ quan sinh dục tơng ứng ở các thời kỳ nh: sng, xung huyết, phân tiết
niêm dịch, độ pH niêm dịch, thành phần các chất trong niêm dịch và sự vận động
của cơ quan sinh dục đặc biệt tử cung phải phù hợp, tơng ứng với trạng thái sinh
lý của hợp tử sau là phôi ở từng giai đoạn phát triển. Có nh vậy mới tạo điều
kiện cho phôi thai sống phát triển bình thờng trong cơ thể mẹ. Vì lẽ đó, cấy
truyền phôi chỉ đợc tiến hành cho những con nhận có trạng thái sinh lý sinh dục

15
phù hợp với giai đoạn phát triển của phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi. Sự không
đồng pha sẽ làm cho mẹ nhận phôi đào thải phôi, phôi không thể tiếp tục sống,
phát triển trong tử cung mẹ nhận. Khi cái nhận phôi động dục đồng thời với cái
cho phôi, hoặc trạng thái sinh lý sinh dục của nó phù hợp với tuổi phôi ngời ta
gọi là đồng pha hoàn toàn và lấy số 0 làm biểu tợng. Ngời ta cũng lấy dấu (+)
hoặc (-) đặt trớc thời gian cái nhận phôi động dục trớc hoặc sau cái cho phôi để
biểu hiện mức độ đồng pha . Ví dụ +1: cái nhận phôi động dục trớc 1 ngày; -1:
cái nhận phôi động dục sau 1 ngày, v.v
Kết quả nghiên cứu của Rowson và ctv (1972) cho biết khi cấy phôi cho

cái nhận phôi đồng pha hoàn toàn tỷ lệ đậu thai đạt đến 91%, trớc 1 ngày (+1)
tỷ lệ này là 57%, còn sau 1 ngày (-1) đạt 52%, +2 ngày: 40%, -2 ngày: 30%.
Thông báo của Church (1974) cho biết tỷ lệ có chửa dao động 35-80% tuỳ
thuộc vào sự đồng pha giữa cái cho phôi và cái nhận phôi. Lowson và ctv (1975);
Church và ctv (1976); Sreenan và Beehan (1976) cùng nhận thấy nếu cái nhận
phôi đợc chọn lọc cẩn thận, thể trạng tốt, chăm sóc nuôi dỡng chu đáo, trạng
thái sinh lý phù hợp với tuổi phôi, tỷ lệ đậu thai đạt 50-60% nếu cấy một phôi và
đạt đến 90% nếu cấy hai phôi.
Mỗi phôi đã đợc tạo ra và lựa chọn để cấy, số phận tiếp theo của nó phụ
thuộc vào kết quả đánh giá phản ứng động dục đồng pha và chuẩn bị con nhận
phôi. Thực chất quá trình chuẩn bị con nhận phôi là gây động dục nhân tạo và
đồng pha nhằm tạo điều kiện bảo đảm cho phôi đợc tiếp nhận và làm tổ sau khi
cấy vào cơ thể bò nhận. Chất lợng của con nhận phôi đợc thể hiện qua chỉ tiêu:
1- Trạng thái động dục bên ngoài (dịch nhầy, dấu hiệu động dục ).
2- Sự chín của nang, rụng trứng và hình thành thể vàng.
3- Trạng thái nội tiết cần thiết cho sự phát triển của phôi.
4- Sự phát triển của cơ quan sinh sản cần thiết cho quá trình làm tổ, mang
thai và cuối cùng là sự đồng pha của tất cả các trạng thái trên với tuổi phôi.

16
Việc gây động dục nhân tạo và đồng pha đợc thể hiện chủ yếu bằng các
hormone nội tiết điều khiển sinh sản với các nguyên tắc sau:
1- Tạo trạng thái khởi động chu kỳ đồng đều giữa các bò thông qua việc
tiêu huỷ thể vàng bằng Prostaglandine F
2

(PGF
2

). 2- Kích thích nang trứng phát

triển ở số lợng thích hợp. 3- Cho sự rụng trứng đồng pha vào thời điểm dự kiến
bằng PGF
2

