CÁC PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC




TIỂU LUẬN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ



Đề tài:
CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƢ LƢỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN




GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy
HV: Nguyễn Thị Bích Duyên
MSHV: 13050181
Lớp: Cao học 2013


TP. Hồ Chí Minh - 2013
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i
MỞ ĐẦU v
Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL 1
1.1 Tính chất hóa lí 2
1.2 Nguồn gốc: 2
1.3 Phân bố 2
1.4 Cơ chế kháng khuẩn 3
1.5 Tác dụng và tác hại: 3
1.5.1 Tác dụng 3
1.5.2 Tác hại 3
1.6 Tiêu chuẩn 4
Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY
SẢN 5
2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ CAP
trong thủy sản 6
2.2 Sắc kí lỏng (LC) 7
2.2.1 LC/APCI/MS
[3]
7
2.2.1.1Chuẩn bị mấu 7
2.2.1.2 Cài đặt thiết bị 7
2.2.1.3 Kết quả 8
2.2.2 LC/MS/MS
[7]
8
2.2.2.1Thiết bị: 8
2.2.2.2 Điều kiện phân tích: 8
2.2.2.3 Kết quả: 9
2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)

[2]
10
2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 10
2.2.3.2 Điều kiện thiết bị 11
2.2.3.3 Kết quả: 12
2.3 Sắc kí khí (GC) 15
2.3.1 GC/MS/MS
[1]
16
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



ii
2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 16
2.3.1.2 Thông số 17
2.3.1.3 Kết quả 18
2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa
[4]
: 19
2.4.1 Tóm tắt quy trình 19
2.4.2 Kết quả: 20
2.4.3 Kết luận 24
2.4.4 Ƣu và nhƣợc điểm 24
KẾT LUẬN 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



iii
Danh mục hình ảnh
Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử CAP 2

Hình 2. 1: Kết quả phân tích CAP 8
Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb) 9
Hình 2. 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP 10
Hình 2. 4: Phân tích CAP (5 ng/mL) 12
Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn
chiết của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157). 13
Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL. 14
Hình 2. 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ

0.1 đến 200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R
2
= 0.9997 14
Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu 16
Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z
304, (2) m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430 18
Hình 2. 10: Xác định CAP 18
Danh mục bảng biểu
Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP 4

Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong
thủy sản 6
Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC-MS
2
17
Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS
2
17
Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu 19
Bảng 2. 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả
20

Biểu đồ 2. 1: Mẫu tôm 21
Biểu đồ 2. 2: Cá fillet 22
Biểu đồ 2. 3: Mẫu nhuyễn thể 22
Biểu đồ 2. 4: Mẫu ghẹ, cua 22
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên




iv
Biểu đồ 2. 5: Mẫu thủy sản tẩm bột 23
Biểu đồ 2. 6: Mẫu chả giò, há cảo 23
Biểu đồ 2. 7: Mẫu đồ khô 23
Ký hiệu
ACPI: atmospheric pressure chemical ionization
ECD: đầu dò cộng kết điện tử
ESI: ion electronspray
ESI (-): negative ion electronspray
GC: sắc kí khí
LC: sắc kí lỏng
LOD: giới hạn phát hiện
MS: khối phổ


Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



v








MỞ ĐẦU

Chloramphenicol (CAP) có đặc tính kháng khuẩn nên thƣờng đƣợc sử dụng
để chữa bệnh trong tôm và đƣợc sử dụng trực tiếp để bảo quản nguyên liệu. Tuy
nhiên, việc sử dụng CAP không đúng cách gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và tích
tụ trong thủy sản gây nên những nguy hiểm cho sức khỏe con ngƣời. Hiện nay, ở
Việt Nam đã có nhiều loài thủy hải sản đã bị cảnh báo và cấm xuất khẩu do sử
dụng CAP quá liều lƣợng.
Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại
cho ngƣời tiêu dùng.
Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phƣơng pháp xác định
hàm lƣợng Chlorophenicol trong thủy sản”



Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



1

Chƣơng 1
TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



2
1.1 Tính chất hóa lí
CAP có tên khoa học là: 2,2-dicholoro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-
(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)ethyl] acetamide.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử CAP
Công thức phân tử: C
11
H
12
Cl
2
N
2
O
5
CAP là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng với tinh thể hình kim hoặc
phiến dài, không mùi, vị rất đắng. Tính tan: tan tốt trong những dung môi phân cực
nhƣ cồn 96%, propylen gylocol, rất dễ tan trong aceton và ethylacetat, khó tan
trong nƣớc. Độ bền: dung dịch CAP bền vững trong môi trƣờng hơi acid hay trung
tính, bền vững với nhiệt độ (chịu nhiệt đến 100
0
C)

