khai thác và phát triển nguồn gen quý hiếm cây thuốc lá

CÔNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN
VIỆN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ







BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN
QUÝ HIẾM CÂY THUỐC LÁ







Chủ trì nhiệm vụ: KS. Trần Thị Thanh Hảo





7722
26/02/2010


HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009

1
CÔNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN
VIỆN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ





BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN
QUÝ HIẾM CÂY THUỐC LÁ

Thực hiện theo Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ sự
nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số
04B/HDD-KHCN ngày 28 tháng 5 năm 2009 giữa Bộ Công Thương
và Công ty TNHH một thành viên Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá




Chủ trì nhiệm vụ: KS. Trần Thị Thanh Hảo
Những người thực hiện chính: TS. Chu Hoàng Hà
CN. Phạm Thị Vân
KS. Nguyễn Hồng Thái
KTV. Nguyễn Hoàng Việt
KTV. Nguyễn Thị Mai Hoa

HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009
2
MỞ ĐẦU
Việt Nam được đánh giá là một trong 15 nước có nguồn tài nguyên di
truyền thực vật phong phú. Sự đa dạng, giàu có về tài nguyên di truyền thực vật
là tiền đề để nước ta phát triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên do sức ép gia
tăng dân số và sự thâm canh nông nghiệp không hợp lý, nguồn gen cây nông
nghiệp đã và đang bị xói mòn, mất mát với tốc độ rất nhanh. Từ một nước thiếu
lươ
ng thực, Việt Nam đã đảm bảo được an ninh lương thực, trở thành nước
xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới. Bên cạnh những thành công to lớn đạt
được, mặt trái của nó là sự mất dần đi nhiều giống lúa địa phương, những giống
lúa có chất lượng cao do áp dụng các giống cải tiến có năng suất cao. Điều này
cũng xảy ra với hầu hế
t các hoạt động gắn với tài nguyên nông nghiệp và lương
thực, thuỷ sản, lâm nghiệp. Theo PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trung tâm
Tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam thì có đến 80%
nguồn gen tại các địa phương đã không còn tồn tại ngoài sản xuất.
Trước thực trạng tài nguyên di truyền thực vật suy giảm, các nhà khoa
học khẳng định đã đến lúc cần chú trọng công tác bảo tồn, phát triển nguồ
n gen
tại cộng đồng bên cạnh bảo quản tại ngân hàng gen.
Tuy nhiên, do nhu cầu cuộc sống, người nông dân chỉ trồng những loại
cây mang lại lợi ích kinh tế hoặc có giá trị sử dụng. Vì thế, mà những nguồn
gen địa phương có chất lượng cao, thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng, có khả
năng chống chịu tốt, nhưng giá trị kinh tế thấp nên đã không được gieo trồng,
có nguy c
ơ biến mất. Bảo tồn thông qua sử dụng được coi là giải pháp tối ưu để
thúc đẩy sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền.

Khai thác, thương mại hóa các sản phẩm bản địa chính là tạo điều kiện
cho người dân bảo tồn, song muốn bảo tồn bền vững phải gắn với phát triển.
Theo GS Nguyễn Ngọc Kính- Phó chủ tịch Hội giống cây trồng Việ
t Nam thì
chúng ta không chỉ khai thác mà còn phải nhân tức là giữ lại cái giống đó, tìm
cách phục tráng, chọn lọc lại để nhân lên sản xuất có quy mô.
Cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả
kinh tế cao. Cũng như các cây trồng khác, hiện tượng xói mòn nguồn gen thuốc
lá cũng đang diễn ra, chính vì vậy công tác thu thập và lưu giữ các giống thuốc
lá được nhiều nước tiến hành như Trung Quốc (hiện có trên 1000 mẫu giống
thuốc lá), Zimbabue
Cũng như các loại cây trồng khác, những giống thuốc lá mới ở Việt Nam
với những ưu thế nổi trội về năng suất, chất lượng cao đang dần dần thay thế
các giống thuốc lá cũ và các giống địa phương. Chính vì vậy việc khai thác và
phát triển nguồn gen quý hiếm thuốc lá là một trong những việc cần tiến hành
thường xuyên nhằm hạn chế sự
xói mòn và mất mát nguồn gen thuốc lá đồng
thời để có nguồn vật liệu khởi đầu phong phú phục vụ cho công tác chọn tạo
giống thuốc lá mới.
3
MỤC LỤC
Trang
TÓM TẮT NHIỆM VỤ 4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
Chương 2. THỰC NGHIỆM 7
1. Mục tiêu 2009 7
2. Nội dung nghiên cứu 7
3. Phương pháp nghiên cứu 7
4. Vật liệu 8

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN 9
1. Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc
tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống 9

1.1. Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại 9
1.2. Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá 10
1.2.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống 10
1.2.2. Một số chỉ tiêu sinh học của các dòng/giống 11
1.2.3. Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính 11
1.2.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống 12
1.2.5. Một số chỉ tiêu hoá học chính thuốc lá nguyên liệu 13
1.2.6. Chất lượng giống dựa vào tính chất hút 13
1.3. Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống 14
2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu 14
2.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp 15
2.2. Chọn lọc invitro sau biến nạp 15
2.3. Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1) 17
2.4. Giai đoạn trồng ra bầu đất 17
2.5. Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 17
3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm 18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 19
1. Kết luận 19
2. Kiến nghị 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO 21
PHỤ LỤC 22
4


