Các phương pháp phân tích acid amin trong thực phẩm

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC





TIỂU LUẬN MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
CÔNG CỤ

Đề Tài: “Các phương pháp phân tích acid
amin trong thực phẩm”



HVTH: Mang Tấn Phong
GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy









TP. HỒ CHÍ MINH – 12/201
2

Mục lục
1. Giới thiệu về acid amin 3
1.1. Thành phần và cấu tạo của amino acid 3
1.2. Màu sắc và mùi vị của amino acid 6
1.3. Tính tan của amino acid 6
1.4. Tính quang học của amino acid 6
1.5. Tính lưỡng cực của amino acid 7
2. Thu nhận amino acid 8
2.1. Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin 8
2.2. Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein 9
3. Các phương pháp phân tích amino acid trong thực phẩm 10
3.1. Sắc ký giấy 10
3.2. Sắc ký bản mỏng 12
3.3. Sắc ký khí 12
3.4. Phương pháp điện di 13
3.5. Phương pháp quang phổ khối 13
3.6. Phương pháp đồng vị 14
3.7. Phương pháp enzyme 14
3.8. Phương pháp vi sinh vật 14
4. Một vài phương pháp cụ thể 14
4.1. Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn
xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 14
4.2. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong
phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 19

3

1. Giới thiệu về acid amin
1.1.Thành phần và cấu tạo của amino acid
Amino acid là đơn vị cấu tạo protein. Amino acid là chất hữu cơ, phân tử có chứa nhóm:
carboxyl (-COOH) và nhóm amino (-NH
2
) gắn với carbon ở vị trí .
Hầu hết amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở dạng L--amino acid. Như
vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R).
Dựa vào tính chất của gốc R các amino acid được chia làm 5 nhóm:
Nhóm 1: gồm 7 amino acid có R không phân cực, kỵ nước: glycine, alanine, proline,
valine, leucine, isoleucine và methionine.

Nhóm 2: gồm 3 amino acid có gốc R chứa nhân thơm: phenylalanine, tyrosine tryptophan.

4

Nhóm 3: gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine, threonine, cystein,
aspargine và glutamine.

Nhóm 4: gồm 3 amino acid có R tích điện dương: lysine, histidine và arginine.

Nhóm 5: gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate và glutamate

Các amino acid thường gặp là những amino acid thường có mặt trong thành phần của các
loại protein. Chúng có khoảng 20 loại và được thu nhận khi thủy phân protein.





5

Bảng 1.1: Các amino acid thường gặp
Tên amino
acid
Tên amino acid theo danh pháp hóa học
Tên
viết tắt
Ký
hiệu
Khối lượng
(Mr – Dalton)
Glycine
-aminoacetic
Gly
G
75
Alanine
-aminopropionic

Ala
A
89
Proline
-pỉolidincarboxylic
Pro
P
115
Valine
-aminoisovaleric
Val
V
117
Leucine
-aminoisocaproic
Leu
L
131
Isoleucine
-amino--metylvaleric
Ile
I
131
Methionine
-amino--metyltiobutiric
Met
M
149
Phenylalanine
-amino--phenylpropionic

Phe
F
165
Tyrosine
-amino--hydrogengenxyphenylpropionic
Tyr
Y
181
Tryptophan
-amino--indolylpropionic
Trp
W
204
Serine
-amino--hydroxypropionic
Ser
S
105
Threonine
-amino--hydrogengenxybutiric
Thr
T
119
Cysteine
-amino--tiopropionic
Cys
C
121
Aspargine
Amid của aspartate

Asn
B
132
Glutamine
Amid của glutamate
Gln
Q
146
Lysine
,-diaminocaproic
Lys
K
146
Hystidine
-amino--imidazolpropionic
His
H
155
Arginine
-amino-guanidinvaleric
Ảg
R
174
Aspartate
-aminosucinic
Asp
D
133
Glutamate
-aminoglutarate

Glu
E
147

Trong phân tử protein có khoảng 20 loại amino acid, tuy nhiên trong cơ thể người và động
vật không tổng hợp được tất cả các loại đó mà phải đưa từ ngoài vào qua thức ăn. Những amino
acid phải đưa từ ngoài vào đó gọi là các amino acid không thay thế. Ngày nay người ta biết được
có khoảng 8-10 loại amino acid không thay thế bao gồm: methionine, valine, leucine, isoleucine,
theonine, phenylalanine, tryptophan, lysine, arginine và histidine.
Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein đôi khi còn có một số
amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất của những amino acid
thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4-hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5-
hydrogenxylysine là dẫn xuất của lysine… Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein,
nhưng có hành trăm loại amino acid khác, chúng có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp
chất khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản phẩm trung gian
của quá trình chuyển hóa trong cơ thể.

6

1.2.Màu sắc và mùi vị của amino acid
Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glyxine, alanine,
valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có
vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic
(monosodium glutamte).
1.3.Tính tan của amino acid
Các amino acid thường dễ tan trong nước và khó tan trong alcohol, ether (trừ proline và
hydrogenxyproline), chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine).
1.4.Tính quang học của amino acid
Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế
nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân

cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được k. hiệu bằng dấu (+), quay trái được k. hiệu bằng
dấu (-). Góc quay đặc hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường.
Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà
các amino acid có cấu trúc dạng D hay L, gọi là đồng phân lập thể. Số đồng phân lập thể được
tính theo 2
n
(n là số carbon bất đối).















