Sắc ký gel và ứng dụng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HÓA HỮU CƠ



TIỂU LUẬN
CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

TÊN ĐỀ TÀI:
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG







Giảng viên: TS. Huỳnh Khánh Duy
Học viên thực hiện: Nguyễn Quốc Khƣơng Anh – 13053071



Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 1 năm 2014


MỤC LỤC
I. GIỚI THIỆU 3
II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL 5
II.1. Đặc điểm của quá trình 5
II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp 8

II.3. Độ giải li 9
III. PHÂN LOẠI GEL 11
III.1. Superdex 11
III.2. Sephacryl 13
III.3. Superose 15
III.4. Sephadex 16
III.5. Sephadex LH-20 18
IV. ỨNG DỤNG 19
IV.1. Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein 19
IV.2. Sắc ký gel trong chiến lƣợc tinh chế 21
IV.3. Xác định khối lƣợng phân tử và phân tích sự phân bố khối lƣợng phân tử .
26
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30


SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 3

I. GIỚI THIỆU
Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các
phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung
môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution). Sắc kí gel phù
hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc
nghiệt.
 Quá trình phân tách bằng phƣơng pháp sắc kí gel (gel filtration)
Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed).
Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa
học và trơ.
Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng lưới

lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt.
Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được
xem là pha động.






1. hạt gel hình cầu
2. mẫu được đưa vào cột
3. Pha động kéo mẫu di
chuyển qua cột. Phân tử
sẽ khuếch tán vào và ra
khỏi lỗ xốp, những phân
tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ
xốp và bị giữ lại trong
cột lâu hơn
4. Pha động qua cột liên
tục, các phân tử lớn
không thể chui vào các lỗ
xốp nên đi ra khỏi cột
trước. Những phân tử
nhỏ khuếch tán vào và ra
khỏi lỗ xốp nên ra khỏi
cột sau.
Hình I.1. Quá trình sắc kí gel
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 4

 Ứng dụng của phƣơng pháp sắc kí gel
Tách loại bỏ những nhóm phân tử (Group separation)
Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối, protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử
lớn. Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi.
Sephadex G-10, G-25, G-50 được sử dụng cho nhóm này
Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation)
Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục
đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự
phân bố khối lượng của mẫu.
Phù hợp cho bước tách cuối cuối cùng của việc tinh chế. Monomer có thể được
tách khỏi tủa và mẫu có thể thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dự trữ.

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 5

II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL
II.1. Đặc điểm của quá trình
Kết quá của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ
đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở
vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật
tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không
vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất
của pha động (buffer) ở thể tích V
o
(xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng
trống (void volume). Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới
giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử
được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột

V
t
(total column volume) của pha động đi qua cột.

Hình II.1. Phổ đồ sắc kí
Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng,
V
e
(elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí. Có 3 cách để xác định V
e
:


Khi thể tích của mẫu quá nhỏ
so với thể tích lớp đệm thì V
e

được xác định từ vị trí ban đầu
của mẫu đến vị trí cao nhất của
mũi sắc kí.

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 6


Hình II.2. Cách xác định thể tích giải li V
e

Bởi vì mũi đối xứng phổ biến trong sắc kí gel, do đó V

e
dễ dàng xác định. Tuy
nhiên V
e
không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển của các cấu tử khi qua cột bởi vì
V
e
sẽ thay đổi phụ thuộc vào V
t
tổng thể tích của lớp đệm và cách nhồi cột. Sự giải li của
mẫu được đặc trưng bởi hệ số phân bố K
d
.