TÓM TẮT NHIỆM VỤ

Mục tiêu chính của nhiệm vụ là khai thác và phát triển những giống thuốc
lá mang nguồn gen quý hiếm
Hàng năm, Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá đều tiến hành thu thập, khảo
sát và đánh giá các giống thuốc lá mới được bổ sung từ nhiều nguồn khác nhau.
Các giống được sắp xếp và phân loại theo một số tiêu chí như theo mục đích sử
dụng (thuốc lá vàng s
ấy, thuốc lá nâu phơi ), theo năng suất, phẩm cấp, hàm
lượng nicotin, đường khử hoặc đặc tính chống chịu sâu bệnh hại chính
Từ những đặc điểm mô tả ban đầu và nhu cầu của người sản xuất chúng
tôi tiến hành chọn lọc những dòng/giống thích hợp và sử dụng các phương pháp
tiêu chuẩn để nhân giống invitro hoặc phục tráng giống để thu được nguồn hạt
giống thu
ần có chất lượng cao nhằm lưu giữ những giống thuốc lá mang đặc tính
quý hiếm đồng thời cung cấp hạt giống cho các vùng sản xuất khi có nhu cầu.

5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cũng như
các cây trồng nông nghiệp khác bệnh và sâu hại luôn là mối đe dọa đến năng
suất và chất lượng nguyên liệu thuốc lá. Mức độ thiệt hại hàng năm tuỳ thuộc
vào từng vùng, từng bệnh mà biến động từ 0-100%, trung bình từ 20-30%. Theo
tổng kết của Shew và Luca, 1991 thiệt hại do sâu bệnh hại thuốc lá tạ
i Mỹ lên
tới 20% .
Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan
tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Chọn tạo giống
theo hướng chống chịu sâu bệnh là một trong những hướng chọn tạo giống
thuốc lá, chính vì vậy những nguồn vật liệu khởi đầu mang những đặc tính
chống chịu sâu bệnh cần được bảo tồn, khai thác và phát triển.
Biệ
n pháp chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh truyền thống gặp một số
khó khăn nhất định do tính trạng qui định đặc tính chống chịu sâu bệnh thường
do nhiều gen qui định hoặc gắn với một số tính trạng không tốt. Để nâng cao
hiệu quả trong chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh, việc ứng dụng công nghệ
biến đổi di truyền để chọn t
ạo giống kháng sâu bệnh hại chính đã và đang được
quan tâm nghiên cứu [1]. Gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vip
(vegetative insecticidal protein-protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho
các protein Vip trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt, có
hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao. Gen vip3 mã hoá các protein hoạt
động trong ruột giữa của côn trùng (gắn với chất nhận đặc hiệu, tạo thành các
kênh trao đổi ion gây nên sự mất cân bằng trao đổi chất, làm tê liệt bộ
máy tiêu

hóa của côn trùng), có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein
cry IA và có phổ hoạt động rộng như diệt được sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại
thuốc lá [4], [5], [6].
Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày
có giá trị kinh tế cao. Vấn đề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những
nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu. Căn cứ vào
chiến lược phát triển ngành thuốc lá từ nay đế
n năm 2020 ngành thuốc lá tăng
cường tạo giống trong nước, tạo giống có khả năng kháng sâu bệnh cao và cho
chất lượng tốt phục vụ sản xuất nguyên liệu trong nước và xuất khẩu [3]. Để đáp
ứng được chiến lược của ngành thuốc lá, việc khai thác và phát triển những
giống thuốc lá có những nguồn gen quý hiếm để phục vụ ngành thuốc lá nói
riêng và ngành công nghiệp nói chung là rất cần thiết.
Ứ
ng dụng công nghệ biến đổi di truyền để biến nạp gen kháng sâu bệnh
hại quan tâm vào cây trồng cũng là một trong những hướng đi được quan tâm để
6
giải quyết vấn đề đó. Trong những năm gần đây, Viện Công nghệ sinh học Việt
Nam đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập các gen mã hoá cho các protein gây độc
với côn trùng và bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp vào một số
đối tượng cây trồng như ngô, bông, thuốc lá [2]. Gen vip3A được các nhà khoa
học phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học phân lập, đánh
giá hoạt tính, phổ tác dụng và công bố trình tự gen t
ại ngân hàng gen quốc tế
(mã số AJ971413 - phụ lục 3) là một trong những kết quả nghiên cứu mới nhất
về gen kháng sâu thế hệ mới có tác dụng diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy (trong
đó có sâu xanh, sâu xám, sâu khoang hại thuốc lá).
7
Chương 2. THỰC NGHIỆM
1. Mục tiêu 2009

- Sản xuất hạt của một số dòng/giống thuốc lá mang đặc tính chống chịu
bệnh hại
- Ứng dụng kĩ nghệ di truyền (công nghệ sinh học) để tạo giống mang gen
chống chịu sâu (vip3A) trên cây thuốc lá
- Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm
2. Nội dung nghiên cứu
2.1. Nhân nhanh 04 dòng/giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang
các đặc tính ch
ống chịu bệnh hại để sản xuất hạt đầu dòng
2.2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu:
- Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá (giống K326) thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.tumerfaciens )
- Bước đầu kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào thông qua phản ứng
PCR với cặp mổi đặc hiệu.
2.3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong
ống nghiệm
3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy cây trong ống nghiệm theo Murashige & Skoog
1962.
- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng theo phương pháp khối ngẫu nhiên
hoàn chỉnh, nhắc lại 3 lần
- Số liệu được xử lý theo IRRISTART 5.0, phần mềm excel
- Phương pháp đánh giá chất lượng giống qua phân tích thành phần hoá
học nguyên liệu thuốc lá: đường khử (TCVN 7102:2002), đạm tổng số (TCVN
7252:2003), nicotin (TCVN 6679:2000), clo (TCVN 7251:2003)
- Đánh giá chất lượng giống qua bình hút cảm quan nguyên liệu theo TC
01-2000.
- Phân cấp thuốc lá nguyên liệu vàng sấy theo tiêu chuẩn TCN 26 -1 -02
- Kỹ thuật trồng và hái sấy thuốc lá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 618-
2005.

