CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATONXIN
TRONG THỰC PHẨM

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2014
NHẬN XÉT
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………

…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
…………………………………………………………………………
…
……………………………………………………………
4
MỞ ĐẦU
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên
lương thực và thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bản vệ sức khỏe con người và vật nuôi.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và aspergillus paraciticus tạo ra, là
độc tố nguyên hiễm nhất và thường nhiễm trong nông sản, gây độc cho người và gia súc, như
gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan ( ung thư gan…), gây quái thai , gây dột biến,…
Thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự
nhiện thì aflatoxin B1 được coi là nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của aspergillus flavus
không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng

cũng có thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin.
ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao,
thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch phơi
sấy nông sản kém, kho chứ không đảm bảo khô ráo thoáng mát, là điều kiện thuận lợi cho
nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là yêu cầu cần thiết và quan trọng. Giới hạn về
mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Để có
cái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con người cũng như
các loại động vật và các phương pháp phân tích để phát hiện và phòng tránh việc nhiễm
aflatoxin nên em đã chọn đề tài “ các phương pháp phân tích Aflatoxin trong thực phẩm”
Do kiến thức và thời gian hạn chế, các thông tin trong bài tiểu luận chủ yếu lấy từ các
trang web nên bài tiểu luận này không tránh khỏi những sai sót, mong thầy thông cảm và
đóng góp ý kiến cho bài của em được hoàn thiện hơn.
5
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin.
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn
10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “ bệnh gà tây”. Sau đó các loại gia cầm khác như
vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh
có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta đã
tìm ra độc tố hóa học của độc chất này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2.
Giữa 4 loại trên thì B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ
độc nhanh nhất và phổ biến nhất.
Năm 1961 các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin tạo ra bởi nấm
Aspergillus flavus va có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật. Trên động vật
thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley
và các cộng sự.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. Các nhà khoa học cũng
đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin.

1.2. Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin.
Aflatoxin được tạo ra bởi hai loại nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu và
môi trường.
Một số loại nấm mốc khác cũng có khả năng sinh ra Aflatoxin với lượng rất ít như loài:
penicillium puberulum Bai, các chủng loại thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariitika,
Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper…
Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavus
thường lẫn với nhiều loại nấm khác, đặc biệt là với penicillium rubrum stoll và khi đó có thể
nhầm Aflatoxin là do penicillium sản sinh ra.
Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Stergmatoxistin và Avecsin
vì có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin.
6
Aspergillus parasiticus Aspergillus flavus
1.3. Điều kiện sản sinh độc tố Aflatoxin.
Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus rất
khác nahu. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố
nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường.
1.3.1. Chủng sinh độc tố.
Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khả sát đều sản sinh ra Aflatoxin,
chỉ có 73% có thể sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh Aflatoxin ở mức độ cao nhất.
Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy theo chất từ đó đã phân lập các
chủng Aspergillus và tùy theo nguồn gốc địa lý. Chẳng hạn người ta đã thấy trong số 284 mẫu
phân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số chúng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ
lạc cũng tại nước này và chỉ có 71% với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen.
Ngoài ra, lượng Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo chủng.
Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng
phần của các Aflatoxin khác nhau đã biết. Nói chung Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất cả
trong thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là Aflatoxin B2, còn

Aflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp.
Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái:
chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả các giống cấy lâu ngày( thể bình
hai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai). Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đóqua
nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng chủng độc của chúng
tăng lên khi cấy truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp.
7
1.3.2. Cơ chất và môi trường
Cơ chất là các hạt có dầu, dặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa
trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hay
phomat ô nhiễm tự nhiên thường không có hoặc có rất ít độc tố. Ngược lại gần 1/3 số chủng
phân lập từ các gia vị có khả năng sinh sản Aflatoxin.
Ngay cả trên cùng một cơ chất khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng Aspergillus
flavus cũng khác nhau. Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có
tính kháng với Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở
phát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin. Đây là hướng nghiên
cứu của nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ Aflatoxin theo một cách có lợi nhất.
Sự hình thành Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển, khối
lượng sợ nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian để sản sinh
Aflatoxin cực đại thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi. Lý do của sự giảm
lượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân
nấm mốc.
Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25
o
C -28
o
C.
Nếu nuôi cấy Aspergillus flavus ở 45
o
C thì khả năng sản sinh Aflatoxin bị hạn chế.

