THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ VI SINH VẬT

THU NHẬN ENZYME AMYLASE
1) Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật:
Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật.
Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tựợng
có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng
tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.
Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường đựơc phn lập từ cc nguồn tự
nhin, bởi vì cc lồi khc nhau v thậm chí cc chủng VSV khc nhau cũng thường sản
sinh ra nhiều hệ enzyme khc nhau.
Để thu nhận amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus
(Asp. Oryzae, Asp. Niger, Asp. Usamii, Asp. Awamo-ri, Asp. Batatae) v Rhizopus
(Rh.Delemar, Rh. Lonnesis, Rh. Neveus, Rh. Japonicum, Rh. Fokinesis, Rh.
Lopninen-sis) v một số lồi của Neurospora v Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ
khơng những chỉ – amylase m cả glucoamylase.
Nấm men v giả nấm men thuộc cc giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylas .Đặc biệt người ta đ tuyển chọn được
chủng Endomycopsis specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase,
– amylase, glucoziltrans-ferase v invertase.
Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như: Bac.
Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact.cassavanum, Clostridium
acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có
khả năng tăng trửơng nhanh (4-6lần vi khuẩn ưa ẩm) như: Bac. Diastaticus, Bac.
Stearothermo-philus, Bac. Coagulans, Bac. Circulans, đặt biệt là Bac. Circulans
được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-70
o
c v tạo amylase mạnh nhất ở 50
o
C. và
phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị
nhiễm VSV khác.Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo amylase mạnh, thì Bac. Subtilis
đựơc nghiên cứu chu đáo hơn cả và được sử dụng rộng ri nhất. Nhiệt độ sinh

trửơng tối thích của Bac. Subtilis là ở 37
o
C.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên,
cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có
khả năng tạo một lượng nhỏ – amylase hoạt động ở 65
o
C cng với proteinase v cc
enzyme khc.
Trong công nghiệp, các biến chủng tạo đựơc bằng cách gây đột biến nhờ tác
động của tác nhân lý hĩa hay hĩa học hoặc tc nhn phối hợp của hai loại tc nhân trên
là những chủng hoạt động rất có khả năng sinh tổng hợp nhiều amylase. Đáng chú
ý l những biến chủng của nấm mốc: Asp. Niger S, Asp.niger S-4,Asp.niger S-4-10;
Asp. Usamii 3758-45 , Asp. Batatae 217-61; Asp. Awamori 78-2 ; Asp. Oryzase 3-
9-15 , Asp. Oryze N-475, Asp. Niger URRL-333 v Asp. Niger NRRR-337.
Phức hệ amylase từ các nguồn khác nhau đều có đặc điểm riêng. Đối với
nấm sợi Aspergillus, trong canh trường của chúng thường có các enzyme sau: –
amylase, glucoamylase, glucoziltransferase. Đa số các chủng của loài Asp. Oryzae
tạo nhiều – amylasesong tạo rất ít glucoziltransferase, ngoài amylase canh trường
bề mặt của Asp. Orzyae cịn protease acid v trung tính.
Trong canh trường các loài nấm sợi đen (Asp. Awamori, Asp. Niger) hàm
lượng glucoamylase kh cao, hoạt lực transglucozilase kh mạnh, song lại cĩ ít –
amylase. Ngồi cc enzyme trn Asp. Awamori cịn tạo protease acid v hemicellulose .
Rhizopus v Endomyces khơng tạo transglucozilase, – amylase cĩ trong mọi chế
phẩm trừ cc chế phẩm từ Endomyces.
Trong các canh trường vi khuẩn thường không tạo thành một phức hệ
enzyme amylase như là ở nấm sợi mà chỉ có một – amylase. Hoạt lực protease của
canh trường vi khuẩn cũng rất cao.
2) Đặt tính và cơ chế tác dụng của amylase:
Amylase l hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Cc enzyme ny