- Một số chỉ tiêu theo dõi chính về sinh trưởng phát triển, mức độ nhiễm
sâu bệnh hại, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng của các
8
giống được đánh giá theo 10 TCN 426-2000 “Quy phạm khảo nghiệm giống
thuốc lá”, phần khảo nghiệm cơ bản.
- Chuyển gen vào mảnh lá thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens (Topping
1998 - phụ lục 4)
- Gen sàng lọc cây sau biến nạp là gen kháng kháng sinh Kanamycine
- Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào trong cây bằng phương pháp PCR
với cặp mồi 35S Fs/Fr (promotor 35S có trong cấu trúc gen chuyển vào cây)
4. Vật liệu
- Vật liệu thực vật:
+ Dòng/ giống thuố
c lá: 3 dòng SG8, SG9 và BS4, giống ChinKB được
chọn lọc để đánh giá và sản xuất hạt đầu dòng, giống K326 được dùng làm
giống đối chứng và để chuyển gen kháng sâu vip3A
- Vật liệu vi sinh: Vi khuẩn A. tumerfaciens chủng C58 mang vector
pBI121 chứa gen vip3A (phụ lục 2, 3)
- Hoá chất: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform,
kanamycine và các hoá chất thông dụng khác.
- Thiết bị máy móc, dụng cụ: Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi
Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy đo pH, bộ điện di, máy PCR,
bể
ổn nhiệt, máy cấy vô trùng, tủ lạnh sâu

9
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN
1. Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc
tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống
1.1. Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại
Hàng năm Viện KTKT Thuốc lá đều tiến hành thu thập bổ sung các giống
thuốc lá vào trong tập đoàn quỹ gen. Trong quá trình thu thập, khảo sát và đánh
giá bước đầu thu được một số
đặc tính quý của một số giống. Trên cơ sở những
đặc tính mô tả ban đầu chúng tôi sắp xếp theo nhóm giống, lựa chọn một số
giống có những đặc tính tốt để tiếp tục đánh giá vào vụ sau.
Năm 2009, chúng tôi chọn lọc và đánh giá một số dòng, giống mang một số
đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại chính là dòng SG8, SG9, BS4 và giống
ChinKB
Bảng 1. Một số đặc điể
m quý của các dòng/giống thuốc lá
TT Dòng/giống Địa điểm /năm thu thập Đặc tính quý
1
Chin KB
Trung Quốc - 2006
Kháng bệnh đen thân, năng suất
cao
2
SG 8
Sài Gòn - 2007
Kháng bệnh héo đốm cà chua
(TSWV)
3
SG9
Sài Gòn - 2007

Kháng bệnh héo đốm cà chua
(TSWV)
4
BS4
Bắc Giang - 2007
Kháng bệnh khảm lá (TMV và
CMV)
Hai dòng SG8 và SG 9 được thu thập ở phía Nam trong năm 2007, với mô tả
ban đầu của cán bộ thu thập về cho thấy trên đồng ruộng nhiễm toàn bộ bệnh virus
xoăn đọt (héo đốm cà chua - TSWV) nhưng có một số cây vẫn sinh trưởng rất tốt.
Năm 2008 đề tài đã khảo sát, đánh giá và bước đầu cho thấy giống có tỷ lệ nhiễm
bệnh virus thấp (<5%) và cho năng suất trung bình. Do vậy năm 2009 chúng tôi
tiến hành nhân nhanh và khảo sát lạ
i tính chống chịu bệnh vius tại miền Bắc.
Dòng BS4 là dòng thuốc lá được chọn lọc trong nước, qua nhiều năm khảo
sát đã cho thấy khả năng kháng cao với bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV) và
khảm lá dưa chuột (CMV).
Giống ChinKB là giống thuốc lá do cán bộ Viện sưu tập trong khi đi công
tác tại Vân Nam - Trung Quốc với đặc điểm mô tả ban đầu cho thấy có năng suất
cao và khả năng kháng bệnh
đen thân tốt, năm 2008 chúng tôi nhân nhanh và khảo
sát đặc tính của giống trong điều kiện Việt Nam và có những kết quả bước đầu cho
thấy giống có tiềm năng năng suất cao (năng suất thực thu trên 22 tạ/ha), kháng
bệnh đen thân và nhiễm bệnh virus nhẹ. Tuy nhiên khả năng đậu quả không tốt.
Từ những mẫu cây invitro, chúng tôi tiến hành nhân cây của các dòng/giống
để khảo sát trong vụ Xuân 2009.
10
Sơ đồ 1. Sơ đồ nhân invitro các dòng/giống
Lá của cây invitro
Cắt các mảnh lá có kích thước 0,5 - 1cm

