Thủy phân lòng trắng trứng

TIỂU LUẬN

THỦY PHÂN LỊNG TRẮNG TRỨNG BẰNG ENZYME

Hà Nợi –2022

1


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU...............................................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................5
1.1

Tổng quan về Trứng........................................................................................5

1.1.1 Giá trị dinh dưỡng của protein trong lòng trắng trứng..................................6
1.2 Thành phần hóa học của lịng trắng trứng............................................................6
1.3 Tiềm năng sử dụng protein và peptit từ protein được tách ra từ lịng trắng trứng
[1].....................................................................................................................................9
1.3.1 Sử dụng trong ngành cơng nghiệp chế biến thực phẩm................................9
1.3.2 Sử dụng trong ngành dược phẩm................................................................10
1.3.3 Sản phẩm thủy phân lòng trắng trứng và ứng dụng....................................11
CHƯƠNG 2: THỦY PHÂN LÒNG TRẮNG TRỨNG BẰNG THERMOLYSIN
...........................................................................................................................................13
2.1 Nguyên Liệu và Phương Pháp............................................................................13
2.1.1 Enzyme và hóa chất.....................................................................................13
2.1.2 Phương pháp thủy phân...............................................................................13
2.1.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế ACE..............................................................14
2.1.4 Ảnh hưởng của màng siêu lọc khác nhau lên hoạt động ức chế ACE........15
2.1.5 Phân bố khối lượng phân tử........................................................................15

2.1.6 Tái chế Thermolysin cho quá trình hàng loạt..............................................15
2.1.7 Đo huyết áp.................................................................................................15
2.2 Kết quả...............................................................................................................16
2.2.1 Mức độ thủy phân và hoạt động ức chế ACE.............................................16
2.2.2 Đặc điểm của chất thủy phân......................................................................17
2.2.3 Tái chế Thermolysin cho quy trình hàng loạt.............................................18
2


2.2.4 Sự thay đổi huyết áp của SHR sau khi dùng dịch thủy phân......................18
2.3 Thảo Luận..........................................................................................................19
KẾT LUẬN.................................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................21

3


LỜI MỞ ĐẦU
Lòng trắng trứng chứa nhiều protein quan trọng về mặt chức năng. Ovalbumin (54%),
ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin (3,5%) và lysozyme (3,5%) là một
trong những protein chính có tiềm năng ứng dụng công nghiệp cao nếu được tách riêng.
Các phương pháp tách các protein này từ lòng trắng trứng đã được phát triển từ đầu
năm 1900, nhưng các phương pháp điều chế các protein này cho các ứng dụng thương
mại vẫn đang được phát triển. Tính đơn giản và khả năng mở rộng của các phương pháp,
sử dụng các hóa chất khơng độc hại để phân tách, và phân tách tuần tự cho nhiều protein
là những tiêu chí rất quan trọng để sản xuất thương mại và ứng dụng các protein này.
Các protein được tách ra có thể được sử dụng trong thực phẩm và công nghiệp thực
phẩm nguyên gốc hoặc sau khi sửa đổi với các enzym. Ovotransferrin được sử dụng như
một chất vận chuyển kim loại, chất chống vi khuẩn hoặc chất chống ung thư, trong khi
lysozyme chủ yếu được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm. Ovalbumin được sử

dụng rộng rãi như một chất bổ sung chất dinh dưỡng và ovomucin như một chất ức chế
khối u. Ovomucoid là chất gây dị ứng trứng chính nhưng có thể ức chế sự phát triển của
các khối u, do đó có thể được sử dụng như một chất chống ung thư. Các peptit thủy phân
từ các protein này cho thấy các hoạt động ức chế men chuyển angiotensin I, chống ung
thư, liên kết kim loại và chống oxy hóa rất tốt. Do đó, việc tách các protein trong lòng
trắng trứng và sản xuất các peptit có hoạt tính sinh học từ các protein trong lịng trắng
trứng đang là những lĩnh vực mới nổi với nhiều ứng dụng mới [1].

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Trứng [1].

Hình 1. 1 Trứng gà
Trứng là một trong số ít thực phẩm được sử dụng trên khắp thế giới không phân biệt
tôn giáo và dân tộc. Trứng gà là một trong những vật phẩm sinh học được bảo quản hồn
hảo được tìm thấy trong tự nhiên và cũng được coi là nguồn cung cấp protein, lipid,
vitamin và khoáng chất tốt nhất. Tuy nhiên, tổng lượng trứng tiêu thụ ở các nước phát
triển đã giảm trong vài thập kỷ qua do hàm lượng cholesterol và chất béo cao. Các cộng
đồng y tế đã công nhận trứng là một loại thực phẩm không lành mạnh và chứa nhiều
cholesterol và khơng khuyến khích mọi người ăn chúng, đặc biệt là người cao tuổi. Tuy
nhiên, lợi ích dinh dưỡng của trứng đã được công nhận. Trứng cũng có nhiều đặc tính
chức năng như tạo bọt, tạo nhũ, có màu sắc và hương vị độc đáo, rất quan trọng trong
một số sản phẩm thực phẩm.
Trứng gồm 3 thành phần chính: vỏ trứng (9-12%), lịng trắng trứng (60%) và lịng đỏ
(30-33%). Tồn bộ quả trứng bao gồm nước (75%), protein (12%), lipid (12%),
carbohydrate và khoáng chất (1%). Protein có trong trứng được phân bố giữa lịng trắng
và lịng đỏ trứng, trong khi lipid chủ yếu tập trung ở lòng đỏ. Lòng đỏ được bao phủ bởi
màng sinh tinh và chủ yếu bao gồm nước (50%), protein (15– 17%), lipid (31–35%) và

carbohydrate (1%). Protein có trong lịng đỏ trứng bao gồm lipovitellins (36%), livetins
(38%), phosvitin (8%) và lipoprotein mật độ thấp (17%). Ngồi ra, lịng đỏ chứa 1%
carotinoit, làm cho nó có màu vàng.
5


