Tuyển chọn và khảo sát đặc điểm đối kháng colletotrichum siamense của vi khuẩn bacillus spp

BỘ CƠNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Tuyển chọn và khảo sát đặc điểm đối kháng Colletotrichum
siamense của vi khuẩn Bacillus spp.
Mã số đề tài: 21.2SHTP01
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Diệu Hạnh
Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ sinh học và thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh – 3/2023

1

Tp. Hồ Chí Minh, ........…


LỜI CÁM ƠN

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:
- Trường Đại học Công Nghiệp Tp. HCM đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài.
- Phịng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế đã hỗ trợ chúng tôi trong việc hoàn
thành hồ sơ đề cương cũng như nghiệm thu đề tài.
- Ban lãnh đạo cũng như bộ phận quản lý Phịng thí nghiệm của Viện Cơng nghệ
Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp. HCM đã tạo điều kiện để
các thí nghiệm được thực hiện.
- Phịng thí nghiệm Vi sinh vật học, Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm,
Trường Đại học Công Nghiệp Tp. HCM đã cung cấp các giống vi sinh vật cho

nghiên cứu này.
- Các em Học viên – Sinh viên đang nghiên cứu và học tập tại Phịng thí nghiệm
Cơng nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công
Nghiệp Tp. HCM đã tham gia thực hiện các thí nghiệm trong đề tài.

2


PHẦN I. THƠNG TIN CHUNG
I. Thơng tin tổng qt
1.1. Tên đề tài: Tuyển chọn và khảo sát đặc điểm đối kháng Colletotrichum siamense của
vi khuẩn Bacillus spp.
1.2. Mã số: 21.2SHTP01
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Họ và tên
(học hàm, học vị)

1

TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh

2

TS. Phạm Tấn Việt

3

TS. Nguyễn Ngọc Ẩn

4

Mã Thị Anh Thư

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Chủ nhiệm đề tài thực hiện các
nội dung:
- Tuyển chọn các chủng vi
khuẩn thuộc chi Bacillus có
khả năng đối kháng C.
siamense
- Khảo sát ảnh hưởng của các
yếu tố nhiệt độ, pH, protease
lên hoạt tính đối kháng của
dịch ni cấy của các chủng vi
khuẩn tuyển chọn được.
- Viết đề cương chi tiết
- Chịu trách nhiệm tổng thể về
tất cả các thí nghiệm trong đề
tài
- Viết báo cáo tổng kết đề tài,
viết bài báo khoa học
Viện CNSH&TP - - Kiểm tra hiệu quả ức chế C.
Trường ĐHCN Tp. siamense của dịch vi khuẩn
trong điều kiện in situ
HCM

- Khảo sát ảnh hưởng của dịch
nuôi cấy của các chủng vi
khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C.
siamense
Viện CNSH&TP - - Tuyển chọn các chủng vi
Trường ĐHCN Tp. khuẩn thuộc chi Bacillus có
khả năng đối kháng C.
HCM
siamense
- Khảo sát ảnh hưởng của dịch
nuôi cấy của các chủng vi
khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C.
siamense
- Xử lý số liệu.
- Khảo sát ảnh hưởng của các
CHSH9A- Viện
CNSH&TP -Trường yếu tố nhiệt độ, pH, protease
lên hoạt tính đối kháng của
ĐHCN Tp. HCM
dịch nuôi cấy của các chủng vi
khuẩn tuyển chọn được
Viện CNSH&TPTrường ĐHCN Tp.
HCM

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh
1.5. Thời gian thực hiện:
3

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2022 đến tháng 3 năm 2023
1.5.2. Gia hạn (nếu có): Khơng có
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 3 năm 2022 đến tháng 3 năm 2023
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
Khơng có sự thay đổi so với thuyết minh ban đầu
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 20 triệu đồng (Hai mươi triệu đồng chẵn)
II. Kết quả nghiên cứu
1. Đặt vấn đề
Anthracnose hay còn gọi là bệnh thán thư, là một loại bệnh thường gặp ở cây trồng và nhất
là các loại cây ăn quả như xoài, dâu tây, quýt, thanh long...và một số cây gia vị như ớt,
điều,...theo như James C. Mertely mô tả lại ở bệnh thán thư xuất hiện trên dâu tây thì khi bị
bệnh, quả thường xuất hiện những tổn thương dưới dạng đốm đen hoặc nâu, trũng tại vị trí
bệnh và thường xuất hiện trong thời tiết ẩm ướt [1], đây cũng là triệu chứng chung cho sự
nhiễm bệnh thán thư ở hầu hết các loại cây trồng khi bị nhiễm bệnh. Tại Trung Quốc, theo
Y.-Z. Diao báo cáo về các loài nấm gây bệnh thán thư đã làm tổn hại đến hơn 30 chi thực
vật, trong đó có ớt, làm tổn hại đến năng suất tới 40% [2].
Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Hưng cũng đã phân loại các chi nấm Colletotrichum gây tổn hại
đến ớt ở đồng bằng sơng Hồng trong đó có 5 lồi là C. truncatum, C. fructicola, C.
gloeosporioides, C. aeschynomenes và C. siamense [3], do Việt Nam có khí hậu nhiệt đới
ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển nên bệnh thán thư xuất hiện khá nhiều,
theo như Lê Hoàng Lệ Thủy báo cáo vào năm 2008 về 2 loài gây hại trên xồi và sầu riêng
tại đồng bằng sơng Cửu Long là Colletotrichum acutatum gây hại trên lá, hoa và quả xoài
và Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên xoài lẫn sầu riêng [4]. Ngồi ra, bệnh thán
thư tại Việt Nam cịn gây hại trên cà phê, theo như báo cáo của Nguyễn Thanh Hà năm
2011 [5], các lồi cây được mơ tả trên đều là những loại cây chủ chốt trong nền nông nghiệp
của nước ta, sự ảnh hưởng của bệnh thán thư làm ảnh hưởng rất lớn đến năng suất cũng như
ảnh hưởng ít nhiều đến nền kinh tế, chính vì vậy việc tìm ra các biện pháp nhằm ngăn ngừa
và điều trị bệnh thán thư ở cây trồng là vơ cùng cần thiết.
Đối với các phương pháp phịng bệnh thơng thường như tỉa cành chỉ có thể giảm bớt phần
nào thiệt hại do bệnh gây ra nhưng không triệt để vì mầm bệnh có thể lan nhanh và rộng khi

găp điều kiện ẩm ướt. Bên cạnh đó, khi phát hiện bệnh, nhiều nông dân đã sử dụng các biện
pháp dùng thuốc trừ sâu và diệt cỏ dại mà không biết rõ nguồn gốc gây bệnh là do nấm mốc
4