 






 



 


 


K
d
đặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy ra sự khuếch tán của những loại phân tử
khác nhau.
Cách xác định V
e
đã được nêu ở trên.
V
o
là thể tích khoảng trống, chính là thể tích của những phân tử trong pha động
không chui vào được mạng lưới lỗ xốp do kích thước lớn và di chuyển thẳng qua cột
bằng thể tích của pha động (buffer). Cột được nhồi tốt thì thể tích V
o
xấp xỉ 30% thể tích
cột.
V
s
là thể tích pha tĩnh bằng V
i
là thể tích pha động bên trong mạng lưới (chỉ chứa
các phân tử kích thước nhỏ). Trong thực tế V
i
rất khó xác định do phải xác định thể tích
mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), do đó để thuận tiện thì V
i
được

thay thế bằng V
t
– V
o
.
Khi thể tích của mẫu lớn,
không thể bỏ qua so với thể tích
lớp đệm thì V
e
được xác định từ
vị trí một nữa thể tích mẫu đến
vị trí cao nhất của mũi sắc kí.

Khi thể tích mẫu quá lớn, tạo
nên mũi sắc kí có vùng phẳng
ngang, thể tích V
e
được xác
định từ vị trí bắt đầu của mẫu
đến vị trí của điểm uốn ở phần
đang tăng lên của mũi giải li.

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 7


Hình II.3. Biểu đồ thể hiện thể tích V
o
và V

t

Do thay V
i
bằng V
t
– V
o
, do đó ta có giá trị K
av
, nó không thực sự đúng với giá trị
hệ số phân bố K
d
. Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giửa K
av
:K
d
, và tỉ lệ này
không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu.





 



 


Hình II.4. Mối quan hệ giữa các biểu thức đƣợc sử dụng quá trình giải li

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 8


II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp
Hệ số phân bố K
av
liên quan đến kích thước của phân tử. Tỉ trọng và kích thước
giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị K
av
và log M
r
(khối lượng
phân tử). Trên một vùng xem xét thì mối quan hệ này là đường thẳng. Chọn lựa phương
pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả
bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị K
av
ứng
với log M
r
của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc.
Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở
thể tích khoảng trống V
o
(K

av
= 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu.
Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị V
t
(K
av
=1)
 Nếu K
av
> 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ
(V
e
> V
t
)
 Nếu K
av
< 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các phân tử có thể
chảy tắt qua cột (V
e
< V
o
).

Hình II.5. Đƣờng cong chọn lọc của Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade và
Superdex 200 prep grade
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 9

II.3. Độ giải li
Độ giải li cho biết độ phân tách giữa các mũi, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố
như tỉ lệ giữa thể tích mẫu và thể tích cột, tốc độ dòng, thông số cột, kích thước hạt, sự
phân bố kích thước hạt, tỉ trọng lớp đệm, độ xốp của hạt, độ nhớt của pha động. Hiệu quả
của quá trình sắc kí gel phụ thuộc vào chủ yếu vào các điều kiện lựa chọn sao cho độ
chọn lọc hợp lí và tránh những mũi giản rộng trong quá trình phân tách.
Độ giải li được xác định bằng biểu thức:





 




 




 V
r1
và V
r2
là thể tích giải li của 2 mũi gần nhau.
 W
1
và W

2
là độ rộng tương đối của mũi.

Hình II.6. Thông số đƣợc sử dụng để xác định độ giải li
Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương pháp
tạo ra những mũi hẹp.

Hình II.7. Sự phụ thuộc của độ giải li vào độ chon lọc và độ rộng của mũi
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 10

Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trình
giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N):
  





 
Trong đó:
 V
e
: thể tích mũi giải li
 W
1/2
: chiều rộng mũi tại một nữa chiều cao mũi.
 L: chiều cao đệm
Hiệu quá có thể được cải thiện bằng cách giảm kích thước hạt, tuy nhiên kích

thước hạt nhỏ tạo trở lực lớn và tốc độ dòng giảm, dẫn đến thời gian tiến hành kéo dài.
Độ đồng đều của lớp đệm và hạt nhồi sẽ ảnh hưởng đến độ đồng đều của dòng
chảy qua cột và do đó sẽ ảnh hưởng đến hình dạng và độ rộng của mũi. Thiết bị sắc kí gel
với độ đồng đều cao luôn cho mũi giải li hẹp.
Loại sắc kí gel với kích thướt hạt nhỏ tạo điều kiện cho các phân tử dễ dàng
khuếch tán vào và ra khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân bằng giữa pha động và pha
tĩnh, vì vậy cải thiện được độ giải li do giảm chiều rộng mũi.
Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình
khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa
trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối
đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách:
V
Sep
= V
eB
- V
eA

Tuy nhiên, do dòng khuếch tán xoáy, sự không cân bằng giữa pha tỉnh và pha
động, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên luôn có vùng giản rộng. Vì vậy thể tích mẫu luôn
nhỏ hơn thể tích phân tách.

