giáo trình công nghệ enzyme protein
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.95 MB, 270 trang )
Công nghệ Enzyme - Protein 1
Mục lục
PHẦN I
Chương 1
1.1.
1.2.
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
CÔNG NGHỆ ENZYME
Những khái niệm cơ bản về enzyme
Định nghĩa enzyme
Thành phần cấu tạo của enzyme
Trung tâm hoạt động của enzyme
Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử
Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử
Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động
Sự tạo thành trung tâm hoạt động
Tính đặc hiệu của enzyme
Khái niệm chung
Các hình thức đặc hiệu
3
7
7
7
14
78
9
12
16
78
1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 9
1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất 12
1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme 17
Chương 2
2.1. 2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
Động học enzyme
Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme
Động học các phản ứng enzyme
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ảnh hưởng của chất kìm hãm
19
19
21
21
26
28
2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch 92.2.3.2 Các chất kìm
hãm thuận nghịch 12
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6.
Chương 3
3.1.
3.2.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Ảnh hưởng của pH
Cách gọi tên và phân loại enzyme
Cách gọi tên enzyme
Phân loại enzyme
38
39
38
44
44
44
3.2.1. Các lớp enzyme 44
3.2.2. Các phản ứng enzyme 46
3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase
3.2.2.2 Lớp enzyme transferase
3.2.2.3 Lớp enzyme hydrolase
3.2.2.4 Lớp enzyme lyase
3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase
3.2.2.6 Lớp enzyme ligase
51
51
Chương 4 Phương pháp nghiên cứu enzyme 52 4.1. Những nguyên tắc
chung khi nghiên cứu enzyme 52 4.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme
53
4.2.1. Nguồn nguyên liệu 38
4.2.1.1 Nguồn thực vật
4.2.1.2 Nguồn động vật
4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật
4.2.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 39
4.3. Hoạt độ enzyme 54
4.3.1.
4.3.2.
Chương 5
5.1.
5.2.
5.2.1.
Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Đơn vị hoạt độ enzyme
Sinh học enzyme
Điều hòa hoạt tính enzyme
Điều hòa sinh tổng hợp enzyme
Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động
56
57
64
64
64
64
5.2.2. Điều hòa tương tác giữa RNA - polymerase với gen promotor 64
Chương 6
6.1.
6.1.1.
6.1.2.
6.2.
6.2.1.
6.2.2.
6.2.3.
6.2.4.
Công nghệ enzyme và ứng dụng
Công nghệ enzyme
Enzyme với công nghệ sinh học
Enzyme không tan
Ứng dụng
Ứng dụng trong y dược
Ứng dụng trong hóa học
Ứng dụng trong công nghiệp
Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
69
69
111
112
69
111
112
113
111
6.2.5. Ứng dụng trong công nghiệp dệt 112
6.2.6. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 113
6.2.7. Ứng dụng trong nông nghiệp
Chương 1
NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME
1.1. Định nghĩa enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó
phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này được gọi
là chất xúc tác.
Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng
có chất làm tăng các phản ứng, chất đó được gọi là enzyme. Enzyme được các cơ thể
sinh vật sinh tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể.
Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô
cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein.
Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa
học trong và ngoài cơ thể. Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng
sinh hóa có thể tóm tắt như sau:
- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh
hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất
cao.
- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng.
Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất
protein. Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chất
chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme.
1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme
Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton (có
kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton)
Enzyme được cấu tạo từ các L - - axitamin kết hợp với nhau bởi liên kết peptit.
Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân
hoàn toàn tạo thành các L - - axitamin. Trong nhiều truờng hợp ngoài axit
amin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:
? Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một
thành phần hóa học duy nhất là protein.
? Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành
phần:
- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme. Apoenzyme thường quyết
định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme.
- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại "agon": như ion kim loại,
vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của
monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần "apoenzyme" (khi cho
thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có
tên riêng là coenzyme. Phần agon quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác,
trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các
yếu tố gây biến tính.
Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử. Hiện nay người ta cũng đã xác
định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúc bậc
bốn. Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo
thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ enzyme bị giảm hoặc bị mất
hoàn toàn. Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại
với nhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi.
1.3. Trung tâm hoạt động của enzyme
Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết
hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme.
Trung tâm của enzyme được tạo nên do một số axit amin đảm trách. Các axit amin
khác trong protein không tham gia gắn với cơ chất mà chỉ làm nhiệm vụ như một
chiếc khung cấu trúc không gian của chiếc khung đó.