nên ít hiệu quả. Các thuốc diệt nấm thường khó phân hủy tích tụ, gây ơ nhiễm mơi trường
sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật. Ngồi ra, các thuốc diệt nấm có
bản chất hóa học khi bị lạm dụng cũng gây nên sự đột biến và sự kháng thuốc ở các chủng
nấm mốc [6, 7]. Trong những năm gần đây, các chế phẩm sinh học trong kiểm soát bệnh
thực vật đang được quan tâm nhằm bảo vệ, phòng và diệt trừ nấm bệnh trong trồng trọt vì
lợi ích thân thiện mơi trường, ít ảnh hưởng đến sức khỏe và có hiệu quả cao. Nhiều nghiên
cứu đã được thực hiện để ứng dụng vi sinh vật ức chế bệnh thán thư do Colletotrichum gây
ra như Wilasinee Konsue đã nghiên cứu việc sử dụng nấm men trong điều trị bệnh thán thư
trên xoài, hay ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis OE-04 đối kháng
Colletotrichum gossypii gây bệnh trên cây bông, Bacillus velezensis CE 100 ức chế bệnh do
Colletotrichum gloeosporioides trên cây óc chó, Bacillus safensis sp. QN1NO-4 chống lại
bệnh thán thư trên cây dâu tây do Colletotrichum fragariae, hay Bacillus subtilis HM1 trong
kiểm soát sau thu hoạch táo để ngăn ngừa nấm mốc Colletotrichum acutatum, hay vi khuẩn
Bacillus methylotrophicus, Bacillus thuringiensis

ức chế sự phát triển của Fusarium

oxysporum, Botryosphaeria sp., Trichoderma atroviride, Colletotrichum gloeosporioides,
and Penicillium expansum trên sơn trà [8-13]. Như vậy, qua các báo cáo được ghi nhận, chi
vi khuẩn Bacillus đã được nghiên cứu và ứng dụng nổi bật trong việc ức chế các loại bệnh
do nấm mốc gây ra, đặc biệt là Colletotrichum.
Trên cơ sở đó, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài "Tuyển chọn và khảo sát đặc điểm đối
kháng Colletotrichum siamense của vi khuẩn Bacillus spp." nhằm hướng tới việc sản xuất các
chế phẩm sinh học có khả năng ức chế nấm C. siamense gây bệnh trên cây trồng, mang lại
nhiều lợi ích về mặt kinh tế, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường tự nhiên.

2. Mục tiêu
a. Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn Bacillus và xác định được đặc điểm đối kháng với
nấm Colletotrichum siamense gây bệnh thán thư.
b. Nội dung đề tài.
-

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng C.
siamense.

5


-

Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C.
siamense.

-

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng của
dịch ni cấy của các chủng vi khuẩn

-

Kiểm tra hiệu quả ức chế C. siamense của dịch vi khuẩn trong điều kiện in situ trên
mô hình quả xồi

3. Phương pháp nghiên cứu
3.1 Nhân giống và bảo quản các chủng vi khuẩn, nấm mốc

Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (35 chủng) và chủng nấm mốc Colletotrichum
siamense gây bệnh thán thư được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu và được lưu trữ trong
bộ sưu tập giống của Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, đại học Cơng nghiệp Tp. Hồ Chí
Minh, ở điều kiện -70C. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. được hoạt hoá qua đêm trong
môi trường Luria-Bertani broth (LB broth) (Himedia-India, tryptone 10,0 g; cao nấm men
5,0 g; NaCl 10,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở 37C, 150 vòng/phút và chủng nấm
mốc kiểm định được nuôi cấy trên môi trường PGA (Khoai tây 200 g, chiết dịch; Glucose
20,0 g; Agar 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày trước
khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc kiểm định của các chủng vi khuẩn Bacillus
spp.
Khả năng đối kháng nấm mốc kiểm định C. siamense của 35 chủng vi khuẩn Bacillus spp.
được đánh giá dựa trên phương pháp khuếch tán trên giếng thạch [14]. Các chủng vi khuẩn
được nuôi cấy trong môi trường LB broth, lắc 150 vòng/phút, 37°C trong 16 giờ để chuẩn bị
cho việc đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc. Bên cạnh đó, chủng nấm mốc C. siamense
được ni cấy trên mơi trường PGA ở nhiệt độ phịng. Các mảnh thạch có chứa hệ sợi tơ
nấm mốc 6 ngày tuổi có đường kính 5,0 mm được đặt vào tâm đĩa Petri có chứa môi trường
PGA. Sau 2 ngày, trên các đĩa Petri này được đục các giếng thạch cách mép đĩa 1,0 cm và
nhỏ 100 μL dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn. Các đĩa tiếp tục được ủ ở nhiệt độ phòng
và quan sát sự phát triển của hệ sợi tơ nấm sau 5 ngày nuôi ủ. Khả năng đối kháng của các
chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng ức chế sự phát triển của hệ sợi tơ nấm
dựa trên sự quan sát hệ sợi tơ nấm từ tâm đĩa Petri đến lỗ thạch chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn
6


so với các vị trí khác. Mức độ mạnh yếu của hoạt tính đối kháng với nấm C. siamense của các
chủng Bacillus tùy thuộc vào khoảng cách ức chế hệ sợi tơ nấm của các chủng vi khuẩn, hay còn
gọi là bán kính kháng mốc và được đo từ mép khuẩn lạc vi khuẩn đến vi trí tơ nấm bị ức chế.

3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của Bacillus spp.

Khả năng sản sinh ra enzyme ngoại bào chitinase được kiểm tra thơng qua vịng phân giải cơ
chất trên môi trường thạch tương ứng. Các đĩa môi trưởng LB có chứa 10g cơ chất chitin,
được sử dụng để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme chitinase. Chủng vi khuẩn
Bacillus spp. được tăng sinh trong môi trường lỏng LB qua đêm và cấy vào các đĩa môi
trường kiểm định. Sau 3 ngày ủ tại 37℃, vòng phân giải cho hoạt tính chitinase được kiểm tra
bằng thuốc thử lugol [15].
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Bacillus spp. lên hệ sợi tơ nấm mốc
Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. lên hệ sợi tơ nấm mốc được kiểm tra
bằng cách ủ hệ sợi tơ nấm đã được nuôi trong môi trường PGB (Khoai tây 200 g, chiết dịch;
Glucose 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) trong thời gian 5 ngày với dịch vi khuẩn
đã được tăng sinh tại 37°C, 150 vòng/phút trong 16 giờ (dịch tăng sinh vi khuẩn đã được ly
tâm ở 4000 vòng trong 15 phút, thu dịch nổi, và dịch nổi sau đó được lọc qua màng lọc 0,45
µm). Sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc trong mơi trường PGB có hoặc khơng có dịch vi
khuẩn được kiểm tra sau 5 ngày ủ bằng cách quan sát dưới kính hiểu vi quang học ở độ
phóng đại 1000 lần [16].
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, điều kiện pH và proteinase K lên hoạt tính
kháng C. siamense của Bacillus spp.
Độ bền nhiệt của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. lên hoạt tính kháng mốc C. siamense
được khảo sát bằng cách ủ dịch nuôi cấy vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau 60°C, 70°C,
80°C và 90°C trong các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút và 15 phút, sau đó kiểm tra hoạt
tính kháng mốc cịn lại của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch.
Độ bền pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn cũng được kiểm tra tương tự bằng cách điều chỉnh
pH của dịch nuôi cấy bằng dung dịch NaOH và HCl đã được hấp khử trùng sao cho pH dịch
nuôi cấy đạt các giá trị 3,0 đến 10,0 và ủ trong 2 giờ, sau đó kiểm tra hoạt tính kháng mốc
cịn lại của dịch ni cấy vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Hoạt tính
7