Hình II.8. Đƣờng cong giải li cho thể tích mẫu khác nhau
Thể tích mẫu nhỏ
Thể tích mẫu tối đa có thể
phân tách nếu không có
vùng giản rộng
Thể tích mẫu tối đa có thể
phân tách trong điều kiện
thực nghiệm

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 11

III. PHÂN LOẠI GEL
Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian
ba chiều. Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ
học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất.
Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại trọng lượng phân tử,
tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel. Các loại gel thương mại thường không
chịu được tính acid hay base quá mạnh, lỗ rỗng không quá lớn vì sẽ làm giảm độ bền cơ
học.
Có hai loại nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel. Xerogel là loại
gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ
trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm. Trong hệ gel này các lỗ
rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng. Nếu dung môi được
loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel bị xụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi khi có thể
khôi phục lại hệ mạng đó.
Ngược lại aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel, thí dụ như thủy
tinh có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng. Đó là nguyên liệu rắn có lỗ rỗng, dung môi có thể
chui vào các lỗ rỗng này, nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel không
bị xụp đổ.
Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố:
 Mục tiêu của thí nghiệm (phân tách độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm
hợp chất).
 Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn.
Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex, Sephacryl, Superose và
Sephadex và Sephadex LH-20
III.1. Superdex
Superdex là lựa chọn cho độ giải li cao, thời gian ngắn và độ thu hồ cao

Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp, Superdex là loại gel được lựa chọn
đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt.
Superdex là một loại composite dựa trên liên kết ngang giữa các hạt rỗng agarose
đến mạng dextran bằng liên kết cộng hóa trị. Nó có độ bền vật lý và hóa học cao bởi
mạng agarose liên kết ngang và có tính chất lọc gel tốt do chuỗi dextran. Độ bền cơ học
của Superdex cho phép những dung môi giải ly có độ nhớt cao như urea 8M vẫn chảy qua
được. Loại gel này có thể chịu đựng tốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn định hay lúc
rửa cột. Tính bền giúp loại Superdex phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp với tốc độ
dòng cao, nhanh và hiệu quả làm sạch tại chỗ. Những tương tác giữa protein và gel
Superdex được bỏ qua khi sử dụng dung môi với cường độ ion trong khoảng 0,15 M đến
1,5M.
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 12


Hình III.1. Mạng lƣới liên kết trong Superdex


Hình III.2. Đƣờng cong chọn lọc cho Superdex (13 m) và Superdex prep grade (34 m)
Superdex được sản xuất với hai loại kích thước hạt (13 m và 34 m) với 4 độ
chọn lọc khác nhau (Superdex Peptide, Superdex 30, Superdex 75 và Superdex 200).
Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 m của Superdex Peptide, Superdex
30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ.
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 13

Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 34 m của Superdex prep grade cho qui
mô công nghiệp.

Khi không biết khối lượng của protein quan tâm thì nên bắt đầu với Superdex 200.
Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng
thể đơn dòng từ đimer và từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp.
Superdex Peptide hay Superdex 30 prep grade dành cho việc phân tách peptides,
oligonucleotides và phân tử protein nhỏ (M
r
< 10000).
Bảng III.1. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superdex

