nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU RAU QUẢ





CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH
TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020
***


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG ĐƠN BỘI KÉP (DƯA CHUỘT,
ỚT) PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ƯU THẾ LAI



Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Nghiên cứu Rau quả
Chủ nhiệm đề tài : GS.TS. Trần Khắc Thi

8827


HÀ NỘI, 6/2011

i
MỤC LỤC


PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu chung 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 3
1.3. Cách tiếp cận 3
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng 4
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấ
n in vitro để tạo cây đơn bội 5
2.2.1 Giới thiệu chung 5
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn 6
2.2.3. Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro
trên thế giới và trong nước 11
2.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột, ớt cay ở nước ta. 17
2.3.1. Chọn giống dưa chuột 17
2.3.2. Chọ
n giống ớt cay 20
PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1. Vật liệu nghiên cứu 22
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 24
3.2. Nội dung nghiên cứu 24
3.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tạo dòng đơn bội kép
(dưa chuột, ớt) 24
3.2.1.1. Trên cây dưa chuột 24
3.2.1.2. Trên cây ớt 30

ii
3.2.2. Ứng dụng quy trình tạo dòng đơn bội kép của một số giống lai F1
dưa chuột, ớt 34
3.2.3. Đánh giá chọn lọc cây 2n, phát triển thành dòng thuần 34
3.3. Phương pháp nghiên cứu 35
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 35
3.3.2. Chỉ tiêu theo dõi 38
3.3.3. Thời gian thực hiện 40
PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41
4.1. Kết quả nghiên cứu trên cây d
ưa chuột 41
4.1.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo cây dưa chuột đơn bội kép 41
4.1.2. Kết quả ứng dụng quy trình tạo cây dưa chuột đơn bội kép trên
một số giống dưa chuột lai F1 65
4.1.3. Kết quả đánh giá, chọn lọc cây dưa chuột đơn bội kép trong điều 68
4.2. Kết quả nghiên cứu trên cây ớt 75
4.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo cây ớt đơn bộ
i kép 75
4.2.2. Ứng dụng quy trình tạo dòng ớt đơn bội kép trên các giống ớt lai
F1 (Hottchili, Green F1, GK99) 96
4.2.3. Kết quả đánh giá, chọn lọc cây ớt đơn bội kép trong điều kiện
nhà lưới 99
3.3 Một số đặc điểm về quả của các tổ hợp lai ớt cay trong vụ xuân hè

2010 106
3.4 Khả năng chống chịu sâu bệnh các tổ hợp lai ớt cay vụ đ
ông
xuân 2011 107
3.5 Khả năng kết hợp chung của các dòng ớt đơn bội kép 108
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 111
5.1. Kết luận 111
5.2. Đề nghị 112
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI
119

iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA α -Naphthaleneacetic acid
BAP 6 - Benzylamino purine
2,4D 2,4 - dichlorophenoxi aceticacid
IAA Indole -3- aceticacid
KI Kinetin
TDZ Thidiazuron
CNM Cao nấm men
CSI Casein
MS Murashige & Skoog, 1962
CW Nước dừa
B5 Gamborg (1968)
N6 Chu và Cs (1975)
CT Công thức
CTTD Chỉ tiêu theo dõi
CTTN Công thức thí nghiệm
Đ/C Đối chứng

NXB Nhà xuất bản
TB Trung bình
S Đường Saccarose







iv
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Đặc điểm của một số giống dưa chuột lai F1 được chọn làm
guồn vật liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy 22
Bảng 3.2. Đặc điểm của một số giống ớt lai F1 được chọn làm nguồn vật
liệu cung cấp hoa để lấy bao phấn nuôi cấy 23
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nề
n môi trường dinh dưỡng cơ bản đến sự khả
năng tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột (sau 4
tuần) 41
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy
bao phấn cây dưa chuột (sau 4 tuần) 42
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến khả năng tạo callus từ
nuôi cấy bao phấn cây dưa chuột (sau 4 tuầ
n) 43
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý lạnh đến khả năng
tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn cây dưa chuột (sau 6
tuần) 44
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo callus từ nuôi cấy in

vitrro bao phấn cây dưa chuột sau (8 tuần nuôi cấy) 46
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP đến sự
tạo callus từ nuôi
cấy in vitrro bao phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 47
Bảng 4.7 : Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + Kinetin đến sự tạo callus từ
nuôi cấy in vitrro bao phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 48
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh của cây dưa chuột
(sau 8 tuần) 50
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự tái sinh từ
callus bao
phấn cây dưa chuột (sau 8 tuần) 51
Bảng 4.10: Ảnh hưởng của BAP + TDZ đến khả năng tái sinh của cây
dưa chuột (sau 8 tuần) 52

v
Bảng 4.11: Kết quả phân tích độ bội của các chồi dưa chuột 54
Bảng 4.12: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh của chồi dưa
chuột in vitro (sau 4 tuần) 55
Bảng 4.13: Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh của chồi
dưa chuột in vitro (sau 4 tuần) 56
Bảng 4.14: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến khả năng nhân nhanh
cây dưa chu
ột đơn bội (sau 4 tuần) 57
Bảng 4.15: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả năng nhân
nhanh cây dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 59
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng nhân
nhanh chồi dưa chuột đơn bội (sau 4 tuần) 60
Bảng 4.17. Ảnh hưởng của hàm lượng casein đến khả năng nhân nhanh
chồi dưa chu
ột đơn bội (sau 4 tuần) 61