1.2 Nguồn gốc:
Năm 1947 Burlcholder đã phát hiện ra CAP từ môi trƣờng nuôi cấy xạ
khuẩn có tên là Streptomyces Veneduela. Chỉ hai năm sau ngƣời ta đã tổng hợp
đƣợc kháng sinh này. Dƣới tác động của của quá trình chuyển hóa, CAP có thể
chuyển hóa thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng
D-glucuronide. Gần 90% lƣợng CAP sẽ bài tiết bằng đƣờng niệu dƣới dạng chuyển
hóa, 15% bài tiết dƣới dạng ban đầu.
1.3 Phân bố
CAP đƣợc phân bố rộng khắp trong cơ thể từ tim, gan, phổi thận, lá lách,
huyết thanh, huyết tƣơng đến dịch màng phổi, dịch cổ trƣớng, tinh dịch, nƣớc bọt,
nƣớc tiểu. Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ
thể. CAP cũng rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bện hoăc thêm
vào thức ăn gia súc sẽ tồn dƣ trong thịt, sữa, trứng.
Khi thải vào môi trƣờng, CAP hiện diện dƣới dạng thể khí là chủ yếu. CAP
phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất
lắng sinh học sống trong nƣớc. Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao nhƣng nó
không bốc hơi, kể cá đất khô lẫn đất ẩm. Dƣới tác động phân giải của vi sinh vật,
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



3
CAP có thể bị phân giải trong đất và nƣớc. CAP cũng bị phân giải bởi các vi sinh
vật đƣờng ruột theo đƣờng phân hủy thành gốc amine. Sự hấp thu và bài tiết: CAP
đƣợc hấp thu qua hệ tiêu hóa, và đƣợc đƣợc bài tiết chủ yếu qua thận.
1.4 Cơ chế kháng khuẩn
CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của
Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp đƣợc protein
dẫn đến yếu đi và chết. Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S
nên sẽ bị ảnh hƣởng. Điều này lý giải độc tính cao của CAP.

1.5 Tác dụng và tác hại:
1.5.1 Tác dụng
CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và
một số loại virut. CAP có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Peniciline và
Steptomycine, diệt đƣợc nhiều loai vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm, xoắn khuẩn
Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Peniciline và Streptomycine.
Ở ngƣời, CAP đƣợc dùng để chữa thƣơng hàn, viêm não, ít đƣợc dùng cho
các trƣờng hợp khác do độc tính cao. Ngoài ra, CAP còn đƣợc bổ sung vào thuốc
mỡ bôi mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt nhƣ viêm kết mạc, viêm giác mạc
hoặc có trong thành phần thuốc mỡ bôi cục bộ để điều trị vết thƣơng ngoài da và
tai. Đôi khi CAP đƣợc điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch
trị các bệnh.
Trong thú y, CAP đƣợc cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho
vào môi trƣờng sống để chữa bệnh.
Tuy nhiên, do có một số hiệu ứng phụ không mong muốn nên việc ứng
dụng CAP trong điều trị có xu hƣớng giảm dần.
1.5.2 Tác hại
Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chƣa đào thải sẽ tồn dƣ
sang sản phẩm thực phẩm và một lƣợng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và
lắng động vào môi trƣờng, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh
thái. Vì CAP có thể tồn tại lâu trong thực phẩm, khi thƣờng xuyên sử dụng thực
phẩm này, con ngƣời có thể gặp những nguy cơ nhƣ: hệ sinh vật cũng nhƣ quá
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



4
trình tổng hợp vitamin ở ruột bị thay đổi làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc.
Do đó muốn tiêu diệt đƣợc cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến
ngƣời bị nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn. Ngoài ra, CAP đi vào

cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra triệu chứng xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong
(do chƣa có đủ men gan để khử CAP); suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xƣơng dẫn
đến thiếu máu, có thể dẫn đến tử vong; có thể tƣơng tác với AND, ARN dẫn đến
những sai lệch về di truyền; gây bạch cầu, giảm hồng cầu, sự thay đổi thành phần
máu xảy ra nếu hàm lƣợng CAP trong máu lớn hơn 25µg/ml; gây viêm lƣỡi, miệng
do thiếu vitamin B2 và PP, bồn nôn, ói, tiêu chảy.
Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại
cho ngƣời tiêu dùng.
1.6 Tiêu chuẩn
Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP
Kháng sinh
Kí hiệu
Giới hạn phát hiện tối thiểu
EU
Mỹ
Nhật
Chloramphenicol
CAP
0.3 ppb
0.3 ppb
0.5 ppb

Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



5

Chƣơng 2
CÁC PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY SẢN
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



6
2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ
CAP trong thủy sản
Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản

Phƣơng pháp
Thực phẩm nền
LOD (µg/kg)
Tham khảo
LC-MS
Một số loài thủy sản
0.1
Van de Riet (1992)

GC-ECD
Tôm
1
Munns (1994)
LC-MS/MS ESI (-)
Tôm
<0.5
Pfenning (2002b)
LC-MS/MS
Tôm
0.08
Neuhaus (2002)
GC-ECD
Tôm
0.05
Ngoc Son (2002)
GC(NCI)-MS
Tôm
0.3

LC-MS/MS APCI (-)
Tôm
0.1

GC-MS/MS
Tôm
0.1
Impens (2003)
LC-MS/MS (ESI)
Tôm, cua

0.1
Storey (2003)

Sự phát triển của đầu dò ion hóa áp suất khí quyển (atmospheric pressure
ionization - API) kết hợp với HPLC đã trở thành kĩ thuật đáng tin cậy và phổ biến
nhất trong phân tích lƣợng dƣ CAP. Sự kết hợp này của sắc kí lỏng và khối phổ
(LC-MS) có thể định tính và định lƣợng những hợp chất phân cực không bay hơi
(nhƣ CAP) mà không cần đồng phân hóa.
Neuhaus và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp LC-MS/MS với LOD
0.08 µg/kg và LOQ 0.3 µg/kg trong tôm. Mottier và những cộng sự đã phát triển
phƣơng pháp dùng LC(ESI)-MS/MS cho thủy sản với giá trị LOD và LOD tƣơng
ứng là 0.003 µg/kg và 0.01 µg/kg.
Impens và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp sàn lọc bằng ELISA và
xác định dƣ lƣợng CAP bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS cả hai kĩ thuật đều cho
LOD là 0.1 µg/kg.
Ngày nay, GC-MS và LC-MS/MS là kĩ thuật đáng tin cậy nhất để xác định
dƣ lƣợng CAP trong thủy sản nói riêng và trong mô động vật nói chung.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



7
2.2 Sắc kí lỏng (LC)
2.2.1 LC/APCI/MS
[3]

2.2.1.1Chuẩn bị mấu
1. Cân 5 g thịt cá và 5 g sodium sulfate
2. Thêm 10 mL ethyl acetate
3. Đồng nhất trong 20 giây

4. Ly tâm mẫu trong 5 phút tại 6000 rpm
5. Tách cặn và lặp lại bƣớc 2 đến 4
6. Kết hợp 2 dung dịch chiết từ ethyl acetate và sấy khô với rotovap tại 40
0
C
7. Hoàn nguyên với 1 mL acetonitrile, thêm 1 mL, lắc và loại bỏ lớp hexane
8. Thêm 1 mL hexane khác, lắc và loại bỏ lớp hexane
9. Sấy khô acetonitrile và hoàn nguyên với 10% acetonitrile trong 10mM
ammonium acetate
10. Lọc vào lọ đựng mẫu tự động
2.2.1.2 Cài đặt thiết bị
* Điều kiện LC
Cột: Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 3x 150 mm, 5 µm
Dung môi A: Nƣớc với 10 mM ammonium acetate
Dung môi B: Methanol
Gradient: 90/10 A/B 15 phút đến 70/30A/B
Nhiệt độ cột: 40
0
C
Thể tích mẫu: 20 µL
Tốc độ dòng: 0.5 mL/phút
* Điều kiện MSD
Ion hóa: APPI (Negative)
Chế độ quét: 100-400 m/z cho sự tối ƣu hóa
SIM ion: 321 m/z (M-H)
-
Nhiệt độ hóa hơi: 350
0
C
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên


8
2.2.1.3 Kết quả

Hình 2. 1: Kết quả phân tích CAP
2.2.2 LC/MS/MS
[7]