, Progesterone, PMSG, PRID, CIDR.
Cũng nh việc gây rụng trứng nhiều, quá trình này chịu sự điều khiển nội
tiết của cơ thể và qua đó chịu sự ảnh hởng rõ rệt của các yếu tố môi trờng,
giống và trạng thái cơ thể.
Đánh giá chất lợng gây động dục đồng pha qua tỉ lệ động dục và thụ thai
cho thấy gây động dục đồng pha theo nguyên tắc rút ngắn giai đoạn thể vàng
bằng PGF trong trờng hợp bò đợc chọn lọc kỹ và nuôi trong điều kiện tiêu
chuẩn hoá có thể tỉ lệ thụ thai bằng hoặc cao hơn với động dục tự nhiên (75% so
với 68%). Việc gây động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) đơn
lẻ không đáp ứng nhu cầu chuẩn bị con nhận phôi. Tỉ lệ động dục ở bò Zebu
Brahman: đợc tiêm hoặc cho ăn 50 mg CAP trong 5 ngày, chỉ đạt 22 - 41%
(Joche và cs, 1978).
Tỷ lệ động dục và thụ thai đợc cải tiến đáng kể khi Progesteron đợc kết
hợp với Estradiol-17. Sử dụng Synchro-Mate-B có thể cho kết quả 88% động
dục, 70% thụ thai ở bò Holstein đã đẻ vài lần (Anderson và cs, 1982). Kết quả
tợng tự cũng đã đợc Foote và Hunter (1964) công bố trong các thí nghiệm trên
bò thịt. ảnh hởng dơng tính của việc bổ xung Estrogen lên tỉ lệ động dục và thụ
thai cũng đã đợc thông báo ở bò Herefors-Angus đợc gây động dục bằng PGF
(Peters, 1984) hoặc Progesterone Releasing Intravanginal Divice (PRID; smith và
McGowan, 1982). Theo thông báo của tác giả này, việc bổ xung Estrogen
(400àg) và thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF làm tăng tỷ lệ động dục và thụ thai

17
thêm 30%; song kết quả tơng tự không xảy ra trong trờng hợp bổ xung
Estradiol-17b vào thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF.
Việc bổ xung Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) cũng có thể đem lại

những cải tiến tỷ lệ rụng trứng và thụ thai. Sự tăng tỷ lệ bò có rụng trứng đã đợc
(Sreenan và cs, 1975) thông báo ở bò thịt đợc bổ xung ECG 750 I.U vào kết
thúc xử lý Progesteron vào thứ 9. Việc bổ xung eCG đợc xem là cần thiết đối
với bò thịt nghỉ ngơi sinh sản do mùa hoặc cho con bú, vì phản ứng động dục sau
khi đợc xử lý PGF thờng thấp ở các bò này.
Máu sinh sản có ảnh hởng rõ rệt lên kết quả gây động dục. Kết quả gây
động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) ở bò Zebu Brahman của
Joche và cs (1978) cho thấy tỷ lệ động dục thầm lặng trong mùa ma cao hơn
hẳn so với mùa khô (41% so với 22%).
Kết quả gây động dục đồng pha cũng phụ thuộc nhiều vào tính năng sản
xuất của bò. Gây động dục đồng pha bằng PGF thờng không hiệu quả đối với bò
thịt đang cho con bú ở trạng thái nghỉ ngơi (anoestrus). Tỷ lệ động dục trong
trờng hợp này chi đạt 30 - 50% (Roche và cs, 1979). Theo Roche và cs (1976)
và Aquino và cs (1989), việc sử dụng Gonadotropin Stimulating Hormon(GnRH)
và Estradiol-17 đều không đem lại những cải tiến đáng kể trong trờng hợp này.
Gosling và cs (1975) quan sát nồng độ hormon Luteinising Stimulating Hormon
(LH) trong máu ngoại vi của bò thịt sau khi tiêm Gonadotropin Stimulating
Hormon(GnRH) 100àg và Estradiol-17 400àg hai lần, vào ngày15 và lặp lại
vào ngày 30 sau khi đẻ cho thấy chỉ có 7/72 bò có đỉnh LH rõ nét.
Liên quan đến việc động dục và cấy phôi, Cooper và Furr (1976) thông báo
90% bò sữa tơ đợc sử lý PGF (500 àg, hai lần, cách nhau 11 ngày) có biểu hiện
động dục trong vòng một ngày (n=175). Tuy vậy kết quả đo thời điểm tiêu thể
vàng qua nồng độ Progesteron trong máu và thời điểm xuất hiện đỉnh LH, rụng