III.2. Sephacryl
Sephacryl là lựa chọn cho phân tách nhanh, độ thu hồi cao tại phòng thí nghiệm và
qui mô công nghiệp
Sephacryl High Resolution (HR) thay thế cho Superdex prep grade trong những
ứng dụng đòi hỏi khoảng tương đối rộng, độ bền hóa học và chịu được tốc độ dòng cao
làm cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp.
Sephacryl HR là một loại composite được hình thành bởi liên kết ngang cộng hóa
trị giữa allyl dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền
cơ học cao. Lỗ xốp của gel được xác định bởi thành phần dextran được điều khiển để
đem lại 5 độ chọn lọc khác nhau. Độ bền cơ học của Sephacryl HR cho phép những dung
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 14

môi có độ nhớt cao chảy qua. Sephacryl S-100 HR cho hiệu suất 96% cho việc tách
những chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, -
lactoglobulin A+B, chymotrypsinogen A, myoglobin, lysozyme, ribonuclease A và
cytochrome C. Cường độ tối thiểu ion nên sử dụng là 0,15 M.

Hình III.3. Một phần cấu trúc của Sephacryl High Resolution

Hình III.4. Đƣờng cong chọn lọc của gel Sephacryl High Resolution


SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 15


Bảng III.2. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephacryl HR

III.3. Superose
Superose có thể dùng trong khoảng khối lượng phân tử rộng nhưng không phù hợp
cho phân tách qui mô công nghiệp
Superose là loại gel bền vật lý và hóa học cao, hình thành dựa trên liên kết ngang
của phân tử lỗ xốp agarose. Một vài tương tác kị nước với gel làm cho những phân tử kị
nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li chậm
hơn dự đoán. Tuy nhiên, trong một vài ứng dụng, những tương tác này có thể giúp làm
tăng độ giải li của quá trình phân tách.
Bảng III.3. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superose

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 16


Hình III.5. Đƣờng cong chọn lọc của gel Superose
III.4. Sephadex
Sephadex được dùng để tách nhanh những nhóm có khối lượng phân tử nhỏ, khử
muối, đổi dung môi và làm sạch mẫu
Sephadex được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran với epichlorohydrin.

Những loại khác nhau của Sephadex là do những mức độ khác nhau của liên kết
ngang và vì vậy nó có những mức độ trương nở và độ chọn lọc khác nhau cho những kích
thước phân tử đặc trưng.
Sephadex G-10 phù hợp cho việc tách những phân tử sinh học như peptides (M
r
>
700) ra khỏi những phân tử nhỏ (M
r
< 100).
Sephadex G-50 phù hợp tách những phân tử có M
r
> 30000 ra khỏi những phân tử
M
r
< 1500 như protein được đánh dấu hay DNA. Loại gel này còn được sử dụng để loại
bỏ nucleotides nhỏ ra khỏi acids nucleic mạch dài.
Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu. Loại gel này
hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có M
r
>
5000.

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 17


Hình III.6. Một phần cấu trúc của gel Sephadex
Bảng III.4. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephadex

SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 18

III.5. Sephadex LH-20
Sephadex LH-20 được sản xuất dành riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp
chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung môi hữu cơ để duy trì độ bền của chúng. Các
hợp chất tự nhiên này là steroids, lipids và peptides có khối lượng phân tử thấp (khoảng
35 amino acids). Các hợp chất thường được phân tách bằng sắc kí phân chia lỏng/lỏng
hay sắc kí hấp thu. Sephadex LH-20 có độ chọn lọc rất cao cho hợp chất có vòng thơm
(aromatic). Nó được sử dụng trong phân tích và trong qui mô công nghiệp để phân tách
những nhóm chất có tính chất tương tự nhau.
Sephadex LH-20 được tạo nên từ những chuỗi hydroxypropylated dextran mà có
liên kết ngang đến mạng lưới polysaccharide. Loại này có thể trương nở trong nước và
dung môi hữu cơ.
Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ
tinh khiết cao bằng sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai
đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang
(diastereoisomers).
Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel và
dung môi hữu cơ. Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước.