1.1.1 Giá trị dinh dưỡng của protein trong lòng trắng trứng
Toàn bộ quả trứng được coi là một nguồn cung cấp protein và lipid tốt, nhưng lòng
trắng trứng chủ yếu bao gồm water (88%) và protein (11%) và nó thiếu lipid. Ovomucin
là một protein glycosyl hóa cao và khoảng 33% ovomucin được tạo thành từ cacbohydrat.
Vì vậy, ovomucin có thể được coi là một nguồn dinh dưỡng tốt có thể cung cấp 2 chất
dinh dưỡng quan trọng là protein và carbohydrate. Ovalbumin là protein chính của lịng
trắng trứng, có thành phần axit amin cân đối, do đó có thể được sử dụng như một nguồn
protein tuyệt vời cho nhiều loại thực phẩm. Phần còn lại của protein trong lòng trắng
trứng cũng được coi là nguồn cung cấp các axit amin thiết yếu.
1.2 Thành phần hóa học của lịng trắng trứng [1].
Lòng trắng trứng chủ yếu bao gồm nước (88%) và protein (11%), phần còn lại bao
gồm carbohydrate, tro và một lượng nhỏ lipid (1%).
Ovalbumin (54%), ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), lysozyme (3,5%) và
ovomucin (3,5%) được coi là protein chính và avidin (0,05%), cystatin (0,05%),
ovomacroglobulin (0,5%), ovoflavoprotein (0,8%), ovoglycoprotein (1,0%) và ovoin ức
chế (1,5%) là các protein phụ được tìm thấy trong lòng trắng trứng (Kovacs-Nolan và
cộng sự, 2005).
Những protein này được công nhận về tầm quan trọng chức năng của chúng. Mỗi
protein có nhiều đặc tính chức năng, và các protein này đã được tách ra khỏi lòng trắng
trứng bằng nhiều cách tiếp cận khác nhau.
Ovalbumin là protein chính của lịng trắng trứng được tổng hợp trong ống dẫn trứng
của gà mái và chiếm 54% tổng số proteins của lòng trắng trứng. Trọng lượng phân tử của
ovalbumin là 45 kDa với 386 axit amin. Ovalbumin khơng có trình tự bậc thang đầu N cổ
điển, nhưng có 3 vị trí biến đổi sau tổng hợp ngồi nhóm acetyl ở đầu N. Thành phần axit

amin của ovalbumin là duy nhất so với các protein khác; axit amin ở đầu N là glycine
được acetyl hóa và đầu cuối C là proline. Nó cịn được gọi là glycoprotein và chứa một
nhóm carbohydrate gắn với đầu N.

6


Hình 1. 2 Ovalbumin
Ovotransferrin là một glycoprotein đơn phân bao gồm 686 axit amin với trọng lượng
phân tử 76 kDa. Nó có trình tự axit amin tương tự như transferrin trong huyết thanh
người và chứa 15 liên kết disulfua. Ovotransferrin chiếm 12% trong tổng số protein của
lịng trắng trứng. Nó được gọi là conalbumin, nhưng được đổi tên thành ovotransferrin
sau khi phát hiện ra rằng nó có thể liên kết với sắt. Một phân tử ovotransferrin có thể liên
kết 2 phân tử sắt và vận chuyển sắt trong cơ thể. Ovotransferrin được gấp thành 2 thùy và
4 miền với mỗi thùy gồm 2 miền α- và β- riêng biệt. Hai miền này được liên kết bằng các
sợi β- đối song song có thể mở và đóng bằng bản lề. Ovotransferrin được tìm thấy ở 2
dạng chính: apo- (khơng chứa sắt) và các dạng holo- (liên kết với sắt). Tính chất hóa học
và vật lý của 2 dạng ovotransferrin này khác nhau đáng kể. Dạng apo không màu, trong
khi dạng holo có màu hồng cá hồi. Dạng holo có khả năng chống lại các điều kiện hóa
học và vật lý hơn dạng apo. Sắt (Fe3+) có thể dễ dàng gắn vào ovotransferrin ở pH> 7,0,
nhưng được giải phóng ở pH

