CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT HỌ NITROFURAN TRONG MẬT ONG

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
MÔN: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
Tiểu luận:
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT HỌ NITROFURAN
TRONG MẬT ONG

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013.
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1 Các định nghĩa 2
1.2 Ảnh hưởng đến sức khoẻ 3
1.3 Các tiêu chuẩn quy định đối với nitrofuran 3
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH
NHÓM NITROFURAN TRONG MẬT ONG 4
2.1 Phương pháp ELISA 5
2.2 Phương pháp New Charm II 9
2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò ESI 10
2.4 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò DAD (Diode
Array Detector) 19
2.5 Phương pháp phân tích dòng chảy dùng chất nhạy quang FI-CL 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
2
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Các định nghĩa
a) Mật ong

Mật ong là chất ngọt tự nhiên được lấy từ ong mật hút mật hoá của cây ăn quả, rất tốt
cho sức khoẻ [1].
b) Thuốc kháng sinh
Kháng sinh là thuốc bảo vệ cho người và động vật, có tác dụng ức chế sự phát triển
hoặc tiêu diệt vi sinh vật như vi khuẩn, nấm hay sinh vật đơn bào.
Có hơn 250 loại thuốc kháng sinh khác nhau được đăng ký trong y học, thú y [1b].
c) Thuốc kháng sinh họ nitrofuran
Kháng sinh họ nitrofuran là một nhóm kháng sinh và kháng khuẩn tổng hợp nhằm
chống lại vi khuẩn E.coli [2] trong công thức có chứa vòng furan và nhóm 5-nitro.
d) Thuốc kháng sinh trong mật ong
Ong mật dễ bị nhiễm các bệnh từ vi sinh vật, vi khuẩn, vi rút, nên người ta sử dụng
thuốc kháng sinh nhằm tăng năng suất, bảo vệ và điều trị bệnh cho ong mật.
Dư lượng thuốc kháng sinh được phát hiện trong sản phẩm mật ong thuộc nhóm A6
[3] gồm
- Sulfonamides: Sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamethaxazole, sulfanilamide
- Aminoglycosides: Streptomycine
- Tetracyclines: Oxytetracycline, Chlortetracycline
- Amphenicols: Chloramphenicol
Thuốc kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi ong
Beta-lactams (penicilins) và macrolides (tylosine, erythromycin)
e) Thuốc kháng sinh họ nitrofuran trong mật ong
Theo tiêu chuẩn EU năm 2002-2003 [4b] thì nhóm chất thuộc họ nitrofuran được phát
hiện trong mật ong gồm
- Nitrofurans gốc: furazolidone (FZD), nitrofurazone, furaltadone, and nitrofurantoin
- Nitrofuran chuyển hoá: nitrofurazone (SEM) (1.6 μg/kg - ppb), furazolidone (AOZ),
3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), semicarbazide (SC), and 1-
aminohydantoin (AH).
- Nitroimidazoles: metronidazole, ronidazole, dimetridazole…
3
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ

1.2 Ảnh hưởng đến sức khoẻ
Họ nitrofuran có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu đối với người. Tuy
nhiên nhóm chất nitrofuran lại gây tác hại cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung
thư và đột biến ở người. [4]
Các tác dụng phụ phổ biến nhất với nitrofurantoin là buồn nôn, nôn, tiêu chảy. Phản
ứng ít gặp hơn bao gồm sốt , ớn lạnh, và khác nhau phản ứng. Nó cũng có thể gây xơ
hóa phổi và viêm gan tự miễn dịch. Tất cả những tác dụng phụ thường gặp hơn ở
người lớn tuổi. Nhiều người cho biết ngứa ran và tê ở cánh tay và chân chỉ sau một vài
ngày sử dụng và ngứa ran và tê chỉ trong vài tuần hoặc thậm chí vài tháng.
Ngoài ra còn có các báo cáo về trường hợp nghiêm trọng và gây tử vong của suy gan
và phổi.
Trẻ sơ sinh (trẻ sơ sinh đến tuổi của một tháng) có hệ thống enzyme chưa trưởng thành
trong các tế bào máu đỏ (glutathione không ổn định) và nitrofurantoin do đó không
được sử dụng vì có thể gây thiếu máu tan máu . Đối với cùng một lý do, nitrofurantoin
không nên cho phụ nữ mang thai sau 38 tuần của thai kỳ, hoặc những người sắp sinh
con.
Nitrofurantoin chống chỉ định ở bệnh nhân có chức năng thận giảm (CrCl <
60ml/phút) do tích tụ và mức độ trong đường tiết niệu thấp hơn trong gan. [2]
1.3 Các tiêu chuẩn quy định đối với nitrofuran
Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm
sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản
xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi trong đó có nitrofuran [4].
Theo tiêu chuẩn EU thì không có giới hạn cao nhất MRLs (Maximum Residue Limits)
thuốc kháng sinh sử dụng cho ong mật, có nghĩa là không cho phép sử dụng kháng
sinh đối với ong mật. MRLs tạm thời đối với các chất thuộc họ nitrofuran là 1 ppb [1].
4
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH
NHÓM NITROFURAN TRONG MẬT ONG
Các phương pháp xác định nitrofuran và chất chuyển hoá trong mật ong

- Định tính, bán định lượng: Charm II Test, ELISA [3]
- Định lượng: HPLC, LC/MS [9]
Trong đó, phương pháp định lượng nitrofuran trong mật ong gồm: GC/MS/MS
(Sánchez-Brunete, Albero, Miguel, & Tadeo, 2005), LC/MS (Tribalat, Paisse,
Dessalces, Grenier-Loustalot, 2006), LC-ESI/MS/MS. Phương pháp xác định
nitrofuran trong thức ăn cho ong mật: HPLC/UV, LC/MS (McCracken & Kennedy,
1997), LC/DAD (Barbosa et al., 2007), CL/FI.
5
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.1 Phương pháp ELISA
2.1.1 Ưu điểm [4b]
Phương pháp ELISA cho giá thành rẻ, linh động, di chuyển được và là phương pháp
sàng lọc mẫu cao, khả năng định lượng nhạy.
2.1.2 Cơ chế hoạt động [4b]
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) dựa trên sự cạnh tranh của các chất
phân tích hoặc mẫu với một loại enzyme của một kháng thể trong các giếng của một
đĩa có độ chuẩn nhỏ (microtitre plate).
Xét nghiệm miễn dịch (immunoassays) có độ nhạy cao và cho phép định lượng dẫn
xuất của các chất chuyển hoá nitrofuran mà không cần những bước tinh chế phức tạp.
2.1.3 Bộ Kit Immuno nitrofuran ELISA [5]
Bộ Kit Immuno Nitrofuran (AOZ) ELISA là dụng cụ thử nghiệm theo phương pháp
sắc ký miễn dịch cạnh tranh, dùng để phát hiện bán định lượng nitrofuran (AOZ) trong
mẫu thủy sản, gà, mật ong.
Thời gian ủ nhiệt: 30 phút +20phút.
Thời gian phân tích: 1 giờ.
Giới hạn phát hiện: 0.1 ppb.
Độ nhạy: 0,025ppb.
Tỷ lệ thu hồi: 85 ± 15%
Tỷ lệ phản ứng chéo
AOZ 100%