Hình III.7. Một phần cấu trúc của gel Sephadex LH-20
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 19

IV. ỨNG DỤNG
IV.1. Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein

Sự thẩm tách (Dialysis) là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc loại bỏ muối
hay những phân tử nhỏ và thay đổi dung môi. Tuy sự thẩm tách xảy ra chậm, đòi hỏi
lượng dung môi lớn và có nhiều khả năng làm mất mẫu trong quá trình tiến hành, hay sự
đứt gãy do protein bị phân giải hay là những liên kết khó kiểm soát giữa mẫu và màng
thẩm tách.
Một kỹ thuật đơn giản hơn và nhanh hơn sử dụng cột sắc kí gel để phân tách dựa
trên sự khác biệt về khối lượng phân tử để loại muối và những phân tử nhỏ. Cột được
nhồi với Sephadex
TM
G-25. Chỉ trong một bước, mẫu sẽ được loại bỏ muối, những phân
tử nhỏ và đổi dung môi mới.
Thể tích mẫu cần loại muối có thể lên tới 30% tổng thể tích cột. Tốc độ và năng
suất cao của phương pháp cho phép những thể tích mẫu lớn vẫn được tiến hành nhanh và
hiệu quả.

Hình IV.1. Phổ đồ quá trình khử muối và đổi dung môi
Bảng IV.1. Thông số cột đƣợc nhồi sẵn cho ứng dụng khử muối và đổi dung môi

Để loại muối cho lượng mẫu lớn có thể sử dụng nhiều cột được bán sẵn như
HiTrap Desalting hay HiPrep 26/10 Desalting. Ví dụ:
 2 cột HiTrap Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 3 ml hay 5 cột thì
thể tích mẫu lên tới 7,5 ml.
 4 cột HiPrep 26/10 Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 60 ml và
thời gian tiến hành khoảng 20 – 30 phút.
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 20

Quá trình khử muối và đổi dung môi thường tốn khoảng 5 phút trên mẫu với trên
95% mẫu được thu hồi (đối với hầu hết các protein)

Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl trong dung môi để chống lại sự
tương tác ion.
Nồng độ mẫu không ảnh hưởng quá trình phân tách miễn là nồng độ protein không
vượt quá 70 mg/ml khi sử dụng dung môi có nước thông thường.
Mẫu nên được hòa tan hoàn toàn, ly tâm hoặc lọc bỏ những phần rắn còn sót.
Ví dụ quá trình khử muối:
 Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)
6

 Mẫu được khử muối trên cột HiTrap Desalting 5 ml với chương trình
ÄKTA prime cài đặt sẵn.
 Dung môi giải li là sodium phosphate 20 mM, sodium chloride 0,15 M, pH
7,0.
 Tín hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV (280 nm) và tín hiệu
đầu ra của muỗi được xác định bằng độ dẫn điện.

Hình IV.2. Sắc kí đồ quá trình khử muối ra khỏi (His)
6
protein bằng ÄKTA prime
 Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu
 Mẫu là 2 mg/ml BSA trong 50 mM sodium phosphate, 0,5 M sodium
chloride, pH 7,0.
 Sử dụng cột khử muối HiTrap Desalting (5 ml), lần lượt sử dụng 1, 3, 5 cột
để tăng thể tích mẫu.
 Dung môi giải li là sodium phosphate 50 mM, sodium chloride 0,15 M, pH
7,0.
 Tốc độ dòng là 5 ml/ phút.
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 21

 Tín hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV (280 nm) và tín hiệu
đầu ra của muỗi được xác định bằng độ dẫn điện.

Hình IV.3. Quá trình scale up ghép nối tiếp nhiều cột cho ứng dụng khử muối
IV.2. Sắc ký gel trong chiến lƣợc tinh chế
Để tinh chế ở mức độ cao hay khi không tìm được phối tử phù hợp cho phương
pháp tinh chế một giai đoạn bằng cột ái lực, một phương pháp nhiều giai đoạn hiệu quả
được phát triển để sử dụng cho quá trình tinh chế. Nó bao gồm sự bắt giữ (Capture), tinh
chế trung gian (Intermediate Purification) và tinh chế ở mức độ cao (Polishing), phương
pháp này gọi tắt là CIPP.
CIPP được sử dụng cho công nghê dược và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để
đảm bảo phát triển một phương pháp nhanh, hiệu quả và chất lượng cao.
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 22