Hình 1. 3 Ovotransferrin
7


Lysozyme là một loại protein quan trọng khác được tìm thấy trong lịng trắng trứng.
Đương nhiên, có nhiều dạng lysozyme được tìm thấy, nhưng lysozyme được tìm thấy
trong trứng là loại có khả năng hịa tan và ổn định nhất trong số đó. Lysozyme lần đầu
tiên được xác định bởi Alderton và cộng sự năm 1946. Nó là một loại enzyme phổ biến

có thể thủy phân liên kết β giữa axit N-acetylneuraminic và N-acetylglucosamine trong
thành tế bào vi khuẩn; nó được gọi là N-acetyl-muramichydrolase và bao gồm lysine và
leucine ở đầu N- và C- tương ứng. Khối lượng phân tử của lysozyme là 14.400 Da và bao
gồm một chuỗi polypeptit duy nhất với 129 axit amin. Trong tự nhiên, protein này được
tìm thấy dưới dạng monome nhưng đơi khi hiện diện dưới dạng chất dimer với độ bền
nhiệt cao hơn. Nó được coi là một loại protein cơ bản mạnh có trong lịng trắng trứng.
Lysozyme có 4 cầu nối disulfua dẫn đến độ ổn định nhiệt cao và điểm đẳng điện của nó
là 10,7. Nó có xu hướng liên kết với các protein tích điện âm như ovomucin trong lịng
trắng trứng.
Ovomucin là một loại protein chính của lịng trắng trứng, chiếm 3,5% tổng lượng
protein của lòng trắng trứng. Ovomucin bao gồm các thành phần hịa tan và khơng hịa
tan: thành phần hòa tan bao gồm 8.300 Da và thành phần khơng hịa tan nằm trong
khoảng từ 220 đến 270 kDa. Nó là một trong những protein trọng lượng phân tử lớn có
gắn cacbohydrate và chịu trách nhiệm tạo ra cấu trúc giống như gel của lòng trắng trứng.
Ovomucin chủ yếu bao gồm 2 loại tiểu đơn vị và chúng được gọi là α và β; α-ovomucin
là đồng nhất, trong khi β-ovomucin là khơng đồng nhất. α-Ovomucin có 2 đơn vị con là
α1 và α2, có ít nhóm cacbohydrat hơn β-ovomucin, là đơn vị giàu cacbohydrat. Ovomucin
có nhiều vùng cuộn hơn ở các đầu của nó, giống như cấu trúc của mucin người. Bởi vì nó
có các vùng cuộn dài, một cấu trúc cuộn ngẫu nhiên được quan sát thấy. β-Ovomucin chủ
yếu bao gồm serine và threonine, và α-ovomucin chủ yếu bao gồm các axit amin có tính
axit như axit aspartic và axit glutamic, nhưng khơng có sự khác biệt về ovomucin từ lòng
trắng trứng dày và lòng trắng trứng mỏng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng ít nhất
3 loại chuỗi carbohydrate được tìm thấy trong ovomucin, bao gồm galalctose,
galacrosamine, axit si-alic và sulfate với tỷ lệ phân tử 1: 1: 1: 1. Trung bình, 33%
ovomucin là carbohydrate.
Ovomucoid là một trong những loại glycosyl hóa cao nhất protein được tìm thấy trong
lịng trắng trứng. Trọng lượng phân tử của ovomucoid là 28 kDa, nhưng dải trong SDSPAGE xuất hiện ở mức 30 đến 40 kDa. Nó được biết đến nhiều như chất ức chế trypsin
và được coi là chất gây dị ứng thực phẩm chính có trong lịng trắng trứng. Mỗi phân tử
8

ovomucoid liên kết với một phân tử trypsin, và cấu trúc 3 chiều của nó được bảo đảm
bằng 3 liên kết disulfide trong đó. Kovacs-Nolan và cộng sự. (2000) cho thấy rằng các
peptit có nguồn gốc từ ovomollen sử dụng pepsin cho thấy hoạt động liên kết IgE và duy
trì các hoạt động ức chế trypsin của nó. Matsuda và cộng sự. (1985) báo cáo rằng
ovomollen khơng mất hoạt tính miễn dịch của nó ngay cả sau khi thủy phân bằng cách sử
dụng pepsin, nhưng vai trò của carbohydrate đối với hoạt động miễn dịch của ovomollen
vẫn chưa được biết đến. Nagata và Yoshida (1984) báo cáo rằng ovomollen có thể được
sử dụng để kiểm soát Streptomyces ban đỏ. Thậm chí, protein cịn được coi là chất ức chế
trypsin, là đặc tính tiêu cực của protein; nó có khả năng kiểm sốt vi sinh vật. Do đó, nó
có thể được sử dụng như một chất chống vi khuẩn cho thực phẩm.

Hình 1. 4 Ovomucoid
1.3 Tiềm năng sử dụng protein và peptit từ protein được tách ra từ lòng trắng trứng
[1].
1.3.1 Sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm
Lysozyme là một trong những protein phân giải vi khuẩn chính được tìm thấy trong
lịng trắng trứng. Lysozyme có khả năng che giấu các mầm bệnh trong thực phẩm như
Listeria monocy-togens và Clostridium botulinum, được coi là 2 mầm bệnh chính gây ra
các vấn đề trong ngành công nghiệp thực phẩm. Lysozyme kiểm sốt chặt chẽ sự hình
thành độc tố của vi khuẩn Clostridium botuli-num ở cá, gia cầm và một số loại rau. Có
thơng tin cho rằng việc thay đổi lysozyme bằng phương pháp xử lý hóa chất và nhiệt độ
đã làm tăng đặc tính kháng khuẩn của nó. Lysozyme khơng chỉ có khả năng ức chế sự
phát triển của vi sinh vật mà cịn có tác dụng kháng virus, kháng vi khuẩn gây bệnh và
9


điều trị. Tổ chức Y tế Thế giới và nhiều tổ chức đã cố gắng cho phép sử dụng lysozyme
trong thực phẩm như một chất bảo quản và nó hiện được sử dụng trong dưa chua
kimuchi, sushi, mì Trung Quốc, pho mát và sản xuất rượu.