Hình 1.1: Đồng phân lập thể của alanine

Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (λ) khoảng từ 220 - 280 nm.
Đặc biệt cùng nồng độ 10
-3
M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực
tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn
các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein.

7






















Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím của tryptophan và tyrosine

1.5.Tính lưỡng cực của amino acid
Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton (H

+
)
thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin -NH2 nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính
base. Vì vậy amino acid có tính chất lưỡng tính.
Trong môi trường acid, amino acid ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH
amino acid lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và
tiếp tục tăng pH amino acid sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dạng anion (tích điện âm). V.
vậy đôi khi người ta coi nó như một di-acid.

Tương ứng với độ phân ly H
+
của các nhóm COOH và NH3
+
có các trị số pK
1
và pK
2
. Từ
đó người ta xác định được pI = (pK
1
+ pK
2
)/2.
Ví dụ: khi hoà tan glycine vào môi trường acid mạnh thì hầu như glycine đều ở dạng cation.
Nếu tăng dần lượng kiềm, thu được đường cong chuẩn độ. Trên đường cong chuẩn độ thấy rằng:
glycine lần lượt nhường 2 proton trước tiên chuyển sang dang lưỡng tính và sau cùng chuyển
thành dạng anion.
8

2. Thu nhận amino acid

2.1.Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin
Phân tích acid amin của protein là một trong những phương pháp tốt nhất và chính xác nhất
để định lượng protein. Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không bị nhiễm là
một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein. Nhiều phương pháp hiện đại có thể loại bỏ
chất đệm, muối ra khỏi protein như phương pháp kết tủa hoặc sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-
HPLC) gây thất thoát protein nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực trở nên khó khăn. Sau đây là
ba phương pháp thường dùng để thu hổi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy
tốc độ cao và sự hấp thu vào màng poly vinylidene difluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu
Prosorb.

2.1.1. Chuẩn bị cột macrospin (mẫu 50-150 µL)
 Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất. Lắp cột nhẹ nhàng
để thu hồi gel ở đáy cột. Hydrate hóa gel với 500 µL nước HPLC trong 15 phút ở nhiệt độ
phòng, sau đó ly tâm cột trong 4 phút ở 2000 g để làm cân bằng cột.
 Rửa cột 3 lần với 500 µL nước để đảm bảo sự cân bằng.
 Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới. Đối với cột macrospin,
them 50-150 µL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột.
 Ly tâm ống 4 phút ở 2000 g, rửa cột với ít nhất 200 µL nước.
 Lấy mẫu đã tinh sạch và rút chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân.

2.1.2. Cột vi xoáy (mẫu 5-25 µL)
 Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng. Làm ướt với 50 µL nước và ly tâm
3 phút ở 1000 g để cân bằng cột. Để có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200 µL nước. Để ly
tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống ly tâm
rỗng 1.7 mL.
 Sau khi cột đã cân bằng, thám khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột.
 Thêm 5-25 µL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột.
 Đặt cột vào một ống mới, xoáy ống 3 phút ở 1000 g. Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch ở trong
ống và sẵn sang để sử dụng.

2.1.3. Chuẩn bị hộp mẫu ProSorb
 Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1 % trifluoroacetic acid (TFA) để đạt kết quả tốt
nhất. Acetonitrile (CAN) với nồng độ hơn 15 % cản trở mẫu dính vào PFVD, vì vậy những
phần của HPLC nên pha loãng với nước cất hoặc 0.1 % TFA để giảm nồng độ của ACN
xuống nhỏ hơn 15 %). Nếu thể tích ít hơn 100 µL, pha loãng mẫu thành 100 µL với 0.1 %
TFA. Nếu mẫu có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì
chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVFD. Bảng 1 tóm tắt
nồng độ của chất tẩy có thể chứa trong mẫu trước khi kết dính vào màng. Ngoài ra, nếu mẫu
9

chứa lượng chất tẩy lớn hơn lương tối đa trong bảng 2.1, có thể them một lượng nhỏ
methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb).
Bảng 2.1: Hàm lượng chất tẩy tối đa
Chất tẩy
Nồng độ tối đa (V/V hoặc W/V)
Triton X-100
0.01
Tween-20
0.01
SDS
0.02
Octyl glucoside
0.25
Brij 35
0.02

 Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp.
 Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 µL methanol (hộp mẫu ProSorb nên được chuẩn bị
kỹ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MiliQ cho mọi bước làm sạch để giảm lượng
acid amin còn sót lại).

 Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 µL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng. Thao tác với
mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa. Nếu mẫu
nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 µL dung dịch đệm vào màng
ướt trước khi cho mẫu vào. Mẫu có thể them trực tiếp vào dung dịch đệm.
 Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắt
đầu.
 Thêm những mẫu thửu thể tích nhỏ, nếu cần đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 µL.
 Rửa màng với 100 µL 0.1 % TFA lần 2.
 Lấy mẫu và làm khô màng PVDF.