2


Môi trường khởi động (3 - 5tuần)
Chọn các mảnh lá phân hóa mạnh, sạch
cắt thành các cụm có kích thước 0,5 - 1cm
2

Môi trường nhân đa chồi (3- 4 tuần)
Chọn các chồi phân hóa rõ ràng
có chiều dài 1 - 2cm, có 1 - 2 lá thật
Môi trường ra rễ (3 - 4 tuần)
Chọn những cây có bộ rễ phát triển đầy đủ
có 3 - 5 lá thật, cao khoảng 3- 5 cm
Ra cây và vào bầu (3- 4 tuần)

Trồng ra ruộng
Năm 2009 các dòng/giống được nhân invitro để đánh giá lại một số đặc tính
quý và chọn cá thể tốt để thu hạt. Một số đặc điểm chính của các dòng/gi
ống được
thu thập thể hiện trong các bảng biểu dưới đây.
1.2. Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá
1.2.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống
Thời gian sinh trưởng của các giống giúp người sản xuất chủ động bố trí
sắp xếp thời gian trồng và bố trí thời vụ hợp lý.
Bảng 2. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống
ĐVT:ngày
TT Tên dòng/
giống
T

ừ trồng -
10% số cây
ra nụ
Từ trồng -
90% số cây
ra nụ
Từ trồng -
lá chín đầu
Từ trồng -
lá cuối chín
1 Chin KB 56,0 60,0 68 115
2 SG8 55,7 58,7 67 114
3 SG9 56,3 59,3 67 114
4 BS4 57,7 59,7 70 117
5 K326 đ/c 54,0 58,7
57 112
11
Kết quả cho thấy đa số các dòng/giống có thời gian sinh trưởng xuất hiện
10% số cây ra nụ từ 54-58 ngày, thời gian ra nụ 90% khoảng 58 đến 60 ngày.
Tất cả các giống khảo sát đều có thời gian sinh trưởng dao động trên dưới 110
ngày, phù hợp với cơ cấu cây trồng.
1.2.2. Một số chỉ tiêu sinh học của các dòng/giống
Chiều cao cây, đường kính thân và độ dài lóng liên quan tới khả năng
chống chịu với đ
iều kiện ngoại cảnh như mưa, gió… Những giống có chiều cao
trung bình và đường kính thân lớn có khả năng chống chịu khá tốt với điều kiện
thời tiết bất lợi như gió mạnh, mưa lớn và thường những cây khoẻ sẽ có tiềm
năng về năng suất và phẩm chất tốt. Độ dài lóng còn liên quan đến sự phân bố
của lá trên cây cũng như độ thông thoáng c
ủa tán cây trên đồng ruộng.

Số lá và kích thước lá là những yếu tố liên quan chặt chẽ đến tiềm năng
năng suất của các giống. Những giống có số lá sinh học cao (SLSH), kích thước
lá lớn sẽ cho tiềm năng năng suất cao.
Bảng 3. Một số chỉ tiêu sinh học về thân và lá của các dòng/giống

KTL (cm)
TT
Tên
dòng/giống
CCSH
(cm)
φ thân*
(cm)
Độ dài
lóng
(cm)
Tổng
số lá
(lá)
SLKT
(lá)
Dài Rộng
1 Chin KB 145,6 2,9 5,2 22,5 17,3 65,1 28,3
2 SG8 149,3 2,9 4,9 22,2 16,9 63,4 23,4
3 SG9 150,1 2,8 4,9 23,2 17,6 65,7 24,5
4 BS4 150,3 2,7 4,7 24,2 19,1 62,1 23,8
5 K326 đ/c 140,7 2,8 5,6 23,7 18,4 62,5 26,0
LSD
5%
4,02 0,84

Ghi chú: CCSH: chiều cao sinh học;
φ
: đường kính thân cách gốc 20 cm; SLKT: số
lá kinh tế; KTL: kích thước lá
Kết quả cho thấy các giống/dòng đều có chiều cao sinh học cao hơn giống
đối chứng K326, đường kính thân và độ dài lóng tương đương nhau.
Dòng SG9 và BS4 có tổng số lá tương đương giống đ/c, dòng SG 8 và
giống Chin KB có tổng số lá thấp hơn đ/c. Số lá kinh tế đạt từ 17 - 19 lá. Kích
thước lá của giống Chin KB lớn hơn các giống còn lại, thể hiện tiềm năng năng
suất tốt.
1.2.3. Mức độ
nhiễm một số bệnh hại chính
Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng/giống được thể trong
bảng 4. Giống Chin KB, dòng SG 8 và SG 9 bị nhiễm bệnh khảm lá nhẹ giai
đoạn sau trồng, dòng BS4 hầu như không bị nhiễm các bệnh hại phổ biến trên
12
đồng ruộng, thể hiện sức chống chịu khá tốt. Như vậy các dòng/giống đều thể
hiện được những ưu thế về đặc tính chống chịu bệnh hại chính theo mô tả ban
đầu.
Bảng 4. Mức độ nhiễm bệnh hại chính của các dòng/ giống
Một số bệnh hại chính
TT
Tên
dòng/giống
Héo rũ vi khuẩn Đen thân TMV +CMV
1 Chin KB + - +
2 SG8 - - +
3 SG9 - - +
4 BS4 - - -
5 K326 đ/c + + ++