kháng mốc được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính ức chế tơ còn lại của các nghiệm thức so

với hoạt tính của dịch ni cấy vi khuẩn ban đầu [17].
Ảnh hưởng của proteinase K lên hoạt tính kháng mốc được khảo sát bằng cách ủ dịch nuôi
cấy vi khuẩn với proteinase K ở nồng độ 1,0 mg/ml trong 2 giờ ở 37°C, sau đó kiểm tra hoạt
tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch [18]
Hoạt tính kháng mốc cịn lại của dịch nuôi cấy sau khi xử lý ở các điều kiện khác nhau được
tính bằng bán kính kháng mốc của mẫu thực nghiệm chia cho bán kính kháng mốc của mẫu
đối chứng. Kết quả được trình bày theo tỷ lệ phần trăm (%).
3.6. Khảo sát khả năng đối kháng C. siamense của vi khuẩn Bacillus spp. trên quả xoài
Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus spp. lên nấm mốc C. siamense trên thực vật được
kiểm tra với mơ hình quả xồi. Quả xồi cát được lựa chọn vừa chín và khơng có vết
thương. Các quả xồi được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, rửa với clorin 100 ppm, rửa lại
với nước cất vô trùng và sát trùng bằng cồn 70°. Các quả xoài được tạo vết thương tại 3 vị
trí bằng kim tiêm trên thân quả xoài với độ sâu 0,2-0,3 cm. Dịch huyền phù sợi nấm C.
siamense được chuẩn bị bằng cách nuôi hệ sợi tơ nấm trong môi trường PGB sau 5 ngày,
phối trộn với môi trường LB vô trùng theo tỷ lệ 1:1 và tiêm 10 µl vào quả xồi tạo mẫu đối
chứng (+). Hỗn hợp của dịch huyền phù sợi nấm và dịch ni cấy vi khuẩn (tăng sinh tại
37°C, 150 vịng/phút trong 16 giờ) được phối trộn theo tỷ lệ 1:1 và được tiêm 10 µl vào quả
xồi tạo mẫu thử nghiệm. Mẫu đối chứng (-) sẽ được thực hiện bằng cách tiêm 10µl mơi
trường LB vơ trùng. Quả xồi sau đó sẽ được để khơ dịch tiêm và đặt vào trong buồng ẩm
đã được khử trùng trước đó. Kết quả được theo dõi sau 6 ngày và quan sát mức độ biểu hiện
bệnh. Mức độ biểu hiện bệnh được tính tốn bằng cách đo diện tích bề mặt mẫu có biểu hiện
bệnh bằng phần mềm QuPath v0.4.0 [19]. Phần trăm biểu hiện bệnh được tính bằng mức độ
biểu hiện bệnh trên các mẫu thực nghiệm chia cho mức độ biểu hiện bệnh ở mẫu đối chứng
(-).
3.6. Định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn Bacillus được định danh ở mức phân tử bằng phương pháp giải trình tự đoạn
gen 16S rRNA bởi phịng thí nghiệm Cơng nghệ động vật (Trường Đại học Konkuk, Seoul, Hàn
quốc) với cặp mồi được sử dụng là 27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG và 1492R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3' [20]. Kết quả giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu 16SrRNA của các vi khuẩn có sẵn trên National Center for Biotechnology Information (NCBI). Các
8

trình tự gene tương đồng được truy xuất từ Genbank (NCBI, [htpp://www/ncbi.nlm.nhi.gov]) và sắp
gióng bằng Clustal X2.1. Cây phát sinh lồi được xây dựng dựa trên thuật tốn UPGMA với
Bootstrap 1000 lần lập bằng phần mềm Mega5 [21].

3.7. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Giá trị kết quả của các thí nghiệm là trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được tính tốn,
vẽ biểu đồ trên Microsoft Excel 2013 và được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA
bằng phần mềm Statgraphics Centurion 18.
4. Tổng kết về kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được một số hiệu quả về mặt khoa học và đào
tạo như sau:
-

Tuyển chọn được 8 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng C. siamense

-

Quan sát được sự biến đổi của hệ sợi tơ nấm C. siamense dưới tác động của dịch
nuôi 8 chủng vi khuẩn tuyển chọn được

-

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng
của dịch nuôi cấy 8 chủng vi khuẩn tuyển chọn được lên sự phát triển của hệ sợi
tơ nấm mốc.

-

Xác định được hiệu quả ức chế mức độ biểu hiện bệnh trên mơ hình quả xồi của

các dịch ni cấy vi khuẩn.

- Cơng bố 1 bài báo khoa học trên Tạp chí Công nghệ IUH
5. Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận
Qua quá trình thực hiện nghiên cứu, các kết quả thu được như sau:
-

Từ 35 chủng vi khuẩn Bacillus, chúng tôi đã sàng lọc được 8 chủng vi khuẩn D7,
D18, D19, TH5, TH14, TH24, II và N9 có hoạt tính đối kháng Colletotrichum
siamense tốt.

-

Hầu hết các chủng đều cho khả năng phân giải chitin cao và làm ảnh hưởng đến cấu
trúc của vách tế bào nấm vì chitin là 1 trong những thành phần có trong tơ nấm mốc,
khả năng phân giải chitin cao ở các chủng như TH14 (1,83cm); TH5 (1,77cm); khả
năng phân giải chitin yếu nhất là chủng N9 (1,27cm).

9


-

Hầu hết hợp chất kháng mốc trong dịch nuôi cấy 8 chủng vi khuẩn đều bền ở khoảng
pH rộng (pH 3,0-10,0) (hoạt tính cịn lại trên 60%) và bền nhiệt lên đến 80°C trong
15 phút (hoạt tính cịn lại trên 40%).

-

Khi kiểm tra sự tác động của proteinase K đến hoạt tính kháng mốc trong dịch ni

cấy 8 chủng vi khuẩn đã cho thấy 5 chủng D7, D19, TH5, TH24, N9 bị ảnh hưởng và
giảm hoạt tính kháng mốc so vơi đối chứng, trong khi 3 chủng D18, TH14, II cho
thấy hoạt tính kháng mốc gia tăng.