thuộc nhĩm enzym thủy phn, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong
polysaccharide với sự tham gia của nước.
R.R’ + H - OH RH + R’OH
a) – amylase : ( – 1,4 glucan – 4 glucanhidrolase, 3.2.1.1)
Về cơ chế tác dụng, người ta thấy rằng – amylase của nấm mốc cắt đứt
được tất cả các liên kết – 1,4-glucoside trong mạch polysaccharide, trừ điểm phân
nhánh trong amylopectin, để tạo thành maltose và dextrin giới hạn. Như vậy chúng
có khả năng chuyển 80-82% tinh bột thành maltose. – amylase khơng chỉ thủy phn
hồ tinh bột m cịn thủy phn cả hạt tinh bột nguyn lnh, song tốc độ rất chậm.
Khi thủy phn tinh bột – amylase thường xảy ra 2 giai đoạn:
 giai đoạn đầu: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của
hồ tinh bột giảm nhanh.
 Giai đoạn hai: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành.
Tính chất đực trưng của nó là khả năng dextrin hóa cao do đó làm cho phản
ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Vì vậy người ta dựa vào
tính chất này để xác định hoạt độ của enzyme. pH tối ưu của –amylase của nấm
mốc l 4,7-4,9.
b) – amylase ( - 1,4 glucan – mantohidrolase 3.2.1.2)
β
- amylase xc tc sự thủy phn cc lin kết – 1,4glucan trong tinh bột, glucogen
và polysaccaric đồng loại,phân cắt tuần tự gốc maltose một từ đầu không khử của
mạch. Maltose tạo thành có cấu hình , vì thế amylase ny được gọi là – amylase. Tc
dụng của – amylase lên tinh bột có thể biểu diễn lên sơ đồ sau:
Tinh bột 54 – 58% maltose + 42 – 46% – dextrin
(Glucogen)
Nếu cho cả – amylase v – amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì
tinh bột bị thủy phn tới 95%.
c) Glucoamylase ( - 1,4 glucan – mantohidrolase 3.2.1.3) hay –
amylase
Glucoamylase thủy phn lin kết - 1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần

tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng
xúc tác thủy phân đ lin kết - 1,4 lẫn - 1,6 glucan. Glucoamylase l enzym ngoại
phân (exoenzym) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose.
Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose cịn cĩ thể tạo thnh cc - oligosaccharide.
Ngồi cc lin kết – 1,4 v – 1,6 glucoside, glucoamylase cịn cĩ khả năng thủy phân
các lin kết – 1,2 v – 1,3 glucoside nửa.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose v maltose tới glucose. Các cơ chất cấu
tạo phân nhánh ( amylopectin, glucogen, - dextrin) bị glucoamylase tấn công với
vận tốc khá lớn. So với tốc độ thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase
tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phn nhanh
hơn là các phân tử thấp.
Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzym glucoamylase như sau:
Glucoamlase kiểu
Tinh bột hay oligosacarit 100% glucose
Glucoamylase kiểu
Tinh bột hay oligosacarit 80-85% glucose + oligosacarit
d. Oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn
(dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.10)
Enzyme ny thủy phn cc loại lin kết -1,6- glucoside trong izomaltose, panose
và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ chất này đến các đường lên men
được. Các loài nấm sợi Asp. Awamori, Asp. Oryzae, Asp. Usamii sinh tổng hợp
enzyme này mạnh hơn cả.
Ngoài các enzyme được kể trên, trong họ hàng cuả amylase cịn cĩ cc enzyme
đồng loại nư. Dưới đây sẽ điểm qua một vài enzyme đó.
e. Pullulanase
Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy cc enzyme cĩ khả năng
thủy phân lin kết -1,6 glucoside trong các polyose và oligosaccharide kiểu tinh bột
và glucogen. Cơ chất đặc thù enzyme này là pullulan – một polysaccharide được
tách ra từ giả nấm men Aureobasidium punllana sym. Pullulasia pullulans. Vì vậy