Bảng 4.18: Ảnh hưởng của xử lý colchicine đến khả năng nhị bội hóa
dòng dưa chuột đơn bội 62
Bảng 4.19: Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng ra rễ của chồi dưa
chuột 63
Bảng 4.20: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi dư
a chuột. 64
Bảng 4.21: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dưa chuột. 64
Bảng 4.22: Kết quả tạo dòng dưa chuột đơn bội kép trên 3 giống
Mijabel, Ajax, Marinda 66
Bảng 4.23: Tỷ lệ sống của cây dưa chuột đơn bội kép 68
Bảng 4.24. Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng phát triển của các
dòng dưa chuột trong vụ xuân năm 2010 tại Viện Nghiên c
ứu
Rau quả. 68
Bảng 4.25. Đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng dưa chuột tạo
ra từ dòng đơn bội (vụ xuân năm 2010 tại viện Nghiên cứu Rau
quả) 69

vi
Bảng 4.26. Năng suất, yếu tố cấu thành năng suất và đặc điểm quả của
các dòng dưa chuột đơn bội kép (vụ xuân năm 2010 tại viện
Nghiên cứu Rau quả) 70
Bảng 4.27. Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của các THL dưa
chuột trong vụ đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 71
Bảng 4.28. Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai dưa chu
ột trong vụ
đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 72
Bảng 4.29. Một số đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai dưa chuột vụ
đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 72
Bảng 4.30. Đặc điểm quả của các tổ hợp lai dưa chuột trong vụ đông

2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 73
Bảng 4.31. Tình hình nhiễm bệnh đồng ruộng c
ủa các THL trong vụ
đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 73
Bảng 4.32: Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các tổ hợp
lai dưa chuột vụ đông 2010 tại Viện Nghiên cứu Rau quả 74
Bảng 4.33. Khả năng kết hợp chung của các dòng dưa chuột với 2 vật
liệu thử 74
Bảng 4.34: Tỷ lệ sống của bao phấn in vitro trên 3 loạ
i môi trường dinh
dưỡng cơ bản (Sau 6 tuần ) 76
Bảng 4.35. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến khả năng tạo callus từ
nuôi cấy bao phấn cây ớt (sau 6 tuần) 77
Bảng 4.36: Ảnh hưởng của xử lý lạnh và thời gian xử lý đến tỷ lệ sống
của bao phấn (sau 6 tuần ) 78
Bảng 4.37: Ảnh hưởng của αNAA đến kh
ả năng tạo callus từ bao phấn
của cây ớt (sau 6 tuần) 80
Bảng 4.38: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + BAP đến khả năng tạo callus
từ bao phấn ớt (sau 6 tuần) 81

vii
Bảng 4.39: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + Kinetine đến khả năng tạo
callus từ bao phấn của cây ớt (sau 6 tuần) 82
Bảng 4.40: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh của callus ớt (sau
4 tuần ) 84
Bảng 4.41: Ảnh hưởng của Zeatin đến khả năng tái sinh của cây ớt 84
Bảng 4.42: Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ + GA3 đến khả nă
ng tái sinh
cây ớt (sau 4 tuần ) 85

Bảng 4.43: Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 + Zeatin đến sự tái sinh cây ớt.
(sau 4 tuần) 86
Bảng 4.44: Kết quả phân tích độ bội của các chồi ớt 87
Bảng 4.45: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh của cây ớt
(sau 4 tuần) 88
Bảng 4.46: Ảnh hưởng của kinetine đến khả năng nhân nhanh của cây ớ
t
tái sinh (sau 4 tuần) 90
Bảng 4.47: Ảnh hưởng của BAP phối hợp với αNAA đến khả năng
nhân nhanh của cây ớt (sau 4 tuần) 91
Bảng 4.48: Ảnh hưởng của BAP phối hợp với IBA đến khả năng nhân
nhanh của cây ớt (sau 4 tuần) 91
Bảng 4.49: Ảnh hưởng của cao nấm men và dịch chiết hữu cơ đến chất
lượng chồi
ớt (sau 4 tuần) 92
Bảng 4.50: Ảnh hưởng của xử lý Colchicines đến khả năng nhị bội hóa
dòng đơn bội 93
Bảng 4.51: Ảnh hưởng của αNAA và IBA đến khả năng ra rễ của chồi ớt 95
Bảng 4.52 : Kết quả ứng dụng quy trình tạo cây đơn bội kép trên 3 giống 96
Bảng 4.53: Tỷ lệ sống của cây đơn bội kép 99
Bảng 4.54. Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng phát triển của các
dòng ớt đơn bội kép chọn lọc 100