Ovotransferrin được biết là có hoạt tính kháng vi khuẩn antimi mạnh và do đó, có thể
được sử dụng để cải thiện độ an tồn của thực phẩm. Babini và Livermore (2000) đã chỉ
ra rằng ovotransferrin làm tăng hoạt tính của pipercillin-tazobactam chống lại E. coli
thơng qua hoạt động thải sắt của nó. Valenti và cộng sự. (1982) báo cáo rằng ovotrans
ferrin ức chế Pseudomonas sp., Escherichia coli và Streptococcus mutans. Gần đây
ovotransferrin đã được sử dụng để kiểm soát vi khuẩn E. coli O157: H7 và Listeria
monocytogens, được biết là có vấn đề đối với các mầm bệnh từ thực phẩm. Ibrahim và
cộng sự. (2000) đã chỉ ra rằng các peptit có nguồn gốc từ ovotransferrin (OTAP-92) có
khả năng tiêu diệt vi khuẩn bằng cách làm hỏng màng tế bào của chúng. Zhang và cộng
sự. (2011) cũng báo cáo rằng các peptide có nguồn gốc từ ovotransferrin có khả năng
kiểm sốt vi sinh vật. Vì vậy, rõ ràng là cả ovotransferrin và các peptit của nó đều có thể
được sử dụng làm chất kháng khuẩn trong thực phẩm. Ovotransferrin có tác dụng chống
oxy hóa trên thịt gia cầm bằng cách thiết lập môi trường oxy hóa khử của tế bào.
Ovomucin cho thấy có tác dụng ức chế tốt các tác nhân E. coli, Bacillus sp., Và
Pseudomonas sp. Theo báo cáo, ovomucin có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với vi
khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Do đó, ovomucin có thể được sử dụng trong ngành công
nghiệp thực phẩm như một chất bảo quản trước thực phẩm. Ngồi ra, nó có đặc tính tạo
bọt và tạo nhũ tốt. Tạo bọt và nhũ hóa là những yếu tố cần thiết trong việc thử làm bánh.
Thêm ovomucin có thể nâng cao mức độ dinh dưỡng trong khi tạo ra kết cấu tốt cho sản
phẩm. Dávalos và cộng sự. (2004) báo cáo rằng các peptit thủy phân từ protein của lịng
trắng trứng thơ cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh. Các peptit chứa TyrAla-GluGlu-Arg-Tyr-ProIle-Leu cho thấy hoạt động thu dọn gốc tự do mạnh mẽ. Do đó, khơng
chỉ protein trong lịng trắng trứng mà các peptit của chúng cũng có thể được sử dụng
trong cơng nghiệp thực phẩm như tác nhân làm giảm q trình oxy hóa lipid trong thực
phẩm.
1.3.2 Sử dụng trong ngành dược phẩm
Ovotransferrin có thể liên kết với sắt và dễ dàng giải phóng sắt liên kết ở pH < 4,5. Vì
vậy, nó có thể là một nguồn bổ sung sắt tuyệt vời cho con người. Ovotransferrin được
báo cáo đã trải qua quá trình tự động phân cắt liên kết thiol sau khi khử và tạo ra các sản
10

phẩm thủy phân một phần có tác dụng chống ung thư rất mạnh đối với tế bào ruột kết và
vú. Lysozyme hoạt động như một chất điều chỉnh và kích thích miễn dịch và có khả năng
ngăn chặn các tế bào khối u. Vì vậy, lysozyme có thể được sử dụng như một chất chống
ung thư. Ovomucin cũng được báo cáo là có hoạt tính chống khối u và tác dụng kháng vi
rút. Do đó, khơng chỉ ovotransferrin mà cịn có thể dùng ovomucin để kiểm sốt sự phát
triển của khối u.
Albumin máu người được báo cáo là một chất vận chuyển thuốc tuyệt vời, cho thấy
rằng ovalbumin cũng có thể được sử dụng như một chất vận chuyển ma túy. Ovalbumin
cũng được báo cáo là có các yếu tố giải phóng hoại tử khối u, có thể áp dụng trong việc
ức chế khối u. Ovomucoid có tác dụng gây dị ứng mạnh đối với một số đối tượng con
người. Vì vậy, ovomucoid đã được nghiên cứu về hóa chất miễn dịch, nhưng vẫn chưa rõ
liệu cacbohydrat gắn với protein hay các liên kết disunfua trong protein gây ra hoạt động
miễn dịch. Ovomucin được báo cáo là tăng cường sự di chuyển bề mặt của tế bào mầm
nguyên thủy, giúp biểu hiện PGCs từ E3 đến E7 trong tế bào phơi nam.
1.3.3 Sản phẩm thủy phân lịng trắng trứng và ứng dụng
Khơng chỉ protein trong lịng trắng trứng, mà cả các sản phẩm thủy phân của chúng
cũng có nhiều đặc tính chức năng. Protein trong lịng trắng trứng có thể được thủy phân
bằng cách sử dụng các enzym khác nhau trong các điều kiện khác nhau.
Trong vài thập kỷ qua, nhiều peptide chức năng có tác dụng có lợi cho sức khỏe đã
được phát triển và đánh dấu. Các peptit hoạt động chức năng này được tạo ra bằng các
enzym như pepsin, trypsin và α-chymotrypsin. Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng chính
lịng trắng trứng làm chất nền cho quá trình thủy phân bằng enzym và tạo ra các peptit có
hoạt tính sinh học; Chiang và cộng sự. (2006) đã sử dụng thermolysin để thủy phân lòng
trắng trứng và tạo ra các peptit hoạt tính sinh học có thể ức chế hoạt động của ACE.
Miguel và Aleixandre (2006) cũng tạo ra peptit bằng cách thủy phân lòng trắng trứng với
pepsin. Trong số các peptit có trình tự axit amin Tyr-Arg-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu,
Arg-Ala-AspHis-ProPhe-Leu, và Ile-Val-Phe cho thấy các hoạt động ức chế ACE mạnh
mẽ. Việc cho những con chuột tăng huyết áp tự phát ăn các peptit này sẽ làm giảm huyết
áp của chuột.