AHD < 0.01%
AMOZ < 0.01%
SEM < 0.01%
2.1.3.1 Thành phần bộ Kit
- 1 khay Microwell phủ kháng thể (12 thanh tháo rời, mỗi thanh 12 giếng)
- 6 lọ dung dịch chuẩn (1ml/lọ):0ng/ml; 0.025ng/ml; 0.05ng/ml; 0.1ng/ml; 0.2ng/ml;
0.5ng/ml
- Dung dịch đệm chiết/rửa (10 x 50 ml)
- Dung dịch đệm phân tích
- Dung dịch cộng hợp (100µL)
- Thuốc thử gốc 12 ml
- Cơ chất 12 ml
6
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
- Dịch hãm (13 ml)
2.1.3.2 Thiết bị và dụng cụ hoá chất
- Máy đọc ELIA có bước sóng: 450nm
- Micropipette đa kênh 50 - 200 µL
- Micropipette đơn kênh 50, 100 and 200 µL
- Máy trộn mẫu, ống đong, ống ly tâm, máy ly tâm
- Hóa chất: Ethyl acetate, Hexane, nước cất
2.1.3.3 Chuẩn bị dung dịch thử
- Dung dịch rửa/chiết: pha loãng 10 lần dung dịch rửa với nước cất (1 ml + 9 ml)
- Dung dịch đệm phân tích: pha loãng 10 lần dung dịch với nước cất (1 ml + 9 ml)
- Pha dung dịch cộng hợp Enzyme với dung dịch đệm rửa/chiết (30 µL + 12 ml)
Đem tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng (20-25°C) trước khi sử dụng
2.1.3.4 Chuẩn bị mẫu: Mật ong
- Hút 1 ml mật ong cho vào ống ly tâm
- Thêm 4 ml nước cất + 0,5 ml dd HCl 1M và 10 ml hexan lắc trong 1 phút
- Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000v/p

- Làm lạnh ống ly tâm 30 phút ở nhiệt độ -80°C.
- Lấy lớp bên dưới làm nóng chảy ở nhiệt độ 50°C trong 5 phút bằng nồi water bath
- Thêm 50 µL thuốc thử gốc và lắc 1 phút
- Để ống ly qua đêm (khoảng 16 giờ) trong tủ sấy ở nhiệt độ 37°C
- Thêm 5 ml dd đệm phân tích , 0.5 ml dd NaOH 1M và 5 ml ethyl acetate và lắc 1
phút
- Ly tâm tốc độ 3000v/p thời gian 10 phút
- Dùng pipette hút chính xác 2 ml trên bề mặt (ethyl acetate layer) cho vào ống tube
khác. Làm khô ở 50°C bằng khí Nitơ.
- Hòa tan cặn với 1 ml hexan lắc đều.
- Thêm 1.6 ml dung dịch chiết/rửa và trộn đều 1 phút.
- Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000v/p
- Dùng Micropipette hút 50 µL dung dịch bên dưới đem chuẩn bị phân tích
2.1.3.5 Qui trình
- Hút 50 µL mỗi dung dịch chuẩn cho vào giếng chuẩn
7
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
- Hút 50 µL dung dịch mẫu thử cho vào giếng mẫu
- Thêm 100 µL dung dịch cộng hợp vào các giếng trên (giếng mẫu, giếng chuẩn và
giếng đối chứng âm)
- Trộn đều và lắc đều hổn hợp
- Ủ ở nhiệt độ phòng (25±2°C) 30 phút
- Đổ sạch dung dịch lỏng ra khỏi giếng và vỗ nhẹ trên giấy thấm đến khi không còn
dung dịch trong giếng.
- Rửa giếng bằng dung dịch rửa (khoảng 250 µL/giếng), vỗ nhẹ các giếng trên giấy
thấm. Lặp lại rửa bằng dung dịch rửa 4 lần
- Thêm 100 µL dung dịch cơ chất vào mỗi giếng
- Giữ và lắc nhẹ các giếng trộn đều dung dịch
- Để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng (25±2°C).
- Thêm 100 µL dung dịch dừng màu vào mỗi giếng, lắc nhẹ

- Đọc kết quả trên máy đo màu (máy đọc ELISA) trong vòng 5 phút
2.1.3.6 Kết quả
- Màu đậm = ít Nitrofuran (AOZ)
- Màu nhạt = nhiều Nitrofuran (AOZ)
- So sánh màu hoặc mật độ quang của các giếng mẫu với màu hoặc mật độ quang của
các giếng đối chứng âm và dương. Từ đó xác định được mức độ nhiễm Nitrofuran
(AMOZ) trong mẫu.
- Hoặc chính xác hơn ta vẽ đồ thị đường chuẩn của Nitrofuran (AOZ) và dựa vào đó
định lượng mức độ nhiễm của mẫu
- Tính toán theo công thức sau:
Trong đó: A
o
: mật độ quang tại giếng đối chứng âm (không có Nitrofuran (AOZ))
A
x
: mật độ quang tại giếng chuẩn hoặc mẫu
Dựng đường chuẩn của Nitrofuran (AOZ) với trục X chia độ logarith
8
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.1.3.7 Lưu ý
- Các thuốc thử cần ở nhiệt độ phòng khi tiến hành thí nghiệm, sau đó cần cho trở lại
ngay vào tủ lạnh, không nên để bên ngoài quá lâu. Riêng đối với cộng hợp enzyme chỉ
nên lấy ra 1 lượng vừa đủ dùng không nên để toàn bộ cộng hợp enzyme ra nhiệt độ
phòng.
- Bảo quản tại 2 - 8
o
C. Lưu ý không được để đông đá, đông đá sẽ làm ảnh hưởng hoạt
tính enzyme.
- Trộn đều cộng hợp một cách nhẹ nhàng, tránh tạo bọt.
- Không để các hoá chất tiếp xúc ánh nắng.