m enzyme ny được gọi là pullulanase. Phân tử lượng của nó là 145.000.
f. -glucosidase hay maltase (-D,glucoside-glucohydrolase, 3.2.1.20)
Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này. Giống như glucoamylase, nó tác
dụng được trên maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Nĩ cịn cĩ
hoạt tính glucosyltransferase, tức l cĩ khả năng chuyển các gốc glucosyl sang
đường và rượu. Khi nghiên cứu cặn kẽ về tính chất của maltose tách từ canh
trường bề mặt của Asp. Oryzae cho biết rằng maltose và glucozyltransferase là một
enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết -1,4, trong các
glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu.
g. Transglucosyldase
Ở nhiều loại nấm sợi Aspergillus, transglucosyldase luôn luôn tương tác với
glucoamylase. Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phn. Vì thế sự cĩ
mặt của nĩ trong dung dịch thường gây nên những nhầm lẫn về sự tồn tại của
glucoamylase. Transglucosyldase thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang các
nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tc tạo thnh cc lin kết -1,4 v -1,6 glucoside.
Pazur (1961) đ tch được enzyme này từ Asp. niger bằng phương pháp sắc ký hấp
thụ trn DEAE-cellulose v cho biết cơ chế tác dụng của nó.
3. Hoạt lực của cc enzyme amylase
Khi sử dụng bất kì 1 chế phẩm enzyme no cũng cần biết r hoạt lực xua1c tc
của nĩ. Cc chế phẩm cĩ hoạt tính phn giải tinh bột thường chứa 1 loại enzyme
amylase. Vì vậy hoạt lực tổng hợp của chng phản nh tc dụng tất cả cc amylase cĩ
trong chế phẩm.
-amylase dễ dng thủy phn tinh bột thnh dextrin khơng cho mu với iodine, cịn
glucoamylase lại phn giải tinh bột tới glucose v lm thay đổi màu với iodine chậm,
vì lẽ trong dung dịch luơn cĩ một lượng nhỏ dextrin phân tử lớn. Do vậy mà người
ta đánh giá sự có mặt của -amylase trong chế phẩm (hoặc canh trường vsv) bằng sự
thay đổi màu với iodine, cịn đánh giá sự có mặt của glucoamylase bằng sự tích tụ
glucose, mặc dù r rng l hiện diện đồng thời của cả 2 enzyme này đ lm tăng hiệu
quả phân giải.
Hoạt độ thật của từng enzyme một thấp hơn so với số liệu thu được. Cho

nên, nếu như ta làm việc với chế phẩm phức hợp thì phải luơn luơn xc định hiệu
lực tác dụng tổng hợp của mọi amylase lên cơ chất. Để xác định hoạt độ của các
enzyme amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:
 Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác
dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung
dịch giảm dần.
 Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iodine.
Khi có amylase tc dụng thì cc sản phẩm phn giải của tinh bột sẽ cho mu khc nhau
đối với iodine.
 Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác
dụng lên cơ chất. Đáng chú ý hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:
 Hoạt độ amylase (HĐA) đặc trưng cho khả năng thủy phân tinh bột bởi các
enzyme amylase (chủ yếu là của -amylase) tới dextrin cho màu với iodine khác với
màu của tinh bột ban đầu. Hiện nay phương pháp so màu quang điện của
Rukliadeva và Goriatreva (1985) được xem là phương pháp xác định hoạt độ
amylase tiêu chuẩn.
 Hoạt độ glucoamylase (HĐGI) đặc trưng cho khả năng của chết phẩm thủy phân
tinh bột đến glucose. Muốn xác định HĐGI cần đo được lượng glucose tạo thành.
 Hoạt độ đường hóa (HĐĐH) phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường
hóa tinh bột đến các đường khử.
 Hoạt độ maltose (HĐM) đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của
chế phẩm enzyme.
 Hoạt độ dextrinase (HĐDEX) đặc trưng cho khả năng thủy phân “ các dextrin tới
hạn “ tới đường khử của chế phẩm enzyme.
4. Thu nhận enzyme amylase từ VSV
a. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở VSV
Khi nuơi VSV tạo amylase cĩ hai qu trình lin quan mật thiết với nhau. Qa
trình tổng hợp sinh khối VSV v qu trình tích tụ enzyme trong tế bo hay ngồi mơi
trường.
Ở một số VSV, qu trình sinh tổng hợp amylase tiến hnh song song với qu

trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối.
Sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt
điểm sinh trưởng. Sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy
enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy
ra sự tổng hợp enzyme cực lớn.
Amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào.
Sự tổng hợp cc enzyme amylase bắt đầu khi việc tạo protein của tế bào đ kết
thc hoặc gần kết thc v cạnh tranh với qu trình ny.
Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác cũng có ảnh hưởng lớn đến sự
tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ amylase khi nuôi chủng Asp. oryzea 3-0-15
đột biến thể hiện ở bảng sau:
Nguồn
cacbon
Hoạt độ của enzyme, đv/100ml Nguồn
Cacbon
Hoạt độ của enzyme, đv/100ml
-amylase Oligo-1,6 glucozidase -amylase Oligo-1,6 glucozidase
Tinh bột % Bột
6 300 800 Ngơ 250 760
4 220 800 Mì 250 760
2 110 800 Mì đen 300 770
1 70 710 Đậu nành Vết 810
b) Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzyme amylase
 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng:
Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi VSV tạo amylase người ta
dùng muối vô cơ. NaNO
3
l nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo
amylase.
Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp

amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase:
Nguồn nitơ Liều lượng muối, % theo N Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi đv/100ml
-amylase glucoamylase
NaNO
3
NaNO
3
(NH
4
)
2
SO
4
NH
4
NO
3
NH
4
NO
3
NH
4
H
2
PO
4
0,30
0,15

0,15
0,15
0,30
0,30
145
26
98
45
5,5
8000
3300
4100
4900
8000
Ngồi ra cịn dng nhiều nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, casein, nước chiết ngô)
nhưng cho hiệu quả kém hơn nhiều so với nguồn nitơ vô cơ.
 Ảnh hưởng của amino acid:
Amino acid là những cấu tử hợp thành cấu tử enzyme. Mặt khác các amino
acid lại không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ
có giá trị dinh dưỡng lớn hơn và cho những chất lượng mới. Amino acid có ảnh
hưởng tốt tới sinh lý của VSV cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase.
 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tố đa lượng và vi lượng (Mg, P, Ca, S, Co, Zn, Mn,…) có ảnh
hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của VSV.
 Ảnh hưởng

của pH nguyn liệu
Ảnh hưởng của PH cm ẩm tới sinh tổng hợp amylase
Cc chất lm ẩm cm
mì tới độ ẩm 60%

pH Hoạt độ enzyme trong mốc thnh phẩm đv/g
Mơi trường Mốc thnh
phẩm
α-amylase Oligo-1,6
glucosidase
Maltase
Trước
thanh trng
Sau thanh
trng
Nước my
HCl (0,1 N)
HCl (0,2N)
HCl (0,25N)
HCl (0,3N)
6,0
5,0
4,5
4,0
3,6
6,1
6,7
6,8
6,1
6,0
6,4
6,7
6,8
6,1
6,0

25,0
27,3
24,7
10,4
8,7
1008
1230
1172
1100
1130
130
134
127
134
133

c. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase:
Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hơp các enzym
amylase trong quá trình nuơi VSV, thì thnh phần mơi trường, tính chất cơ lý của
môi trường , độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí ,nhiệt độ nuôi và pH môi
trường…là những yếu tố cơ bản tối quan trọng.
Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme amylase từ VSV:
Chuẩn bị mơi trường
Nuơi cấy VSV giống
Có 2 phương pháp VSV là phương pháp bề mặt (pp nổi) và phương php bề
su (pp chìm). Phương pháp nuôi quyết định sơ đồ công nghệ nuôi:
Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt
Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất
hữu cơ (tinh bột, dextrin…) hydro ở dạng H
2