viii
Bảng 4.55. Chiều cao cây qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của
các dòng ớt đơn bội chọn lọc 101
Bảng 4.56. Đặc điểm hình thái thân, lá, quả của các của các dòng ớt đơn
bội kép chọn lọc 102
Bảng 4.57. Đặc điểm hình thái hoa của các dòng ớt đơn bội kép chọn lọc 103
Bảng 4.58: Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất các dòng ớt đơn bội

kép chọn lọc 103
Bảng 4.59. Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của các tổ
hợp lai trong vụ đông xuân 2010. 104
Bảng 4.60. Năng suất và các yếu tố tạo thành năng suất của các tổ hợp
lai ớt cay vụ đông xuân 2010 105
Bảng 4.61 . Đặc điểm quả của các tổ hợp lai ớt cay vụ Đông xuân 2011 106
Bảng 4. 62. Khả năng chống chịu sâu bệnh các tổ hợp lai ớt cay vụ đông
xuân 2011 107
Bảng 4.63: Khả năng kết hợp chung về năng suất của các dòng và cây
thử 108


1
PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Sản xuất rau là ngành có vai trò ngày càng quan trọng và có mức tăng
trưởng khá cao trong sản xuất nông nghiệp của nước ta. Rau xanh vừa là
nguồn thực phẩm không thể thiếu cho mỗi bữa ăn hàng ngày với yêu cầu mức
tăng khối lượng bình quân hàng năm gấp đôi tỷ lệ tăng dân số ( FAO, 2006),
vừa là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng nông s
ản
xuất khẩu có tiềm năng. Mức tăng sản lượng rau của nước ta khá cao: theo số
liệu thống kê, năm 2010 tổng diện tích trồng rau các loại đạt 780 ngàn ha, sản
lượng 13 triệu tấn; so với 2005 diện tích tăng 145 ngàn ha( tốc độ tăng bình
quân 4,2%/năm), sản lượng tăng 3,3 triệu tấn( tốc độ tăng bình quân
6,1%/năm). Đây cũng là ngành sản xuất mang lại hiệu quả kinh tế cao cho
nông dân . Theo số liệu của dự án Superchain ( 2009) thu nhập bình quân trên
1 ha rau ở Đồng bằng sông Hồng tại vùng luân canh với cây lương thực đạt
trung bình 46,3 triệu đồng/vụ, tại vùng chuyên canh từ 86- 120 triệu đồng/

năm. Một trong những nguyên nhân của sự tăng trưởng trên là tỷ lệ sử dụng
các tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất, nhất là giống lai khá cao. Tuy nhiên phần
lớn các giống lai F1 được nhập hoặc do các công ty nước ngoài cung cấ
p.
Việc tạo giống trong nước, đặc biệt là nhóm rau chủ lực, có khả năng ra hoa
trong điều kiện Việt Nam thuộc các họ thực vật Cucurbitaceae và Sonalaceae
là cần thiết trong giai đoạn hiện tại và trong tương lai.
Dưa chuột và ớt cay thuộc nhóm cây rau ăn quả chủ lực ở nước ta hiện
nay. Ngoài việc đáp ứng nhu cầu trong nước ngày càng tăng , sản phẩm của
các cây này còn là ngu
ồn nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu với thị trường
rộng lớn và ổn định. Hầu hết các giống dưa chuột và ớt cay hiện đang trồng
trên đất nông nghiệp tại vùng sản xuất hàng hóa tập trung ở nước ta là giống
lai F1 có nguồn gốc nước ngoài. Các giống này ngoài năng suất và độ đồng

2
đều cao, quả của các giống này còn thích hợp với thị hiếu tiêu dùng của nước
nhập khẩu. Tuy nhiên, do giá thành hạt giống cao và nhiều giống chưa qua
khảo nghiệm tính thích ứng đã ảnh hưởng tới hiệu quả sản xuất. Việc tạo
giống trong nước theo yêu cầu của sản xuất và phù hợp với sinh thái vùng
canh tác ngày càng trở lên cần thiết.
Bên cạnh đó, các giống lai nước ngoài được nhập nội tr
ồng liên tục qua
nhiều năm đã làm xói mòn nguồn gen các giống thuần địa phương có tính
thích ứng cao, khả năng chống chịu sâu bệnh và chất lượng thương phẩm tốt.
Một trong những khó khăn nữa của công tác tạo giống lai các đối tượng trên
hiện nay là việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống
thường tốn rất nhiều thời gian và công sức. Thông qua thụ phấn cưỡng bức và
chọn lọc liên tục cũng phải qua 7-8 thế hệ mới nhận được các dòng thuần để
đánh giá khả năng kết hợp của chúng. Tuy vậy, phương pháp này trong nhiều