Ghi chú: - Không bị bệnh +: Nhiễm bệnh nhẹ (TLB<10% )
++: Nhiễm bệnh trung bình (TLB: 10 - 20%) ; +++: Nhiễm bệnh nặng (TLB >20% )
1.2.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống
Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống được thể
hiện trong bảng 5.
Bảng 5. Năng suất và phẩm cấp của các dòng/giống
TT
Tên
dòng/giống
KLTB
lá tươi
(g)
Tỷ lệ
tươi/ khô
Tỷ lệ
cấp 1+2
(%)
Tỷ
lệ
cọng
(%)
NS thực
thu
(tạ/ha)
1 Chin KB 62,7 8,3 23,7 32,0 20,1
2 SG8 54,0 7,9 17,6 33,5 15,9
3 SG9 56,3 8,0 25,5 30,5 16,8
4 BS4 50,4 9,0 11,8 38,0 17,8
5 K326 đ/c 56,9 7,5 30,0 36,5 20,9
LSD

5%
1,76
Ghi chú: KLTB: Khối lượng trung bình; NS: năng suất
Giống Chin KB có khối lượng lá tươi cao, có tỷ lệ tươi/khô trung bình,
năng suất tương đương giống đối chứng. Dòng SG8 và SG9 có năng suất thực
thu tương đương nhau và thấp hơn giống đối chứng. Riêng dòng BS4 có tỷ lệ
tươi/khô cao, tỷ lệ cấp 1+2 thấp, có tỷ lệ cọng cao và năng suất thấp hơn so với
đ/c.
13
1.2.5. Một số chỉ tiêu hoá học chính thuốc lá nguyên liệu
Chất lượng nguyên liệu của các giống được chúng tôi đánh giá thông qua
một số chỉ tiêu hoá học chính. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 6.
Bảng 6. Thành phần hoá học của lá sấy các dòng/giống
ĐVT : %
TT Tên dòng/ giống Nicotin N tống số Đường khử Clo
1 Chin KB 2,19 1,79 20,9 0,41
2 SG8 2,86 2,02 19,8 0,34
3 SG9 3,07 2,30 16,0 0,48
4 BS4 2,17 2,56 11,8 0,34
5 K326 đ/c 2,38 1,85 16,7 0,51
Dòng SG8 và SG9 có hàm lượng nicotin cao hơn so với các dòng/giống
còn lại.
Dòng BS4 có hàm lượng đường khử khá thấp (11,8%), các dòng/giống
còn lại có hàm lượng đường khử trung bình (từ 16 -21%)
Tất cả các giống đều có hàm lượng clo dao động xung quanh giá trị 0,5
không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng thuốc lá nguyên liệu
1.2.6. Chất lượng giống dựa vào tính chất hút
Kết quả đánh giá chất lượng dòng/giống dựa vào tính chất hút được thể
hiện trong b
ảng 7.

Bảng 7. Chất lượng các dòng/giống qua bình hút cảm quan
ĐVT: Điểm
TT
Tên
dòng/giống
Hương Vị
Độ
nặng
Độ
cháy
Màu
sắc
Tổng
điểm
1 Chin KB 9,3 9,2 7,0 6,0 6,0 37,5
2 SG8 9,6 9,6 6,5 6,0 6,0 37,7
3 SG9 9,2 9,4 6,4 6,0 6,0 37,0
4 BS4 9,5 9,6 6,9 6,0 6,0 38,0
5 K326 đ/c 9,5 9,5 6,5 6,0 6,0 37,5
Các dòng/giống đều có hương và vị khá (9,2 - 9,6 điểm), độ nặng vừa
phải (6,4 - 7 điểm), độ cháy khá (6 điểm), màu sắc từ vàng cam tới vàng sáng,
tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm), đáp ứng chất lượng nguyên liệu trong
nước.
14
1.3. Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống
Tiến hành chọn những cá thể có kiểu hình tương đối đồng đều trong suốt
quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngoài đồng ruộng, bao hoa và thu hạt
giống của các dòng/giống. Kết quả được thể hiện trong bảng 8.
Bảng 8. Kết quả chọn lọc và lượng hạt của các dòng/giống
TT Dòng/giống

Số cây
chọn lọc
Tổng khối
lượng hạt (g)
Khối lượng
1000 hạt (mg)
Tỷ lệ nảy
mầm (%)
1 Chin KB 40 105 0,086 85,3
2 SG8 35 110 0,083 85,7
3 SG9 30 100 0,087 85,1
4 BS4 45 150 0,083 86,3
Hạt thu được của các dòng/giống có khối lượng 1000 hạt từ 0,083g đến
0,087g, tỷ lệ nảy mầm đạt 85 đến 87%, đáp ứng chất lượng hạt giống thuốc lá
nguyên chủng (chỉ tiêu chất lượng hạt giống thuốc lá nguyên chủng theo 10TCN
619 - 2005: khối lượng 1000 hạt trên 0,08 g và tỷ lệ nảy mầm trên 85%). Lượng
hạt thu được từ 100 - 150g/giống, đủ để cung cấp cho 5 -7 ha trồng trong những
nă
m tiếp theo.
2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu
Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal
protein). Protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa, xuất hiện trong pha sinh
trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây độc
với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây độc đối với
một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera).
Trong nhóm gen vip thì gen vip3A đượ
c đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì
gen mã hoá cho protein Vip3A có hoạt lực diệt sâu mạnh, phổ hoạt động rộng.
Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptea)
như sâu xanh hại thuốc lá, sâu khoang, sâu xám mà protein Cry hầu như không

có tác dụng .
Gen vip3A sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên
cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen
được chèn vào vector chuyển gen th
ực vật pBI121 dưới sự điều khiển của
promotor 35S và được biến nạp vào vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58.
15
Sơ đồ 2. Quá trình biến nạp gen
vip3A
vào thuốc lá và sàng lọc cây sau biến nạp