Hàm lượng trong cơ chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành Aflatoxin.
Ở lạc nhân, lượng nước từ 15-30% thì sự hình thành Aflatoxin sau 2 ngày, trền gạo cần lượng
nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%. Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rất
nhanh. Đặc biệt là sau thu hoạch, cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gain làm khô kéo
dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin.
Độ pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin, dù nó là
bao nhiêu thì lúc nào cũng có xu hướng quy về trị số giữa 4 và 5.
Nguồn carbon: người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexoza vào
môi trường nuôi cấy lên sản lượng Aflatoxin của Aspergillus và kết luận rằng các đường
glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin.
8
Gluxit
Nồng độ
1% 3%
D glucose +++ +++
D manose +++ +++
D fructose +++ +++
D galactose - ++
D gulose - 0
D arabinose - -
D ribose - +
D eritrose - 0
D
glyxerandehyt +++ +++
D xilose + ++
Nguồn đạm: trên môi trường có đạm Nitrite, Aspergillus flavus tiết ra ít Aflatoxin, môi
trường có đạm amoniac, axit uric và axit glutamic, Aspergillus flavus sản sinh ra nhiều hơn, vì
vậy trong công thức cổ điển của Czapeck, NaNO
3
được thay thế bằng NH

4
Cl hay một muối
amoni khác. Lượng Aflatoxin cao nhất trên môi trường có nấm men hay có pepton hoặc tốt
hơn nữa là có các axit amin. Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích sự tổng hợp các
Aflatoxin, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng.
Các ion kim loại: sự có mặt của Zn, Mg hay Fe kích thích khả năng sản sinh Aflatoxin,
Co, Cr, Mn, Ca có ít hiệu lực.
Các chất khác; khi Aspergillus flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ở
giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ. Ngoài ra người ta còn thấy việc thêm
lipid ( chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì đã loại bỏ lipid có
hiệu quả tốt đến sản sinh Aflatoxin. Ảnh hưởng có lợi của các axit béo đến việc hình thành
độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng
trong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin, việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình
thành các tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin. Thêm
Dimetylsunfoxit (DMSO) vào môi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lên
chút ít hoặc giảm sút rất nhiều. Ở đây có le4la2 một tác dộng chuyển hóa qua lại hơn là một
phản ứng hóa học giữa DMSo với các Aflatoxin.
9
1.4. Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin.
1.4.1. cấu trúc hóa học.
Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã tìm thấy
khoảng 18 loại Aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợp
chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất bởi nấm Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B
1
, B
2
, G
1
, G

2
.bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu
phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue và G là viết tắt của Green. Các sắc kí lớp
mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom:metanol (98.5 :1.5) được tách bằng hệ
thống clorofrom:carbon tetraclorua:nước:metanol(2:2.5:1:3) đã phát hiện 2 vết huỳnh quang
dưới ánh sáng tử ngoại, một vết huỳnh quang xanh tím, đó là Aflatoxin B
1
, một vết khác có Rf
thấp hơn và huỳnh quang màu lục, đó là Aflatoxin G
1
, Aflatoxin G
1
có cấu trúc gần giống
Aflatoxin B
1
, nó có 2 chức lacton, còn Aflatoxin B
1
chỉ có một. Bằng cách khử nối đôi cách
trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B
1
và G
1
ta thu được hai sản phẩm độc
khác là Aflatoxin B
2
và Aflatoxin G
2
. So với Aflatoxin B
1
, độc tố của chúng đối với vịt con

kém hơn từ 60 đến 100 lần, như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có khả năng mất hidrat
chuyển thành Aflatoxin B
1
rất độc.
Aflatoxin B
1
, B
2
trong sửa bò chuyển hóa và gọi là Aflatoxin M
1
và Aflatoxin M
2
( M là
viết tắt của milk). Aflatoxin M
1
có huỳnh quang xanh màu tím, Aflatoxin M
2
có Rf thấp hơn
và huỳnh quang màu tím. Aflatoxin M
1
là hidroxi-4 Aflatoxin B
1
, và Aflatoxin M
2
là hidroxi –
4 Aflatoxin B
2
.
Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B
1

thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp
theo là G
1
, trong khi đó B
2
và G
2
tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
10
Ngoài 6 loại Aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại Aflatoxin khác,
người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin.
- Aflatoxin P
1
: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất của fenolic của Aflatoxin B
1
. Người ta
đã phân lập được chúng trên ambeclit XAD – 2( Rohm và Haas). Trọng lượng phân tử của nó,
xác định bằng khối phổ là 2.8. Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của Aflatoxin B
1
.
- Aflatoxin 3B và toxin B
3
: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy Aspergillus flavus,
dạng tinh thể, màu vàng kim độ độc kém Aflatoxin B
1
từ 40 đến 50 lần.
- Aflatoxin B
3
( được subblefield và đồng sự thành lập) còn gọi là porositicol. Nhân xiclopenten
tận cùng của Aflatoxin B

1
được thay thế bằng một chuỗi bên etanol, do đó chất này là 6 –
metoxi – 7 – (2 – hidroxictyl) difurocumarin.
1.4.2. Tính chất vật lý.
Các Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng tia cực tím sóng dài. Điều này cho phép
các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp ( 0.5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc kí bản mỏng).
Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý về việc phát
hiện và định lượng. Nồng độ Aflatoxin M
1
0.02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng.
Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến diểm nóng chảy, khi được làm
nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia
cực tím ở phía sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao.
Các Aflatoxin trong các dung môi cloroform và benzen bền vững trong nhiều năm nếu đươc
giữ trong chổ tối và lạnh. Các Aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện nấu bình
thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu
hủy Aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định.
Các Aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform, metanol
và đặc biệt ở dimetylsulfoit ( dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp
11
dụng các Aflatoxin vào các động vật thực nghiệm). Tính tan của Aflatoxin trong nước dao
động từ 10 – 20 mg/l.
1.4.3. Tính chất hóa học.
Sự có mặt của các vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy
phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực
phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có
mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm
là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu.