trường hợp vẫn không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử ở tất cả các cặp allen .
Vì vậy, việc áp dụng biện pháp nuôi cấy in vitrro bao phấn sẽ rút ngắn được
thời gian tạo dòng thuần mà các nghiên cứu trên một số
cây lương thực đã
khẳng định được tính hiệu quả của nó, đồng thời có thể lợi dụng nguồn vật
liệu là các giống thương mại đang trồng phổ biến để tạo dòng thuần làm
nguồn vật liệu cho con lai mới [6], [11].
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn đã giao cho Viện Nghiên cứu Rau quả chủ trì thực hiện đề tài:
“ Nghiên c
ứu tạo dòng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống
ưu thế lai”. Giai đoạn 2007 – 2010.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung
Tạo được một số dòng ớt, dưa chuột mới làm nguồn vật liệu cho công
tác chọn tạo giống ưu thế lai phục vụ sản xuất bằng công nghệ đơn bội kép

3
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
+ Quy trình tạo dòng dưa chuột, ớt đơn bội kép
+ Tạo được 1-2 dòng dưa chuột, ớt thuần làm vật liệu phục vụ cho chọn tạo
giống ưu thế lai.
1.3. Cách tiếp cận
- Tiếp cận hệ thống. Đề tài đã thực hiện tuần tự các kỹ thuật từ nuôi ấy
bao phấn các đối tượng nghiên cứu, tái sinh callus, nhị bội hóa cây đơ
n bội ,
đánh giá đặc tính nông sinh học cây đơn bội kép ngoài đồng ruộng và xác
định khả năng kết hợp các dòng thu nhận để phục vụ cho tạo giống lai F1 như
một hệ thống các kỹ thuật đồng bộ và hoàn chỉnh.
- Tiếp cận kế thừa. Do nội dung nghiên cứu này trên đối tượng dưa

chuột và ớt chưa được thực hiện ở nước ta , việc tiếp thu và vậ
n dụng các
phương pháp được triển khai có kết quả ở nước ngoài thông qua các nguồn tài
liệu đã giúp đề tài xác định các kỹ thuật cần thiết nhằm tạo khả năng phát sinh
phôi và tái sinh cây từ bao phấn có hiệu quả.














4
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng.
Công tác chọn tạo giông với cây trồng tự thụ phấn trong một thời gian dài
người ta yêu cầu phải có những tái tổ hợp gen mong muốn từ các nguồn đồng
hợp tử khác nhau. Bằng phương pháp truyền thống thường phải mất 8-10 năm
để tạo ra con lai đồng hợp tử ổn định. Ở cây th
ụ phấn chéo thường gặp nhiều
khó khăn hơn để có những dòng tự phối cường lực mạnh vì hiện tượng suy

giảm do cận giao. Những dòng tự phối đồng hợp tử này sẽ được lai với nhau
để tạo con lai F1 ưu thế lai. Việc nghiên cứu cây đơn bội làm vật liệu nguồn
để lưỡng bội hóa chúng thành những vật liệu đồng hợp tử đã trở nên hữ
u dụng
cho nhà chọn giống. Thời gian cần thiết để tạo ra dòng vật liệu nguồn- dòng
đơn bội kép ( double haploit – DH) như vậy được rút ngắn rất nhiều, khoảng
3-4 lần, tùy đối tượng cây ( Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2007) [2].
Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả năng và
triển vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chon giống, vì lẽ trong bất
kỳ
một quần thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử
thường là cao hơn so với trong hợp tử. Do đó về mặt lý thuyết sẽ thường
xuyên và rất nhanh nhận được các dạng đồng hợp tử có những tổ hợp các dấu
hiệu mong muốn bằng cách gấp đôi trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể ở các thể
đơn bội .
Để so sánh kh
ả năng chọn giống ở mức độ đơn bội và lưỡng bội , người ta
sử dụng công thức 2
n
đối với các thể đơn bội và 4
n
đối với các thể lưỡng bội .
Công thức đầu tiên 2
n
cho phép ta xác định tất cả các tổ hợp gen có thể có về
mặt lý thuyết ở mức độ đơn bội khi hình thành giao tử, còn công thức thứ hai-
4
n
để tính tổng số tối thiểu những cây F2 mà trong đó có thể xuất hiện tất cả
các tổ hợp gen có thể về mặt lý thuyêt ở mức độ lưỡng bội. Thí dụ, để nhận

5
được tất cả những kiểu dòng đồng hợp tử trên cơ sở tái tổ hợp 7 cặp gen độc
lập thì về mặt lý thuyết cần phải có ở mức độ đơn bội 128 giao tử cái của cây
lai F1. Ở mức độ lưỡng bội để đạt được chính kết quả này cần không ít hơn
16.384 cây F2 . Khi tăng chỉ số n=10 thì những trị số tương ứng nêu ở trên sẽ
là 1024 và 1.048.576. Phép so sánh này đã chỉ ra rằng , hiệu quả của chọn
giống tổ hợp tăng hàng trăm lần trong trường hợp dùng phương pháp in vitro
tạo các dạng đơn bội trong quần thể để chuyển nó sang dạng DH bằng cách
gấp đôi số nhiễm sắc thể đơn bội, ( Trần Duy Quý, 1997) [8].
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội.
2.2.1 Giới thiệu chung
Nuôi cấ
y bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn trong có chứa
các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng tạo ra cây
đơn bội, là một lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào công
tác chọn giống cây trồng. Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời
gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọ
c và
giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa. Các dòng thuần có thể nhanh chóng
được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn
nhất. Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn như sau [8],[30]:

Phôi hoá
Cây đơn bội
Tạo callus
Cây đơn bội
Nuôi cấy bao phấn trên môi
trường dinh dưỡng đặc hiệu

6
Một số ưu điểm của phương pháp này như sau: Kỹ thuật khá đơn giản,
ở một số loài sự phân chia tế bào dễ dàng ngay cả khi những tế bào hạt phấn
chưa thực sự chín. Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với môi trường nuôi cấy
cao (tần suất cảm ứng môi trường cao) và có thể sản xuất thể đơn bội với số
lượng lớn trong thời gian ngắn.
Một số nhược điểm chính của tạo thể đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn
là: Đối với một số loài nhiều cây tạo ra không phải là đơn bội. Ở cây ngũ cốc,
thu được cây xanh rất ít; nhiều cây bạch tạng hoặc bị thể khảm[30] .
Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử,
trong mộ
t quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng
phương pháp truyền thống[19], [39], [45]. Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối
cùng của nuôi cấy bao phấn, chúng có đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và
được coi là nguồn vật liệu đa dạng phong phú cho chọn tạo giống [35], [38],
[16]. Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống,
làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính bi
ến dị cho chọn lọc và giúp giải
quyết những khó khăn trong lai xa.
Các dòng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn

của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất.
Như vậy, phương pháp nuôi cấy bao phấn đã góp phần rút ngắn rất nhiều
thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề
trong lai xa. Chính vì vậy mà phương pháp này đang được áp dụng rộ
ng rãi
trong chọn tạo giống cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn
Nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn cho chúng ta thấy
hiệu quả của nuôi cấy bao phấn nói chung và bao phấn dưa chuột nói riêng
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Điều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát
triển c
ủa hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho
phấn và thành phần của môi trường dinh dưỡng [14], [20] [25], [29].

7
*. Ảnh hưởng của cây cho bao phấn.
Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết
quả nuôi cấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các
giống trong một loài. Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một
đặc điểm có khả năng di truyền [37], [41], [49].
Tác giả Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua
đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen c
ủa các giống
được đưa vào nuôi cấy, callus chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống. Sự tái
sinh cây chỉ có được từ callus của 15 giống. Số liệu thu được ch thấy kiểu gen
ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn [40].
Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến
sự hình thành callus và tái sinh cây khi nuôi cấy bao phấn. Niizeki (1983) và
Haberlebos (1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của ki
ểu gen và mối tương

tác giữa kiểu gen, môi trường đến sự hình thành callus và tái sinh cây. Ngoài
ra theo một số nhà khoa học thì ngoài kiểu gen ra còn có các nhân tố tế bào
chất cũng ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn (Heberlebor, 1985) [29]. Tuy
nhiên trong thời gian gần đây, Quimio và Zapata cho rằng: “sự hình thành
callus và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà không liên can gì đến
các nhân tố tế bào chất”[41].
Điều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn
cũng như mố
i tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài đều
ảnh hưởng đến phản ứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro. Chaleff, (1982)
cho rằng: “Nhiệt độ tới hạn của cây cho bao phấn là 18
o
C”. Hơn nữa, nếu cây
sống trong điều kiện nhà lưới có nhiệt độ cao thì sự hình thành callus và tái
sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng[18].
*. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của bao phấn
Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất
quan trọng đến kết quả nuôi cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng

8
thấp, đồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng. Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây
trồng nào cũng có hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các
loại hoà thảo có nhiều điểm khác nhau. Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai
đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho nuôi cấy bao phấn lúa, còn theo Claphm
(1971) lại cho rằng đại mạch có hiệu suất tạo cây cao nhất ở giai đoạn đơn
nhân sớm. Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay đổi về giai đoạn
phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa
giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường
nuôi cấy tăng từ 6 đến 9% (Chaleff ,1982) [18].
Để đạt được hiệu quả

trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai
đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa quan trọng. Chẳng hạn đối với lúa các
nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ
nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt
phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn nhân muộ
n là tốt nhất (Guzman,
2000), có nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là
2- 4cm (Zapata, 1983)[53].
Trên cây thuốc lá Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao
phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa có chiều dài tương đương nhau[42].
*. Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy
Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao
phấn trước khi nuôi cấy
đều có tác động đối với sự hình thành callus và tái
sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống.
Điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh
cây cao, callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn
bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn không xử lý. Các giống khác nhau đòi
hỏi điều kiện xử lý có khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triể
n của
hạt phấn cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý. Tác giả khẳng định khả năng
hình thành callus tăng lên gấp đôi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử

9
ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình
thành cây xanh giảm [10].
Năm 1983 Ying đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu
quả nuôi cấy bao phấn đã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo được
chứng minh ở nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước. Tapia
và cs cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạ

t phấn, làm tăng sự phân
chia của hạt phấn và giúp giải phóng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính
đực (Tapia, 2000). Sugimoto lại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự
do và làm thay đổi tương quan giữa các axit amin tự do dẫn đến tăng tần số tái
sinh cây đơn bội [43],[52].
Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ
từng các giống cây trồng khác nhau. Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả
năng
tạo mô sẹo giảm dần, có thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ
lạnh. Đối với lúa, Gooal và cộng sự, (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ
ôn hoà 10
o
C lên bao phấn trong 11 ngày đã nâng tỷ lệ tạo mô sẹo từ 12,5%
lên 32,8%. Ngoài ra Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh
cây và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn [47].
Như vậy việc xử lý lạnh rất có ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn.
Một số phương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma, xử lý
trong đều kiện yếm khí tạo ra b
ởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hoà và
với khí cacbonic ở 8
o
C trong 6 ngày đều có lợi cho sự hình thành callus [22].
*. Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy
Nhiệt độ trong phòng nuôi có ảnh hưởng đến khả năng hình thành
callus và tái sinh cây. Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 25
0
C với
biên độ là 25 - 28
0
C và cho tái sinh cây là 20 - 25

0
C. Nhiệt độ cao hơn nhiệt
độ tối thích chính là nguyên nhân làm tăng cây bạch tạng. Chen (1983) cho
rằng nếu nhiệt độ phòng nuôi cao hơn 30
0
C thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch
tạng. Wang và cộng sự (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh hay cây

10
bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ
không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm
sáng tỏ thêm[50].
*. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả
của nuôi cấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dự
ng và sử dụng như
môi trường White (1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường
Nitsch (1969), môi trường Gamborg (1968) Tuỳ theo từng đối tượng nuôi
cấy khác nhau những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi
trường khác cho phù hợp. Tuy nhiên cũng có một số quy luật chung: Các cây
hoà thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ cao để khởi động sự
phân chia đầu tiên. Hàm lượng đường có thay đổi tuỳ đối tượng: Lúa mì 60-
120g saccaroza/l, cây họ
cà chỉ cần 20- 40g/l. Dịch chiết khoai tây, nấm men,
nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi
cấy bao phấn [1], [42].
Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật như auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn
và sự cân bằng giữa auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định
phản ứng giữa bao phấn với môi trường và thay đổi s

ự biểu hiện di truyền.
Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc
lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con. Trong một vài trường hợp
lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin (Evan, 1981) [27].
Những auxin được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn
là: αNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4-
dichlorophenoxy acetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T
(2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid). Trong đó, αNAA ở nồng độ 1 – 2 mg/l
được coi là có hiệu quả hơn so với các auxin đơn lẻ hay kế
t hợp khác[18], [23].

11
Theo Phan Hữu Tôn (2004) để tạo mô sẹo đối với cây lúa thì auxin
2,4D ở nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất [10]. Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại
cho rằng phối hợp cả 2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ
và các loại hoóc môn còn phụ thuộc vào từng kiểu gen[12].
Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các môi trường đã
được nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần ph
ải được thiết lập
cho từng kiểu gen bởi vì không có môi trường đơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất
cho nhiều kiểu gen (Karim, 1987) [34].
Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT,
Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose cũng được nghiên cứu, ABA và DDT
được coi là ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi
xanh trong nuôi cấy bao phấn lúa. Trong khi đó, Actinomicyn-D và 2-
deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa nước. ABA
làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo ki
ểu gen [48].
2.2.3. Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro
trên thế giới và trong nước.

* Các nghiên cứu ngoài nước.
Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu đựơc tỷ lệ cây
đơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài trường hợp có thể thu được cây
có mức độ bội thể cao hơn (Chu, 1982) [21]. Các bao phấn dùng để nuôi cấy
thường được lấy từ các cây của quần thể
F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng
di truyền tối đa trong quần thể những cây đơn bội được tạo thành. Nhiễm sắc
thể của cây đơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn F1, sau khi lưỡng bội hoá sẽ
trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các
dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và cho ra giống mới [44].
Tác giả Brasiluro và cộng sự (1999) đ
ã tiến hành thí nghiệm nghiên
cứu giai đoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia gamma trên
bao phấn cà chua đến sự hình thành callus. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt

12
phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều calus nhất. Bao phấn và
chiều dài nụ hoa đều có ý nghĩa quan trọng liên quan đến giai đoạn phát triển
bao phấn. Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả đã xử lý hạt và nụ
hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2) và đem cấy
trên môi trường Gresshoff và Doy (1972) có bổ sung các chất điều hoà sinh
trưởng khác nhau. Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự sai khác có ý
nghĩa đến sự hình thành callus [17] .
Đối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuôi cấy bao phấ
n để tạo cây
đơn bội cũng đã được nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu và đã thu
được những thành công nhất định. Tuy nhiên, dòng đơn bội kép được tạo ra
thông qua nuôi cấy bao phấn còn nhiều hạn chế [28], [13], [24]. Những yếu tố
như đặc tính di truyền, điều kiện trồng của cây mẹ, giai đoạn phát triển của
tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy, môi trường và đ

iều kiện nuôi cấy
có ảnh hưởng đến kết quả của quá trình nuôi cấy bao phấn [15].
Với cây dưa hấu tác giả Xue và cộng sự (1989) cho rằng tiến hành lấy
hoa khi bao phấn ở giai đoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có
tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất. Callus phát sinh trên môi
trường khoáng MS có bổ sung 2mg/l BA + 2mg/l Ki + 3 saccarose + 6-7%
agar ở pH 5,8. Sự phát sinh cơ quan thu được bằng nuôi cấy callus trên môi
trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 mg/l GA3 + 4mg/l BA + 30-40 mg/l
adenine + 500mg/l lactalbumin hydrolysate. Sự phát sinh c
ơ quan chuyên hoá
và sự phát triển chồi thu được trên môi trường nuôi cấy MS + 2mg/l
Triaconital. Rễ phát sinh trên môi trường agar + ½ MS + 0,2mg/l IBA +
1mg/l IAA + 1,5% succarose + pH 5,7. Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn
thu được cây đơn bội và đơn bôi kép qua quá trình nuôi cấy [51].
Các nghiên cứu khác trên cây bí ngô Metwall cho thấy rằng khi nuôi
cấy bao phấn cây ở giai đoạn giữa và cuối của giai đoạn hạt phấn một nhân
được thu vào buổi sáng và xử lý ở nhiệt độ 4
0
C trong 4 ngày, khử trùng nụ

13
hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium
hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môi trường MS + 150g succarose +
5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất. Rễ của 20 cây tạo ra được soi ở dưới
kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là đơn bội [26].
Các tác giả Juhasz, Venczel, Balogh đã tạo cây đơn bội thông qua quá
trình nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh. Hoa cái
được thu từ cây mẹ trồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm đối với cây bí
xanh và 0,5 – 1 cm đối với cây dưa chuột. Cắt thành từng lát c
ấy vào môi

trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, môi trường phát sinh phôi có chứa NAA
và BA đều có kết quả đối với cả dưa chuột và bí xanh [28].
Năm 1974 Eun và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột đã phát
hiện calus phát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường có
bổ sung 2,4 D. Sau 30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện[33].
Theo Lazarte, và Sasser, (1982) bao phấn dưa chuột được trên nuôi cấy
môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đó tạo callus trên môi trường cơ bản
MS. Phôi phát triể
n thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch đặc có
chứa 20 g/lit raffinos [36].
Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa
chuột. Tác giả Suprunova và Shmykova (2008) đã nuôi cấy 10 giống (Hiziz,
Gordion, Hana, Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin).
Kết quả chỉ có giống Gordion có thể tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn. Trong
số những chất điều tiết sinh trưởng được nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) là tốt nhất
cho sự cảm ứng của bao ph
ấn với nồng độ tối ưu nhất là 0,02 mg/l. Dựa vào kết
quả nghiên cứu các tác giả khẳng định giai đoạn phát triển tốt nhất của bao phấn
để tạo cây đơn bội là tiểu bào tử đơn nhân muộn và sớm [46].
Năm 2002, Ashok Kumar và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên hai
giống dưa chuột Calypso và Green Long cho thấy bao phấn dưa chuột của cả
hai giống đều thích hợp cho sự
tái sinh phôi trực tiếp và tái sinh phôi gián tiếp

14
thông qua quá trình tạo callus trên môi trường cơ bản B5có bổ sung 0,25M
saccarose và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM. Nụ hoa trước
khi nuôi cấy đựơc xử lý lạnh 4
o
C trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu.

Callus hình thành sau hai tuần nuôi cấy và có màu vàng. Callus sau khi hình
thành được chuyển sang môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M
saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM Ki. Sau đó lại được chuyển sang môi
trường để phát sinh phôi là môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M
saccarose và 5µM ABA. Cuối cùng để phôi nảy mầm thành cây, callus lại
được chuyển sang môi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25 µM NAA
+ 0,25 µM KN. Qua soi nhiễm sắc thể ở đầu rễ của 24 cây tái sinh ở mỗi
giống đã phát hiện được 21 cây giố
ng Calypso và 17 cây giống Green Long là
đơn bội [13].
Tại Trung Quốc năm 2007 Song et al. cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của
cây dưa chuột chỉ có 16 kiểu gen tạo được callus. Tác giả đã khẳng định xử lý
nụ hoa trước khi nuôi cấy là chìa khoá của sự thành công trong nuôi cấy bao
phấn. Xử lý nhiệt phụ thuộc vào kiểu sinh thái, các loài dưa chuột từ vùng
lạnh có phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh, các loài dưa chuột từ vùng nóng có
phản
ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt. Môi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus
là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3%
sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự phát sinh phôi là MS có bổ sung
0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự tái
sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar[ 32].
Đối với cây ớt, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu nuôi cấy bao phấn
của nhiều dòng giống ớt khác nhau và đã thu được kết quả khác nhau:
Kim và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của giống Capsicum
annuum L. trên môi trườ
ng MS chứa 0,1 mg/l NAA và 0,1 mg/l kinetine. Bao
phấn được ủ và chịu nhiệt độ tới 31
0
C và sự phát triển của tiểu bào tử trong
bao phấn ở các giai đoạn khác nhau được quan sát hình thái tế bào học bằng