Ovalbumin được thủy phân cho thấy hoạt động ức chế ACE mạnh mẽ (Miguel et al.,
2007). Fujita và cộng sự. (2000) ovalbumin thủy phân với pepsin, trypsin, và αchymotrypsin và tạo ra 7 peptit ức chế ACE, bao gồm LKA, LKP, LAP, IKW, FQK
11


PKR, FKGRYYP và IVGRPRHQG. Một số peptit được tạo ra từ ovalbumin không chỉ
cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh mà còn làm giảm hàm lượng lipid trong máu
(Manso và cộng sự, 2008). Tác dụng giãn mạch (Miguel và cộng sự, 2007) được quan sát
thấy từ các peptit có nguồn gốc từ lòng trắng trứng cũng như từ ovalbumin. Yu và cộng
sự. (2012) báo cáo rằng ovokinin và ovokinin từ 2 đến 7 cho thấy các hoạt động ức chế
ACE nổi bật nhất và trong số các peptit được tạo ra.
Không chỉ ovalbumin mà cả ovotransferrin cũng được sử dụng để sản xuất các peptit
có hoạt tính sinh học có giá trị. Các sản phẩm thủy phân của ovotransferrin cho thấy hoạt
động kháng khuẩn mạnh mẽ. Ibrahim và cộng sự. (2000) đã báo cáo rằng các peptit có
nguồn gốc từ ovotransferrin cho thấy hoạt động của vi khuẩn antimi rất tốt. Tuy nhiên,
ovotransferrin đã mất khả năng liên kết sắt sau khi thủy phân (Wu và AceroLopez, 2012).
Peptide có nguồn gốc từ ovotransferrin cũng cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh
mẽ. Ovotransferrin được thủy phân với các enzym như protamex, alkalse, trypsin và αchymotrypsin cho thấy tác dụng bảo vệ chống lại stress oxy hóa bao gồm tổn thương
DNA trong bạch cầu người (Moon và cộng sự, 2013). Ngoài ra, các sản phẩm thủy phân
được tạo ra từ ovotransferrin, có trình tự peptit Lys-Val-Arg-Glu-GlyThr, có hoạt tính ức
chế ACE mạnh cũng như hoạt động giãn mạch (Wu và Acero-Lopez, 2012). Peptide có
nguồn gốc từ ovomucoid cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch chống lại các tế bào T
và các peptit từ ovomucin cho thấy các hoạt động sinh sản của đại thực bào trong ống
nghiệm (KovacsNolan và cộng sự, 2005), cho thấy rằng chúng cũng có thể là ứng cử viên
tốt cho việc sử dụng dược phẩm ở người.

12


CHƯƠNG 2: THỦY PHÂN LÒNG TRẮNG TRỨNG BẰNG

THERMOLYSIN
2.1 Nguyên Liệu và Phương Pháp [2].
2.1.1 Enzyme và hóa chất
Thermolysin (EC3.4.24.27) từ Bacillus thermoproteolyticus rokko, là một
metalloendopeptidase ngoại bào có thể điều chỉnh nhiệt có chứa bốn ion canxi. Đồng yếu
tố là kẽm và canxi. Thermalmolysin thủy phân các liên kết peptit ở phía đầu N của các
gốc axit amin kỵ nước. Độ pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của nó lần lượt là 8,0 và
65-70° C. Thermolysin ổn định từ pH 5 đến 9,5. Thermolysin có độ đặc hiệu phân cắt
thấp, do đó nó tạo ra một số đoạn ngắn. Vị trí phân cắt ưu tiên thermolysin: phân cắt XY-Z, trong đó X = bất kỳ axit amin nào, Y = Leu, Phe, Ile, Val, Met, Ala và Z là bất kỳ
axit amin nào khác với Pro. Bốn protease bao gồm alcalase, esperase, thermolysin và
chymotrypsin đã được sử dụng để thủy phân lòng trắng trứng trong nghiên cứu trước đây
và thermolysin là chất mạnh nhất vì tính đặc hiệu thấp. Quá trình thủy phân bằng enzyme
rất tốn kém do chi phí của enzyme. Liều lượng thấp của thermolysin đã được sử dụng
trong cuộc điều tra này
 Thermolysin (từ Bacillus thermoproteolyticus rokko) và angiotensin Iconverting enzyme (ACE) thu được từ phổi thỏ
 Hippury-Lhistidyl-L-leucine (HHL), axit hippuric (HA), các chất đánh dấu
trọng lượng phân tử bao gồm cytochrome C, aprotinin, gastrin I, chất P,
triglycine và glycine được được mua từ Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
Hoa Kỳ) hoặc Merck (Damdstadt, Đức).
 Màng siêu lọc cellulose tái sinh được lấy từ Millipore Corporation (Bedford,
MA, USA).
2.1.2 Phương pháp thủy phân
 1,0% (w/v) lịng trắng trứng thơ và 0,2% (w/w lịng trắng trứng) Thermolysin
được sử dụng để sản xuất sản phẩm thủy phân.
 Nhiệt độ và độ pH của thermolysin được xác định trong nghiên cứu trước đây
là 65 ° C và 8,0, tương ứng.
13