Công

thức nguyên tử
Trọng
lượng phân
tử
Điể
m nóng
chảy
H
uỳnh
quang
AFlatoxi
n B
1
C
17
H
12
O
6
312
268 -
269
X
anh
lam
AFlatoxi
n B
2
C
17

H
14
O
6
314
286 -
289
X
anh
lam
AFlatoxi
n G
1
C
17
H
12
O
7
328
244
-246
X
anh
lục
AFlatoxi
n G
2
C
17

H
14
O
7
330
229 -
231
X
anh
lục
AFlatoxi
n M
1
C
17
H
12
O
7
328 299
X
anh
tím
AFlatoxi
n M
2
C
17
H
14

O
7
330 293
X
anh
tím
Bảng: Tính chất hóa lý chủ yếu của các Aflatoxin
ở nhiệt độ cao ( khoảng 100
o
C) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng có thể
tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm.
12
Khi có các axit vô cơ và bổ sung nước, Aflatoxin B
1
và G
1
chuyển hóa thành Aflatoxin
B
2
A và G
2
A. Các sản phẩm cộng hợp tương tự của Aflatoxin B
1
và G
1
cũng được hình thành
với clorua axit formic thionyl, clorua axit axetic và axit thionyl trifluoroacetic.
Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine,
hydrogen peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân tử
Aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang.

Sự hydro hóa Aflatoxin B
1
và B
2
sinh ra Aflatoxin G
1
và G
2
tương ứng. Sự khử
Aflatoxin B
1
bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin. Khử Aflatoxin B
1
và B
2
bằng
natriborohydride tạo ra RB
1
và RB
2
tương ứng. hiện tượng đó là kết quả của việc mở vòng
lacton bởi sự khử nhóm axit và nhóm xeton ở vòng cyclopenten.
1.4.4. Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin.
Allcrofl và camaghan là những người đầu tiên nhận thấy nếu cho bò sữa ăn khô lạc có
nhiều Aflatoxin, thì sữa của chúng có độc với vịt con một ngày tuổi. Qua phân tích người ta
phát hiện ra các chất độc chỉ gồm những vết Aflatoxin B
1
, chủ yếu là các dẫn xuất Aflatoxin
M
1

và M
2
. Một lượng rất ít Aflatoxin đó đã được phát hiện trong các giống nuôi cấy
Aspergillus flavus trên lạc và trên nhiều cơ thể khác. Để chắc chắn rằng các Aflatoxin M
trong sữa là những sản phẩm chuyển hóa của Aflatoxin ăn vào, người ta cho chuột cái đang
cho con bú uống Aflatoxin B
1
và đã tìm thấy Aflatoxin M trong sữa. Aflatoxin M
1
còn được
tìm thấy trong sữa dê, mật chuột, gan chuột, phân và nước tiểu bò cái và cừu, máu, nước tiểu,
mật, thận thỏ con, trong nước tiểu người ăn bơ dầu lạc có nhiễm khuẩn.
Việc chuyển hóa các Aflatoxin diễn ra rất nhanh. Nếu cho bò cái ăn một lượng duy nhất
( 0.5 mg/kg) hỗn hợp các Aflatoxin B
1
: 44%, G
1
:44%, B
2
:2% và phân tích đều đặn sữa, người
ta thấy 85% lượng Aflatoxin phát hiện trong sữa và nước tiểu được bài tiết ra trong vòng 48
giờ, 4 ngày sau trong sữa và 6 ngày sau trong nước tiểu, phân không phát hiện một vết bào
nào nữa. Trong sữa chỉ có Aflatoxin M
1
và lượng chất này chỉ chiếm 0.35% lượng Aflatoxin
B
1
ăn phải. Mặt khác, nếu cho 67 đến 200mg Aflatoxin B
1
vào khẩu phần hàng tuần của bò

cái, người ta thấy có 0.07 đến 0.15 mg/kg Aflatoxin M
1
trong sữa đã đông khô.
Ở các động vật không vú, sự chuyển hóa Aflatoxin B
1
chủ yếu là sự hidroxyl hóa, đồng
thời mất nhóm metyl, cuối cùng đưa đến những sản phẩm như Aflatoxin B
1
tìm thấy trong
nước tiểu.
Nếu cho chuột ăn các Aflatoxin B
1
và G
1
, phân tích nước tiểu của chúng thấy nhân
cumarin vẫn còn nguyên vẹn, phân tử bị thoái biến do mở nhân furan, hình thành một mạch
bên thẳng tận cùng bởi một nhóm andehyt. Nhóm này sẽ tự oxi hóa khi bài tiết ra.
13
1.5. Độc tính của Aflatoxin
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính ( liều gây chết người khoảng 10mg), độc tố Aflatoxin
còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Aflatoxin là một trong những chất gan
ung thư gan mạnh nhất, nếu hấp thụ một lượng 2.5 mg Aflatoxin trong thời gian ngắn
( khoảng 3 tháng) có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm.
Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:
- Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác.
- Ức chế lên hệ miễn dịch.
- Ăn mòn thành ruột và dạ dày.
- Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết.
- Gây ung thư gan ở người và gia súc.
Như vậy, Aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật.

nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan.
14
CHƯƠNG 2 : NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA AFLATOXIN
2.1. Cơ chế tác động của Aflatoxin
Aflatoxin B
1
là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp nên dễ
dàng được hấp thu hoàn toàn sau khi ăn.
Khi đến ruột non, Aflatoxin B
1
sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch vào ruột
non tá tràng.
Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, Aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất( chiếm
khoảng 17% lượng Aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80% bị
bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó còn bài tiết qua tuyến sữa gây
bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ. Chu kì bán rã trong huyết tương là 36.5 phút, lượng phân
phối là 14 % trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1.25 Aflatoxin M
1
chủ
yếu bài tiết trong vòng 48 giờ.
Cho đến nay, các luận chứng khoa học đã công nhận khả năng tác động lên tế bào gan
của Aflatoxin trải qua 5 giai đoạn sau:
- ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và RNA.
- Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA.
- Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin.
- Biến đổi hình dạng nhân tế bào.
- Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein.
→ Hậu quả là gây ưng thư biểu mô tế bào gan.
Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro-furan nên Aflatoxin B
1

liên kết với một số
enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong.
Tại gan, Aflatoxin B
1
(AFB
1
)được chuyển hóa bởi nhóm enzym cytochrome p450 ( ở
người p450 III A4 đối với người lớn và p450 III A6 đối với thai nhi) tạo thành sản phẩm
chuyển hóa như Aflatoxicol, Aflatoxin Q
1
, Aflatoxin P
1
, và Aflatoxin M
1
, tùy thuộc vào
khuynh hướng di chuyển của loài. Đối với con người, phần lớn Aflatoxin B
1
chuyển hóa thành
AFQ
1
, ngoài ra còn có AFM
1
, Aflatoxicol (AFL), AFLH
1
, AFP
1
, AFB
2a
, và AFB
1-2

, 2-
dihydrodiol.
Enzym cytochrome P450 IIIA4 vừa kích hoạt vừa giải độc AFB
1
qua quá trình trao đổi
chất, các sản phẩm tạo thành bao gồm chất chuyển hóa độc hại (epoxit) từ epoxidation và chất
15
chuyển hóa ít độc hại từ hydroxy và demethylation. Chỉ có 8,9 – exo epoxide gây đột biến còn
những sản phẩm khác đều là những sản phẩm giải độc.
Dưới sự xúc tác của enzym glutathione-S-transferase, liên hợp của epoxit và glutathione
(GSh, một tripetide nội sinh được tổng hợp từ tế bào bằng 3 amin: cysteine, glutamic và
glycine, gắn kết với các độc chất trong gan, chuyển hóa chúng và đào thải ra ngoài) được tạo
thành, làm giảm sự biến đổi DNA do epoxit gây ra, con người có ít glutathione-S-transferase
hoạt động đối với liên kết 8,9-epoxit hơn so với chuột, vì thế con người ít có khả năng giải
độc chất chuyển hóa quan trọng này.
Các epoxit AFB
1
có thể phản ứng với nito hạt nhân, các nguyên tử khác có thành phần
oxy và lưu huỳnh trong tế bào ( Guengeerich và các cộng sự 1996). Chất hoạt động mạnh này
cco1 thể kết hợp với các thành phần của DNA cụ thể là guanine để tạo ra sự biến đổi trong
DNA ( Hendrickse 1991). Đây có thể là sản phẩm quan trọng nhất gây bệnh ung thư.
Các đồng phân exo của Aflatoxin B
1
(AFB
1
) 8,9-epoxit gây đột biến bằng cách xen giữa
DNA vì hình thành một sản phẩm cộng hợp với guanine do phản ứng với các nguyên tử
7
N
của guanine. Mặc dù các epoxit thủy phân nhanh trong H

2
O ( 0.6 s
-1
ở 25
o
C), nhưng các sản
phẩm cộng hợp DNA vẫn rất cao.
Trong cơ thể con người, AFB
1
chuyển hóa chủ yếu thành sản phẩm cộng hợp Aflatoxin
B
1
-N
7
guanin. Sự đan xen các epoxit gây ra sự chuyển G thành T ở codon 249 của gen p53
trong gan (AGG → AGT: Arg →Ser), có thể dẫn đến tổn thương và ung thư gan.
Ngoài ra trong quá trình tuần hoàn, Aflatoxin B
1
còn được gắn với các protein huyết
tương đặc biệt là albumin để tạo thành Aflatoxinalbumin ( Autrup và cộng sự năm 1991). Các
AFB
1
8,9 – exo epoxit sau khi thủy phân tạo thành AFB
1
– dihydrodiol sẽ oxy hóa liên tiếp
dialdehyde và ngưng tụ với nhóm S-amin của lysine. Sản phẩm cộng hợp này là một cấu trúc
protein- Aflatoxin hoàn toàn thay đổi chỉ giữ lại các coumarin và vòng cyclopen-tenone của
16
hợp chất ban đầu. Các chu kì bán rã trung bình cuaa3 albumin ở người là 20 ngày. Do đó,
Aflatoxin sẽ tích lũy lâu dài khi có albumin.