- Phải cẩn thận, luôn mang găng tay, áo blouse. Dụng cụ sau khi dùng phải làm vệ sinh
sạch sẽ, rửa bằng nước Javen 5%
- Không dùng bộ kit khi đã quá hạn.
- Sử dụng pipette đúng sẽ giúp có kết quả đúng
- Khi cho cộng hợp vào giếng phải cho thật nhanh để thời gian cộng hợp ở trong giếng
là gần như bằng nhau giữa các giếng, nếu không kết quả sẽ sai lệch.
9
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.2 Phương pháp New Charm II [6]
Năm 1986 thì phương pháp Charm II là phương pháp hàng đầu trong trong việc phân
tích kháng sinh trong sữa. Vì phương pháp này nhanh, đơn giản, nhạy.Ngày nay thì áp
dụng trong mọi mẫu, mẫu mật ong vào 2003 [6b].
2.2.1 Ưu điểm [6]
Phương pháp Charm II Test cho kết qủa định lượng trong vòng 10-20 phút nhanh hơn
1 giờ so với các phương pháp định lượng khác trong khi giới hạn phát hiện
Furazolidone (FZD) chuyển hoá thành 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) tương đương
với phương pháp ELISA và LC/MS. Thêm nữa, phương pháp ELISA, LC/MS, HPLC
phải mất thời gian cô cao, lôi cuốn dung môi hữu cơ trong khi cao chiết Charm II sử
dụng dung dịch đệm, không ảnh hưởng đến sức khoẻ.
Hệ thống Charm II còn có thể phát hiện các chất beta-lactams, sulfonamides,
tetracyclines, aminoglycosides, macrolides, amphenicols/chloramphenicol.
Năm 2007, định lượng AOZ bằng Charm II cho độ nhạy 0.3 ppb, nồng độ kháng sinh
trong mật ong khoảng µg/kg hoặc ppb.
2.2.2 Phương pháp Charm II Test
- Cơ chế hoạt động: Charm II sử dụng những tác nhân cần thiết gắn nguyên tử đánh
dấu H3 và C14 vào trong mẫu thí nghiệm. Mẫu thuốc có nồng độ cao dư lượng
nitrofuran sẽ cho kết quả âm và mẫu có nồng độ thấp cho kết quả dương.
- Chuẩn bị mẫu: Mật ong được hoà tan 1 phần trong 3 phần đệm MSU và pH khoảng
7.5 với đệm M2.
Cao mật ong được thêm liên tục thuốc thử đã hoạt hoá và sẽ cạnh tranh với mẫu thí

nghiệm với nhiệt độ ủ khác nhau, rất nhạy trong định tính thuốc.
Sau khi phản ứng hết đem ly tâm, nếu có kết tủa thì nguyên tử đánh dấu không tạo liên
kết với mẫu mà tách thành phức gắn liên kết đồng vị đánh dấu. Viên tròn (phức đồng
vị đánh dấu) được đem phân tích trong máy bắn tia lửa sau 1 phút cho kết quả. Càng ít
thuốc đánh dấu trong mẫu thì kết quả càng cao.
2.2.3 Kết quả
- Định tính: Kết quả diễn đạt bằng điểm chuẩn. Điểm chuẩn là một số cho biết âm hay
dương, nhỏ hơn 2 SD là mẫu âm, lớn hơn 2 SD là mẫu dương. Mẫu lớn hơn điểm
chuẩn là mẫu không có thuốc còn mẫu nhỏ hơn hoặc bằng thì dự đoán là có thuốc.
Điểm chuẩn dựa vào giới hạn phát hiện LOD (limit of detection) ± 2-3 cho kết quả
chính xác hơn.
- Định lượng: dùng tỉ số B/B
o
sau đó kiểm tra bằng HPLC hoặc LC/MS
B: cpm của mẫu thử
B
o
: cpm của mẫu trắng, không có dư lượng nitrofuran
10
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò ESI [7]
Năm 2007, Mayda I Lopez và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
ghép khối phổ LC/MS/MS ion hoá để xác định đồng thời dư lượng nitrofuran trong
mẫu mật ong.
Xác định đồng thời các chất furazolidone, nitrofurazone, furaltadone, và nitrofurantoin
Khoảng định lượng: 0.5-2 ppb
Độ chính xác: 92-103%
Sai số: 10%
Giới hạn định lượng: 0.25 ppb
2.3.1 Hoá chất và thiết bị

- Chất chuyển hoá nitrofuran với mạch nhánh gắn HCl 1-aminohydantoin (AH) và
semicarbazide (SC) mua từ Aldrich (Milwaukee, WI).
- 3-Amino-2-oxazolidinone (AOZ) và 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone
(AMOZ) mua từ WITEGA (Berlin, Germany).
- Chất nội chuẩn HCl-C
13
,
15
N
2
(SC+3), 3-amino-2-oxazolidinone-d
4
(AOZ-d
4
), 3-
amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone-d
5
(AMOZ-d
5
), và 2-nitrobenzal-dehyde
(2-NBA) cũng mua từ Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI).
- Furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, và nitrofurantoin mua từ Sigma (St. Louis,
MO).
- Dung môi methanol, hexane, và ethyl acetate loại HPLC mua từ Burdick & Jackson
(Muskegon, MI).
- Thuốc thử loại ACS CH
3
COONH
4
, axit KH

2
PO
4
và NaOH mua từ Sigma-Aldrich.
- HCl đặc (loại thuốc thử ACS) and NaCl (loại thuốc thử USP) từ Fisher Scientific Co.
(Pittsburgh, PA).
- Nước khử ion chưng cất từ hệ thống nước Milli-Q-Plus.
- Cột Oasis HLB SPE (60 mg, 3 ml) từ Waters Corp. (Milford, MA). Với đầu lọc
Teflon syringe (13 mm, 0.2 µm) của hãng Gelman Sciences (Ann Habor, MI).
- Hệ LC/MS/MS gồm
+ Hệ sắc ký lỏng LC gồm máy bơm 2 đầu của Agilent 1100 model G1312A và tiêm
mẫu tự động model G1329A (Agilent Technologies, Inc., Wilmington, DE). Cột sắc
ký của Inertsil ODS-3 5 µm, 150 x 2.1 mm, với cột nhồi bảo vệ (Varian, Walnut
Creek, CA). Một đầu lọc trước cột giữa tiêm mẫu tự động và cột bảo vệ (Upchurch,
Oak Habour, WA).
+ Một Micromass Quattro gồm thiết bị phân tích khối phổ phương pháp ion hoá (ESI)
ion dương (Waters, Milford, MA).
11
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
- Thiết bị khác. Máy cô quay dung môi TurboVap LV. Rack ống nghiệm 15 ml
(Zymark, Hopkinton, MA). Máy đo pH Orion model SA520 pH-meter (Orion
Research Inc., Boston, MA). Máy siêu âm model 175D (Crest Ultrasonics Corp.,
Trenton, NJ).
2.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Dung dịch gốc (~ 1 mg/ml). Stock Solutions
Cân khoảng 10-12 mg mỗi chất AOZ, SC, AH, và AMOZ định mức trong 10 ml dung
môi 100% methanol. Riêng SC dùng bình 100 ml vì SC ít tan trong MeOH. Nồng độ
pha chính xác từ dung dịch tinh khiết hoặc dạng muối. Hỗn hợp dung dịch chuẩn cuối
cùng chứa 0.200 ng/µL mỗi loại AOZ, SC, AH, AMOZ trong dung môi MeOH-nước
50% từ dung dịch chuẩn trung gian gồm 2.00 ng/µL trong 100% MeOH.