-

Thử nghiệm trên mơ hình in situ quả xồi, 8 chủng vi khuẩn đã cho kết quả giảm
mức độ biểu hiện bệnh của nấm mốc trên quả xoài lên đến ~ 90%.

Như vậy, với các kết quả đạt được, 8 chủng vi khuẩn Bacillus D7, D18, D19, TH5,
TH14, TH24, II và N9 là các đối tượng tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học đối với
nấm mốc C. siamense, hạn chế bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt trên
ngành trồng trọt và kinh doanh quả xồi.
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Tiếng Việt: Bệnh thán thư do nấm mốc Colletotrichum làm giảm năng suất thu hoạch
của nhiều loại cây trồng. Việc kiểm soát loại bệnh này bằng phương pháp sinh học và giảm
sử dụng các hóa chất đang ngày càng được quan tâm, trong đó các chủng vi khuẩn Bacillus
là đối tượng tiềm năng. Trong nghiên cứu này, 35 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã
được kiểm tra khả năng đối kháng với nấm mốc Colletotrichum siamense và kết quả cho
thấy 28/35 chủng vi khuẩn đã được xác nhận có khả năng đối kháng với nấm mốc C.
siamense. Dịch nuôi cấy của 8 chủng vi khuẩn cho hoạt tính đối kháng cao D7, D18, D19,
TH5, TH14, TH24, II và N9 đã tác động lên vách tế bào của hệ sợi tơ nấm C. siamense với
các biểu hiện như trương phình, đứt gãy, gấp khúc, phân hủy tế bào của hệ sợi tơ nấm. C.
siamense. Đồng thời các chủng vi khuẩn này cũng thể hiện khả năng sinh tổng hợp các
enzyme phân hủy vách tế bào nấm chitinase. Hoạt tính kháng nấm của dịch ni cấy vi
khuẩn cũng thể hiện khả năng bền nhiệt, bền pH và bền với hoạt động của protease K ở các
mức độ khác nhau. Thử nghiệm khả năng đối kháng trên mơ hình quả xồi cho thấy dịch
ni cấy của 8 vi khuẩn kiểm nghiệm làm giảm hơn 90% mức độ biểu hiện bệnh gây ra bởi
nấm mốc C. siamense.
Từ khóa: Bệnh thán thư, Bacillus amyloliquefaciens, kháng mốc, Colletotrichum siamense, xoài

10


Tiếng Anh: Anthracnose disease caused by the fungus Colletotrichum affects many crops
and reduces crop yields. Controlling this disease by biological methods and reducing the use
of chemicals is of increasing interest, in which Bacillus strains are potential candidates. In
this study, the antagonistic characteristics of 35 strains belong to Bacillus genus on
Colletotrichum siamense were investigated and the results showed that 28/35 bacterial
strains were confirmed to have the ability to antagonize the C. siamense. Cultures of 8
bacterial strains showed high antagonistic activity of D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II
and N9 affected the fungal cell wall which led to swelling, breakage, folding, and cell lysis
of the fungal mycelia. Moreover, these bacterial strains also showed the ability to
biosynthesize fungal cell wall degrading enzymes such as chitinase. The antifungal activity
of the bacterial cultures also demonstrated heat stability, pH stability, and resistance to
protease K activity at different levels. Furthermore, in vivo antagonistic test on mango fruit
model showed that these Bacillus spp. reduced more than 90% of the disease severity
caused by C. siamense.
Key words: Anthracnose, antifungal, Bacillus amyloliquefaciens, Colletotrichum siamense,
mango.
III. Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
TT

kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm
Đăng ký

1

Chủng vi khuẩn Bacillus
có hoạt tính đối kháng C.

Đạt được

5-8 chủng có hoạt tính 8 chủng vi khuẩn có
sinh học
hoạt tính hoạt tính đối

siamense

kháng C. siamense. 6
chủng đã được định
danh bằng phương pháp
sinh học phân tử.

2

Bài báo IUH

1 bài báo khoa học cấp

Đã được chấp nhận đăng

Trường

tại Tạp chí Khoa học và
Cơng nghệ -IUH

11


Ghi chú:
-

Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp

nhận nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn trường ĐH Công Nghiệp Tp. HCM đã cấp kính phí
thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định.
-

Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối báo cáo.

(đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang cuối
kèm thơng tin quyết định và số hiệu xuất bản)
IV. Tình hình sử dụng kinh phí
T

Nội dung chi

T
A

Chi phí trực tiếp

1

Th khốn chun mơn

2

Ngun, nhiên vật liệu, cây con..

3

Thiết bị, dụng cụ

4

Cơng tác phí

5

Dịch vụ thuê ngoài

6

Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu giữa kỳ

7

In ấn, Văn phịng phẩm

8

Chi phí khác

B

Chi phí gián tiếp

1

Quản lý phí

2

Chi phí điện, nước

Kinh phí

Kinh phí

được duyệt

thực hiện

(triệu đồng)

(triệu đồng)

16.986.000

16.986.000

1.500.000

1.500.000

1.514.000

1.514.000

Ghi
chú

Tổng số
V. Kiến nghị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)
- Tiếp tục nghiên cứu về các thành phần hóa học có vai trị kháng mốc C. siamense trong
dịch nuôi cấy của từng loại vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao.
- Thử nghiệm trên quy mơ pilot của các vi sinh có hoạt tính tốt giúp ngăn ngừa bệnh thán
thư trong ngành trồng trọt và kinh doanh quả xoài.
VI. Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)
12


-

Chủng vi khuẩn Bacillus spp. có hoạt tính ức chế sự phát triển của hệ sợi tơ nấm C.
siamense (6 chủng).

-

Bài báo đã được chấp nhận đăng ở Tạp chí Khoa học và Công nghệ IUH (1 bài)
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 3 năm 2023

Chủ nhiệm đề tài

Phịng QLKH&HTQT

Viện Cơng nghệ Sinh học &
Thực Phẩm

13


PHẦN II. BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
(báo cáo tổng kết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ý của hội đồng nghiệm thu)
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về nấm Colletotrichum
1.1.1 Đặc điểm hình thái
Colletotrichum là một chi quan trọng trong họ Melanconiacae, bộ Melanconiales, lớp
Coelomycetes. Colletotrichum sp. được phân loại dựa vào đặc điểm tản nấm, hình dạng,
kích thước bào tử, lơng gai và đĩa áp. Colletotrichum sp. có 2 hình thức sống là ký sinh và
hoại sinh.

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum perseae. Hình a - b: Mặt trước và mặt
sau của nấm trên môi trường PDA. Hình c: Cuống sinh bào tử đính (Ascomata). Hình d:
Lơng gai (Setae). Hình e: Các tế bào thể bình (Conidiogenous cells). Hình f - g: bào tử.
Hình h – i: Túi bào tử (Asci and ascospores). Hình j – q: Đĩa áp (Appressoria) [22].