Đối với các cơ quan khác trong cơ thể, Aflatoxin ảnh hưởng đến các chuỗi vận chuyển
điện tử can thiệp vào hệ thống cytochrome- làm giảm ATP, ức chế ATP và ngăn cản sản xuất
năng lượng tế bào.
Ngoài ra, việc tăng AFB
1
– 8,9 epoxit làm tăng đáng kể lượng lipid peroxide. Peoroxy
hóa lipid màng tế bào làm mất tính trọn vẹn của màng tế bào, giới hạn hoạt động của enzym
và lý giải màng tế bào.
AFM
1
và AFG
1
hình thành glucoronide hoặc liên hợp sulphate được bài tiết trong nước
tiểu. Sản phẩm cộng hợp với DNA và Afb
1
-N7-guanine cũng được bài tiết trong nước tiểu,
Aflatoxin M
1
và M
2
được bài tiết trong sữa. Liên hợp AFB
1
-glutathione được bài tiết chủ yếu
qua mật.
Aflatoxin B
1
có độc tính gần tương đương Aflatoxin M
1
. Aflatoxin M
2

ít độc hơn
Aflatoxin M
1
. Các Aflatoxin B
2
và G
2
có độc tính kém hơn nhiều so với Aflatoxin B
1
. Người
ta còn nhận thấy rằng khi không có nối đôi dihydrofuran ở đầu cùng thì độc tính giảm đi
khoảng 4.5 lần, độc tính cũng giảm khi có dạng lacton kép.
2.2. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên thực vật
Aflatoxin xâm hại màng tế bào và chất gắn nội bào, các ribosome biến mất, gia tăng các
thể lưới và túi golgi, lưới nội chất cuốn lại, hình thành các tiểu tế bào, các bản mỏng và hạt
bền trong lục lạp biến dạng.
Tác dụng sinh lý học của Aflatoxin lên thực vật bậc cao, ức chế sinh trưởng, ức chế sự
tổng hợp chất diệp lục,…có những trường hợp Aflatoxin B
1
tác động như một chất hiệp trợ
của axit indolinaxetic, nhưng những dẫn xuất của cumarin và những lacton chưa no khác.
Chẳng hạn thêm 0.02 đến 200µg/l Aflatoxin B
1
thì thúc đẩy tác động của 100µg/l A.I.A ( axit
indoaxetic) ở cây đậu Pisum sativum. Ở thuốc lá và cà chua cũng vậy. Nếu như Aflatoxin B
1
ức chế sự sao chép AND thể ty lạp thì nó lại hầu như không làm biến đổi sự tổng hợp của các
protein trong mô thực vật bậc cao, nó không có tác dụng lên hoạt tính của trietylen
triophotphoamit.
Aflatoxin B

1
ức chế sự tổng hợp α-amilaza và lipaza do axit giberelic đưa vào trong các
hạt đại mạch và hạt bông đang nảy mầm.
17
2.3. Ảnh hưởng của các Aflatoxin lên động vật.
2.3.1. Tác dụng cấp tính.
Nhiễm độc cấp tính thường biểu hiện bằng cái chết của động vật với những triệu chứng
thường gặp là hoại tử nhu mo gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp.
Dấu hiệu nhiễm độc đặc trưng nhất chỉ xuất hiện vài ngày trước khi chết. Các con vật
buồn bã, lảo đảo, một số có triệu chứng thần kinh: co giật cơ, động tác thiếu phối hợp và thân
ưỡn ngửa. Lúc chết con vật duỗi thẳng chân.
Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan thường là do Aflatoxin B
1
, B
2
, G
1
, G
2
, trong
đó độc tính mạnh nhất là B
1
, sau đó đến G
1
, rồi đến B
2
và sau cùng là G
2
. Bên cạnh gan, các
cơ quan khác như phổi, thận, mạc treo, túi mật…cũng bị tổn thương ít nhiều.