- Dung dịch chuẩn. Working Standard Solutions
Dung dịch chuẩn của dư lượng chất chuyển hoá nitrofuran 0.00500, 0.0100, 0.0200,
0.0400, 0.0800 ng/µL lấy từ dung dịch gốc cuối cùng (0.200 ng/µL) hoặc pha trong
MeOH-nước 50%.
- Dung dịch gốc nội chuẩn. Internal Standard Stock Solutions
Cân khoảng 2-3mg chất nội chuẩn dạng tinh khiết hoặc dạng muối các chất AOZ-d
4
,
SC+3, và AMOZ-d
5
định mức trong 10 ml methanol 100%. Hỗn hợp dung dịch làm
chất nội chuẩn gồm 0.0400 ng/µL mỗi chất AOZ-d
4
, SC+3, và AMOZ-d
5
trong
MeOH-nước 50% pha từ 2.00ng/µL hỗn hợp dung dịch gốc trung gian 100% MeOH.
Tất cả dung dịch chuẩn được ổn định trong một năm bảo quản dưới nhiệt độ < -10°C.
- Mẫu chuẩn định lượng. Calibration Standards
Chuẩn 5 chất chuyển hoá nitrofuran AOZ, SC, AH, AMOZ ở các nồng độ 0.250,
0.500, 1.00, 2.00, and 4.00 ng/g (với nồng độ ppb trong mật ong) thêm vào 100 µL
dung dịch chuẩn (0.00500, 0.0100, 0.0200, 0.0400, 0.0800 ng/µL) và 50 µL dung dịch
nội chuẩn (tương đương1 ng/g trong mật ong) cho vào ống ly tâm polypropylene 50
ml. Chuẩn độ kiểm tra mẫu mật ong nhằm làm giàu mẫu cao tăng phản ứng của dẫn
xuất.
12
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Hình 1: Công thức hoá học của nitrofuran mẹ và các chất chuyển hoá 3-amino-2-
oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ),
semicarbazide (SC), and 1-aminohydantoin (AH).

2.3.3 Dư lượng nitrofuran từ tổ ong
- Đàn ong. Bee Colonies.
2 đàn ong (Apis mellifera) lấy 5 khung lỗ tổ ong từ 5 tổ. Đàn thứ 2 lấy 5 khung lỗ tổ
ong ngẫu nhiên ở trên lỗ thấp nhất. Ong chúa được giữ bằng cách đặt dụng cụ đuổi
ong bên dưới giữa phần đỉnh và đáy tổ để bảo đảm không có ong con nào được ấp trên
tổ. Đàn ong được nuôi trong phòng thí nghiệm USDA-ARS Bee Research Laboratory
ở Beltsville, MD. Thí nghiệm được bắt đầu đầu tháng 5 năm 2005, suốt trong mùa bồ
kết gai đen (Robinia pseudoacacia) và tulip poplar (Lirodendroan tulipifera) làm
nguồn mật hoa.
- Liều lượng nitrofuran trong mật ong. Dosing Nitrofurans to Bees
Furazolidine (23.2 mg), nitrofurazone (25.3 mg), furaltadone (25.8 mg), và
nitrofurantoin (25.6 mg) (mua từ Sigma-Aldrich) trộn với 159.9 g đường hạt và 80 g
mật ong dẻo thành bánh giống một miếng chả hambuger nhỏ. 50.02 g chả gồm hỗn
hợp đường-mật ong đặt lên trên khung tổ ong của một trong số đàn ong thí nghiệm.
25.04 g chả của cùng hỗn hợp đem đặt ở cùng vị trí của đàn thứ 2. Liều lượng bảo đảm
đủ lượng thuốc cho ong bệnh. Mật ong dùng trong chả thuốc được thu từ đàn ong của
năm trước và đã được phân tích để bảo đảm không còn thuốc.
- Thu mật nhiễm bệnh. Collection of Incurred Honey
Những con ong ở cả 2 đàn tiêu thụ những miếng chả trong 24h. Sau 3-4 ngày, đem
những miếng chả, những khung chứa mật ong dán nhãn và dự trữ trong những tổ trống
ở nhiệt độ phòng 25
o
C. Những khung lấy đi được thay bằng những khung với lỗ tổ ong
trống. Thu thêm 2 mẫu mật ong từ mỗi loài trong 1-2 tuần được 4 mẫu. Mật ong được
13
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
chiết kiệt từ lỗ tổ ong bằng spatulas làm bằng thép không gỉ và đem lọc qua vải thưa
đã tiệt trùng rồi đựng trong những bình tráng bằng methanol. Tuỳ thuộc loài và số
ngày hút mật, ong bệnh sản xuất từ 300 ml đến >1L mật cho mỗi mẫu.
- Chuẩn hoá phương pháp cho mật nhiễm bệnh. Incurred Honey for Method