2.2.2.1Thiết bị:
Hệ thống máy LC/MS/MS gồm thiết bị sắc ký lỏng (Dionex Ultimate 3000)
kết nối với đầu dò khối phổ ba tứ cực (Bioapplied System Qtrap 4000); bộ bơm
mẫu tự động; cột sắc ký pha đảo Phenomenex Aqua 5u C18 125A, 50x2mm và cột
bảo vệ pha đảo Phenomenex.
2.2.2.2 Điều kiện phân tích:
* Điều kiện HPLC:
Cột sắc ký Phenomenex Aqua 5u C18 125A, 50x2 mm
Tốc độ dòng: 0,35 - 0,4 ml/phút
Pha động: A (H
2
O): B (MeOH) theo chƣơng trình gradient
Nhiệt độ cột: 25
0
C
Thể tích bơm mẫu: 20 µL.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên




9
* Điều kiện đầu dò MS/MS:
Nguồn tạo ion Turbo Spray
Kiểu tạo ion âm, kiểu scan: MRM
Điện thế ion hóa: 4200V
Nhiệt độ ống mao quản: 500
0
C
2.2.2.3 Kết quả:
* Định lượng CAP dựa trên phân mảnh ion:
CAP đƣợc xác nhận dựa trên phân ion phân tử m/z=321; hai ion xác nhận
m/z = 151,9 và m/z=256,9; và chúng đƣợc định lƣợng dựa trên m/z = 151,9.
 Đường chuẩn định lượng CAP
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên 6 điểm chuẩn với các nồng độ chuẩn
0.1 ppb; 0.2 ppb; 0.3 ppb; 0.4 ppb; 0.5 ppb; 1 ppb.

Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb)
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



10

Hình 2. 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP
Phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 23596 x + 1270.2; đƣờng chuẩn có hệ số
tƣơng quan R
2
= 0.9939; giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là 0.03 ng/g, hiệu
suất thu hồi của phƣơng pháp 87.93 – 116.80 %
2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)

[2]

2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu
Mẫu tôm đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:
1. Đồng nhất mẫu: 100 g tôm đƣợc rã đông, thêm nƣớc và xay bằng máy xay
sinh tố
2. Cân 5 g mẫu tôm đã đƣợc đồng nhất cho và ống polypropylene 15 mL
3. Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn CAP –d5 (ISTD) và khuấy trộn kỹ để
đảm bảo sự phân bố đồng đều của ISTD trong mẫu.
4. Thêm 2 mL nƣớc và khuấy trôn kỹ
5. Thêm 5 mL ethyl acetate. Cho vào ống để khuấy cơ và khuấy kĩ khoảng 30
phút
6. Ly tâm ở 7000 rpm trong 15 phút
7. Chuyển phần nổi trên bề mặt vào ống polypropylene 15 mL
8. Thêm 5 mL Ethyl acetate vào tissue pellet ở bƣớc 7 và lập lại quy trình
chiết.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



11
9. Sấy bã dƣới khí N
2
ở 55
0
C
10. Hoàn nguyên với 300 µL methanol và pha loãng thành 10 mL với nƣớc.
Tại thời điểm này, mẫu đã sẵn sàng để chiết pha rắn (SPE)
2.2.3.2 Điều kiện thiết bị
* SPE

Cartridge: Strata – X
Điều kiện: 3 mL Methanol (1-2 mL/phút)
Cân bằng: 3 mL nƣớc (1-2 mL)
Nạp: Trích 10mL mẫu mô tôm (1 mL/phút)
Rửa: 3 x 1 mL nƣớc
Sấy: >10’’ Hg trong 5-10 phút để loại bỏ lƣợng nƣớc dƣ
Chiết: 3 x 1.0 mL Ethyl acetate (1mL/phút)
Dry down: khí N
2
ở 55
0
C
Hoàn nguyên: 500 µL Acetonitrile/ nƣớc (20:8)
* Điều kiện LC-MS/MS
Cột: Kinetex 2.6 µm C18, 50 x 2.1 mm
Pha động: A: 5mM Ammonium bicarbonate, B: Acetonitrile
Gradient:
Time B (%)
0.00 5
2.00 5
2.01 95
4.50 95
Tốc độ dòng: 0.4 mL/phút
Thể tích tiêm: 0.4 mL/phút
Nhiệt độ: 25
0
C
Mẫu: 1. CAP, 2 CAP-d5
Đầu dò: API 4000~ MS/MS, ESI-
Chế độ quét: MRM

Nhiệt độ: 45
0

Mẫu: 1. Chloramphenicol
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



12
2. Chloramphenicol-d5
2.2.3.3 Kết quả:
Việc sử dụng kỹ thuật Kinetex ® cho phép việc rửa giải rất nhanh của CAP
ở 2.15 phút (hình 2.4). Trong chế độ ESI, CAP đƣợc phát hiện bằng việc quan sát
sự chuyển đổi khối lƣợng 321.2/152 và chất nội chuẩn CAP-d5 bằng việc quan sát
sự chuyển đổi khối lƣợng 326.0/157.0. Sự chuyển đổi khối lƣợng 321.2/152 đƣợc
chọn cho việc định lƣợng bởi vì m/z 152 cho cƣờng độ ion sản phẩm mạnh nhất. sự
chuyển đổi khối lƣợng 321.2/257.2 cung cấp sản phẩm ion lớn thứ 2 và đƣợc chọn
cho việc xác nhận.