 Độ pH của dung dịch lòng trắng trứng được điều chỉnh thành 8,0 bằng NaOH 1

N và được đun nóng đến 65 ° C trước khi tăng nhiệt.
 Phần mẫu, được rút ở 10, 20, 30, 60, 120, 180 và 240 phút từ hỗn hợp phân
giải protein, được làm nóng ngay lập tức trong nồi cách thủy sơi trong 10
phút.Các phần của hỗn hợp đun nóng được sử dụng để đo độ pH và mức độ
thủy phân của chúng (DH). Phần còn lại của hỗn hợp đã được làm nóng được
đem đi ly tâm ở 10.000 × g trong máy ly tâm siêu nhỏ trong 10 phút.
 Các chất nổi phía trên đã được thử nghiệm về hoạt động ức chế ACE của
chúng.
 Mức độ thủy phân tại bất kỳ thời điểm nào được đo bằng phương pháp
orthophthaldialdehyde (OPA).
2.1.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế ACE
 Hoạt tính ức chế ACE được phân tích quang phổ bằng cách sử dụng HHL làm
chất nền theo phương pháp của Cushman và Cheung. HHL được chuẩn bị bằng
dung dịch đệm natri borat 0,1 M (pH 8,3) có chứa 0,4 M NaCl.
 ACE từ phổi thỏ được hòa tan trong cùng một dung dịch đệm ở nồng độ 60
mU / mL.
 Một hỗn hợp chứa 225 μL dung dịch HHL và 25 μL dịch thủy phân protein
được ủ ở 37 ° C trong 5 phút.
 Thêm 75 μL dung dịch ACE vào hỗn hợp, thời gian ủ được kéo dài thêm 30
phút.
 Phản ứng được dừng lại với 20 μL axit trifluoroacetic 0,1% (TFA).
 Hippuric acid (HA) do ACE giải phóng được xác định bằng RP-HPLC trên cột
LiChrospher C18 (4 × 250 mm, Merck, Đức). Pha động là 0,1% TFA trong
50% metanol với tốc độ dòng 0,8 mL / phút. Nước thải đầu ra được theo dõi
bằng máy dị tia cực tím (Shimadzu, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 228 nm.
 Giá trị IC50 được xác định là nồng độ của chất ức chế ACE hoặc chất thủy phân
protein cần thiết để giảm chiều cao của đỉnh HA xuống 50%, và được xác định
bằng phân tích hồi quy của hoạt động ức chế ACE (%) so với nồng độ protein.
Giá trị IC50 được biểu thị bằng mg protein / mL.
 Hoạt động ức ACE (%) được biểu thị bằng

Hoạt động ứng chế ACE (%) = (Ho – Hp) x 100 / Ho
14


Trong đó: Ho là chiều cao của đỉnh HA khi chưa thủy phân protein;
Hp là chiều cao của đỉnh HA với dịch thủy phân protein.
2.1.4 Ảnh hưởng của màng siêu lọc khác nhau lên hoạt động ức chế ACE
Các sản phẩm thủy phân được tạo ra bởi quá trình thủy phân bằng enzym đã được xử
lý siêu lọc tuần tự bằng cách sử dụng các đĩa cenlulose có kích thước tái tạo với các
ngưỡng cắt khối lượng phân tử 10; 3 và 1 kDa (MWCO), riêng lẻ. Mỗi chất thấm được
thu thập để xác định nồng độ protein, hồ sơ phân bố trọng lượng phân tử và IC 50 đối với
hoạt động ức chế ACE.
2.1.5 Phân bố khối lượng phân tử
Sự phân bố trọng lượng phân tử của dịch thủy phân được phân tích bằng sắc ký loại
trừ kích thước hiệu năng cao (HPSEC). HPSEC bao gồm một cột Superdex peptide
10/300 GL, được kết nối với một máy dò UV được đặt ở bước sóng 214 nm. Pha động là
đệm phosphat 0,02 M (pH 7,2) chứa 0,25 M NaCl và tốc độ dòng được đặt ở 0,5 mL /
phút.
2.1.6 Tái chế Thermolysin cho q trình hàng loạt
Lị phản ứng theo mẻ là một bình phản ứng (250 mL) với một áo nước nóng được
khuấy để cung cấp sự khuấy trộn và gia nhiệt đồng đều. Một trăm ml lòng trắng trứng 1%
(pH 8,0) và thermolysin được đưa vào bình phản ứng và hỗn hợp được đun nóng. Sau khi
phân hủy lòng trắng trứng ở điều kiện tối ưu trong 4 giờ, dịch thủy phân được ly tâm
(3.000 × g) và phần nổi phía trên được đưa vào q trình siêu lọc qua màng có MWCO
3kDa. Chất thấm (khoảng 80% về thể tích) được thu hồi để đo hoạt tính ức chế ACE và
tổng hợp nitơ. Phần rút lại (20% về thể tích) phía trên màng, có chứa nhiệt độ cao, được
tái chế cho q trình thủy phân lơ tiếp theo. Việc tái chế thermolysin để thủy phân theo
mẻ được lặp lại ba lần
2.1.7 Đo huyết áp
SHR đực được mua từ Trung tâm Động vật Phịng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài

Loan, Trung Hoa Dân Quốc). Huyết áp tâm thu (SBP) của SHR, từ 7 đến 8 tuần tuổi (250
đến 300 g trọng lượng cơ thể), được đo như sau.
Những con chuột đã được cung cấp từng dịch thủy phân bằng cách đặt nội khí quản
được giữ ở 37 ° C trong 5 phút, và HATT được đo bằng dây quấn đuôi với một máy đo
15


huyết áp điện được lập trình (MK 1030, Muromachi Co. LTD, Nhật Bản). Nước muối
đệm phosphat (0,15 M NaCl và 0,01 M đệm phosphat, pH 7,4) có chứa lịng trắng trứng
được sử dụng làm chất đối chứng, và tác dụng chống tăng huyết áp của bột thủy phân hòa
tan trong dung dịch đệm này đã được đo.
2.2 Kết quả [2].
2.2.1 Mức độ thủy phân và hoạt động ức chế ACE
Sự thay đổi pH, mức độ thủy phân (DH) và ức chế ACE của hỗn hợp thủy phân trong
quá trình thủy phân được thể hiện trong Hình 1. Độ pH giảm nhanh chóng từ 8 xuống 6,6
trong 30 phút đầu tiên trong q trình thủy phân và sau đó giảm từ từ xuống 6,5 trong 4
giờ

Hình 1. Quá trình thay đổi theo thời gian của pH, mức độ thủy phân và hoạt động ức
chế ACE của dung dịch lòng trắng trứng bị thủy phân bởi nhiệt độ cao
Việc tạo ra các đoạn peptit trong quá trình thủy phân sẽ làm tăng tính axit. Sự giảm
nồng độ protein và tăng độ axit sẽ làm giảm hoạt tính của enzym do đó làm chậm sự giảm
16


pH. Hoạt động của thermolysin sẽ duy trì 60% ở pH 6,5. Việc kiểm soát pH của hỗn hợp
thủy phân bằng bộ điều khiển trong quá trình thủy phân sẽ là một cách hiệu quả để cải
thiện hoạt tính của enzym. Ngược lại, DH trong quá trình phân hủy tăng nhanh chóng từ
0 đến 11,4% trong 30 phút ban đầu và sau đó tăng từ từ lên 15,1% trong 4 giờ. Khá giống
với sự thay đổi DH, hoạt tính ức chế men chuyển của hỗn hợp thủy phân pha loãng 10 lần

tăng nhanh lên 57% trong 30 phút đầu tiên, 60% trong 30 phút tiếp theo và giữ ở trạng
thái gần như ổn định trong quá trình thủy phân giờ sau. Tất cả những thay đổi này về pH,
DH và hoạt động ức chế ACE là của quá trình thủy phân bằng enzym điển hình và của
chức năng hypebol trong thời gian của quá trình. Bốn giờ thủy phân được coi là đủ cho
quá trình này.
2.2.2 Đặc điểm của chất thủy phân
Dung dịch thủy phân trong suốt có mùi pepton rất nhẹ và khơng có vị đắng. Các thuộc
tính màu, L, a và b, đối với dung dịch thủy phân và bột thủy phân lần lượt là 99,3, -0,9,
5,8 và 93,1, -1,2, 4,93. Chất thủy phân sẽ không truyền màu sắc cũng như hương vị cho
sản phẩm khi được thêm vào như một chất phụ gia thực phẩm. Hầu hết protein thủy phân
bằng các enzym khác, đặc biệt là enzym vi khuẩn sẽ cho vị đắng. Vị đắng của dịch thủy
phân sẽ hạn chế việc sử dụng nó làm phụ gia thực phẩm hoặc tiêu dùng như hiện nay.
Hương vị nhạt nhẽo của dịch thủy phân lòng trắng trứng được tthủy phân bởi thermolysin
là do tính chất đặc hiệu của enzym đặc biệt của nó, tức là thermolysin thủy phân liên kết
peptit trên vị trí đầu N của axit amin kỵ nước.
Đánh giá cảm quan của sữa gầy và sữa gầy có chứa 1% bột thủy phân lịng trắng
trứng được trình bày trong Bảng 1. Khơng có sự khác biệt đáng kể nào về mùi, vị đắng và
khả năng chấp nhận tổng thể giữa sữa gầy và sữa gầy có chứa dịch thủy phân.
Bảng 1. Đánh giá cảm quan của sữa gầy và sữa gầy có chứa dịch thuỷ phân lòng
trắng trứng.