Validation
Mỗi mẫu mật ong bệnh lấy từ phòng thí nghiệm Bee Research Laboratory được chia
nhỏ đựng trong tối ở 3 nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng, -20°C, và -80°C. Những
mẫu này được đem đi phân tích độ bền của nitrofuran gốc và dư lượng chất chuyển
hoá nitrofuran trong mật ong bệnh ở nhiệt độ phòng. Mật ong dự trữ ở -80°C làm mẫu
0 ở nhiệt độ phòng. Theo định kỳ, các mẫu được lấy từ ong bệnh ở nhiệt độ phòng và
trữ ở -80°C để làm chậm các phản ứng phân huỷ. Sự phân mảnh nitrofuran gốc và chất
chuyển hoá dư lượng kháng sinh trong mật ong được giữ trong tổ hoặc ở nhiệt độ
phòng chờ đem lọc sau khi thu thì không sử dụng. Phương pháp đánh giá dùng cho
mật nhiễm bệnh giữ ở -20°C. Kiểm tra mật ong từ phòng thí nghiệm Bee Research
Laboratory và mua mật ong từ cửa hàng tạp hoá địa phương để kiểm tra lại mẫu, chỉ ra
những điểm giống nhau và kiểm tra phương pháp trên mật ong có tính chất vật lý khác
(kết tinh, sẫm màu, sạch và chứa lượng lớn lỗ tổ ong hay phấn hoa).
2.3.4 Phương pháp trích ly dư lượng chất chuyển hoá nitrofurans.
5 chất chuẩn và 12 mẫu chuẩn bị trước 2 ngày đem phân tích là thích hợp. Cân mật
ong đã đồng nhất hoá (2.00 ± 0.1 g) đựng trong ống ly tâm polypropylene 15ml. Sau
khi cân, thêm vào 10µL dung dịch chuẩn tương ứng làm giàu mẫu ở 3 nồng độ (0.500,
1.00, và 2.00 ng/g). Cũng thêm vào 100µL dung dịch đem chuẩn có các chất chuyển
hoá nitrofuran tương ứng từ những ống ly tâm polyethylene 50µL để làm giàu 5 mẫu
chuẩn định lượng (0.250, 0.500, 1.00, 2.00, và 4.00 ng/g). Kiểm soát mẫu không bệnh
và mẫu bệnh phải cùng lúc. Tất cả mẫu và dung dịch chuẩn phải thêm 50µL hỗn hợp
nội chuẩn cho nồng độ bằng nhau là 1.00 ng/g mật ong.
Sau khi thêm 5 ml NaCl 10% và mẫu và chất chuẩn đậy nắp và quay hỗn hợp cho đến
khi mật ong phân huỷ hết. Mẫu mật ong (không phải dung dịch chuẩn) được ly tâm ở
nhiệt độ phòng trong 5 phút và 4000 rpm (3400 RCF). Phần nổi lên trên dùng pipet
Pasteur nạp vào cột Oasis HLB với 2 ml methanol và 2 ml nước. Nước giải hấp thu
vào ống ly tâm polypropylene 50 ml. Dư lượng chất chuyển hoá nitrofuran đi qua cột
SPE thu được nước giải hấp. Những ống mẫu quay lần thứ 2 với 1 ml nước. Nước rửa
được lọc tiếp tục trong cột SPE và tương tự thu được nước giải mẫu.
Thể tích cuối của chất chuẩn thêm 3 ml nước Milli-Q để bằng nước mẫu giải hấp.

Thêm vào chất chuẩn và nước giải 100 µL dung dịch 2-nitrobenzaldehyde (50 mM
trong methanol) rồi thêm 5 ml dung dịch HCl 0.125M, để lắc đều qua đêm trong bồn
nước 37°C (~14-16 giờ).
Mẫu và chất chuẩn được làm lạnh tới nhiệt độ phòng và thêm 3 ml đệm K
2
HPO
4
0.1M.
Sau đó, điều chỉnh pH của mẫu và chất chuẩn khoảng 7.15 - 7.25 bằng cách thêm dung
14
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
dịch NaOH 0.8M hoặc HCl 0.125M. Thêm vào 4 muỗng cà phê NaCl hạt (~1.25 ml)
và 5 ml hexane. Lắc nhẹ và ly tâm ở 4000 rpm (~ 3400 RCF) trong 10 phút ở 15
o
C. Bỏ
lớp hexane trên bề mặt, lớp nước chia làm 2 với 6 ml EtOAc. Mẫu và chất chuẩn được
trộn, quay mạnh trong 15 giây. Sau đó đem ly tâm ở 4000 rpm (~ 3400 RCF) trong 5
phút ở 15 °C, thu lớp trên EtOAc vào ống polypropylene sạch 15 ml. Lớp EtOAc được
rửa 2 lần với nước và sấy trong Turbo Vap LV ở 50 °C. Để đạt độ chính xác cao (đặc
biệt là NP-AMOZ) ngay khi cao khô thêm vào 2 ml methanol rửa trong thành ống.
Quay mạnh ống trong 10 giây và tiếp tục làm khô.
Làm lại cao theo hai bước. Đầu tiên, thêm 40 µL methanol lắc trong 15 giây và đánh
siêu âm trong 2 phút. Tiếp theo thêm 160 µL nước lắc trong 15 giây và lọc qua đầu lọc
mẫu tự động PTFE 0.2-µm cho vào lọ nhỏ 300-µL.
2.3.5 Phương pháp trích ly nitrofurans gốc
Sản phẩm trên tiếp tục xử lý để định lượng nitrofurans gốc có trong mẫu mật ong bệnh
đã đem định lượng chất chuyển hoá nitrofuran. Sau khi qua cột SPE thu dung dịch
nước giải chứa chất chuyển hoá nitrofuran, rửa cột SPE trong 1 phút với 3 ml hexane
và làm khô, sau đó nitrofurans gốc được rửa giải với 3 ml acetonitrile. Sau đó đem sấy
trong Turbo Vap LV để làm bay hơi acetonitrile ở 50°C; thêm 5 ml NaCl 10% và tiếp

tục chiết để được phân đoạn cao ethyl acetate. Tóm lại, để ngăn không cho nitrofurans
gốc tạo dẫn xuất với 2-NBA phải chú ý pH. Hai chất furaltadone và furazolidone được
đem phân tích bởi hệ LC/MS/MS đầu dò ESI bắn phá ion dương trong khi
nitrofurazone và nitrofurantoin bắn phá ion âm.
2.3.6 Phân tích định lượng
- Chạy sắc ký LC:
Pha động: NH
4
Ac 10 mM (A) và 100% methanol (B).
Chạy gradient trong 20 phút, tốc độ dòng 0.200 ml/phút.
Thời gian 2 phút 1 phút 14 phút 1 phút 2 phút
Phương pháp isostatic gradient isostatic gradient Isostatic
A 80 50 50 80 80
B 20 50 50 20 20
Tiêm 10 µL mẫu vào cột ở nhiệt độ 4 °C và nhiệt độ cột giữ ở 25 °C.
Ổn định cột ít nhất 1 giờ trước khi tiêm mẫu. Trong lúc này ta ổn định khí và thiết bị
điện. Tiêm 3 lần mẫu chuẩn để ổn định và kiểm tra thiết bị. Một loạt mẫu đem chuẩn
gồm: dung môi, chất chuẩn, dung môi, điều chỉnh ion âm dương, để hiệu chỉnh mẫu,
dung môi, mẫu cao chiết, dung môi và chất chuẩn.
Sau mỗi lần chạy, rửa cột với MeOH-nước = 75:25 trong 1 giờ, tốc độ dòng 200
ml/phút để đẩy hết NH
4
Ac và chất khác ra khỏi cột.
- Phân tích MS/MS
15
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Khảo sát proton [M + H]
+
, của các chất chuyển hoá nitrofuran có m/z 249 (NPAH),
209 (NPSC), 236 (NPAOZ), và 335 (NPAMOZ) bắn phá CID cho ion mẹ.