2.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp
Dòng khuẩn lạc A.tumerfaciens chủng C58 mang gen vip3A được nuôi hồi
phục trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc. Sau đó chọn một dòng
khuẩn lạc tròn, độc lập trên LB đặc cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa
kháng sinh chọn lọc để để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen.
Dịch huyền phù vi khuẩn đươc đo bằng phương pháp đo giá trị mật độ quang

(Optical Density- OD) ở bước sóng 600 nm, có giá trị đạt 0,75, đủ điều kiện để
biến nạp vào mảnh lá thuốc lá theo phương pháp đĩa lá.
2.2. Chọn lọc invitro sau biến nạp
Sau biến nạp, các mảnh lá được đồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường tái
sinh chồi (GM), sau đó chuyển sang môi trường tái sinh chứa kháng sinh chọn lọc
Kanamycine nồng độ 30 mg/l (GM Kan 30). Sau 3 tuần các c
ụm chồi được tách và
cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kanamycine nồng độ 50 mg/l (GM Kan 50).
Những chồi phát triển tốt sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường GM Kan
50 lần 2. Sau đó chồi được cấy chuyển sang môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh có
chứa Kanamycine nồng độ 50 mg/l (RM Kan 50).
Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng qua các giai đoạn khác nhau
thể hiện trong bảng 9.
Ra rễ
Tái sinh đa chồi
Mảnh lá ngâm trong dung
dịch huyền phù vi khuẩn
Biến nạp
Dịch huyền phù
vi khuẩn
Mảnh lá tiền nuôi cấy
Chủng khuẩn trên
môi trường LB đặc
Trồng cây trong bầu đất
Ra cây bầu trấu : cát
16
Bảng 9. Tỷ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn chọn lọc invitro
ĐVT:(%)
Giai đoạn
Công thức

Mảnh lá Cụm chồi Ra rễ (lần 1) Ra rễ (lần 2)
CTTN 77,7 82,3 73,3 81,8
Đ/C1 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/C2 93,3 96,7 96,7 96,6
LSD
5%
6,9 3,4 4,6 4,9
Ghi chú: CTTN: công thức thí nghiệm; Đ/C1: mẫu không chuyển gen trên môi trường
có chứa kháng sinh chọn lọc Kan; Đ/C2: mẫu không chuyển gen trên môi trường không chứa
kháng sinh chọn lọc Kan
.
Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi
Ở CTTN, số mảnh lá tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc GM Kan
30 khá cao (77,7%). Theo lý thuyết những dòng tái sinh được trên môi trường
có kháng sinh Kan là do trong genom của chúng có mang gen kháng Kan nên
có thể kết luận đây là những mẫu đã biến nạp thành công, trong khi ở Đ/C1 các
mảnh lá không tái sinh đa chồi, vàng dần và chết chứng tỏ trong tế bào của các
mảnh lá không biến nạp không chứa gen kháng Kan nên chúng không thể tái
sinh trên môi trường có kháng sinh này.
Đ/C 2 có tỷ lệ mẫu phân hóa thành
cụm chồi trên môi trường GM là 93,3%.
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau biến nạp:
Những cụm chồi ở CTTN được cắt nhỏ và chuyển sang môi trường tái
sinh đa chồi GM Kan 50 để tiếp tục chọn lọc, những cụm chồi ở Đ/C2 được
dùng làm vật liệu cho Đ/C 1 và Đ/C 2 ở giai đoạn chọn lọc cụm chồi.
Số cụm chồi tiếp tục phân hoá trên môi trường chọn lọc (GM Kan 50) đạt
82,3%, các cụm chồi còn lại phân hoá chậm và vàng dần, trong khi Đ/C1 100%
các cụm chồi phân hóa chậm hoặc ngừng phân hoá ,vàng dần và chết, Đ/C2 có
tỷ lệ mẫu tái sinh trên môi trường là 96,7%.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh:

Những chồi khỏe sẽ được tách ra và chuyển dang môi trường ra rễ (RM
Kan 50) để tạo cây hoàn chỉnh.
Số chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sinh tr
ưởng tốt trên môi trường
RM chọn lọc lần 1 (Kan 50) đạt 73,3%, trên môi trường RM chọn lọc lần 2 (Kan
50) đạt 81,8%, phần còn lại không ra rễ, sinh trưởng chậm hoặc ngừng sinh
trưởng trong khi Đ/C1 có 100% chồi không ra rễ, vàng dần và chết còn Đ/C2 có
96,55% chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
17
Như vậy có thể quá trình chuyển gen và sàng lọc cây sau chuyển gen
invitro đã được hoàn thành.
2.3. Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1)
Từ những dòng chọn lọc trên môi trường RM (Kan 50), chọn 16 dòng
thuốc lá chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt nhất và đủ điều kiện (có 4-5 lá
thật, có bộ rễ phát triển đầy đủ, cao từ 4-6cm ) để ra cây vào giá thể trấu : cát
(tỉ lệ 1: 1).
Đây là bước chuyển cây từ
giai đoạn cung cấp các điều kiện sống tối ưu
trong phòng sang giai đoạn cây tự tổng hợp, đồng hóa và dị hóa các chất từ điều
kiện tự nhiên để phục vụ cho các hoạt động sống của mình. Bước chuyển cây ra
giá thể được coi như bước trung gian để cây cây thích nghi từ từ với điều kiện
ngoại cảnh và ra rễ mới.Với đặc
điểm hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển
mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi
vào giá thể khá cao (91,3%), hệ rễ mới phát triển mạnh, chứng tỏ sự thích nghi
của cây với điều kiện ngoại cảnh khá tốt, là tiền đề để có những cây khỏe mạnh
khi cây sống trong điều kiện ngoại cảnh mớ
i.
2.4. Giai đoạn trồng ra bầu đất
Giai đoạn trồng ra bầu đất là giai đoạn cây được chuyển sang điều kiện tự