O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở
trong thành phần cấu tạo cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.
Enzym ngoại bo
Enzym nội bo
Ph vỡ tế bo
Lọc hoặc ly tm
enzyme thơ
Cơ dặc
Tinh chế
Enzym tinh khiết
Sấy
Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng pp bề mặt l cm mì, cm
gạo. Cm mì, cm gạo l nguyên liêụ hoàn hảo và có thể là 1 cấu tử duy nhất của môi
trường để nuôi VSV không cần bổ sung thm cc chất khc nữa. Cm mì 16-22% tinh
bột, 10-12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%),
cystine (0,3%), arginine(1%), lysine (6%), tryptophan(0,3%), 3-4% chất béo,
10,3% cellulose, các nguyên tố tro (Na-0,09%, K-1%,Ca-0,16%,P-0,94% ) và
nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10-15%
chất béo ,10-14% protein ,8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37-
59%).
Chất lượng của cám gạo, cm mì cĩ ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các
enzym amylase .cám gạo không được chứa tinh bột dưới 20-30%, cám không có
dư vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc
không quá 0.05% Cấu tử bổ sung được đưa vào có thể là chất làm xốp môi
trường hoặc làm giàu thêm các chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà cám không
có đủ. Các cấu tử này thường là mầm mạch (15-20%) , trấu(2-25%), mùn cưa (5-
10%)…. Có thể dùng cặn b canh trường rắn (sau khi trích ly enzym ) làm cấu tử
chính của môi, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và chất phụ gia chứa nhiều bào tử
VSV khác nên cần phải thanh trùng để bảo đảm chúng nuôi phát triển bình thường
và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.Cần thanh trùng dưới áp suất

hơi 1-1,5 atm trong vịng 6-8 giờ, cĩ thể thanh trng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 120
o
C
trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%0 và 0,8% HCl kỹ
thuật theo khối lượng môi trường.
-Độ ẩm tối thích của môi trường: Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu
tối thích (đối với Asp. Niger, Asp. Awamort, Asp. Flavus, Asp. Oryzae )của môi
trường là 58-60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình
nuơi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm giảm độ thoáng khí , cịn thấp hơn 50-
55% thì kìm hm sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo enzym
amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường hình tam gic, trong tủ ấm phịng
thí nghiệm hoạt lực amylase cao nhất thu được ở độ ẩm 65-68%).
Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp enzym amylase được
trình by trong bảng sau:
Phương án
thí nghiệm
20 giờ 34 giờ 42 giờ
Độ ẩm (%) Hoạt động
amylase
đv/g canh
trường khô
Độ ẩm (%) Hoạt động
amylase
đv/g canh
trường khô
Độ ẩm (%) Hoạt động
amylase
đv/g canh
trường khô
Khay để hở 27,8 15,0 23,8 18,0 22,0 20,5

Khay đậy
nắp
46,4 20,4 42,4 32,9 42,4 36,7
Cần thơng khí lin tục suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh
trưởng của mình VSV tiu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra 1
lượng lớn nhiệt sinh lý v CO
2
.Vì vậy cần phải thải nhiệt ny bằng thơng giĩ với
khơng khí vơ trng cĩ độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên
tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên )tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi
trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và dy khay. Thường là ở giai
đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thong khí vào phịng nuơi koảng 4-5 lần thể tích
khơng khí trn 1 thể tích phịng nuơi/1 giờ, cịn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ cịn 10-
12 thể tích khơng khí.
Nhiệt độ nuôi:tồn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia
làm 3 thời kỳ:
-Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu
tiên, đối với vi khuẩn 3-4 giờ).Trong thời kì ny phải đốt nóng không khí phịng nuơi
v giữ cho nhiệt độ phịng nuơi khơng thấp hơn 23-30
o
C đối với nấm mốc và duy trì
nhiệt độ 32-38
o
C cho vi khuẩn . Độ ẩm tuơng đối của không khí là 96-100%.
-Thời kì sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vịng 4-18 giờ). Ở giai
đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra 1 lượng nhiệt sinh lý rất lớn.Kết quả l
trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37-40
o
C , đôi khi cao hơn tới
47