Hình IV.4. Các giai đoạn tổng hợp và tinh chế theo CIPP
Bắt giữ (Capture): mục tiêu chính là cô lập, làm tăng nồng độ và làm bền sản
phẩm cần tinh chế.
Tinh chế trung gian (Intermediate): loại bỏ những chất bẩn lớn như các protein,
acids nucleic, endotoxins và viruses.
Tinh chế ở mức độ cao (Polishing): Ở giai đoạn này các vết bẩn hầu như đã được
loại bỏ, chỉ còn lại những vết bẩn dạng vết hay có tính chất gần giống với chất chính.
Mục tiêu giai đoạn này là thu được sản phẩm hoàn toàn tinh khiết bằng cách loại bỏ
những vết bẩn còn lại.
Trong đây, sắc kí gel có thể được sử trong việc khử muối và đổi dung môi trong
quá trình chuẩn bị mẫu đã trình bày ở trên và nó được sử dụng cho giai đoạn tinh chế ở
mức độ cao.

 Lựa chọn và kết hợp các kỹ thuật tinh chế

Hình IV.5. Sự cân bằng giữa 4 tiêu chí mà các kỹ thuật tinh chế cần có
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 23

Năng suất (Capacity): liên quan đến lượng mẫu có thể được xử lí khi tinh chế.
Trong một số trường hợp lượng mẫu bị giới hạn bởi thể tích như trong phương pháp sắc
kí gel hay khi lượng chất bẩn nhiều hơn lượng mẫu.
Tốc độ (Speed): hầu như quan trọng ở thời điểm bắt đầu tinh chế, ở đó chất bẩn
như proteases phải được loại bỏ nhanh nhất có thể.
Thu hồi (Recovery): khả năng thu hồi bị ảnh hưởng bởi những điều kiện hoạt động
trong thiết bị có thể làm phá hủy cấu trúc của mẫu. Là yêu cầu quan trọng, làm tăng giá
trị của sản phẩm được tinh chế.
Độ giải li (Resolution): đạt được nhờ vào việc lựa chọn kỹ thuật và hiệu quả của
quá trình sắc ký. Độ giải li thường khó đạt được yêu cầu ở bước cuối vì khi đó tính chất
của mẫu và tạp chất gần như giống nhau.
Lựa chọn phương pháp đáp ứng mục tiêu cho các giai đoạn tinh chế. Chọn lựa kết
hợp các phương pháp với nhau dựa trên ưu điểm của phương pháp và điều kiện của mẫu
ở thời điểm ban đầu và khi kết thúc.
Bảng IV.2. Những ƣu điểm của các kỹ thuật tinh chế cho CIPP

Lượng mẫu tối thiểu xử lí phải ở giữa các bước tinh chế để tránh những yêu cầu về
điều kiện của mẫu không phù hợp giữa hai bước xử lí. Sản phẩm giải li ở cột đầu tiên
phải ở trong điều kiện phù hợp cho việc xử lí ở cột tiếp theo.
Ammonium sulfate thường được sử dụng cho việc làm trong và tăng nồng độ mẫu
để mẫu ở môi trường nồng độ muối cao. Do đó nên chọn HIC trong giai đoạn bắt giữ vì
HIC đòi hỏi lượng muối cao để tăng liên kết với đệm, nồng độ muối và tổng thể tích mẫu
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 24