Thời gian dừng cho mỗi lần bắn phá là 0.500 giây. Thông số phát hiện: mao quản:
0.31 kV; máy chiết: 2.0 V; thấu kính RF 0.2 V; bộ nguồn 125 °C; nhiệt độ solvate hoá
400 °C; dòng khí solvate hoá 600 l/giờ; máy nhân quang 650 V.
Dẫn xuất
Ion mẹ
(m/z)
Ion con
(m/z)
Cone
(V)
Năng lượng hoạt hóa
(eV)
NPAH 249 104 29 21
134 29 12
178 29 13
NPAOZ 236 104 28 21
134 28 12
149 28 13
NPSC 209 134 24 11
166 24 10
192 24 12
NPAMOZ 335 128 21 22
262 21 16
291 21 12
int std NPAOZ-d
4
240 134 28 12
int std NPSC+3 212 168 24 10
int std NPAMOZ-d
5

340 296 21 12
Bảng 1: Chuyển hoá SRM
- Định lượng
Chạy sắc ký tách 3 ion kết hợp với ms (phần mềm Target Lynx). Dựng đường chuẩn
và tính diện tích peak suy ra nồng độ của chất phân tích và dung dịch nội chuẩn (ng/g).
NPAMOZ-d
5
dùng làm chất nội chuẩn cho NPAH vì deuteri hoá NPAH không phổ
biến. Nồng độ mẫu phân tích suy ra từ đồ thị hồi quy tuyến tính. Hệ số tương quan (r
2
)
cho mỗi đường chuẩn là > 0.99. Nồng độ phân tích (trừ mẫu kiểm tra và mẫu hiệu
chỉnh) đo khối lượng khác nhau từng 2g mẫu tính toán nồng độ theo đường chuẩn.
Thẩm định phương pháp
Máy phân tích khối lượng thành ion con và kiểm tra tỉ lệ các peak >3:1.
Phân tích ion dương với thời gian lưu của ion con là 3% và tỉ lệ diện tích peak của 3
ion con được tính trong khoảng 10% so với đường cong chuẩn.
2.2.7 Kết qủa
16
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Bảng 2: Mẫu mật ong đã xử lý trước 2 tuần trong 4 cột với sai số (CV) ≤ 10% và độ
chính xác khoảng 92-103%. So với phương pháp ma trận với độ chính xác trung bình
không có chất nội chuẩn là 76% AMOZ, 72% AH, 60% AOZ, và 45% SC.
Giới hạn định lượng (LOQs) thấp nhất là 0.23 ppb. Nhờ có phân tích LC/MS/MS
LOQs có thể thấp hơn nữa đối với NPAOZ và NPAMOZ.
Nguồn mật ong có thể lấy từ nhiều nơi, tính chất vật lý khác nhau: kết tinh, sẫm màu,
sạch và chứa lượng lớn lỗ tổ ong hay phấn hoa.
Kiểm tra lại phương pháp bằng cách định lượng 2 mẫu mật ong hiệu chỉnh trong 38
mẫu thuốc thú y chiết với chất chuyển hoá nitrofuran gồm: sulfadimethoxine,
sulfamerazine, sulfadiazine, ormetoprim, trimethoprim, oxytetracycline,

chlortetracycline, tetracycline, doxycycline, flumequine, oxolinic acid, difloxacin,
danofloxacin, enrofloxacin,sarafloxacin, ciprofloxacin, penicillin G, amoxicillin,
ampicillin,cloxacillin, dicloxacillin, oxacillin, cephalexin, erythromycin, tilmicosin,
tylosin, emamectin (Bla), invermectin, metronidazole, albendazole, fenbendazole,
ketoconazole, malachite green, leuchomalachite green, lincomycin, florfenicol amine,
diflubenzuron, and teflubenzuron.
17
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Bảng 3: Kết quả phân tích chất chuyển hoá nitrofuran trong mẫu mật ong, sai số ≤ 6%
Hình 2: Sắc ký đồ RIC phân tích (NP) AOZ, AMOZ, SC, AH. Trên cùng: RIC của
mẫu kiểm tra, ở giữa: RIC hiệu chỉnh mẫu 0.5 ng/g chất chuyển hoá, bên dưới: sắc ký
đồ RSM của 0.5 ng/g mẫu hiệu chỉnh trong 1 ng/g chất nội chuẩn.
2.2.8 Thảo luận
18
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Hình 3: Độ bền của các chất chuyển hoá và nitrofurans ở nhiệt độ phòng.
Chất chuyển hoá có nồng độ cao hơn so với nitrofurans gốc. 4 chất đều bền ở nhiệt độ
phòng trong đó chỉ có semicarbazide (chất chuyển hoá của nitrofurazone) bị phân huỷ
nhẹ ở nhiệt độ phòng. Vì vậy, mật ong thừơng được giữ ở nhiệt độ phòng trong nhiều
tuần hoặc nhiều tháng trước khi đem phân tích.
Để tránh nghẹt cột, mẫu nạp vào cột SPE phải dùng pipet Pasteur. Phải nạp phần giữa
mẫu đã lọc qua vào cột SPE trước sau đó nạp phần rắn phía trên hoặc phấn hoa dưới
đáy ống. Đây là bước quan trọng trong phương pháp không làm ngẹt khi phân mảnh.
Cô quay hồi lưu theo 2 bước: 40 µL MeOH hoà tan cao thêm 160 µL nước thu được
200 µL MeOH 20% dung môi hồi lưu. Làm bay hơi dung môi để được lớp mỏng cao
trên tường của bẫy đem phân tích. Cao dược hoà tan trong MeOH 100% chứ không
pha trong MeOH 20% để hoà tan hết. Đun hồi lưu giúp các chất chuyển hoá giữ lại tốt
hơn và chính xác hơn, đặc biệt là NPAMOZ. Dung dịch MeOH 20% cũng sử dụng
trong pha động.
Tiêm lượng nhỏ cao (10 µL) vào LC/MS/MS và pha động tăng dần để dường cong