1.3.1. Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử
Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp
các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi
polypeptit.
Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của
enzyme là:
- Nhóm SH (sunfidryl) của Cysteine
- Nhóm - NH2 (amin) của Lysine
- Nhóm OH (Hydroxyl) của Serine, Threonine và Tyrosine
- Nhóm COOH (Cacboxyl) của axit Glutamic, Aspactic
- Vòng imidazol của Histidine
- Vòng indol của Tryptophan
- Nhóm guanilic của Acginine
Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và được
định hướng trong không gian sao cho
chúng có thể tương tác với nhau trong quá
trình phản ứng.
Ví dụ, Trung tâm hoạt động của
Colinesteraza bao gồm các nhóm: -OH
của serine, tyrosine, -COOH
của
glutamic, imidazolit của histidine.
Hình 1.1 : Trung tâm hoạt động của enzym colinesteraza
Các trung tâm hoạt động có thể hình thành dễ dàng khi các nhóm chức ở gần
nhau trên Apoenzyme. Nhưng có khi chúng ở xa nhau thì phải hoạt hóa bằng cách
cắt đi một đoạn peptide nào đó, chúng xích lại gần nhau và tạo thành trung tâm hoạt
động.
Ví dụ, Tripxinogen là trạng thái không hoạt động, nhưng khi dưới tác dụng của
enzyme Enterokinaza thì 6 axit amin bị loại ra, các nhóm chức lúc này xích lại gần
và trung tâm hoạt động được dễ dàng.
1.3.2. Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử
Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại
(vitamin, ion kim loại ) và các nhóm định chức của các axit amin ở phần
apoenzyme.
Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là những kim
loại hóa trị 2: Fe, Co, Mn, Zn, Cucác kim loại này có thể trực tiếp tham gia trong phản
ứng xúc tác, liên kết bền với các phân tử enzyme. Enzyme bị mất hoạt động sau khi
loại bỏ ion kim loại, tuy nhiên hoạt động có thể được phục hồi lại hoàn toàn ngay
sau khi thêm ion kim loại vốn có trong phân tử của nó. Một số enzyme có thể được tái
hoạt hóa dưới tác dụng của các ion kim loại khác. Tuy nhiên sự thay thế này thường
làm thay đổi hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme.
1.3.3. Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động
Dựa vào vai trò của trung tâm hoạt động các nhóm chức năng có thể phân thành
các nhóm sau đây:
- Các nhóm xúc tác: là những nhóm trực tiếp tham gia trong phản ứng kết hợp
với phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa, kết hợp với cofacto.
- Các nhóm tiếp xúc: kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hóa có vai
trò tương tự dây neo buộc cơ chất lại.
- Các gốc cấu tạo hay cố định: không trực tiếp kết hợp với cơ chất, nhưng
tương tác với các nhóm xúc tác và tiếp xúc, cố định các gốc này trong những vị trí
không gian nhất định và giữ chúng ở trạng thái hoạt động xúc tác. Sự liên hệ giữa
trung tâm hoạt động với phần còn lại của cơ chất được thực hiện qua gốc này.
1.3.4. Sự tạo thành trung tâm hoạt động
Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúc
không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất cũng giống như ổ khóa
tương ứng với chìa khóa. (Hình a)
Hình 1.2 Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b)
Từ đó có thể suy ra rằng enzyme có hình thể tương đối vững chắc, cố định, kết
hợp với cơ chất như một khuôn nào đó. Tuy nhiên dần dần người ta thấy quan
niệm của Fisher đã không giải thích thỏa đáng được nhiều dẫn liệu thực nghiệm.
Đến năm 1958, Kosland đã đề ra thuyết "tương ứng cảm ứng" cho rằng phân tử
enzyme cũng như trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn chắc mà có tính
mềm dẻo, cấu hình không gian của nó có thể thay đổi khi tiếp xúc với cơ chất Theo
Kosland thì trong phân tử enzyme có sẵn các nhóm định chức của trung tâm
hoạt động nhưng chúng chưa được sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động xúc
tác.
Khi tương tác với cơ chất, các nhóm định chức ở phần trung tâm hoạt động của
phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ
chất (Hình b). Trong trường hợp này cơ chất và enzyme có sự tương tác yếu. Do đó,
chúng rất dễ bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm
phản ứng.