2.2.Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein
2.2.1. Thủy phân bằng acid
Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch
HCL 6N dư ở nhiệt độ 100-120
o
C trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin
dưới dạng tự do hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy mọt phần,
tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acis glutamic, acid
aspartic và NH
4
+
.
2.2.2. Thủy phân bằng kiềm
Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH,
bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị
racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá
hủy. Vì vậy phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan.
Thủy phân bằng enzyme
10

Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm.
Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được
gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ
đặc hiệu khác nhau với liên kết peptide. Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầu tận cùng của
chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu
C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở
giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin…

3. Các phương pháp phân tích amino acid trong thực phẩm
Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng amino acid thường là sự kết hợp của nhiều
phương pháp hoá lí và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp phụ các amino acid không giống nhau để
phân tích. Hoặc dựa vào cấu trúc của amino acid tự do sau khi chuỗi polypeptide đã bị thuỷ phân,
có thể định lượng amino acid đầu N tận cùng bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy,
có thể xác định amino acid đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm carboxyl với tác nhân khử
NaBH, hoặc sử dụng enzyme carboxypepitdase…

3.1.Sắc ký giấy



Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích
- b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi

11

Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung
môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bão hoà hơi
nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là
một dung môi hữu cơ bão hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất

trong dung dịch.
Người ta mang lên một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch cần phân tích rồi nhúng
đầu giấy có mang dung dịch cần phân tích đó vào chậu dung môi hữu cơ linh động bão hòa nước
(như rượu butilic)
Trong quá trình di chuyển chậm của dung môi qua ống mao dẫn của giấy, các cấu tử
riêng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà hỗn hợp được
phân chia ra thành các cấu tử thành phần.
Sự chuyển dịch của các chất trong khi tiến hành sắc lý có thể giải thích như sau: các sợi
xenlulozo của giấy có ái lực lớn đối với nước và hấp phụ nước trong dung môi hữu cơ bão hòa
nước (đóng vai trò là chất mang). Ở đây pha tĩnh là nước, còn dung môi hữu cơ là chất lỏng linh
động khi dung môi chảy qua phần giấy có chứa dung dịch cần phân tích thì một phần các chất
chuyển vào dung môi (pha động). Khi dung môi tới phần giấy không có chứa các chất phân tích
thì ở đó lại xảy ra quá trình phân bố các chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung môi hữu
cơ. Lần này, các chất lại chuyển từ (dung môi) pha hữu cơ sang pha nước. Như vậy, nếu cho
dung môi chuyển dịch liên tục qua giấy, các chất phân tích sẽ được chuyển từ điểm mang ban
đầu đến một điểm khác trên giấy theo hướng chảy của dung môi do kết quả của quá trình tách
phân bố liên tục giữa hai pha tĩnh động.
Quá trình phân tích này được tiến hành trong thiết bị kín bão hòa của dung môi và nước.
Khi tuyến dung môi đã đi được đoạn đường 30-40 cm, người ta lấy giấy ra sấy khô và phun
thuốc nhuộm màu, nhờ đó xác định được vị trí của các cấu tử trên dải giấy. Dải giấy sau khi hiện
màu gọi là sắc kí đồ.
Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyển dịch (ký hiệu là Rf) có ý nghĩa rất lớn. Hệ số vận tốc
chuyển dịch Rf là tỉ số giữa quãng đường đi được của chất so với quãng đường chuyển dịch của
dung môi. Rf là đại lượng đặc trưng và không đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xác
định.
Các kiểu sắc ký giấy: Tùy thuộc vào hướng hoặc chiều chuyển dịch của dung môi, người
ta phân biệt một số dạng sắc ký như sau:
 Sắc ký nghịch: khi dung môi chảy dịch từ dưới lên trên.
 Sắc ký thuận: khi dung môi chảy từ trên xuống.
 Sắc ký vòng tròn: khi dung môi chuyển dịch từ tâm ra xung quanh.

Ngoài ra người ta còn phân biệt: sắc ký một chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một
hướng nhất định. Sắc ký hai chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một chiều nào đó, sau đó
sấy khô và cho dung môi chảy theo một chiều khác vuông góc với chiều ban đầu.
Phương pháp sắc ký giấy một chiều (có thể thuận hoặc nghịch) là phương pháp đơn giản
nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó, khả năng phân tích kém hơn sắc ký hai chiều.
12

Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thu được không
gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn.
Để định lượng các acid amin người ta thường sử dụng các phương pháp sau:
 So sánh bằng mắt thường cường độ màu và diện tích các vết màu của hợp chất đã cho
với cường độ màu và diện tích các vết màu của hỗn hợp đối chứng đã biết rõ nồng độ.
 Đo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung môi thích hợp. Sai số
của phương pháp này khoảng 3÷6%.
 Dùng densitomet đo mật độ màu của các vết trong khi cho ánh sáng xuyên qua. Độ
chính xác của phép đo tăng lên đến 10÷15%.
3.2.Sắc ký bản mỏng
Nguyên tắc: dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên
một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di
chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử.
Các chất hấp phụ thường dùng: silicagel, alumin oxit, sephadex,… được kết hợp với
thạch cao để dán vào phiến kính.


3.3.Sắc ký khí
Nguyên tắc: dựa vào tính chất khó bay hơi của các amino acid nên có thể sử dụng nhiệt
để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng amino acid với
cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydric acetic.
Cột thường dung là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1%
(carbowax 1564 hoặc 6000). Thông số nhiệt độ: 125

o
C – 155
o
C, tốc độ dòng chảy 60-240
ml/phút.
13


3.4.Phương pháp điện di
Nguyên tắc: dựa vào tính chất tích điện của các amino acid trong môi trường có pH nhất định.
Dưới tác dụng của điện trường các amino acid tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các
amino acid tích điện âm (-) sẽ chạy về cực (+). Do khả năng tích điện không giống nhau trong
điện trường giữa các amino acid vì vậy tốc độ di chuyển của các amino acid không giống nhau
trong điện trường. Kết quả các mino acid phân bố trải ra trên giá thể (giấy hoặc polyamide).