tuyến tính có r
2
> 0.99.
Dung dịch chuẩn có thể dùng dung dịch có sẵn vì tỉ lệ ion là như nhau khi đem phân
tích MS/MS. Dùng dung dịch có sẵn có thể gia tăng lượng mẫu chạy trong ngày và
tăng độ nhạy khi phân tích MS. Tuy nhiên sẽ không vẽ được đường chuẩn làm giảm
hiệu quả của chất nội chuẩn.
19
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.4 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò DAD
(Diode Array Detector) [8]
Năm 2007, Jorge Barbosa và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
đầu dò DAD ghép với ion hoá khối phổ để xác định hàm lượng nitrofurans trong cao
ethyl acetate ở môi trường kiềm và tinh chế qua cột NH
2
.
Định luợng nồng độ thấp nitrofurantoin (NFT), nitrofurazone (NFZ), furazolidone
(FZD) và furaltadone (FTD) trong thức ăn gia súc dùng chất nội chuẩn nifuroxazide
(NXZ)
Hình 1: Công thức hoá học của các nitrofurans.
Vùng định lượng từ 50-100 µg/kg
2.4.1 Hoá chất và thiết bị
Tất cả hoá chất và dung môi sử dụng đều là loại hoá chất phân tích, trừ dung môi chạy
cột là loại HPLC.
- Nước khử ion từ Mill-Q System (Millipore, Bedford, USA).
- Ethyl acetate, axit acetic băng, dung dịch amoni hydroxit NH3 >30%, acetone,
methanol, acetonitrile, N,N–dimethylformamide và ammonium acetate từ VWR
(Darmstadt, Germany).
- Dung môi chạy HPLC lọc qua màng lọc nylon 0.45 µm (Whatman, Maidstone, USA)
và Cartridges Sep-Pack NH2 (6 ml, 1 g) mua từ Waters (Milford, USA). Lọ thuỷ tinh

nhỏ PVDF Mini-uniprepTM mua từ Whatman.
- Máy xay Retsch ZM 200 (Haan, Germany), Mettler Toledo PC2000 và cân AE100
(Greifensee, Switzerland), máy ly tâm Heraeus Megafuge 1.0 (Hanau, Germany), máy
20
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
cô quay chân không (Büchi, Flawil, Switzerland) và máy cô quay chân không tốc độ
cao (Công ty nhiệt điện tử, Milford, USA) để cô cao và tinh chế.
- Sắc ký lỏng với đầu dò mảng diode (LC-DAD) gồm hệ HPLC cột HP/Agilent 1100
Series đầu dò diode array (HP/Agilent Techonologies, Waldbronn, Germany), dùng
Lichrospher 60, RP-select B, 5 µm, cột phân tích 250 mm × 4 mm với Lichrospher 60,
RP-select B, 5 µm, cột bảo vệ trước cột 4 mm × 4 mm (Merck, Darmstadt, Germany).
Thu dữ liệu từ phần mềm ChemStation cho LC 3D®, rev. A.10.01 (Agilent
Techonologies, Waldbronn, Germany).
- LC-MS/MS gồm hệ HLPC của Agilent 1100 Series (Agilent Techonologies,
Waldbronn, Germany) ghép với hệ ba tứ cực Sciex API 3000 (Applied Biosystem,
Foster City, USA) đầu dò khối phổ, với Zorbax Eclipse XDB–C18, 5 µm, cột 150 mm
× 2.1 mm, cột bảo vệ Zorbax Eclipse XDB, C8, 5 µm, 12.5 mm × 2.1 mm (Agilent
Technology, Palo Alto, USA). Thu dữ liệu từ phần mềm Sciex Analyst® software,
Version 1.4.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
2.4.2 Dung dịch chuẩn
Furazolidone, furaltadone, nitrofurantoin, nitrofurazone và nifuroxazide dùng làm
dung dịch nội chuẩn (IS) mua từ Sigma–Aldrich (St. Louis, USA).
- Dung dịch gốc của 5 chất (100 µg mL
-1
) đem pha mỗi chất trong N,N–
dimethylformamide:methanol (10:90).
- Hỗn hợp dung dịch chuẩn làm pha động chạy cột từ dung dịch gốc (14 mM
ammonium acetate (pH 4.6):acetonitrile (70:30, v:v).
Dung dịch chuẩn ổn định ít nhất 2 tháng ở chỗ tối 4
o

C, dung dịch gốc ổn định ở chỗ tối
-20
o
C ít nhất 6 tháng.
2.4.3 Chuẩn bị mẫu
Thức ăn gia cầm, heo, bò… từ chợ Bồ Đào Nha.
2.4.4 Trích ly, chiết tách
Một lượng lớn 5g thức ăn được băm nhỏ bỏ vào 250 ml chất đồng trùng hợp
polypropylene đem ly tâm và ngắt mạch với SI được nồng độ.
2.4.5 Tinh chế
Cartridge Sep-Pack NH
2
thêm vào 5 ml hệ acetone:methanol = 80:20. Cao chiết hồi
lưu trong cartridge và nitrofurans được tách ra bởi 5 ml hỗn hợp dung môi. Phần tách
ra đem làm khô bởi máy cô quay chân không tốc độ cao và lượng dư đem chiết hồi lưu
với 500 µL hỗn hợp CH
3
COONH
4
14mM (pH = 4.6):acetonitrile = (70:30,…).
Dung dịch thu được đem lọc qua màng lọc 0.45 µm đựng trong lọ thuỷ tinh PVDF
Mini-uniprepTM trước khi chạy sắc ký.
21
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.4.6 Phân tích LC-DAD
50 µL dung dịch lọc tiêm vào hệ LC-DAD. Hệ 2 dung môi pha động gồm hỗn hợp (A)
CH
3
COONH
4