2.3.2. Tác dụng mãn tính.
Gia súc phải ăn thức ăn nhiễm Aflatoxin ở nồng độ thấp trong thời gian kéo dài thì độc
tố này sẽ tích lũy ở một số cơ quan trong cơ thể như gan, thận, từ đó gây nhiễm độc gan, xuất
huyết đường tiêu hóa, ung thư gan. Nó làm giảm thấp tỉ lệ nuôi sống, giảm sư sinh trưởng, sức
sản xuất của động vật, giảm độ cứng chắc của xương, gây biến dạng bộ phận xương. Khi
nhiễm Aflatoxin thường giảm sức đề kháng của động vật, làm giảm lượng sữa ở bò. Một số
loại mẫn cảm với Aflatoxin như chuột, vịt, cá khi bị nhiễm độc mãn tính thường dẫn đến ung
thư, gây quái thai.
2.4. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên con người.
Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư nguyên phát tăng ở
những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với Aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của Aflatoxin như
thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi. Tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của Aflatoxin B
1
với AND
của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm
thấy trong máu ngoại vi, trong máu nhau thai, máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với
Aflatoxin B
1
. Bên cạnh đó có liên quan đến sự phơi nhiễm Aflatoxin B
1
với sự đột biến gen ở
các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53, một gen kiễm soát sự chết tế bào
theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế
bào sẽ chuyển thành ác tính.
Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến dị tật thai nhi hoặc quái thai,
nặng có thể chết non thai nhi.
18
Nhiều nghiên cứu tại các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế giới đã cho thấy,
nồng độ Aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biến ung thư gan ở vùng đó.
Nói chung các chất này tá động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử nhu mô

gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho để nhằm chống đỡ tạm thời, rồi
tiến đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ gây ung thư gan. Nhưng bản chất của Aflatoxin
không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc
vào sự tồn tại của nhân dihydrofuran phần 5 lacton chứa nó, do đó phần nối đôi tận cùng
difuran quan trọng trong tính độc và gây độc. chính vì vậy mà Aflatoxin B
1
bao giờ cũng gây
ung thư mạnh hơn B
2
và G
2
( do B
2
không có nối đôi nên kém độc hơn).
Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, Aflatoxin B
1
hay HBV
(viết tắt của hepatitis B virus- virut loại B) có khả năng liên kết lại với nhau, gây ung thư gan
60 lần cao hơn HBV riêng lẻ. HBV cản trở tế bào gan chuyển hóa độc tố Aflatoxin. Phức hợp
Aflatoxin M – DNA ở lâu trong gan lại làm tăng khả năng hủy hoại gen ức chế khối u, như
p53. Chính vì thế việc đồng phơi nhiễm HBV trong thời kì tiếp xúc với Aflatoxin sẽ làm nguy
cơ mắc bệnh ung thư gan tăng lên rất nhiều.
19
CHƯƠNG III: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
AFLATOXIN
3.1. Phát hiện bằng con đường lý – hóa học.
Ta có thẩ nhận biết sự có mặt Aflatoxin một cách dễ dàng nhờ một số tính chất của
chúng:
- Khử nitrat bạc amoniac, molipdat và natri tungstat.
- Trong môi trường pecloric, tạo với cacbonzon thành hợp chất cộng có màu tím

đặc trưng, cũng chức năng này phản ứng yếu với vanilin trong môi trường xút
38%.
- Ngưng tụ với phenol trong môi trường sunfuric và acid sunfuric cũng có hình
dè quạt.
- Dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm.
- Phản ứng với di-O-anizidin- tetrazolium clorua để tạo thành các hợp chất
xanh- tím với các aflatoxin B
1
, B
2
và nâu với Aflatoxin G
2
.
3.1.1. Chiết xuất và tinh chế nước chiết
Phần lớn các phương pháp chiết xuất và tinh chế đều dựa trên tính chất của Aflatoxin
tan trong một số dung môi hữu cơ như cloroform, metanol, etanol, axeton, benzen . và không
tan trong một số dung môi béo như hexan, ete dầu hỏa, ete etylic…
3.1.2. Tách bằng sắc ký.
 Sắc ký giấy
Việc tách bằng sắc ký đầu tiên được thực hiện trên sắc ký giấy và triển khai bằng
hệ thống benzen: toluen: xiclohexan: etanol: nước. các phương pháp được
khuyên dùng là những phương pháp cổ điển, dùng 2 hệ thống dung môi.
- Hệ thống 1 gồm butanol : axit acetic: nước (20: 19: 1)
- Hệ thống 2 gồm cloroform: metanol (95:5)
Với hệ thống 1, việc làm bão hòa thùng sắc ký với pha ướt và triễn khai thực hiện
với pha tren ở nhiệt độ 24
0
C. sắc ký chạy 20 giờ trên băng giấy Whatmann số 1,
kích thước 550 x 30 mm. Vết sắc ký ở cách gốc băng giấy 60mm, cách tầm dung
môi bắt đầu lan 30 mm.