Hình dạng, kích thước bào tử và hình thái khuẩn lạc có sự khác biệt giữa các lồi. Trên mơi
trường PDA, hình thái khuẩn lạc của Collectotrichum sp. có màu trắng xám, vàng nhạt đến
hồng cam. Kích thước bào tử của các lồi Colletotrichum cũng có sự khác biệt. Chiều dài
bào tử dao động từ 11-17μm, chiều rộng dao động từ 3,5-10μm. Bào tử dạng hình trụ hoặc
hình liềm, trong suốt, đầu hơi tù, đỉnh trịn, khơng có vách ngăn. Bào tử nang được tạo ra
14

sau giai đoạn hợp nhân và giảm phân, trong mỗi nang thường chứa 8 bào tử. Sợi nấm mảnh,
phân nhánh, khơng màu, có vách ngăn, có nội bào và gian bào. Mỗi tế bào của hệ sợi nấm
sản xuất ra nhiều hạt dầu. Khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng
chất nền nhỏ dưới lớp ngồi cùng. Colletotrichum có khả năng sinh sản vơ tính bằng bào tử
đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử. Trước khi nảy mầm, bào tử có hiện tượng
phồng lên, tế bào chất phình to. Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô
van hoặc hình quả trứng, được gọi là đĩa áp [22, 23]
1.1.2 Cơ chế gây bệnh của Colletotrichum sp.
Bào tử của nấm từ các mô trên quả bị bệnh hoặc từ cây bệnh phát tán đến toàn cây, toàn
ruộng qua nước mưa, nước tưới. Khi đã tiếp xúc với vật chủ, bào tử nảy mầm và sản xuất
ống mầm, sau đó tiếp tục hình thành đĩa áp xâm nhập trực tiếp vào lớp biểu bì của thực vật.
Xung quanh đĩa áp tiết ra dịch ngồi bào, giúp đĩa áp có thể dễ dàng bám dính lên vật chủ.
Sau khi xâm nhập vào các mơ chủ, các lồi Colletotrichum thường có hai chiến lược lây
nhiễm ký chủ khác nhau: ký sinh hemibiotrophy (intracellular hemibiotrophic pathogens)
hoặc mầm bệnh nội mô dưới da (subcuticular intramural pathogens). Ở cơ chế mầm bệnh
nội mô dưới da, mầm bệnh phát triển bằng cách hình thành một mạng lưới nội bào của sợi
nấm bên dưới lớp biểu bì, sau đó lan nhanh khắp mơ, gây hoại tử và phá hủy thành tế bào
thực vật thông qua việc tiết enzyme cutinase. Với cơ chế ký sinh hemibiotrophy, mầm xâm
lấn vào tế bào chủ bằng một túi nhiễm trùng nguyên phát, sau đó tăng sinh sợi nấm nguyên
sinh dày và sợi nấm thứ cấp mỏng. Sợi nấm phát triển trong lòng tế bào, giữa màng plasma
và thành tế bào thực vật. Sự tương tác giữa thực vật và nấm bệnh lúc này là biotrophic. Chỉ
trong giai đoạn sau của quá trình lây nhiễm, nấm mới bị hoại tử [23, 24].
1.1.3 Colletotrichum siamense
C. siamense là một trong năm loại nấm được xác định thuộc phức hợp C. gloeosporioides
gây bệnh thán thư bao gồm Colletotrichum aenigma, C. alienum, C. perseae, C. siamense
và C. Theobromicola. Các loài nấm này được phân bố rộng rãi ở ít nhất ba châu lục. Ngoại
trừ lồi C. perseae có số lượng ký chủ rất hạn chế, bốn lồi Colletotrichum cịn lại có phạm
vi ký chủ tương đối rộng, trong đó có lồi C. siamense. C. siamense được báo cáo là đối
tượng gây nên bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng khác nhau như cây trồng họ cam quýt,
cây chè, ớt, cao su, hành, mãng cầu, dâu tây... [25]. Gần đây, C. siamense cùng với C.

asianum được báo cáo là 2 loài mới gây nên bệnh thán thư trên xoài ở Thái Lan (2022) [26].

15


Như vậy, với khả năng gây bệnh trên nhiều ký chủ thực vật và sự lan truyền rộng rãi trên thế
giới, C. siamense là đối tượng cần được kiểm soát trong phát triển nơng nghiệp.
1.2 Bệnh thán thư trên xồi
1.2.1 Triệu chứng
Thán thư là một trong những loại bệnh phổ biến trên cây xồi. Bệnh gây hại trong suốt q
trình phát triển của cây từ lúc vừa ra lá non đến khi thu hoạch quả. Trên lá, bệnh gây ra các
vết hoại tử màu nâu đen, xuất hiện ở cả hai mặt của lá. Các vết hoại tử từ từ lan rộng thành
các mảng lớn, khiến lá xoài quắn quéo và thủng rách, gây ra bệnh cháy lá trên xoài. Giai
đoạn lá non là giai đoạn nhạy cảm nhất với bệnh. Ở điều kiện thuận lợi, bệnh sẽ xâm nhiễm
lên cành cây và gây chết cành. Bệnh thán thư cũng gây ảnh hưởng ở giai đoạn ra hoa của
cây xoài. Hoa khi nhiễm bệnh cũng có các chấm hoại tử màu đen, khiến hoa không thể thụ
phấn được. Trên quả xoài, bệnh cũng gây vết hoại tử màu đen xuất hiện ở phần cuống hoặc
trên thân quả. Các khối bào tử màu hồng cam hình thành trên vết thương. Mầm bệnh xâm
nhiễm vào quả xồi từ khi trái cịn xanh, tuy nhiên đến khi quả xồi chín gần thu hoạch
được mới phát bệnh hàng loạt. Bệnh thán thư khiến quả xoài thối rữa và rụng sớm, gây thiệt
hại kinh tế rất lớn cho người nơng dân [27].