14mM (pH = 4.6):acetonitrile (B) chạy gradient với tốc độ dòng 1.2
ml/phút
Thời gian 1 phút 15 phút 0.1 phút
Phương pháp isostatic gradient gradient
A 70 50 70
B 30 50 30
Phát hiện tất cả các chất ở bước sóng 375 nm vì nitrofurans hấp thu mạnh nhất ở gần
bứơc sóng này.
2.4.7 Phân tích LC/MS/MS
Để phân tích LC/MS/MS tiêm vào cột 50 µL, chỉnh nhiệt độ ở 30
o
C. Hệ dung môi pha
động chạy HPLC-DAD đem dùng cho LC/MS/MS với tốc độ dòng 0.4 ml/phút. Tăng
hệ từ A = 90% đến A = 10% trong 9 phút, sau đó gradient về A = 90% trong 0.2 phút
rồi chạy đẳng dòng trong 3.8 phút.
Khối phổ bắn phá ion dương FTD, FZD, NXZ, bắn phá ion âm các chất NFT, NFZ,
NXZ. Chạy chương trình nhiều phản ứng cùng lúc MRM thu được kết quả bảng 1.
N
2
được dùng làm khí ngăn, khí ăn mòn, khí phun ở tốc độ 7.4 và 9l/phút giống qúa
trình ion hoá. Nhiệt độ của nguồn ion được cố định ở 350
o
C, hiệu điện thế 5.0 kV.
22
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.4.8 Kết quả và thảo luận
- Kiểm tra pH trong khoảng 5.0-4.5 cho thấy hình dạng và diện tích pick tốt nhất ở
pH=4.6 (hình 3)
Hình 3: LC-DAD hỗn hợp chuẩn nitrofuran 0.5µg/ml với dung dịch acetate đầu ở
pH=4.9 (A) và pH=4.6 (B)

- Khảo sát pH của chiết lỏng lỏng thức ăn thì pH=8 là hiệu quả nhất.
- Ở giai đoạn tinh chế dùng cột NH
2
phân tích với dung dịch đệm MeOH:Na
2
PO
4
0.1M
pH 8.0 (80:20, v:v) là tốt nhất. Tuy nhiên hỗn hợp methanol:acetone cũng được xem là
tách tốt, tinh chế ít sạch hơn nhưng độ chính xác cao.
- Để đánh giá điều kiện tốt nhất của pha động ta kiểm tra hệ actonitrile và dung dịch
CH
3
COONH
4
đầu 125 mM pH=4.8 (70:30). Quan sát được peak rộng của chất nội
chuẩn NXZ.
23
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
Kết quả tốt đối với cả ion dương và ion âm trong hình 4.
Hình 4: (A) sắc ký LC/MS/MS của mẫu trắng chuẩn nồng độ 50 µg/kg 4 nitrofurans
(B) sắc ký của mẫu trắng
- Những mẫu đem phân tích phải chuẩn bị trong 3 ngày, đối với mẫu chuẫn thì chỉ sử
dụng trong ngày.
- Giới hạn tính CCα từ kết quả của 20 mẫu trắng và đường chuẩn trong 3 ngày.
CCα = 2.33 σ
N
/ε
σ
N

độ lệch chuẩn của biên độ nhiễu ở thời gian lưu mỗi lần phân tích
ε độ dốc của đường chuẩn
Tính toán CCα so sánh với phương pháp phân tích đầu dò UV mẫu có nồng độ cao
hơn 300-500 µg/kg. Sử dụng LC/MS/MS cho khoảng định lượng 20-50 µg/kg tuỳ
chất.
2.4.9 Thảo luận
Phương pháp LC-DAD xác định dược nhiều chất FZD, NFT, FTD, NFZ trong mẫu
thức ăn nồng độ 50–100 µg/kg so sánh với đầu dò UV 300-500 µg/kg.
24
Tiểu luận các phương pháp phân tích công cụ
2.5 Phương pháp phân tích dòng chảy dùng chất nhạy quang FI-CL [9]
Năm 2010, Pawinee Thongsrisomboon sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy
dùng chất nhạy quang là phương pháp xác định nhanh chóng và nhạy các chất họ
nitrofurans như furazolidone (FZD), nitrofurantoin (NFT) và nitrofurazone (NFZ)
trong thức ăn của vật nuôi dựa trên chất nhạy quang KMnO
4
trong môi trường axit
H
2
SO
4
.
Trong thời đại mới, phương pháp phân tích dòng FI phát triển trên nhiều lĩnh vực phân
tích với ưu điểm là sử dụng tác nhân và lượng mẫu ít, tiêm mẫu liên tục và tự động,
không yêu cầu sắc ký đơn, tốc độ phát hiện nhanh (thường từ 0.1-10 giây). Sử dụng
chất nhạy quang phổ biến KMnO
4
.
Phương pháp này được xem là phương pháp mới, sử dụng ít mẫu và tác nhân, ít chất
thải ra môi trường.

2.5.1 Dung dịch và thuốc thử
Tất cả đều dùng dung dịch phân tích.
- Dung dịch gốc KMnO
4
(10
-2
M) pha bằng cách hoà tan 0.1587 g KMnO
4
(Ajax,
Australia) trong nước khử ion và để trong tủ lạnh trong 1 tuần.
- Dung dịch chất mang H
2
SO
4
0.1M chuẩn bị hằng ngày từ dung dịch axit sulphuric
2M (Merck, Germany) trong nước.
- Dung dịch thuốc thử KMnO
4
đã axit hoá (2.5 x 10
-5
M) chuẩn bị hằng ngày trong lúc
pha dung dịch gốc KMnO
4
thành dung dịch chất mang.
Tất cả các dung dịch đều được khử oxi bằng cách sục N
2
trước khi dùng. Hệ thống
nước tinh khiết dùng pha dung dịch hệ thống cất nước cực sạch (18.2 MX, Millipore,
France).
- Nitrofurans (furazolidone, nitrofurantoin, và nitrofurazone) của Sigma–Aldrich

(Steinheim, Germany). Dung dịch gốc 200 mg/L của tất cả các nitrofurans pha bằng
cách hoà 0.02 g mỗi nitrofuran trong 80 ml dimethylformamide (Fisher, UK) thêm tiếp
ethanol (Merck, Germany) để được 100 ml.
- Dung dịch nitrofuran chụẩn chạy cột được chuẩn bị hằng ngày bằng cách hoà tan
dung dịch gốc (200 mg/L) với dung dịch chất mang và tránh ánh sáng vì tính kém bền
của dung dịch loãng nitrofuran dưới bức xạ UV.
- Dung dịch gốc được giữ lạnh ở 4
o
C trong thùng gỗ khi không dùng.
2.5.2 Lấy mẫu
Thức ăn gia cầm, heo, bò mua từ cửa hàng trong chợ Chiang Mai.
2.5.3 Thiết bị
- Hệ thống FI (hình 2) gồm bơm nhu động 2 kênh theo tỉ lệ tuỳ chọn (Minipuls 3,
Gilson, France), van tiêm mẫu (Type 50, Rheodyne Inc., CA, USA) và ống nối PTFE
(đường kính 0.5 mm). Tín hiệu chất nhạy quang được thu trong máy đo độ sáng dòng
25