18
trứng của Hahn (1976) trên bò sữa đợc xử lý PGF (ICI 80 996) vào ngày thứ 10
- 11chu kỳ cho thấy thời điểm tiêu thể vàng tơng đối tập trung (sai lệch 3,3 giờ
so với trung bình), nhng thời điểm rụng trứng còn phân tán (sai lệch 18 giờ so
với trung bình 81 giờ).
Theo Roche (1976) tỷ lệ động dục ở bò tơ và bò sữa Holstein đợc cấy

Progesteron vào trong âm đạo trong 12 ngày là 99% và trong đó 90% tỷ lệ bò có
động dục cùng ngày là 72% và 70%. Cũng theo Roche việc bổ xung Estradiol-
17 vào ngày đầu cấy Progesteron đem lại những cải tiến quan trọng: 94% bò
trong trờng hợp này có biểu hiện động dục đồng pha cung ngày.
nh hởng của Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) và Estradiol-17 lên
sự đồng pha cũng đợc Nancarraw và Miller (1976) thông báo trên bò đợc xử lý
PGF, PGF kết hợp ECG (750 I.U) và PGF kết hợp với estradiol benzoate 500 àg.
Sai lệch thời gian xuất hiện động dục tơng ứng cho các lô trên là 5,5 - 7 giờ
(trên 78,9%); 3 giờ (trên 67,2%) và trên 2,4 giờ (trên 52,9%).
So sánh kết quả thụ thai sau cấy phôi ở bò có độ lệch pha khác nhau,
Hensen (1976) thông báo tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi bò Belgian blue-white bred
đợc xử lý PGF dao động từ 40 tới 65% trong độ lệch pha cho nhận -24 tới + 12
giờ và cao nhất ở mức lệch: +6 giờ (trớc con cho, tức phôi trẻ hơn), -24 giờ (con
nhận rụng trứng sau con cho).
Theo Rowson và cs (1969) giới hạn lệch pha động dục chp phép tối đa là
24 giờ. Việc cấy phôi vào con nhận động dục 36 giờ trớc con cho hoặc hơn 12
giờ sau con cho đều cho kết quả chửa thấp, trong khi theo Hahn (1976) sự lệch
pha 0,5 ngày có thể chấp nhận.
Phơng pháp sử dụng hormone có thể khác nhau, phải đợc lựa chọn, điều
chỉnh cho từng trờng hợp cụ thể mới đem lại hiệu quả cao. Sử dụng SMB cho
kết quả 88% động dục, 70% có chửa ở bò Holstein (Anderson và ctv, 1982).

19
Kết quả cuối cùng của cấy phôi đợc thể hiện qua tỷ lệ thụ thai. Quá trình
làm tổ chỉ xảy ra trong khoảng thời gian giới hạn. Trong trờng hợp sinh sản bình
thờng, sự phối hợp nhịp nhàng giữa phôi và cơ thể mẹ đợc thực hiện nhờ các
Steroid (Maurer và Echternkamp, 1982). Protein nội mạc tử cung Uretroglobin và
các tín hiệu trao đổi thông tin do phôi tổng hợp nh Triphoblaxin, PSPB
(Pregnancy Specific Protein).
Cấy phôi là sự chuyển phôi từ cơ thể mẹ này (mẹ cho) sang một cơ thể mẹ