Hình 2. 4: Phân tích CAP
Một đỉnh tạp chất, tách tại 3.0 phút, đƣợc thu trong các mẫu tôm chiết xuất
nhƣng đƣợc tách ra một cách dễ dàng với peak CAP (hình 2.5). Sự hiện diện của
peak tạp chất tƣơng tự đã đƣợc báo cáo trƣớc đây bởi USFDA
6
. Tuy nhiên, với kĩ
thuật vỏ-lõi Kinetex và những điều kiện sử dụng ở đây, tạp chất đƣợc tách tốt và
không nhiễu vào lƣợng CAP. Một lợi ích khác so với phƣơng pháp USFDA là thời
gian chu kì LC ngắn hơn một cách đáng kể (4.5 phút so với 20.5 phút), cho phép
tăng đáng kể công suất và hiệu suất.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên


13

Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiết
của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157).

Mũi tạp chất tách tại 3.0 phút đƣợc tách tốt khỏi CAP và không ảnh hƣởng
đến việc định lƣợng. 0.1 ng/g CAP trong tôm dùng ống Strata-X SPE và cột
Kinetex C18 LC
Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn đƣợc dựng trong khoảng nồng độ từ 0.1
ng/mL đến 200 ng/mL bằng cách vẽ tƣơng đối (diện tích mũi của CAP/ diện tích
mũi của IS) so với nồng độ. Khoảng nồng độ này tƣơng ứng từ 0.1 ng/g – 20 ng/g
(0.01 – 20 ppb) trong mô tôm. Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn thì tuyến tính
trong khoảng hiệu chuẩn với giá trị của R
2
= 0.9998 (hình 2.6). Tại mức nông độ
tiêu chuẩn thấp nhất (0.1 ng/mL) tín hiệu nhiễu là 115.9 (hình 2.5), vì vậy giới hạn
định lƣợng (LOQ) đƣợc ƣớc lƣợng là ≤ 0.01 ng/mL, điều này tƣơng ứng từ ≤ 0.001
ng/g trong tôm hoặc ≤ 0.001 ppb.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



14

Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL.
Ion định lƣợng đƣợc dùng là 321.2/152. Phƣơng trình tuyến tính y =
0.2663x + 0.2169 với R

2
= 0.9998

Hình 2. 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0.1 đến
200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R
2
= 0.9997
Kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp này thì tốt hơn so với những phƣơng pháp
đƣợc cháp nhận hiện nay bởi USFDA do LOQ là 0.001 ng/g (0.3 ppb) và LOD là
0.08 ng/g (0.08 ppb). Dựa trên đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn, phƣơng pháp
này cung cấp LOQ 0.001 ng/g (0.001 ppb) thấp hơn 300 lần so với báo cáo từ
những phƣơng pháp của USFDA.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



15
2.3 Sắc kí khí (GC)
Sự hiện diện của những nhóm chức phân cực trong phân tử CAP đòi hỏi cần
có 1 giai đoạn đồng phân hóa, thƣờng là thông qua phản ứng sylic hóa trƣớc khi
phân tích sắc kí khí. Việc đính thêm những nhóm chức đặc trƣng trên phân tử CAP
có thể làm giảm LOD của đầu dò ECD và MS. Phản ứng sylic hóa thƣờng đƣợc
xúc tác bởi axit hoặc bazơ. Những tác chất thƣờng đƣợc dùng để sylic hóa bao
gồm:
- Hỗn hợp của hexamethyldisilazane (HMDS), trimethylchlorosilane
(TMCS) và pyridine
- N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (BSTFA)
- Hỗn hợp của BSTFA và TMCS
- N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (NSTFA)
Đầu dò ECD đƣợc sử dụng rộng rãi để phân tích CAP. Phƣơng pháp GC-