dưỡng. Sau 14 ngày chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đặt
trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất đạt 90 %
(tương đương với Đ/C) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoạ
i cảnh.
Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái
sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn
thành
2.5. Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen
Vào giai đoạn 30 ngày sau trồng, khi cây đã mọc ra lá mới và phát triển
bình thường thì tiến hành thu mẫu lá non của 16 dòng thuốc lá chuyển gen để
tách chiết DNA tổng số. Các mẫu DNA được kiểm tra với cặp mồi 35S Fs/Rs để
xác định xem gen
được chuyển vào có tiếp tục phiên mã và hoạt động trong cây
hay không bằng phản ứng PCR . PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn
nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp
thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo
lý thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen
nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển
gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó
đã mang đoạn gen cần chuyển [1], [2].
Promotor 35S được thiết kế trong cấu trúc vector pBI121, nằm trong phần
bờ trái và bờ phải của cấu trúc chứa đoạn gen chuyển vào cây, có tác dụng tăng
cường quá trình phiên mã của gen được chuyển vào. Cặp mồi 35S Fs/Rs được
18
thiết kế để nhân đoạn gen có kích thước 314 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR
của 16 dòng thuốc lá chuyển gen được thể hiện trong hình 1


Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs
M: marker; 1-16: các dòng thuốc lá chuyển gen

đ/c (-) : mẫu lá cây không chuyển gen
đ/c (+): plasmit tách từ vi khuẩn A.tumerfaciens C58 mang vector pBI121 chứa gen vip3A


Toàn bộ 16 dòng thuốc lá chuyển gen (được ký hiệu K326 - v1 đến K326
- v16) đều cho một băng duy nhất ở vị trí khoảng 300 bp, phù hợp với kích
thước tính toán ban đầu chứng tỏ trong các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ To
đều có sự có mặt của promotor 35S có trong cấu trúc vector pBI121/vip3A được
thiết kế trong nghiên cứu.
Việc đánh giá sự sinh trưởng, phát triển cũng như đặc tính kháng sâu qua
phản ứng Biotest sẽ được tiếp tục tiến hành trong thời gian tiếp theo.
3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm
20 dòng/giống mang các nguồn gen quí được bảo tồn trong ống nghiệm,
thường xuyên cấy chuyển sang môi trường mới đảm bảo các giống sinh trưởng
phát triển tốt. Nguồn hạt giống được bảo quản trong kho lạnh, định kỳ 3
tháng/lần kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của hạt.



19

Bảng 10. Danh sách các dòng/giống được bảo tồn

TT
Tên
dòng/giống
Đặc tính quý Ghi chú
1 Chin KB Kháng bệnh đen thân Cây invitro và hạt
2 SG 8 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) Cây invitro và hạt
3 SG9 Kháng bệnh héo đốm cà chua (TSWV) Cây invitro và hạt

4 BS4 Kháng bệnh khảm lá (TMV và CMV) Cây invitro và hạt
5 K326 - v1 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o
6 K326 - v2 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

7 K326 - v3 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

8 K326 - v4 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

9 K326 - v5 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

10 K326 - v6 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

11 K326 - v7 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

12 K326 - v8 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

13 K326 - v9 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

14 K326 - v10 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

15 K326 - v11 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

16 K326 - v12 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

17 K326 - v13 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

18 K326 - v14 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

19 K326 - v15 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

20 K326 - v16 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Nhân nhanh 04 giống thuốc lá mang các đặc tính chống chịu bệnh hại
để sản xuất hạt giống
Nhân invitro, đánh giá lại đặc tính quý của 4 dòng/giống thuốc lá về tính chống
chịu bệnh hại (03 dòng: SG8, SG9, BS4 và giống ChinKB). Kết quả cho thấy
20
dòng SG8, SG9 và giống Chin KB hầu như không xuất hiện bệnh đen thân và
héo rũ vi khuẩn, bị nhiểm bệnh khảm lá nhẹ giai đoạn sau trồng, dòng BS4
không bị nhiễm bệnh hại, thể hiện sức chống chịu tốt với bệnh hại chính trên
đồng ruộng trong điều kiện phía Bắc. Giống Chin KB có tỷ lệ tươi/khô trung