Hình 1.2: Bệnh thán thư trên quả của trái xồi. Hình A: Bệnh thán thư ở giai đoạn đầu. Hình
B: Bệnh thán thư ở giai đoạn nghiêm trọng. Hình C: Sự phát triển của vết hoại tử bên trong
16


qua xồi. Hình D: Bào tử của nấm Colletotrichum gloeosporioides hiện diện trên vết hoại tử
[27].
1.2.2 Nguyên nhân và chu trình gây bệnh

Chi nấm Colletotrichum spp. được cho là tác nhân chính gây ra bệnh thán thư trên xồi.
Trong các nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định các chủng C. gloeosporioides, C.
capsici, C. falcatum, C. truncatum, C. sansevieriae, C. acutatum và C. coccodes có khả
năng gây ra bệnh thán thư trên các loại cây trồng ở Ấn Độ [28]. Bệnh phát triển qua các giai
đoạn sau:

Hình 1.3: Chu trình lây nhiễm bệnh thán thư trên xồi [29].
Giai đoạn phát tán: ở giai đoạn này, bào tử nấm bệnh trong đất sẽ được phát tán khi nước
mưa bắn lên cây hoặc thông qua việc tưới nước của người nông dân
Giai đoạn tiếp xúc: bào tử mầm bệnh xâm nhiễm vào các vị trí tổn thương trên hoa, lá, quả
hoặc thân cây
Giai đoạn nhiễm bệnh: trên lá hoặc quả còn non, bào tử sẽ nảy mầm và xâm nhập qua lớp
biểu bì và lan rộng tới các mơ. Trên trái chín, mầm bệnh cũng xâm nhập qua lớp biểu bì,
17


nhưng đến khi trái cây vào giai đoạn chín già mới bộc phát bệnh. Trong điều kiện ẩm ướt,
khi độ ẩm gần 100% và nhiệt độ dao động từ 25°C - 30°C là lúc mầm bệnh phát triển mạnh
nhất [30].
1.3 Chi Bacillus trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật
Các chủng Bacillus là vi khuẩn Gram dương hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí đa dạng, có khả
năng sinh enzyme catalase và hiện diện ở khắp nơi trong tự nhiên. Chúng có khả năng hình
thành nội bào tử khi điều kiện mơi trường trở nên bất lợi, chỉ có một nội bào tử được hình
thành trên một tế bào và có thể ở trạng thái khơng hoạt động này trong nhiều năm. Nội bào
tử của một chủng Bacillus từ vùng Morocco đã được báo cáo là vẫn sống sót sau khi được
xử lí bằng nhiệt khơ với nhiệt độ lên đến 420°C và khả năng này được duy trì sau nhiều thế
hệ. Do bào tử của nhiều lồi Bacillus có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút
ẩm nên chúng khó bị loại bỏ khỏi các nguyên liệu y tế, dược phẩm và là nguyên nhân
thường xuyên gây ơ nhiễm. Một số lồi Bacillus được biết đến như những sinh vật gây hư
hỏng thực phẩm [31, 32].

Bên cạnh đó, các lồi Bacillus cũng được sử dụng trong nhiều quy trình y tế, dược phẩm,
nơng nghiệp và cơng nghiệp bằng cách tận dụng các đặc điểm sinh lý đa dạng, khả năng tạo
ra nhiều loại enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa khác. Ngoại trừ B. anthracis và B.
cereus sản sinh độc tố, các chủng Bacillus còn lại thường có lợi, an tồn cho thực vật và mơi
trường sinh thái [18]. Những đặc tính này của các lồi Bacillus làm cho chúng trở thành tác
nhân kiểm sốt sinh học tốt để thay thế thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp. Nhiều chủng
Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh do nấm mốc gây ra trên thực vật như
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, các chủng Aspergillus và Penicillium ….[32-34].
1.4 Biện pháp phòng và trị bệnh thán thư
Trong những năm gần đây, các chế phẩm sinh học trong kiểm soát bệnh thực vật đang được
quan tâm nhằm bảo vệ, phòng và diệt trừ nấm bệnh trong trồng trọt vì lợi ích thân thiện mơi
trường, ít ảnh hưởng đến sức khỏe và có hiệu quả cao. Phịng và điều trị bệnh thán thư là
vấn đề quan trọng giúp nâng cao chất lượng nông sản và làm giảm tổn thất kinh tế do dịch
hại gây ra. Việc sử dụng kết hợp các phương pháp phòng trị bệnh một cách hợp lý sẽ giúp
tối ưu khả năng chống chọi bệnh hại của cây.
Phương pháp hóa học: việc sử dụng thuốc hóa học trong phòng và điều trị bệnh thán thư
trên cây trồng vẫn là một trong những biện pháp có hiệu quả. Ở giai đoạn ra hoa, để ngăn
18


chặn bệnh thán thư, người nơng dân có thể phun thuốc Bavistin trong vòng 15 ngày. Ở giai
đoạn tiền thu hoạch, người nơng dân có thể phun dung dịch có thành phần là Copper
oxychloride 0,2% và zineb 0,2% sau khi tưới để phòng trừ bệnh. Ở giai đoạn bảo quản sau
thu hoạch, phương pháp xử lý trái trong dung dịch salicylic acid hoặc potassium
phosphonate nồng độ 1000mg/l kết hợp ngâm trái trong dung dịch natri bicarbonate 3% ở
51,50C giúp ngăn chặn sự ảnh hưởng của bệnh thán thư đến trái xoài trong 12 ngày [35, 36].
Bên cạnh phương pháp sử dụng thuốc hóa học, phịng trị bệnh thán thư bằng phương pháp
sinh học đang được ưu tiên ứng dụng vì tính an tồn và thân thiện với mơi trường cũng như
sức khỏe con người. Năm 2016, Nguyền Hồng Quí và cộng sự đã tìm ra 3 chủng xạ khuẩn
HG10, HG17 và HG21 có khả năng phịng trị bệnh thán thư trên xoài với hiệu quả làm giảm

bệnh cao nhất là 77,32% so với mẫu đối chứng. Kết quả này cho khả năng phòng trị bệnh
của các chủng xạ khuẩn cao tương đương với thuốc hóa học Carbenzim – một loại thuốc
thơng dụng trong phịng trị bệnh thán thư [37]. Ngồi việc sử dụng các chủng vi sinh vật
trong phòng trị bệnh thán thư, các chế phẩm sinh học có khả năng kháng nấm cũng đang
được nghiên cứu rộng rãi. Phạm Đình Dũng và cộng sự đã tìm ra chế phẩm oligochitosan –
nano silica có khả năng đối kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides. Nghiên cứu cho
thấy khi bổ sung chế phẩm ở nồng độ từ 20-60 ppm cho kết quả ức chế nấm cao nhất là
67,2% [38]. Một số chiết xuất từ thực vật cũng có khả năng ức chế bệnh thán thư. Đặng Đức
Quyết và cộng sự đã tạo ra chế phẩm CP 7.8 có thành phần từ chiết xuất củ nghệ vàng có
khả năng hạn chế bệnh thán thư hại ớt, bệnh thối xám hại dâu tây, cải bắp và hoa hồng [39].
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để ứng dụng vi sinh vật ức chế bệnh thán thư do
Colletotrichum gây ra như Wilasinee Konsue đã nghiên cứu việc sử dụng nấm men trong
điều trị bệnh thán thư trên xoài, hay ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis OE-04
đối kháng Colletotrichum gossypii gây bệnh trên cây bông, Bacillus velezensis CE 100 ức
chế bệnh do Colletotrichum gloeosporioides trên cây óc chó, Bacillus safensis sp. QN1NO4 chống lại bệnh thán thư trên cây dâu tây do Colletotrichum fragariae, hay Bacillus subtilis
HM1 trong kiểm soát sau thu hoạch táo để ngăn ngừa nấm mốc Colletotrichum acutatum,
hay vi khuẩn Bacillus methylotrophicus, Bacillus thuringiensis ức chế sự phát triển của
Fusarium oxysporum, Botryosphaeria sp., Trichoderma atroviride, Colletotrichum
gloeosporioides, và Penicillium expansum trên sơn trà [8-13]. Như vậy, qua các báo cáo
được ghi nhận, chi vi khuẩn Bacillus đã được nghiên cứu và ứng dụng nổi bật trong việc ức
chế các loại bệnh do nấm mốc gây ra, đặc biệt là Colletotrichum. Tuy nhiên, hiện nay,
19