3.5.Phương pháp quang phổ khối
Nguyên tắc: dùng một chum tia electron bắn vào một lượng chất thử rất nhỏ, các phân tử
chất thử trước hết được phá thành nhiều mảnh ion mang điện dương trong điều kiện chân không.
Các mảnh ion nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành peak với cường độ khác nhau tương ứng
với khối lượng của mỗi ion, đó là khối phổ.
14

Có nhiều loại máy quang phổ khối với mức độ phân giải khác nhau, máy có độ phân giải cao là
máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối
lượng.

3.6.Phương pháp đồng vị
Nguyên tắc: dựa vào hoạt tính phóng xạ của amino acid cùng một loại đã đánh dấu để xác
định vị trí và số lượng của amino acid đó trong chuỗi polypeptide.

Ứng dụng: xác định một hoặc một vài amino acid trong hỗn hợp có nhiều loại amino acid khác
nhau, hay một amino acid cần được xác định trong nhiều mẫu của một loại thí nghiệm.
3.7.Phương pháp enzyme
Có thể các định amino acid bằng phương pháp enzyme dựa trên nguyên tắc mỗi một loại
enzyme có khả năng phân giải đặc hiệu một loại L-amino acid nhất định. Xác định sản phẩm tạo
thành sau phản ứng với enzyme tương ứng có thể biết được amino acid trong hỗn hợp.

3.8.Phương pháp vi sinh vật
Một số vi khuẩn sinh trưởng trong một điều kiện thích hợp, chúng rất nhạy cảm với pH để
sản xuất ra các enzyme L-amino acid decarboxylase đặc hiệu với từng loại amino acid và hoạt
động của chúng giải phóng CO
2
trong môi trường. Xác định nồng độ CO
2
bằng áp kế Warburg
để suy ra thành phần của amino acid.
Phần lớn trường hợp điều kiện pH thích hợp thường nằm trong vùng acid.
Ví dụ: Ở pH 4.5 tạo ra L-glutamate 1-carboxylyase (glutamate decarboxylase _ EC 4.1.1.15), EC
4.1.1.15 xúc tác chuyển hóa L-glutamic → 4- aminobutanoate (-aminobutyrate) + CO
2
.
Ở pH 5.5 tạo ra L-tyrosine carboxylyase (EC 4.1.1.25), EC 4.1.1.25 xúc tác chuyển hóa
L-tyrosine →Tyramine + CO
2
.

4. Một vài phương pháp cụ thể
4.1.Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất
với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey)
4.1.1. Giới thiệu

Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo pha
(RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin. Các bước tạo dẫn
15

xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác với pha không phân cực và ổn định, mà còn cần cho
việc đo quang.
Thuốc thử Marfey 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc (S)-2-[(5-fluoro-
2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acid amin.
Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất ổn định
mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1). Dinitronphenyl alanine amid hấp thu
mạnh bước sóng 340 nm (ε = 30000 M
-1
cm
-1
), điều này cho phép đầu dò xác định được ở phạm
vi subnmol.
Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid amin
thường gặp. Ưu điểm của thuốc thử Marfey là:
1. Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần phải
tăng nhiệt độ cột phản ứng.
2. Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm.
3. Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn.
4. Tạo dẫn xuất acid amin ổn định.
Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương pháp
hiệu quả và rẻ tiền. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trong các
lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứng enzyme
của acid amin.

Hình 4.1: Thuốc thử Marfey (I) và L,L-dẫn xuất từ L-acid amin và thuốc thử (II)
4.1.2. Nguyên liệu và thiết bị
Thủy phân protein
 Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm
 Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt
 Dung dịch HCl 6N
Phản ứng thu nhận dẫn xuất
 dd acid amin chuẩn
 Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21
16

 Thuốc thử Marfey. Lưu ý: thuốc thử Marfey là dẫn xuất của 1-fluoro-2,4-
trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên cần thận trọng khi sử dụng.
 HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sulfoxide (DMSO)
Phân tích sắc ký
 Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp
nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin.
 Cột sắc ký: cột silicat C
8
chuyển đổi pha, ví dụ như: LiChrospher 100 RP 8 (250 x
4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 x 4.6 mm; 7 μm

from Perkin-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-
Nagel), or Vydac C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from The Separations group).
 Đầu dò UV/vis kèm theo ô chứa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 µL. Dẫn xuất
của acid amin được phát hiện ở 340 nm.
 Tổng hợp peak: các phần mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng
peak của acid amin
 Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí
 Dung môi A: 13 mM trifluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v)
tetrahydrofuran trong nước.
 Dung môi B: Acetonitrile (50% v/v) trong dung môi A.
4.1.3. Phương pháp
Thủy phân protein
 Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 μL dung dịch acid
amin chuẩn chứa 2.5 μmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó làm khô dưới áp suất nhẹ trong
thiết bị cô đặc SpeedVac.
 Đặt những lọ thủy tinh mẫu trên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa 200 μL
dung dịch HCl 6N.
 Sục khí argon vào những lọ trên trong 5-15 phút rồi đậy nắp kín và không cho
không khí lọt vào.
 Ủ những lọ thủy tinh ở 110
o
C trong 24 giờ hoặc 150
o
C trong 2 giờ trong tủ ấm
khô.
 Chờ một thời gian cho quá trình thủy phân xảy ra xong, lấy những lọ thủy tinh
khỏi tủ ấm, làm nguội về nhiệt độ phòng và mở nắp từ từ.
 Lấy lọ thủy tinh nhỏ ở trong ra, lau khô bề mặt ngoài bằng giấy mềm rồi làm khô
ở áp suất nhỏ.
Phản ứng thu nhận dẫn xuất