sẽ được giảm đáng kể sau khi giải li ra khỏi cột HIC. Pha loãng những phân đoạn của
mẫu hay đổi dung môi thì dùng những cột sắc kí gel (khử muối), trước khi cho vào cột
IEX và AC.
Sắc kí gel không có liên kết giữa chất và mạng lưới gel, do đó không bị ảnh hưởng
bởi điều kiện dung môi, nhưng bị hạn chế bởi thể tích mẫu. Sắc kí gel phù hợp cho việc
sử dụng sau bất cứ kỹ thuật làm tăng nồng độ như IEX, HIC, AC bởi vì protein mục tiêu
được giải li với thể tích giảm đi và thành phần từ dung môi không ảnh hưởng quá trình
lọc gel.
Ở bước bắt giữ, nên lựa chọn kỹ thuật có liên kết hiệu quả với protein mục tiêu và
liên kết yếu nhất có thể đối với chất bẩn. Một mẫu được tinh chế cần kết nối các kỹ thuật
và có nhiều phương án lựa chọn. Ví dụ trong chiến lược IEX-HIC-GF, giai đoạn bắt giữ
có thể lựa chọn theo sự khác nhau về điện tích (IEX), giai đoạn tinh chế trung gian có thể
dựa trên sự khác nhau về tính kị nước (HIC) và giai đoạn tinh chế cuối cùng dựa trên sự
khác nhau về kích thước (GF).

Hình IV.6. Phƣơng pháp kết hợp các kỹ thuật sắc kí
 Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối cùng
SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 25

Hầu hết sự phân tách dựa trên điện tích, tính kị nước, hay ái lực hóa học được sử
dụng cho những giai đoạn trước bước cuối cùng trong chiến lược CIPP để phương pháp
sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối. Sản phẩm có thể được tinh
chế và đổi dung môi trong một bước và dimers và các kết tủa được loại bỏ.
Sắc kí gel là kĩ thuật sắc kí chậm và kích thước cột sẽ xác định thể tích mẫu. Việc
sử dụng sắc kí gel sau những kĩ thuật khác một phần là để giảm thể tích mẫu để có thể sử

dụng cột kích thước nhỏ hơn. Loại gel cho bước này thường dùng là Superdex.

Hình IV.7. Phổ đồ tách dimers và multimers ra khỏi ZZ-brain IGF trên Superdex 75 prep
grade cho bƣớc tinh chế cuối cùng
 Tinh chế kháng thể đơn dòng humanised IgG
4
theo kỹ thuật CIPP
Humanised IgG
4
được lấy từ nuôi cấy tế bào u tủy và tinh chế bằng sự kết hợp sắc
kí ái lực và lọc gel. Kháng thể được bắt giữ bởi sắc kí ái lực sử dụng MabSelect
TM
. Sắc kí
gel trên cột Superdex 200 prep grade được sử dụng để tách các monomer từ dimer và các
polymers lớn.
Trên phổ đồ sắc ký ta thấy sau khi tách mẫu bằng sắc kí ái lực ta thu được mũi
IgG
4
tinh khiết, tách riêng so với phần còn lại. Nhưng nó vẫn lẫn các dimers và monomer
với nhau mà cột ái lực không phân tách được. Tiếp tục cho mẫu IgG
4
đi qua cột sắc kí gel
thì dựa trên sự khác biệt với khối lượng giữa monomer và dimer, multimer nên tách ra
được mũi monomer rõ rệt.
Phân tích các mẫu giải li ra khỏi cột bằng phương pháp điện di protein (SDS-
PAGE), dung dịch khi giải li ra khỏi cột sắc kí ái lực (đường số 3) ta nhận thấy vết của
IgG
4
rõ ràng, hoàn toàn tách khỏi các vết của mẫu ban đầu, nhưng sự khác biệt giữa mẫu
sau khi ra khỏi cột sắc kí gel (đã tách monomer ra khỏi dimer) và mẫu ở đường số 3 là

không rõ ràng trên SDS-PAGE. Nhưng khi giảm thể tích mẫu, thì ở vết H-chain ở đường
số 2 và đường số 3 ta nhận thấy vết ở đường số 2 (giải li ra khỏi cột sắc kí ái lực) vẫn còn
đuôi dơ ở phía sau kéo theo còn ở đường số 3 trở đi (giải li ra khỏi cột sắc kí gel) thì hầu
như không thấy. Điều đó cũng cho thấy khả năng tinh chế ở bước cuối của cột sắc kí gel.