khác (mẹ nhận), số phận phôi sau khi cấy vào cơ thể mẹ nhận, sẽ phụ thuộc vào:
1. Môi trờng cơ thể mẹ nhận.
2. Giới hạn miễn dịch.
3. Sự trao đổi tín hiệu mẹ - phôi trong trờng hợp cấy phôi cùng loài. Yếu
tố quan trọng nhất là sự trao đổi tín hiệu giữa phôi và cơ thể mẹ là sự đồng pha.
Theo thông báo của các tác giả, tỷ lệ có chửa trên 50% nếu độ lệch pha
giới hạn xung quanh 1 ngày, sẽ giảm xuống chỉ còn 20% nếu độ lệch pha lớn hơn
2 ngày.
Newcomb và Rowon (1975), Yadan (1986), Newcomb (1977) cho rằng để
có tỷ lệ đậu phôi cao, thì bò nhận phôi động dục muộn hơn 1 ngày so với bò cho
phôi. Iglesias (1971), Alcalas (1986) cho rằng để có tỷ lệ đậu thai cao hơn, thì bò
nhận phôi biểu hiện động dục sau bò cho phôi 1 ngày
Tỷ lệ bò có chửa cao nhất nếu cặp cho nhận phôi có độ lệch pha trong
phạm vi 6 đến 24 giờ (Bùi Xuân Nguyên và ctv, 1996).
1.3. ụng lnh phụi
Cơ chế đông lạnh phôi: Nghiờn cu v c ch ụng lnh t bo, theo định luật
Loi Raoult, độ hạ băng điểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ các chất hoà
tan. khi hạ nhiệt độ, lúc xuất hiện tinh thể nớc đầu tiên là bắt đầu thay đổi giai
đoạn đông băng. Điều này chỉ có thể xẩy ra khi nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng độ

20
hạ băng điểm của dung dịch. Nhiu nghiờn cu cho bit bờn trong tế bào chứa
hơn 80% nớc, nồng độ nớc này cao hơn bên ngoài tế bào. Vì vậy, sự thay đổi
giai đoạn đông lạnh nội bào xẩy ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài.
Trong quá trình đông lạnh, trớc tiên ở môi trờng bên ngoài tế bào những tinh
thể nớc đợc tạo thành, làm tăng nồng độ chất hòa tan nhanh chóng. Sự tăng áp
suất thẩm thấu ny, nớc sẽ đi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào. Mức độ
mất nớc tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc
độ này phải ở trên tốc độ giới hạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế
bào, khả năng tạo băng đá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do

đông lạnh hay giải đông. Tốc độ lạnh ở dới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế
bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ chất
hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào. Trong môi trờng huyền phù
(vừa thể lỏng vừa tinh thể) nớc tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế
bào sẽ mất nớc để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào,
mi trao i cht ca t bo ngng hot ng, t bo sng tim sinh. Nh vậy,
sự hiện diện của tinh thể nớc đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai
yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống
sót của tế bào.
Theo Mazur (1977), cho bit những hiện tợng vật lý chính xẩy ra trong
quá trình đông lạnh tế bào. khi nhiệt độ hạ xuống -5
0
C, tế bào và môi trờng
xung quanh cha đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh cha tạo đá (supercooling) và vì
sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh. Tinh thể nớc sẽ hình
thành bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -5
0
C đến -15
0
C (do ngẫu nhiên hay do tạo mầm
nớc - seeding), nhng các chất bên trong tế bào vẫn cha đông lạnh và nhiệt độ
lạnh cha tạo đá, có thể do màng tinh thanh ngăn cản sự lan rộng tinh thể nớc
vào trong tế bào chất. Theo định nghĩa, nớc ở nhiệt độ lạnh cha tạo đá bên

21
trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nớc trong dung dịch đợc đông
lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này, nớc sẽ đi ra ngoài
tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào.
Tốc độ làm lạnh nh hng n cỏc hiện tợng vật lý xẩy ra tiếp theo bên
trong tế bào. Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nớc nhanh do

ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh
cha tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng
các chất hoá học ngoại bào. Kết quả là tế bào mất nớc và không đông lạnh bên
trong tế bào. Nhng nếu tế bào đợc đông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng
mất nớc nhanh để duy trì cân bằng, vì vậy nhiệt độ lạnh cha tạo đá
(supercolling) tăng lên và cuối cùng đạt đợc sự cân bằng bằng việc đông lạnh
nội bào.
Có nhiều chất bảo vệ lạnh đợc sử dụng với các nồng độ khác nhau và
thờng đợc dùng kết hợp với nhau. Những chất bảo vệ lạnh đợc dùng phổ biến
hin nay gồm glycerol và dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol
(ethylene glycol, propylene glycol.).
Glycerol (C
3
H
5
(OH)
3
) có phân tử lợng 92; có tính độc nhẹ, có tác dụng
nh một chất chống đông; có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan
trong nớc và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế
bào thay thế các phân tử nớc thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho tế bào không bị
giảm dung tích. Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với
các phân tử nớc, nên nớc đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ đợc sự giãn nở của
tinh thể nớc có kích thớc lớn, ngăn cản đợc sự phá vỡ màng và tế bào. Vì vậy
mà glycerol giữ đợc sự ổn định về nồng độ của các chất hoà tan, không làm thay
đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình
đông lạnh. Để phôi có thể cân bằng với glycerol, ngời ta chuyển phôi vào dung