15
việc sử dụng chất DAPI. ớt có đặc điểm là hạt phấn phát triển rất không đồng
đều trong bao phấn đơn. Tỷ lệ hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau thay đổi theo
các giai đoạn nuôi cấy và tỷ lệ hạt phấn chết tăng mạnh từ ngày thứ hai sau nuôi
cấy. Kết quả cho thấy giai đoạn hạt phấn thích hợp nhất cho sự phát triển phôi có
chứ
a tỷ lệ lớn (75%) hạt phấn ở đầu giai đoạn hai nhân [30].
Tác giả Gonzalez - Garcia, Juvencio (2004) cũng nuôi cấy hạt phấn ớt
của sáu mươi cặp lai giữa loài phụ Veracruzano và giống địa phương nhằm
theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của tiểu bào tử. Thí nghiệm được tiến
hành khi hạt phấn ở giai đoạn đơn nhân giữa tới giai đoạn hai nhân và nuôi
cấy trên môi trưòng MS gồm 6% đư
òng, 0,7% agar, pH là 5,7 có bổ sung các
chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như 2,4D, IBA, IAA. Kết quả cho thấy,
hiệu quả của nuôi cấy bao phấn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen của cây cho
phấn. Sự phát sinh phôi từ tiểu bào tử tốt nhất trên môi trường chứa 0.3mg/l
BA và 2 mg/l IAA [31].
Kết quả nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của 4 cặp lai F1 và 13 dòng
giống của ớt ngọt và ớt cay của tác giả Qin, Rotino (2002) lại cho rằng sự

phát sinh phôi chỉ xuất hiện trên môi trường chứa 0,5 mg/l 6-BAP. Có tổng số
268 phôi thu được từ 2937 bao phấn và cây đơn bội và nhị bội có tỷ lệ tương
đương nhau [32].
*. Các nghiên cứu trong nước.
Ở nước ta, công nghệ đơn bội được ứng dụng với hai mục đích chính:
- Cố định ưu thế lai thông qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần
chủng bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn con lai F1.
- T
ạo dòng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và

mang gen kết hợp rộng.
Sau năm 1975, nuôi cấy tế bào được phát triển, phương pháp nuôi cấy bao
phấn cũng được nghiên cứu. Các kết quả đầu tiên nuôi cấy thành công bao phấn
lúa được Lê Thị Muội công bố năm 1978 (Nguyễn Đức Thành, 2000) [9]

16
Khi nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy tạo cây đơn bội, tác giả
Nguyễn Đức Thành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho nuôi cấy có thể là
bao phấn hoặc hạt phấn tách rời. Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn giản hơn
về mặt kỹ thuật và môi trường nuôi cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ
mô soma của thành bao phấn và như vậy rất khó phân biệt với cây tự l
ưỡng
bội bắt nguồn từ hạt phấn. Tuy nhiên thành bao phấn lại có vai trò quan trọng
trong sự phát triển của hạt phấn. Hạt phấn được khởi đầu phân chia trong bao
phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tục phát triển.
Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt
phấn và đóng vai trò như bể chứa chất trao
đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và
biến đổi các chất từ môi trường nuôi cấy. Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó
khăn để nuôi cấy và môi trường nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn. Sự ổn
định pH là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào vì vậy pH môi trường
cũng cần được quan tâm. Sự bền vững và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào
pH môi trườ
ng như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường là 5,5 - 5,8
trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong môi trường
có khuynh hướng kết tủa[9].
Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc loài phụ
Japonica có tỷ lệ tạo callus cao hơn các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Xử
lý đòng ở nhịêt độ 7
o

C trong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và môi
trường tái sinh cây thích hợp cho nhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin +
1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [5].
Khi nuôi cấy bao phấn của các dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với
môi trường tác giả Nguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận điều kiện ngoại cảnh của cây
cho bao phấn ( ánh sáng, nhiệt độ, chế độ dinh dưỡng ) và đặc biệt là yếu tố mùa
vụ có ảnh hưởng rất l
ớn đến tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dòng EGMS.
Nuôi cấy các dòng lúa EGMS khi hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ đem lại hiệu
quả cao hơn nhiều so với nuôi cấy ở thời điểm hạt phấn bất dục [4].