o
C.Vì vậy cần ohải hạ nhiệt độ phịng nuơi gip cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở
nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29
o
C và độ ẩm cao vào
phịng nuơi.
-Thời kì tạo enzym amylase mạnh mẽ (ko di từ 10-20 giờ). Trang thời kì ny cc
qu trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các enzym amylase
được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống
3-4
o
C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc
trên môi trường rắn là 28-30
o
C , cho Bac. Subtilis l 35-37
o
C.
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn : thời gian nuôi để có lượng
amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tuỳ thuộc vo tính chất
sinh lý của chủng sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzym mà có thể ngừng sinh
trưởng của nấm mốc vào bất kì lc no thấy cần thiết. sự tạo bo tử l hiện tượng không
mong muốn vì thường là làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa ssố nấm mốc
Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mmốc bắt đầu
sinh đính bào tử . Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuơi để có
tích luỹ amylase cực đại đối với từng loại sợi nấm và vi khuẩn như sau:
Chủng Thời gian nuơi (giờ)
Asp. oryzae – 476 24-25
Asp. oryzae –KC 30-36
Asp. oryzae 8F
1

24-30
Asp. awamori 22 36
Bac. Subtilis 68-72 (ở 30
o
C )
Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề su
Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo
amylase là có chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn Nitơ dinh dưỡng
thường dùng là nitơ vô cơ (NaNO
3
). Sinh tổng hợp -amylase hoạt động ở các
chủng Aspergillus thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid
sulfuric . Đối với sinh trưởng của 1 số nấm sợi tạo maltase và oligo-1,6-gluco
amylase hoạt động lại rất cần có Mg trong môi trường . Để tạo điều kiện cho VSV
phát triển tốt và sinh nhiều amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại
nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành,… đó là nguồn bổ
sung amino acid , vitamin và các tạp chất sinh trưởng .Dưới đây là 1 số môi trường
lỏng dung để nuôi VSV tạo thành các enzym amylase . Đối với Aspergillus, người
ta thường nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6%tinh bột ;0,9% NaNO
3
;
0,001% FeSO
4
;0,1% KH
2
PO
4
;0,05 MgSO
4
; 0,05 KCl và nước máy. Ở Trung

Quốc, người ta thường dùng môi trường có thành phần: bột ngô -6%; NaNO
3
-
0,3%; MgSO
4
.7H
2
O-0,05 %; HCl (36%) – 0,1%.
Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể
thêm nước chiết mầm mạch , nước chiết ngô , nước cám nấu nước chiết bôt đậu
nành.
Ở Trung Quốc, người ta thường dng mơi trường cĩ thnh phần như sau:bột
ngơ -6%; NaNO
3
-0,3%; MgSO
4
.7H
2
O-0,05 %; HCl (36%) – 0,1%.
Để nuôi Asp. Oryzae 3-9-15 với mục đích thu -amylase, chọn môi trường có:
65% bột ngô; 0,9% NaNO
3
; 0,005% MgSO
4
, và 10% nước chiết mầm mạch
(100g/1 lít H
2
O), pH môi trường 6-7. Môi trường để nuôi các chủng nấm tạo
amylase dung trong công nghiệp rượu (Asp.niger S
4

, S
4
-10-10-III, Asp.niger
NRRL-337, Asp.balatae 61 Asp. Usamii 1788/45) l dịch lọc b rượu có hàm lượng
chất khô 4-6% và thêm 0,2% MgO, 1-2% bột ngô hay bột mì.
Trong công nghiệp bia, để nuơi Asp. Oryzae, Phedo-rov dng dịch lọc b bia
nghiền vụn (phế liệu của nh my bia) v thm vo cc chất sau: 1,5% bột đại mạch; 1%
mầm mạch; 0,9% NaNO
3
; 0,1% KCl; 0,1% KH
2
PO
4
; 0,01% MgSO
4
.7H
2
O; pH môi
trường là 5,6-5,7.
Môi trường để nuôi Asp. Awamori nhằm thu glucoamylase ở Liên Xô cũ
người ta thường dùng là: dung dịch nước có chứa 3% bột ngô; 0,91% NaNO
3
(theo
nitơ 0,15%); 0,05% KCl; 0,1% KH
2
PO
4
; 0,05% MgSO
4
; 0,001% FeSO