 Thêm 50 μL hỗn hợp theo tỉ lệ triethylamine : methanol : nước = 1 : 1 : 2 vào lọ
đã làm khô rồi trộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô.
 Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM) bằng cách
cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone.
17

 Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào 100 μL
triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 μL dung dịch thuốc thử Marfey và trộn vortex
thật đều.
 Ủ lọ thủy tinh đó ở 40
o
C trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và tránh
ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra.
 Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 μL dung dịch HCl 2N. Khi này phản ứng kết thúc.
Làm khô hỗn hợp dưới áp suất nhỏ.
 Bảo quản hỗn hợp ở -20
o
C trong bóng tối cho đến khi sử dụng.
 Thêm vào mẫu đã làm khô 1mL dung dịch dimethyl sulfoxide (DMSO) 50% v/v.
Phân tích sắc ký
 Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng cao áp theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
 Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung môi B.
 Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với dung môi A
bằng cách thêm vào cột 20 μL (50-1000 pmol).
 Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2. Việc phân tích dẫn xuất
2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acid cysteic thu
được kết quả trong 120 phút (hình 4).

Bảng 4.1: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc thử

Marfey.
Thời gian (phút)
% Dung môi A
% Dung môi B
0
90
10
15
90
10
15,1
90
10
115
50
50
165
0
100
170
0
100

 Xác định những yếu tố ảnh hưởng đối với mỗi acid amin từ khu vực đỉnh của biểu
đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol.
 Khi quá trình phân tích sắc ký kết thúc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại khí
20% v/v để bảo quản. Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanol.

18

Hình 4.2: Sự tách dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amid của L-acid amin bằng
phương pháp HPLC. Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ lượng 20 μL hỗn hợp acid amin
chuẩn. Thiết bị: cột LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel); mẫu
chứa 100 pmol dẫn xuất của 18 L-acid amin; dung môi A chứa 13mM acid trifluoroacetic
cùng tetrahydrofuran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitrile 50% v/v trong dung
môi A; tốc độ chảy 1mL/phút; đầu dò bước sóng 340 nm; cột rửa giải với lượng dung môi B
trong dung môi A phù hợp. Dẫn xuất acid amin được biểu thị bằng những chữ cái, ví dụ acid
cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs. FFDA đặc trưng cho đỉnh của thuốc thử;
đỉnh không có ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ có liên quan, như được chỉ trong quá
trình chạy sắc phổ riêng lẻ trong thuốc thử riêng.
4.1.4 Chú ý
 Để phân tích acid amin khi acid này đóng vai trò là cơ chất hay sản phẩm trong
phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết. Thêm dung dịch acid
perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ 1M và ủ trên đá trong ít nhất 15 phút.
Khi thêm cùng một thể tích dung dịch KOH 2M ở trạng thái lạnh, acid perchloric chuyển
thành muối KClO
4
. Sau khi ly tâm 15 phút ở 4

o
C, ta thu chất nổi trên bề mặt, đem làm
khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất.
 Việc tách hoàn toàn dung dịch HCl ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản
ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey.
 Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng lượng acid amin không nên vượt quá tỉ lệ 3:1
 Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ
vàng sang cam rồi đỏ.
 Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng.
 Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi bảo quản
ở -20
o
C trong bóng tối. Trong dung dịch DMSO 50% v/v, dẫn xuất thu được sẽ ổn định
trong 72 giờ ở -4
o
C và hơn 6 tuần nếu bảo quản ở -20
o
C.
19

 Để quá trình đạt hiệu suất cao nên sử dụng thiết bị phun HPLC tự động.
 Cột phản ứng silicat C
8
từ những nhà sản xuất khác nhau sẽ cho kết quả của 19
dẫn xuất acid amin, tuy nhiên, khu vực dốc gradient của dung môi B nên tương tự cho
mỗi cột. Nếu tính thêm acid S-carboxymethyl-L-cysteine và tryptophan thì 2 acid này
tách riêng biệt trong sắc phổ riêng lẻ.
 Việc xác định mỗi đỉnh trên biểu đồ sắc phổ được thiết lập bằng việc thêm lượng
dư acid amin gấp 3 lần. Ô thuốc thử nên được chạy theo từng mẻ với thuốc thử Marfey để
xác định peak liên quan. Thuốc thử dư sẽ gây cản trở cho việc tách riêng peak của

arginine và glycine. Lysine và tyrosine được tách riêng như những dẫn xuất không thể
thay thế.

4.2.Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong
phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl
4.2.1. Giới thiệu
Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu UV thường
được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phương pháp
phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng. Dẫn xuất acid amin
phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC.
Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2 proline và hydroxy
proline. Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút chân không và tốn thời
gian để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại thuốc thử dư để tránh
nhiễu đối với đỉnh phân tích.
Mặc dù có những tiến bộ trong việc tìm thuốc thử cho thu nhận dẫn xuất vì những dẫn xuất
vẫn còn khuyết điểm, các nhà khoa học vẫn cần thuốc thử với những đặc điểm: đơn giản, nhạy,
ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò UV.
Dẫn xuất sử dụng trong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có
OPA (dansyl, dabsyl, 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPTC)). Với những dẫn xuất OPA, những
sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi vì OPA không phản
ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác nhân oxi hóa. Hơn nữa, dẫn xuất Dansyl được
hình trong bóng tối và không bền khi thời gian phản ứng kéo dài, dưới tác dụng của dung môi,
ánh sáng và bị nhiễu bởi những đỉnh song vì những sản phẩm phụ trong suốt quá trình dẫn xuất
hóa. Dẫn xuất dansyl, theo báo cáo thấy rằng nó liên kết với những hợp chất hóa học để tiêu diệt
vi khuẩn rất chặt chẽ. Nhược điểm của dẫn xuất này là sự vượt mức hàm lượng ure, muối
photphat, NH
4
NO
3
sẽ thay đổi pH đệm của phản ứng và gây cản trở cho quá trình.