Các chất có cùng kiểu cấu trúc với cơ chất thực nhưng có sự thay đổi ở một
phần nào đó trong phân tử có thể vẫn kết hợp với enzyme nhưng tạo thành phức
chất không hoạt động vì các nhóm định chức của trung tâm hoạt động không được
định hướng đúng đắn.
Ở những enzyme alosteric (enzym dị lập thể, enzym điều hòa) còn có trung tâm dị
lập thể (trung tâm điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất
khác. Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa alosteric. Khi
trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa alosteric sẽ làm thay đổi cấu
trúc không gian của trung tâm hoạt động. Do đó hoạt tính xúc tác của enzyme sẽ bị
thay đổi theo.
Nếu quá trình này làm tăng hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này
gọi là chất điều hòa dương. Ngược lại, nếu quá trình này làm giảm hoạt tính của
enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa âm. Chất điều hòa này
hoàn toàn không bị biến đổi khi chúng tương tác với enzyme.
1.4. Tính đặc hiệu của enzyme
1.4.1. Khái niệm chung
Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa
enzyme với các chất xúc tác khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự
chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác
dụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của
enzyme.
1.4.2. Các hình thức đặc hiệu
Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất.
1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng
Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong các
kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định.
Ví dụ, amino axit có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử
amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy
cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase,
aminoacid oxydase và aminotransferase.
1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất
Mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng. Các enzyme có thể
phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng. Mức độ đặc hiệu của các
enzyme không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức sau:
? Đặc hiệu tuyệt
đối
Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng
với chất nào khác. Ví dụ, urease hầu như chỉ tác dụng với ure, thủy phân nó thành
khí cacbonic và amoniac:
Tuy nhiên, ure cũng tác dụng được với các chất khác có cấu trúc gần giống ure
(hydroxyure) nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần.
Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặc hiệu
tuyệt đối, vì arginase chỉ xúc tác thủy phân L- arginin tạo thành L-ornitin và ure mà
không tác dụng lên este metylic của arginin.
Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng
chính xác cơ chất của nó.
? Đặc hiệu nhóm tương
đối
Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong
phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành
mối liên kết đó.
Ví dụ, lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este.
Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptide
? Đặc hiệu
nhóm
Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định với điều
kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định
Ví dụ, cacboxypeptidaza có khả năng phân cắt liên kết peptide gần nhóm
cacboxypeptidaza
R - C - N - CH - COOH
RCOOH + H
2
N - CH -
COOH
OH R' R'
cacboxyl tự do.
? Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất.
Ví dụ, phản ứng khử nước của axit malic để tạo thành axit fumaric dưới tác
dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với axit L - malic mà không tác dụng lên
D - malic axit
Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis
hoặc trans. Ví dụ, enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của axit
fumaric mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành axit L - malic
Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ
giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng.
Ví dụ, lactatracemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau
giữa axit D - và L - lactic, aldo - 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa
- D - glucose thành - D - Glucose, v.v Các enzyme này có vai trò quan trọng
khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể
chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ.
Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống
nhau hoàn toàn về mặt hóa học.
Ví dụ, hai nhóm - CH
2
OH trong phân tử glycerin, glycerophosphatkinase xúc tác
cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không
phải C1).
1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung
gian enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa. Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do
kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các
liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như
thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia
phản ứng dễ dàng.
Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so
với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất
xúc tác thông thường.
Ví dụ, trong phản ứng phân hủy H
2
O
2
thành H
2
O và O
2
nếu không có chất xúc
tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì năng
lượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng lượng
hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol.
Sự tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản
phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:
E + S ES P + E
Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ
chất, P là sản phẩm (Product)
- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh
và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp;
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng;
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới
dạng tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là
các tương tác:
- Tương tác tĩnh điện (liên kết ion, liên kết muối, cầu muối, cặp ion): Liên
kết này được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất (S) với nhóm tích điện trai
sdaaus trong phân tử enzym (E).
- Liên kết hydro: Liên kết này được tạo thành theo kiểu A - HB, trong đó
hydro kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo liên kết yếu với B. Liên
kết này được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B là 3A
0
.
- Tương tác VanderWaals: Tương tác này yếu hơn tương tác tĩnh điện và liên
kết hydro. Tương tác này thể hiện rất rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có thể
đồng thời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzym. Nó chỉ xảy ra khi có sự ăn
khớp về cấu trúc không gian giữa cơ chất và enzym.