22
dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để

thực hiện quá trình rút nớc nội bào và thay thế bằng glycerol.
Ethylene glycol có phân tử lợng thấp hơn (62,07) so với của glycerol
(92,10), chất này có tác dụng tơng tự glycerol và có thể dùng thay thế cho
glycerol trong đông lạnh phôi bò. Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong
đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi bò theo
các bớc mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Docchi và cs. 1995, Voelkel và Hu,
1992).
Nguyen và cs. (2000) đã báo cáo rằng khi sử dụng 60% ethylene glycol
trong dung dịch PBS để đông lạnh, tỷ lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải
đông tơng ứng là 78% và 55%. Tuy nhiên, khi các tác giả này kết hợp làm mất
nớc một phần và sử dụng 39% ethylene glycol, 0,7M sucrose và 8,6% filcoll, tỷ
lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải đông tơng ứng là 77% và 85%.
Hasler và cs. (1997) đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong
dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M ethylene glycol. Sau khi giải
đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tơng ứng là 69,2% và 62,4%.
Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lợng thấp
(78,13). Chất này lần đầu tiên đợc Wilmut và Rowson (1973) sử dụng để đông
lạnh phôi bò. Tuy nhiên, nhiều tác giả đã nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả
năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì
glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế, đến cuối những năm
1970, glycerol đợc dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò.
Đờng (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic
acid) cũng đợc dùng nh những chất bảo vệ lạnh nhng chúng thờng đợc
dùng với các chất bảo vệ lạnh khác.
Kasai (1996) đã tổng kết rằng, các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử
dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc sự dụng kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh

23
nh dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol,
polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác

nhau để đông lạnh phôi đông vật có vú.
Theo Bui Xuan Nguyen (1997), việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả
năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữac các loài. Đối với thỏ, khả
năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glycerol hay DMSO rất
thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%). Đối với phôi dâu-phôi nang
bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so
với 0%). Trong khi đó, phôi bò đợc đông lạnh trong hỗn hợp chất bảo vệ lạnh
sucrose-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với trong hỗn hợp sucrose-propaneol
(65% so với 0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất
bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác vẫn cha đợc rõ.
Với quan điểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại
tế bào sống khác. Điều quan trọng nhất của quá trình đông lạnh là loại bỏ nớc
nội bào trớc khi chúng đợc đông lạnh. Đã có nhiều nghiên cứu về kỹ thuật
đông lạnh bao gồm loại chất bảo vệ lạnh và nồng độ sử dụng của chúng, tốc độ
hạ nhiệt độ, nhiệt độ tạo đá và nhiệt độ chuyển phôi sang nitơ lỏng cũng nh
nhiệt độ và tốc độ giải đông (Renard và cs. 1982; Lehn-Jensen, 1983; Franks và
cs. 1986; Prather và cs. 1987; Renard và cs. 1984; Nguyen và cs. 2000).
Cỏc nghiờn cu trc õy, đông lạnh phôi có thể chia làm 2 phơng pháp:
đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh. Đông lạnh chậm là phơng pháp mà ở đó
quá trình làm mất nớc nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xẩy ra chậm
trớc khi phôi đợc chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng. Đối với phơng pháp
đông lạnh chậm, phôi đợc chuyển vào môi trờng có chất bảo vệ lạnh theo
nhiều bớc với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi
trờng có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp. Thời gian cân bằng trong phơng
pháp này thờng 10-30 phút. Sau khi cân bằng, phôi đ
ợc đông lạnh với tốc độ