17


Giá trị trung bình trong cùng một cột được theo sau bởi các chữ cái khác nhau là khác
nhau đáng kể. (p <0,05)
a-Thang điểm năm (5 = cực kỳ mùi, 4 = mùi vừa phải, 3 = hơi nặng, 2 = mùi ít, 1 =
khơng mùi).
b-Một thang điểm năm (5 = cực kỳ đắng, 4 = đắng vừa phải, 3 = hơi đắng, 2 = hơi
đắng, 1 = không đắng).

c-Thang điểm năm (5 = thích rất nhiều, 4 = thích nhẹ, 3 = khơng thích hoặc khơng
thích, 2 = khơng thích một chút, 1 = khơng thích rất nhiều).
2.2.3 Tái chế Thermolysin cho quy trình hàng loạt
Trái với hầu hết các enzym sinh học, thermolysin ổn định đáng kể ở dưới 70 ° C.
Trọng lượng phân tử của nó là khoảng 34,6 kDa. Thermolysin có thể dễ dàng thu hồi từ
quá trình thủy phân bằng cách siêu lọc để tái sử dụng.
2.2.4 Sự thay đổi huyết áp của SHR sau khi dùng dịch thủy phân
Tại 0, 2, 4, 6 và 8 giờ sau khi uống dịch thủy phân hoặc dịch thủy phân được bao bọc
liposome, huyết áp được đo ở chuột SHR (Hình 4).

18


Hình 4. Tác dụng hạ huyết áp của một lần uống duy nhất dịch thủy phân ở chuột tăng
huyết áp tự phát (SHR).
Trong đối chứng, khơng có thay đổi nào về huyết áp trong vòng 8 giờ sau khi dùng.
Tuy nhiên, các peptit của thermolysin cho thấy hoạt tính hạ huyết áp mạnh ở chuột SHR
(186 mg peptit / kg trọng lượng cơ thể) 2 giờ sau khi dùng (-26,7 mmHg). Ở 4, 6 và 8 giờ
sau khi dùng, các peptit này cũng có tác dụng chống tăng huyết áp mạnh (tương ứng -23,
-20 và -13 mmHg). Khơng có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy giữa hai liều lượng:
186 mg và 372 mg peptide / kg trọng lượng cơ thể. Peptide MLVs cho thấy hiệu quả tốt
hơn trên hoạt động chống tăng huyết áp so với peptide chỉ. Liposomeencapsulation đã
được sử dụng để đưa thuốc đến đích vì lipsome có khả năng chống lại q trình tiêu hóa
ở dạ dày và tăng cường hấp thu ở ruột. Các peptit này có tác dụng chống tăng huyết áp
phụ thuộc vào liều lượng và chế phẩm dùng cho chuột SHR.
2.3 Thảo Luận [2].
Thermolysin cho thấy hiệu quả thủy phân lòng trắng trứng cao. Sản phẩm thủy phân
lòng trắng trứng bằng cách sử dụng thermolysin có màu gần như trắng và hương vị nhạt
và có thể được sử dụng như một chất dinh dưỡng. Hỗn hợp peptit trong dịch thủy phân
thể hiện hoạt động ức chế ACE mạnh mẽ. Các peptit hoạt động chính trong dịch thủy

19


phân tương đối ngắn với MW dưới 1kDa. Hỗn hợp peptit trong dịch thủy phân cho thấy
tác dụng chống tăng huyết áp mạnh trên SBP ở chuột SHR với liều 0,18 g / kg thể trọng.
Việc tái chế thermolysin để sản xuất hàng loạt hỗn hợp peptit là khả thi và có thể lặp lại
nhiều lần để giảm chi phí sản xuất. Những hỗn hợp peptide thủy phân này có thể được sử
dụng như một chất phụ gia thực phẩm sức khỏe cho bệnh nhân cao huyết áp.

KẾT LUẬN
Các ứng dụng cơng nghiệp của protein trong lịng trắng trứng cũng như các sản phẩm
thủy phân bằng enzyme của chúng đang ở giai đoạn sơ sinh mặc dù một số nghiên cứu về
việc sử dụng protein của trứng đã được công bố trong hàng trăm năm. Các hướng nghiên
cứu được đề xuất trong tương lai về protein của lòng trắng trứng bao gồm phát triển các
phương pháp đơn giản, kinh tế và có thể mở rộng có thể tách nhiều thành phần của trứng,
sản xuất các peptit chức năng từ các thành phần đã tách biệt, đặc trưng hóa lý của các
peptit có chức năng cụ thể và kiểm tra hiệu quả chức năng của protein lòng trắng trứng
cũng như các peptit của chúng sử dụng hệ thống thực phẩm và động vật. Tách riêng các
protein chức năng từ lòng trắng trứng và sản xuất các peptit chức năng từ các protein đã
tách, và sử dụng làm chất kháng khuẩn, chất dinh dưỡng, dược phẩm hoặc chất bổ sung
chất dinh dưỡng sẽ làm tăng giá trị và công dụng của trứng, điều này sẽ cải thiện khả
năng duy trì của ngành công nghiệp trứng [1].

20