Dẫn xuất hóa với 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPITC) tạo nên sự ổn định của dẫn xuất
NPITC – 1 chất rất phù hợp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò UV ở 254- 340 nm. Nhược điểm
của NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân không. Trong
trường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó. 1 thuốc thử dễ bay hơi
hơn trong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin tiêu chuẩn. BTC_acid
20

amin được phân tích bằng RP-HPLC và đầu dò UV phát hiện ở bước song 250nm. Thuốc thử
này cũng rất phù hợp trong phân tích acid amin trong thực phẩm.
Ưu điểm của BITC: dễ bay hơi, do đó giảm thời gian phân tích (vì những sản phẩm phụ và
thuốc thử dư dễ loại bỏ); khả năng tách dẫn xuất với cystine, cystein, PTC không có khả năng
này, những dẫn xuất acid amin bậc 2, proline, hydroxyproline cũng được dò thấy với độ nhạy
cảm rất cao. Nhưng asparagines và serine thì không thấy rõ và khả năng bền của dẫn xuất BTC ở
nhiệt độ phòng chỉ khoảng 8h.
BZTC có dạng tương tự BTC (ngoại trừ NPITC) được thu nhận dẫn xuất từ 22 acid amin
đối với BZTC thành công và những dẫn xuất này được tách ra hoàn toàn trong pha đảo của cột
Nova. Thuốc thử BZITC kém bay hơi hơn so với BITC nhưng khả năng bay hơi tương tự PITC.
Ưu điểm của dẫn xuất BZTC là đạt hiệu quả cao hơn trong phương pháp đảo pha so với dẫn xuất
PTC trong cùng điều kiện thí nghiệm.
4.2.2. Nguyên liệu-Thiết bị
Thiết bị
1. Máy hút chân không
2. Hệ thống phân phối dung môi Spectra-Physics 8800 cùng với hệ thống bài khí và ổn
định dung môi
3. Đầu dò bước song UV Spectra 200
4. Nova Pak C18
5. Thiết bị đun nóng dạng cột Eppendorf CH-30
Thuốc thử
1.BITC, BZITC, PITC (bảo quản ở 0-5
o

C)
2.Bolvine serum albumin (BSA), acid amin chuẩn, norleucine. Acid amin chuẩn bảo quản
ở nhiệt độ phòng còn BSA được giữ ở 2-8
o
C.
3.HPLC – grade acetonitrile, CH
3
OH, tetra hydrofuran (giữ ở nhiệt độ phòng)
4.Những thuốc thử khác
5.Mẫu thực phẩm
Dung dịch chuẩn
1. Dung dịch acid amin chuẩn: Trộn hỗn hợp acid amin chuẩn, ngoại trừ glutamine,
cystine, cysteine, được chuẩn bị ở nồng độ 2.5 µmol/mL trong dd HCl 0.01M. Dung
dịch chuẩn của glutamine và cysteine được chuẩn bị với nước.
2. Chuẩn bị dung dịch đệm: gồm hỗn hợp acetonitrile-methanol-triethylamine với tỉ lệ
10:5:2 chứa L-norleucine (nồng độ 2.5 µmol/mL) với vai trò như chất chuẩn bên
trong, được bảo quản ở 0-5
o
C và phải chuẩn bị lại sau khoảng thời gian rất ngắn.
4.2.3. Phương pháp
Quá trình thủy phân BSA và mẫu thực phẩm:
1. Cho BSA (4mg) và bột đậu nành đã nghiền hoặc mẫu trứng đã đồng hóa (0,2g) lần
lượt vào ống nghiệm 5ml và 25ml với nắp vặn có lỗ và màng ngăn.
2. Thêm 0,5ml và 15ml HCl 6M chứa 0,1% phenol vào ống nghiệm 5ml và 25ml, theo
thứ tự.
21

3. Sau khi vặn nắp chặt, đâm 2 kim tiêm bằng thép không rỉ qua màng ngăn.
4. Nối 1 kim ngập trong dung dịch với nitơ khô cung cấp, kim còn lại nối vào bơm chân
không.

5. Rút chân không bằng bơm chân không trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ vào.
6. Tháo kim nối với bơm chân không trước khi tháo kim nối với nitơ.
7. Cẩn thận tháo nắp có lỗ, thay bằng nắp không có lỗ vì những lỗ nhỏ có thể tạo thành
khi áp suất cao.
8. Thủy phân ở 145
o
C trong 4 giờ.
9. Làm khô bã BSA với nitơ ở 50
o
C, hòa tan với 5ml HCl 0,01M. Mẫu đã sẵn sàng cho
quá trình tạo dẫn xuất.
10. Lọc bã đậu nành và trứng, sấy với thiết bị sấy thùng quay. Hòa tan và điều chỉnh tới
50ml HCl 0.01M.
11. Dùng sắc ký trao đổi cation để làm sạch dung dịch thủy phân đậu nành và trứng.
12. Cho 5ml dung dịch thủy phân đi qua cột trao đổi cation 100 x 13 mm (Dowex 5 x 8)
với vận tốc 6 giọt/phút để giữ lại acid amin ở nhựa trao đổi ion.
13. Rửa cột nhiều lần với 20ml nước.
14. Tách rửa acid amin trên cột trao đổi cation với 40ml dung dịch ammonia 4M, tốc độ 6
giọt/phút.
15. Làm khô dung dịch đã tách rửa trong thiết bị sấy thùng quay ở 50
o
C, hòa tan bằng
dung dịch HCl 0,01M và điều chỉnh thể tích đến 50ml. Mẫu đã sẵn sàng cho quá trình
tạo dẫn xuất.