Với hệ thống 2, việc làm bão hòa và chạy sắc ký thực hiện với cùng một pha và
lần lượt kéo dài 1 giờ và 3 giờ 30 phút. Hệ thống dung môi này được sử dụng
nhiều.
Dù là hệ thống nào người ta cũng sấy ở 100
0
C trong vòng 20 phút.
20
 Sắc ký cột : phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh Aflatoxin có trong
mẫu. phương pháp này đơn giản, ít tốn kém chỉ xác định định tính. Kĩ thuật nhồi
cột mini bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và
20cm chiều dài. Loại sắc ký này thường được sử dụng. Tùy theo trường hợp mà
người ta dùng:
- Cột alumin
- Cột gel silic với chất tách là cloroform và 5% hỗn hợp metanol – cloroform.
- Cột axit silixic với chất tách là hỗn hợp cloroform : etanol (99:1).
- Cột xenluloza với chất tách là hỗn hợp hexan: cloroform (1:1)
 Sắc ký lớp mỏng : đây là là phương pháp được dùng thường xuyên nhất. có thể
triển khai trong nhiều hỗn hợp khác nhau, thông thường nhất là:
- Cloroform: metanol (99:1), (98: 2), (97 : 3), (95 : 5), (93 : 7)
- Cloroform : axeton ( 90 : 10), ( 85 : 15).
- Cloroform : axeton : etanol ( 89 : 10 : 1).
- Metanol : nước : ete ( 3 : 1: 96)
- Benzen : etanol : nước (46 : 35 :19).
Thời gian triển khai thay đổi từ 45 phút hay 2 đến 3 giờ. Người ta thường khuyên nên
hoạt hóa bằng nhiệt vì việc chuyển dịch dung môi ở nhiệt độ thấp chậm hơn. Rỏ ràng là Rf
của các Aflatoxin khác nhau biến đổi tùy theo điều kiện làm sắc ký.
Đối với sắc ký lớp mỏng, người ta thường dùng alumin, bột xenluloza hoặc gel poliamit
làm giả.
Một điểm rất quan trọng nữa là các lớp mỏng phải thật sự bão hòa trước trong bình, nơi
sắc ký sẽ triển khai. Sự bão hòa này phải đủ lâu để được hoàn toàn, nhưng không được kéo

dài quá vì có thể gây ra những nhiễu loạn quan trọng trong việc chuyển dịch các thành phần
cấu tạo của các mẫu.
Giá đỡ sắc ký thường là những tấm kính 200 x 200 mm, nhưng những phương pháp đơn
giản hóa khuyên dùng những phiến kính thường để làm tiêu bản hiển vi (26 x 76 mm) hay
những giá đỡ mềm như tấm phim.
Khi làm sắc ký, một số hợp chất có thể tương tự Aflatoxin, để tránh xác định nhầm, nên
sử dụng một hệ thống 2 chiều. Hệ thống này giúp dễ thấy sự khác biệt giữa các Aflatoxin B
1
và G
1
(do có trị số Rf thường gần nhau).
Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu
và các vết của độc tố chuẩn số có sự sai lệch kết quả từ 20-30%.
Phương pháp đo mật độ huỳnh quang trên máy Fluroclensytometer có nhiều tiến bộ
hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường. Tuy nhiên có nhiều phòng thí nghiệm hiện
21
đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều
khi sử dụng qua máy Densitometer.
Hội hóa học phân tích ( A.O.A.C -1980) đã lưu ý đến phương pháp phân tích dịnh lượng
sử dụng TLC. Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức
nghiên cứu ưng thư thế giới. các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự
chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao.
Hiện có 4 phương pháp phân tích TLC phổ biến nhất là CB( contiamintion Branch), BF
(the beft food), EFC (the eropean economic community) và Pon’s ( Pons methods) . Phương
pháp CB có nhiều ưu điểm hơn cả và thường xuyên được sử dụng. Tuy nhiên phương pháp
CB dắt tiền và sử dụng quá nhiều dung môi để phân tích. Phương pháp BF có tính thực tế hơn
nhiều, dễ làm và tiêu thụ ít dung môi, dung môi sử dụng là nước và metanol ít độc hơn
chloroform. Phương pháp Pon’s có nhiều ưu điểm, sử dụng là dung môi aceton và nước , dung
môi này không hòa tan mỡ.
Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với Aflatoxin, dẫn đến sự khẳng

định sai lệch. Phương pháp khẳng dịnh sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản
sắc ký. Dựa vào sự biến đổi của Aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so
với huỳnh quang ban đầu cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển
sang cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân
tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa
học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận.
Aflatoxin B
1
được axit hóa để trở thành đồng phân Aflatoxin B
2
. Đồng phân này có màu
huỳnh quang màu xanh và có độ dài R
f
thấp hơn so với độ chuyển thành Aflatoxin B
2
nhờ axit
Tryloacetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trên dung môi chạy. axit
sunfuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanhda trời của Aflatoxin B
1
thành màu vàng. Thử
nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của Aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển
thành màu vàng.
3.2. các phương pháp định lượng.
Mặc dù các quy trình luôn luôn thay đổi, nhưng các bước cơ bản vẫn giữ nguyên, bao
gồm: chiết xuất, loại trừ mỡ, làm sạch, phân tích và định lượng.
sự phối hợp các kĩ thuật chiết xuất lỏng và dẫn đến phương pháp được sử dụng rộng
rãi nhất ngày nay là phương pháp CB ( contamination branch) của Epp;ey. Phương pháp BF
(best food) nhanh và kinh tế hơn, nhưng làm sạch kém hơn cũng đã được triển khai. Việc định
22
tính và định lượng các Aflatoxin có thể thực hiện bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng

hiệu cao năng (HPLC) và ELISA.
3.2.1. Sắc ký lỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatography- HPTLC)
Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như
chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục
cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động , cải thiện được sự đồng
nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát.
Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí
và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess.
Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 microlits so với 5-10µl mẫu trong
phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). nồng độ chất
chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03 µg)
Aflatoxin B
1
ở củ lạc.
Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một
phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất.
3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( high ferformane liquid chromatorgaphy-
HPLC)
Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn
lọc dùng định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả 2 pha: pha bình thường và pha
phản.
Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang.
Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua
silicagel pha bình thường sử dụng cột nhồi silicagel 0.5 µm và pha động sử dụng benzen:
acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định 0.5µm/kg.
Hust (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các
Aflatoxin B
1
, B
2

, G
1
, G
2
ở nồng độ 5pg.
Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của
Aflatoxin B
1
. Kết quả phát triển phương pháp đồng phân cột.
23
3.3. Xét nghiệm ở người.
Hiện tại có 2 phương pháp thường được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm Aflatoxin
ở người. Phương pháp đầu tiên là tính lượng phức AFB
1
-guanine trong nước tiểu. sự có mặc
của các phân tử nhỏ hơn chỉ ra rằng có sự tồn tại Aflatoxin trong vòng 24 giờ. Tuy nhiên
phương pháp này dựa trên thời gian bán hủy của sự chuyển hóa, mức độ AFB
1
-guanine tính
được có thể thay đổi theo từng ngày, vì vậy nó chắc chắn không phải là phương pháp tốt để
xác định hàm lượng Aflatoxin đối với sự phơi nhiễm trong thời gian dài. Một phương pháp
khác là tính lượng phức AFB
1
-alumin trong huyết thanh. Cách tiếp cận này tính được lượng
Aflatoxin phơi nhiễm sau thời gian vài tuần đến vài tháng.
KẾT LUẬN
Aflatoxin là độc tố do nấm mốc sinh ra. Tron đó có họ Aflatoxin thì có độc tố Aflatoxin
B
1
, B

2
, G
1
, G
2
là phổ biến. Aflatoxin B
1
xuất hiện chủ yếu và là chất có độc tính cao nhất.
Aflatoxin là những chất có khả năng gây ung thư. Aflatoxin khi vào trong cơ thể người có thể
làm giảm sức đề kháng, gây tổn thương gan hoặc ung thư gan.
24
Qua các phương pháp nghiên cứu trên cho thấy việc kiểm tra Aflatoxin trong thực phẩm
là việc cần thiết nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
phương pháp phân tích Aflatoxin được chấp nhận trên toàn thế giới là phương pháp sắc kí
lỏng hiệu hiệu năng cao. Phương pháp sắc kí bản mỏng được dùng nhiều trong phòng thí
nghiệm.
Hiện nay các quá trình phân tích Aflatoxin trong mẫu thực phẩm đang được sử dụng tại
các trung tâm y tế dự phòng ở nước ta phải qua nhiều giai đoạn từ khấu chiết tách và làm sạch
mẫu. Do phải qua nhiều giai đoạn nên việc định tính và định lượng Aflatoxin dễ bị sai số lớn
và tốn nhiều thời gian.
Qua phương pháp nghiên cứu cho thấy có 80% số mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
mặc dầu
hàm lượng nằm trong giớ hạn cho phép (10ppb). Phương pháp chiết tách trên cột chiết pha
rắn về:
- Độ nhạy hiệu suất thu hồi giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
- Giá thành rẽ hơn vì sử dụng dung môi ít
- Ít độc hơn và không gây ô nhiễm môi trường.
- Thời gian ngắn.
- Phù hợp với các trung tâm y tế dự phòng tuyến tính, các cơ quan xuất khẩu

nông sản thực phẩm.
ở nước ta quy định về hàm lượng Aflatoxin tối đa cho phép ở thực phẩm cho người là
5ng/g (ppb) đối với Aflatoxin B
1
và 10ng/g đối với Aflatoxin tổng số
đối với trẻ em không được phép có Aflatoxin.
ở việt nam các phương pháp phân tích độc tố Aflatoxin đã được sử dụng rộng rãi như
phương pháp bản mỏng, phương pháp sắc kí lỏng cao áp…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Moreau Claude, Đặng Hồng Miên(dịch), “ Nấm Mốc Độc Trong Thực Phẩm” NXB khoa
học kỹ thuật, 1980.
[2]. Viện công nghệ sinh học và thực phẩm- Trường đại học công nghiệp thành phố hồ chí
minh,” An Toàn Và Vệ Sinh Thực Phẩm” NXB đại học công nghiệp tp. HCM, 2008.
25