bình, năng suất tương đương giống đối chứng K326. Dòng SG 8 và SG9 có hàm
lượ
ng nicotin cao hơn đối chứng, năng suất thực thu tương đương nhau và thấp
hơn giống đối chứng. Riêng dòng BS4 có tỷ lệ tươi/khô cao, tỷ lệ cấp 1+2 thấp,
có tỷ lệ cọng cao, năng suất và hàm lượng đường khử thấp so với đ/c. Các
dòng/giống đều có hương và vị khá, độ nặng vừa phải, độ cháy khá, màu sắc từ
vàng cam tới vàng sáng, tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm)
Chọn lọc những cá thể sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều để thu hạt giống.
Lượng hạt giống thu được từ 100 -150g dòng/giống, đạt yêu cầu về chất lượng
hạt nguyên chủng (khối lượng 1000 hạt trên 80 mg, tỷ lệ nảy mầm trên 85%).
1.2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu
Chuyển thành công gen kháng sâu vip3A dưới sự điều khiể
n của promotor 35S
vào 16 dòng thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58
Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong 16 dòng thuốc lá chuyển gen
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu là 35S Fs/Rs cho thấy toàn bộ 16 dòng
thuốc lá chuyển gen (100%) đều cho một băng có kích thước khoảng 300 bp,
chứng tỏ sự có mặt của gen được chuyển vào 16 dòng thuốc lá chuyển gen.
1.3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm
20 dòng/giống mang nguồ
n gen quí được thường xuyên cấy chuyển sang môi
trường mới, Nguồn hạt giống được bảo quản trong kho lạnh đảm bảo các
dòng/giống sinh trưởng phát triển tốt.
2. Kiến nghị
- Đề nghị Hội đồng KHKT Bộ CN nghiệm thu nhiệm vụ năm 2009 và cho phép
tiếp tục thực hiện nhiệm vụ trong những năm tiếp theo

Hà Nội, ngày tháng năm
Xác nhận của đơn v
ị chủ trì Chủ nhiệm đề tài

Trần Thị Thanh Hảo


21





TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội. Công nghệ sinh học thực vật trong
cải tiến giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp - 1997
2. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang
Huấn . Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh
vật Việt Nam. NXB Khoa học và kĩ thuật - 2003
3. Hoàng Tự Lập và cs. Giáo trình thi nâng ngạch viên chứ
c Tổng công ty
Thuốc lá Việt Nam năm 2008 - 2009
4. Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương
Thảo . Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. NXB NN - Hà Nội -
2005
5. Crickmore, N., Ziegler, D.R., Fietelson, J., Schnepf, E.,Van Rie, J., Lereclus,
D., Baum, J. and Dean, D.H. . Revision of the nomenclature for Bacillus
thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular
Biology Review 62:807-813; 1998
6. Yu, C G., M. A. Mullins, G. W. Warren, M. G. Koziel, and J. J. Estruch.

The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses
midgut epithelium cells of susceptible insects. Applied and
Environmental Microbiology 63:532-536; 1997
22

PHỤ LỤC


Phụ lục 1: Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Phụ lục 2: Cấu trúc vector pBI121
Phụ lục 3: Trình tự gen vip3A
Phụ lục 4: Phương pháp chuyển gen quan tâm vào cây thuốc lá (cải tiến)
(Topping, 1998)
Phụ lục 5a: Kết quả xử lý số liệu ngoài đồng ruộng
Phụ lục 5b: Kết quả xử lý số liệu trong phòng thí nghiệm
Phụ lục 6: Các hồ sơ liên quan đến nhiệm vụ
Quyết định giao nhiệm vụ

Hợp đồng
Thuyết minh
Biên bản nghiệm thu cấp cơ sở
Bài phản biện của Hội đồng cấp cơ sở

23
Phụ lục 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Nhóm Hóa chất Hàm lượng (mg/l)
KNO
3
1900
NH
4
NO
3
1650
MgSO
4
180,54
KH
2
PO
4
170
Đa lượng
CaCl
2
332,02

H
3
BO
3
6,2
MnSO
4
22,3
ZnSO
4
8,6
KI 0,83
Na
2
MoO
4
0,25
CuSO
4
0,025
CoCl
2
0,025
Na
2
EDTA 37,3
Trung và Vi lượng
FeSO
4
.7H

2
O 27,8
Glysin 2
Nicotinic acid 0,5
Myo-Inositol 100
Pyridoxine HCl 0,5
Vitamin
Thiamine HCl 0,1

Phụ lục 2. CẤU TRÚC VECTOR pBI121




Ghi chú: gen vip3A được chèn vào vị trí của gen gus (GUS CDS)



24
Phụ lục 3. TRÌNH TỰ GEN vip3A

LOCUS AJ971413 p DNA linear BCT 19-MAY-2005
DEFINITION Bacillus thuringiensis vip3A gene for vegetative insecticidal
protein.
ACCESSION AJ971413
VERSION AJ971413.1 GI:66351675
KEYWORDS vegetative insecticidal protein; vip3A gene.
SOURCE Bacillus thuringiensis
ORGANISM Bacillus thuringiensis

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;
Bacillus cereus group.
REFERENCE 1
AUTHORS Pham,N.B., Le,N.H., Pham,T.T., Chu,H.H. and Le,B.T.
TITLE Cloning and sequence analysis gene encoding the vegetative
insecticidal protein (VIP3A) of some Vietnamese B.
thuringiensis strains
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 2370)
AUTHORS Pham,N.B.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-MAY-2005) Pham N.B., Plant Cell Technology,
Institute of Biotechnology (IBT), Hoang Quoc Viet Str. 18, Cau Giay,
Hanoi,10000, VIET NAM
FEATURES Location/Qualifiers
source 1 2370
/organism="Bacillus thuringiensis"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="BTAB51"
/db_xref="taxon:1428
"
/country="Viet Nam"
gene
1 2370