Hình 4.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị thủy phân

22


Hình 4.4: Sơ đồ dẫn khí N
2
vào thiết bị chứa mẫu

Quá trình tạo dẫn xuất
1. Cho 20µl hỗn hợp dung dịch acid amin chuẩn, 50µl dung dịch cystine chuẩn, và mẫu
thủy phân (BSA; 100µl, đậu nành; 500µl, trứng; 500µl) vào từng lọ nhỏ hình nón
2ml với 1 nắp đậy vặn có lỗ và một màng ngăn.
2. Làm khô dung dịch hoàn toàn với khí nitơ ở 50
o
C
3. Thêm vào một lượng thích hợp acetonitrile vào mỗi lọ và làm khô lần nữa.
4. Hòa tan bã trong 50µl dung dịch đệm.
5. Thêm vào 3ml BITC, BZITC, PITC vào mỗi dung dịch hòa tan trên để tạo dẫn xuất
BITC, BZITC, PTC.
6. Sau khi vặn nắp chặt, quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện ở 40
o
C trong 30 phút để
tạo dẫn xuất BTC và PTC, ở 50
o
C trong 30 phút để tạo dẫn xuất BZTC.
7. Sau khi tạo dẫn xuất, dùng 2 kim tiêm bằng thép không rỉ đâm xuyên qua màng ngăn
vào lọ. Nối một kim với nitơ cung cấp và 1 kim với bơm chân không.
8. Sục nitơ vào lọ, đồng thời rút chân không để hoàn thành quá trình làm khô ở nhiệt độ
phòng trong khoảng 10 phút đối với dẫn xuất BTC và khoảng 40 phút đối với dẫn

xuất BZTC và PTC.
9. Thêm 100µl acetonitrile vào lọ và làm khô dung dịch trong 5 phút với dẫn xuất BTC
và 30 phút với dẫn xuất BZTC và PTC.
10. Hòa tan bã của dẫn xuất BTC trong 1ml ammonium acetate 0,02M.
11. Hòa tan bã của dẫn xuất BZTC và PTC trong 1ml Na2HPO4 chứa 5% methanol và
1,5% tetrahydrofuran (pH 6,8, điều chỉnh với acid phosphoric.)
12. Lọc dung dịch bằng màng membrane 0,25µm.
13. Cho lần lượt từng 10µl dung dịch vào HPLC






23

Phép sắc ký
Hệ thống HPLC: Spectra-Physics 8800 hệ thống 3 dung dịch
Detector: Detector bước sóng cực tím phổ 200 có thể lập trình
Bước sóng 240 nm cho dẫn xuất BTC
để phát hiện: 246 nm cho dẫn xuất BZTC
254 nm cho dẫn xuất PTC
Cột Nova-Pak C
18
(300 x 3,9 id, 4µm dimethyloctadecylsilyl silica vô định hình,
nước). Nhiệt độ cho mọi cột dẫn xuất là 40
o
C với cột gia nhiệt Eppendorf
CH-30.
Dung môi Cho dẫn xuất BTC:

Dung dịch A: ammonium acetate 0,05M (pH 6,7, điều chỉnh với acid
phosphoric).
Dung dịch B: dung dịch natri phosphate 0,02M dibase chứa 5% methanol và
1.5% tetrahydrofuran-acetonitrile (50:50).
Dung dịch C: acetonitrile : nước = 70:30
Tỉ lệ dung môi:


A
B
C
Tốc độ chảy
0.0 phút
100 %
0 %
0 %
1 ml/phút
5.0 phút
85
15
0
1 ml/phút
14.0 phút
70
20
10
1 ml/phút
20.0 phút
60
20

20
1 ml/phút
25.0 phút
30
20
50
1 ml/phút
30.0 phút
10
20
70
1 ml/phút

Cho dẫn xuất BZTC và PTC:
Dung môi A: Na
2
HPO
4
0,02M chứa 5% methanol và 1.5% tetrahydrofuran
(pH 6,8, chỉnh với acid phosphoric.)
Dung môi B: dung môi A và acetonitrile (50:50)
Dung môi C: acetonitrile và nước (70:30)
Tỉ lệ dung môi:

A
B
C
Tốc độ chảy
0.0 phút
100 %

0 %
0 %
1 ml/phút
15.0 phút
76
20
4
1 ml/phút
20.0 phút
70
20
10
1 ml/phút
30.0 phút
50
30
20
1 ml/phút
40.0 phút
30
35
35
1 ml/phút


24

Sau đó thực hiện một bước rửa trong 20 phút với dung môi C để bảo vệ cột
không bị hỏng. Cả 2 loại tỉ lệ dung môi trên đều thích hợp cho mẫu dẫn xuất
acid amin và dẫn xuất acid amin chuẩn.