4
. pH môi
trường là 7,0-7,2.
Ở Nhật, Fukanehara nuôi Asp. Awamori bằng môi trường sau: bột ngơ –
3,9%; cm mì – 1,56%; cm gạo – 0,56%; Na(H
2
PO
4
)
2
– 0,28%; NaNO
3
– 0,28% và
nước máy.
Để nuôi Endomyces sp. Hattori (Nhật) dùng dung dịch nước có 6% cám mì,
dng mơi trường lỏng có 2,5% b ngơ, 0,1-0,5% acid oleic để nuôi Endomycopsis sp.
Imsenetxki dùng môi trường lỏng có chứa nước nấu khoai tây 5% và 0,1% CaCO
3

để nuôi Bac. Diastalicus với mục đích thu amylase bền nhiệt.
Cấu tử của môi trường nuôi Bac.subtilis là bột ngô. Ngoài ra cịn cĩ cc chất
hiệp trợ khc như K
2
SO
4
, lactoza, NaCl, MgSO
4
. Có thể nuôi Bac.subtilis bằng nước
chiết cám 20% hay bằng môi trường Nomura cải tiến: 2% tinh bột; 0,067M
(NH

4
)
2
HPO
4
; 0,2% MKCL; 0,002M MgSO
4
.7H
2
O; 0,001M CaCl
2
và dịch chiết đậu
nành 5%. pH môi trường – 7,2.
Môi trường Nomura có thành phần như sau: tinh bột-8% xitrat n; Natri-
0,04%; (NH
4
)
2
HPO
4
0,15M; KCl-0,02 maltose; MgSO
4
.7H
2
O-0,002M; CaCl
2
-
0,001M; rượu etylic-1%; nước chiết đậu nành 5%. Logina nuôi Bac.mesentricus
bằng môi trường có chứa: nước nấu khoai tây 120%; nước nấu ngô 4% và CaCO
3

0,1% (pH-7,0).
Người ta phân biệt các phương pháp nuôi chìm sau:
- Phương pháp gián đoạn
- Phương pháp tuần hoàn – liên tục
- Phương pháp dịng chảy lin tục.
Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các
enzyme amylase ở các chủng VSV nuôi chìm l nồng độ ion hydro trong môi trường
và sự biến đổi của nó trong quá trình sinh tổng hợp của chủng nuơi.
Độ acid của canh trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các
muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV.
Trước hết, pH của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Nếu
như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi VSV tiu thụ ion
ammonium, cc ion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho
thm CaCO
3
vào để trung hịa mơi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp
cho việc tổng hợp enzyme amylase.
Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong qu trình VSV
tiu thụ anion (NO
3
-
) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa
pH tăng lên. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu
-amylase là 5,5-5,7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm
mạch và NaNO
3
). Trong qu trình nuơi mơi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối
kì sinh trưởng canh trường có pH 7,8-8,2. Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự
nhiên môi trường khi VSV sử dụng NaNO

3
làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt
tới sinh tổng hợp -amylase. Không cần có một sự điều chỉnh pH nào cả. Ở đây giá
trị pH tối thích cho tổng hợp -amylase (7-8) khác hẳn giá trị pH tối thích đối với
hoạt động của enzyme (pH 4,7-4,9). Khi điều chỉnh giá trị pH tới giá trị ban đầu
hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì hoạt lực -amylase cũng giảm đi nhiều
(gần bằng 23%). Khi dùng các muối ammonium phosphate làn nguồn nitơ để nuôi
chủng mốc này thì pH tối thích của mơi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu
glucoamylase người ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh
bột. Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH=8. pH
tối thích bn đầu cho chủng này sinh trưởng là 7,0-7,2. Khi kết thúc pH canh trường
là 7,6-8,0. pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac.subtilis nhằm thu -amylase thích
hợp nhất l 6,8-7,5, cịn để tổng hợp protease lại là 7,0-7,8. pH ban đầu tối thích cho
sinh tổng hợp các enzyme là 7,0-7,8. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0
đều làm giảm vận tốc sinh tổng hợp enzyme, cịn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn
hầu như không phát triển.
Nhiệt độ nuôi: nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh
trưởng của VSV và sự tạo thành các enzyme amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế
độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lực các enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối
thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30-32
o
C (trong đó có Asp.oryzae
3-9-15 và Asp.awamori 22), Bacillus subtilis. Môi trường thích hợp nhất và tạo
nhiều amylase ở nhiệt độ 37
o
C. Một số vi khuẩn khác lại có nhiệt độ sinh trưởng
tối thích cao hơn. Bac.diastaticus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 60-65
o
C. Bac.circulans
phát triển mạnh ở nhiệt độ 65-70