ECD cho phân tích CAP trong cơ tôm có LOD là 1 µg/kg (Munns, 1994)
GC kết hợp với MS, những kĩ thuật ion hóa thông dụng nhất là ion hóa hóa học
(CI) và electron impact (EI)
Ion hóa hóa học âm (NCI) cho số lƣợng mảnh vỡ ít. Tuy nhiên, ion phân tử
luôn nằm trong vùng phổ. Nhờ sự hiện diện của hai nguyên tử Chlorine trong phân
tử CAP, GC-MS trong NCI là một trong những kĩ thuật đáng tin cậy nhất, nó cũng
là phƣơng pháp thông dụng nhất cho việc xác định lƣợng dƣ của CAP. GC-MS
trong EI là chế độ ít nhạy nhất. Tuy nhiên, nó tạo phổ của những phân mảnh, vì
vậy có thể lƣu trữ dữ liệu điện tử cho mục đích tham khảo.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



16
2.3.1 GC/MS/MS
[1]

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Phân tích GC-MS
2

Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu
Bên cạnh phát hiện với MS trong chế độ EI, CAP cũng có thể đƣợc xác định
bằng cách dung kĩ thuật ion hóa mềm NCI. Bởi vì nguyên tử Cl trong cấu trúc
phân tử, dẫn đến việc làm giảm giới hạn phát hiện so với việc cùng EI
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên




17

2.3.1.2 Thông số

Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC-MS
2

Thông số
GC
Chia dòng/ không chia dòng (chế độ không chia dòng)
Nhiệt độ
Tốc độ chia
Van chia đóng tại
Van chia mở tại
Chương trình nhiệt độ GC
Nhiệt độ ban đầu
Đoạn 1
Đoạn 2
Khí mang
Dòng cột

260
0
C
60 ml min
-1

-0,10 min
1.00 min

90
0
C (giữ 1 phút)
280
0
C (20
0
C min
-1
)
280
0
C (giữ 15 phút)
Helium
0.91 ml min
-1



Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS
2

Thông số
GCQ plus
Nhiệt độ nguồn ion
Nhiệt độ chuyển dòng
Khí tinh khiết (ion hóa hóa học âm)
Dòng khí tinh khiết
200
0

C
275
0
C
Methane
0.3 ml min
-1


Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên



18
2.3.1.3 Kết quả

Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z 304, (2)
m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430
Sau khi đồng phân hóa với MSTFA thành Chloramphicol-trimethylsilyl
ether (CAP-TMS) và hòa tan trong Toluene, giới hạn phát hiện là 0.005 ng µl
-1
có
tỷ lệ tín hiệu/nhiễu nhỏ nhất và bằng 3. Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS
đƣợc giải thích trong khối phổ, nhƣ hình 2.9.

Hình 2. 10: Xác định CAP
Mặc dù thời gian đồng phân hóa không phải rất quan trọng, nhƣng kết quả
tối ƣu thu đƣợc sau 90 phút. Thật quan trọng để phân tích mẫu trong vòng 24 giờ
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên


19
sau khi đồng phân hóa. Bởi vì TMS ether dễ bay hơi, sự bay hơi của MSTFA sau
khi đồng phân hóa rất quan trọng và không kéo dài hơn 8 phút. Khi phân tích trong
chế độ quét toàn bộ GC-MS
2
m/z 304, 322, 358, 394 và 340 đặc trƣng cho CAP
2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa
[4]
:
Phƣơng pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể
(Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) là một công cụ hiệu quả cho
mục đích thử nghiệm sàn lọc. Tuy nhiên, có những yêu cầu khắt khe về LOD và độ
không đảm bảo đo và các tỷ lệ dƣơng tính giả và âm tính giả của xét nghiệm.
2.4.1 Tóm tắt quy trình
Kít thử ELISA: Kít thử của các hang R-Biopharm và TAPB
Quy trình chuẩn bị mẫu: Dƣ lƣợng CAP trong 3 g mẫu đƣợc trích ly bằng 6
mL ethyl acetate. Dịch chiết đƣợc cô đến khô ở 50
0
C dƣới dòng N
2
. Cặn khô đƣợc
hòa tan trong 1 mL đệm và làm sạch bằng 1 mL hexan. Hàm lƣợng CAP trong dịch
chiết đƣợc phân tích với kít thử ELISA
Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu

Quy trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lƣợng CAP trong
dịch chiết trên ELISA tuân thủ theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử
nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dƣơng để kiểm soát chất lƣợng

kết quả thử
Giới hạn phát hiện: 0.1ppb