nghiên cứu về việc sử dụng các chủng Bacillus để kiểm sốt sinh học bệnh thán thư trên
xồi vẫn chưa có báo cáo nào được cơng bố, do đó, việc thực hiện nghiên cứu này là cần
thiết trong việc phát triển nền nông nghiệp bền vững của nước nhà.

20

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (35 chủng) và chủng nấm mốc Colletotrichum
siamense gây bệnh thán thư được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu và được lưu trữ trong
bộ sưu tập giống của Phịng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, đại học Công nghiệp Tp. Hồ Chí
Minh, ở điều kiện -70C. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. được hoạt hố qua đêm trong
mơi trường Luria-Bertani broth (LB broth) (Himedia-India, tryptone 10,0 g; cao nấm men
5,0 g; NaCl 10,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở 37C, 150 vòng/phút và chủng nấm
mốc kiểm định được nuôi cấy trên môi trường PGA (Khoai tây 200 g, chiết dịch; Glucose
20,0 g; Agar 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày trước
khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 2.1: Chủng vi khuẩn và nguồn gốc phân lập
STT Tên chủng
1
Bacillus subtilis D5

Nguồn gốc phân lập (**)
Đất – Tp. Hồ Chí Minh

2

Bacillus licheniformis D7

Đất – Tp. Hồ Chí Minh

3
4
5

Bacillus sp. D14
Bacillus sp. D15
Bacillus subtilis D18

Đất – Tp. Hồ Chí Minh
Đất – Tp. Hồ Chí Minh
Đất – Tp. Hồ Chí Minh

6

Bacillus amyloliquefaciens D19

Đất – Tp. Hồ Chí Minh

7
8
9

Bacillus sp. I
Bacillus sp. II
Bacillus sp. N9

10

Bacillus sp. R4

11

Bacillus sp. R19

12

Bacillus sp. R20

13

Bacillus sp. R22

14
15
16
17
18

Bacillus sp. TH1
Bacillus sp. TH2
Bacillus sp. TH3
Bacillus sp. TH4
Bacillus velezensis TH5

Đất – Bình Thuận
Đất – Bình Thuận
Nước thải – Tp. Hồ
Minh
Nước thải – Tp. Hồ
Minh
Nước thải – Tp. Hồ
Minh
Nước thải – Tp. Hồ
Minh

Nước thải – Tp. Hồ
Minh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh

Ghi chú
Định danh SHPT16SrRNA
Định danh SHPT16SrRNA
(*)
(*)

Định danh SHPT16SrRNA
Định danh SHPT16SrRNA
(*)
(*)

Chí

(*)

Chí

(*)

Chí

(*)

Chí

(*)

Chí

(*)

(*)
(*)
(*)
(*)

Định danh SHPT16SrRNA
21


19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

31

Bacillus sp. TH6
Bacillus sp. TH7
Bacillus sp. TH8
Bacillus sp. TH8
Bacillus sp. TH10
Bacillus sp. TH12
Bacillus sp. TH14
Bacillus sp. TH15
Bacillus sp. TH17
Bacillus sp. TH18
Bacillus sp. TH19
Bacillus sp. TH20
Bacillus sp. TH21
Bacillus subtilis TH22

Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh
Đất – Trà Vinh

Đất – Trà Vinh

32

(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)
(*)

Định danh SHPT16SrRNA
Định danh SHPT16SrRNA

Bacillus subtilis TH24
Đất – Trà Vinh
33
(*)
34
Bacillus sp. TH26
Đất – Trà Vinh
(*)
35

Bacillus sp. TH27
Đất – Trà Vinh
(*) Các chủng vi khuẩn được định danh tới chi bằng phương pháp quan sát hình thái và đặc
điểm sinh hóa theo khóa phân loại Bergey
(**) Các mẫu đất, mẫu nước thải được thu nhận tại các ruộng vườn nông thôn ở các địa
phương khác nhau.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nhân giống và bảo quản các chủng vi khuẩn, nấm mốc
Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (35 chủng) và chủng nấm mốc Colletotrichum
siamense gây bệnh thán thư được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu và được lưu trữ trong
bộ sưu tập giống của Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, đại học Cơng nghiệp Tp. Hồ Chí
Minh, ở điều kiện -70C. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. được hoạt hố qua đêm trong
mơi trường Luria-Bertani broth (LB broth) (Himedia-India, tryptone 10,0 g; cao nấm men
5,0 g; NaCl 10,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở 37C, 150 vịng/phút và chủng nấm
mốc kiểm định được ni cấy trên môi trường PGA (Khoai tây 200 g, chiết dịch; Glucose
20,0 g; Agar 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày trước
khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2 Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc kiểm định của các chủng vi khuẩn
Bacillus spp.
Khả năng đối kháng nấm mốc kiểm định C. siamense của 35 chủng vi khuẩn Bacillus spp.
được đánh giá dựa trên phương pháp khuếch tán trên giếng thạch [14]. Các chủng vi khuẩn
22


được nuôi cấy trong môi trường LB broth, lắc 150 vòng/phút, 37°C trong 16 giờ để chuẩn bị
cho việc đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc. Bên cạnh đó, chủng nấm mốc C. siamense
được nuôi cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ phịng. Các mảnh thạch có chứa hệ sợi tơ
nấm mốc 6 ngày tuổi có đường kính 5,0 mm được đặt vào tâm đĩa Petri có chứa môi trường
PGA. Sau 2 ngày, trên các đĩa Petri này được đục các giếng thạch cách mép đĩa 1,0 cm và
nhỏ 100 μL dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn. Các đĩa tiếp tục được ủ ở nhiệt độ phòng

và quan sát sự phát triển của hệ sợi tơ nấm sau 5 ngày nuôi ủ. Khả năng đối kháng của các
chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng ức chế sự phát triển của hệ sợi tơ nấm
dựa trên sự quan sát hệ sợi tơ nấm từ tâm đĩa Petri đến lỗ thạch chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn
so với các vị trí khác. Mức độ mạnh yếu của hoạt tính đối kháng với nấm C. siamense của các
chủng Bacillus tùy thuộc vào khoảng cách ức chế hệ sợi tơ nấm của các chủng vi khuẩn, hay cịn
gọi là bán kính kháng mốc và được đo từ mép khuẩn lạc vi khuẩn đến vi trí tơ nấm bị ức chế.