Độ nhạy của các dẫn xuất BTC, BZTC VÀ PTC
 Độ nhạy của các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC có thể phát hiện ở 0.05 aufs, đây
là mức giới hạn cho ranh giới bền vững với lượng nhỏ nhất.
 Cũng có thể xác định mối quan hệ tuyến tính bằng phép phân tích định lượng.
Độ bền của các dẫn xuất BTC và BZTC
Sự biến thiên của các đỉnh trong vùng phản ứng của các chất dẫn xuất BTC và BZTC với
nhiệt độ phòng trong thời gian lưu trữ có thể xác định được độ bền của các chất dẫn xuất BTC và
BZTC.
Phép phân tích thống kê
 Để xác định được khả năng tái sản xuất, tất cả các thí nghiệm đều phải được lập lại từ
3 lần trở lên.
 Độ lệch tương đối tiêu chuẩn ( RSDs) trên kết quả phân tử gam tương đối (RMR) có
thể được tính toán để so sánh về độ chính xác của các chất dẫn xuất .Sự tuyến tính của
các đồ thị định cỡ trong các dãy thích hợp cũng có thể được phát hiện bởi sự định rõ các
yếu tố thống kê quan trọng của hệ số tương quan (γ) của đồ thị định cỡ.
 Khả năng tái sản xuất và sự chính xác trên BSA và các mẫu thực phẩm cũng có thể
được so sánh với phương pháp dùng phép ghi sắc trao đổi ion và các dữ liệu từ những tài
liệu khác
4.2.4. Chú ý
1. Nếu sử dụng một bơm chân không mà không dùng nước, phải lắp đặt thiết bị để hấp
thu những chất phản ứng còn dư thừa bay hơi và những sản phẩm phụ sinh ra trong
suốt quá trình chuyển hóa bởi vì bơm chân không sẽ trở nên vô dụng khi có mặt các
vật chất bay hơi.
2. Những chất phản ứng này dường như rất bền trong nhiều năm nếu không bị mở ra ,
nhưng khi nắp của chúng được mở ra nhiều lần ,những chất phản ứng này chỉ được sử
dụng trong 6 lần cho dù chúng được bảo quản ở -20ºC. Tất cả các chất phản ứng này
đều rất độc và có hại.
3. Những dung dịch chuẩn của glutamine và cysteine thường được chuẩn bị với nước
bởi vì trong quá trình lưu trữ kéo dài các acid amin này trong dung dịch HCl, sẽ xảy
ra sự biến đổi thành pyroglutamic acid và cystine theo thứ tự lần lượt như trên.

4. Đối với chất dẫn xuất BZTC dành cho tiêu chuẩn bên trong của mẫu, L-norleucine
không nên sử dụng.
5. Khi cung cấp khí nitơ khô, phải kết nối ống để hấp thu tất cả các hơi ẩm như được chỉ
ra trong hình 2. Ống chứa muối Na
2
SO
4
khan phải được thay đổi định kỳ từ 1 đến 2
lần.
6. Khi nắp có 1 lỗ trở thành nắp không còn lỗ, thì bạn phải cẩn thận vì vách ngăn không
thể tháo ra được.
25

7. Phải thật cẩn thận, không để mẫu, dung dịch rửa và dung dịch tách rửa rơi vào bề mặt
chất dẻo dung để trao đổi cation trong cột.
8. Tốc độ của các giọt dung dịch rửa trong suốt quá trình rửa không quan trọng.
9. Khi phân tích với sắc ký trao đổi ion và phương pháp chuyển hóa ninhydrin, phải làm
khô dung dịch mẫu trong các máy bay hơi quay. Hòa tan lại lần nữa trong chất đệm
citrate Na 0.2 M (pH = 2.2) và đưa vào máy phân tích mino acid tự động.( LKB 4150
alpha , cột trao đổi cation Ultrapac 11)
10. Do tác động đồng thời của acetonitrile bốc hơi ,phần còn lại của nước sẽ được làm
khô hoàn toàn .
11. Các phản ứng hóa học của các chất dẫn xuất BTC và BZTC diễn ra như sau:

12. Quang phổ UV của hỗn hợp acid amin BTC và BITC, sự hợp lại của 2 chất phản ứng
được chỉ ra trong hình 5. λmax của acid amin BTC vào khoảng 234 nm, nhưng bước
sóng có tác dụng mạnh nhất vào khoảng 250 nm, nó có thể tránh được sự hấp thu phổ
của các tạp chất và chất điện phân, ammonium acetate trong dung môi
13. Phổ UV của hỗn hợp acid amin BZTC và hỗn hợp acid amin TC khi hoà tan trong
dung dịch NaH
2
PO
4
0.02 M được chỉ ra trong hình 6. Những bước sóng cho khả năng
hấp thu mạnh nhất là 220 nm và 238 nm trong dẫn xuất BZTC; 215 nm và 270 nm
trong dẫn xuất PTC.Nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất là 246 nm trong dẫn
xuất BZTC và 254 nm trong dẫn xuất PTC, để tránh được sự nhiễu của phổ hấp thu
các tạp chất, chất điện phân và có thể thấy được một ranh giới bền vững.
14. Sắc phổ acid amin chuẩn của các chất dẫn xuất BTC và BZTC khi so sánh với chất
dẫn xuất PTC được tách riêng trong cột Nova Pak C
18
được chỉ rõ trong hình 7.Tất cả
22 acid amin chuẩn được chuyển hóa với các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC và
được phân giải trong cột lưu trữ C
18

.