2.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của Bacillus spp.
Khả năng sản sinh ra enzyme ngoại bào chitinase được kiểm tra thơng qua vịng phân giải
cơ chất trên môi trường thạch tương ứng. Các đĩa môi trưởng LB có chứa 10g cơ chất chitin,
được sử dụng để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Chủng vi khuẩn
Bacillus spp. được tăng sinh trong môi trường lỏng LB qua đêm và cấy vào các đĩa môi
trường kiểm định. Sau 3 ngày ủ tại 37℃, vòng phân giải cho hoạt tính chitinase được kiểm
tra bằng thuốc thử lugol. Đường kính vịng phân giải chitin được tính bằng hiệu số của
đường kính vịng halo và đường kinh khuẩn lạc vi khuẩn [15].
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Bacillus spp. lên hệ sợi tơ nấm mốc
Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. lên hệ sợi tơ nấm mốc được kiểm tra
bằng cách ủ hệ sợi tơ nấm đã được nuôi trong môi trường PGB (Khoai tây 200 g, chiết dịch;
Glucose 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) trong thời gian 5 ngày với dịch vi khuẩn
đã được tăng sinh tại 37°C, 150 vòng/phút trong 16 giờ (dịch tăng sinh vi khuẩn đã được ly
tâm ở 4000 vòng trong 15 phút, thu dịch nổi, và dịch nổi sau đó được lọc qua màng lọc 0,45
µm) với tỷ lệ phối trộn 10% dịch vi khuẩn (OD600nm = 0,6) so với tổng thể tích mơi trường
nuôi cấy nấm mốc. Sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc trong mơi trường PGB có hoặc
khơng có dịch vi khuẩn được kiểm tra sau 5 ngày ủ bằng cách quan sát dưới kính hiểu vi
quang học ở độ phóng đại 1000 lần [16].

23


2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, điều kiện pH và proteinase K lên hoạt tính

kháng C. siamense của Bacillus spp.
Độ bền nhiệt của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. lên hoạt tính kháng mốc C. siamense
được khảo sát bằng cách ủ dịch nuôi cấy vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau 60°C, 70°C,
80°C và 90°C trong các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút và 15 phút, sau đó kiểm tra hoạt
tính kháng mốc cịn lại của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch.
Độ bền pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn cũng được kiểm tra tương tự bằng cách điều chỉnh
pH của dịch nuôi cấy bằng dung dịch NaOH và HCl đã được hấp khử trùng sao cho pH dịch
nuôi cấy đạt các giá trị 3,0 đến 10,0 và ủ trong 2 giờ, sau đó kiểm tra hoạt tính kháng mốc
cịn lại của dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Hoạt tính
kháng mốc được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính ức chế tơ cịn lại của các nghiệm thức so
với hoạt tính của dịch ni cấy vi khuẩn ban đầu [17].
Ảnh hưởng của proteinase K lên hoạt tính kháng mốc được khảo sát bằng cách ủ dịch nuôi
cấy vi khuẩn với proteinase K ở nồng độ 1,0 mg/ml trong 2 giờ ở 37°C, sau đó kiểm tra hoạt
tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch [18].
Hoạt tính kháng mốc cịn lại của dịch ni cấy sau khi xử lý ở các điều kiện khác nhau được
tính bằng bán kính kháng mốc của mẫu thực nghiệm chia cho bán kính kháng mốc của mẫu
đối chứng. Kết quả được trình bày theo tỷ lệ phần trăm (%).
2.2.6. Khảo sát khả năng đối kháng C. siamense của vi khuẩn Bacillus spp. trên quả
xoài
Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus spp. lên nấm mốc C. siamense trên thực vật được
kiểm tra với mơ hình quả xồi. Quả xồi cát được lựa chọn vừa chín và khơng có vết
thương. Các quả xồi được rửa sạch bằng nước cất vơ trùng, rửa với clorin 100 ppm, rửa lại
với nước cất vô trùng và sát trùng bằng cồn 70°. Các quả xồi được tạo vết thương tại 3 vị
trí bằng kim tiêm trên thân quả xoài với độ sâu 0,2-0,3 cm. Dịch huyền phù sợi nấm C.
siamense được chuẩn bị bằng cách nuôi hệ sợi tơ nấm trong môi trường PGB sau 5 ngày,
phối trộn với môi trường LB vô trùng theo tỷ lệ 1:1 và tiêm 10 µl vào quả xoài tạo mẫu đối
chứng (+). Hỗn hợp của dịch huyền phù sợi nấm và dịch nuôi cấy vi khuẩn (tăng sinh tại
37°C, 150 vòng/phút trong 16 giờ) được phối trộn theo tỷ lệ 1:1 và được tiêm 10 µl vào quả
xoài tạo mẫu thử nghiệm. Mẫu đối chứng (-) sẽ được thực hiện bằng cách tiêm 10µl mơi

24


trường LB vơ trùng. Quả xồi sau đó sẽ được để khô dịch tiêm và đặt vào trong buồng ẩm
đã được khử trùng trước đó. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình cho
các nghiệm thức [40]. Kết quả được theo dõi sau 6 ngày và quan sát mức độ biểu hiện bệnh.
Mức độ biểu hiện bệnh được tính tốn bằng cách đo diện tích bề mặt mẫu có biểu hiện bệnh
bằng phần mềm QuPath v0.4.0 [19]. Phần trăm biểu hiện bệnh được tính bằng mức độ biểu
hiện bệnh trên các mẫu thực nghiệm chia cho mức độ biểu hiện bệnh ở mẫu đối chứng (-).
2.2.7. Định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn Bacillus được định danh ở mức phân tử bằng phương pháp giải trình tự đoạn
gen 16S rRNA bởi phịng thí nghiệm Công nghệ động vật (Trường Đại học Konkuk, Seoul, Hàn
quốc) với cặp mồi được sử dụng là 27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG và 1492R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3' [20]. Kết quả giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu 16SrRNA của các vi khuẩn có sẵn trên National Center for Biotechnology Information (NCBI). Các
trình tự gene tương đồng được truy xuất từ Genbank (NCBI, [htpp://www/ncbi.nlm.nhi.gov]) và sắp
gióng bằng Clustal X2.1. Cây phát sinh lồi được xây dựng dựa trên thuật toán UPGMA với
Bootstrap 1000 lần lập bằng phần mềm Mega5 [21].

2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Giá trị kết quả của các thí nghiệm là trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được tính tốn, vẽ
biểu đồ trên Microsoft Excel 2013 và được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA bằng
phần mềm Statgraphics Centurion 18.

25