o
C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 50
o
C vì
vậy người ta thường cấy giống ở nhiệt độ 70
o
C cịn tiến hnh cho tích lũy amylase ở
50
o
C nuôi chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, peptone và
phấn. Nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzyme tạo thành
amylase của Bac.coagulans và Bac.slearothermophilus được nuôi ở 35
o
C v 55
o
C có
độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ ở 90
o
C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh
trưởng ở nhiệt độ 35
o
C bị mất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của
chủng được nuôi ở nhiệt độ 55
o
C chỉ bị vơ hoạt cĩ 10-12%.
Sục khí v khuấy trộn. Phần lớn VSV tạo amylase l những VSV hiếu khí. Vì
vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hịa tan trong dịch
nuơi cấy. trong qu trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phn tử cho hoạt
động sống nên lượng oxy hịa tan trong mơi trường lỏng phải luôn luôn được bổ
sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tới sinh

trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzym của VSV.
Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuơi VSV cĩ thể thực
hiện bằng nhiều cch khc nhau:
Sục khơng khí vơ trng vo thiết bị nuơi
Bằng my cc kiểu chuyn dng
Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy
Bằng tc dụng của cc khí sinh ra khi ln men.
Muốn nuơi VSV tạo enzym cĩ hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường
bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên lục trong suốt quá trình nuơi. Việc
chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự
sinh trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm m cịn đối với
sự sinh tổng hựop enzym amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m
3
không khí vô trùng (có
nhiệt độ không cao quá 40
o
C) trn 1m
3
môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi
trong khoảng 68-72 giờ.
Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhn giống (48 giờ) v trong
cc thng ln men sản xuất (48-52 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để
nuôi Asp. Oryzae (3-9-15) phải l 30m
3
/m
3
môi trường/giờ đối với thùng nhân giống
và 40m
3

/m
3
môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.
Oryzae (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O
2
/lít môi trường. Chủng này có vận
tốc tiêu thụ oxy hịa tan cực lớn vo cuối pha sinh trưởng log. Vận tốc tiêu thụ O
2

giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt địi hỏi nhiều khơng khí
hơn là nuôi VSV ưa ẩm.
Người ta nuôi Bac. Subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 37
o
C) cĩ cnh
khuấy lm việc lin tục v sục khơng khí vô trùng vào môi trường với lượng là
40m
3
/m
3
môi trường/giờ. Cịn nuơi vi khuẩn ny trong thng ln men sản xuất (trong 48
giờ ở 37
o
C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục khí vô trùng với lượng
60m
3
/1m
3
môi trường/giờ. Thời gian nuôi VSV để lượng amylase cực lớn trong
phương pháp nuôi chìm phụ thuộc vo đặc tính sinh lý của chúng, vào phương pháp
nuôi và một số yếu tố liên quan như: nuôi Asp.oryzae (3-9-15) trong htùng lên men

nhân giống 48 giờ, cịn nuơi trong thng ln men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ.
Lượng giống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với thể tích môi trường dinh
dưỡng.
Trong công nghiệp rượu, khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp gián
đoạn thì thời gian nuơi thích l 68-72 giờ. Tuổi của nấm tốt nhất l 24-30 giờ v lượng
vật liệu gieo cấy là 10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng. Khi nuôi bằng
phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dịng chảy lin tục, thời gian nuơi
sẽ ngắn hơn rất nhiều (30-40 giờ). Asp.awamori 22 sản sinh glucoamylase cũng
đựoc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52
giờ hay hơn nữa. thời gian nuôi Bac.subtilis trong thng nhn giống ko di 15 giờ, cịn
trong htng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể tích môi
trường dinh dưỡng. Đối với Endomycopis sp thời gian nuôi để có lượng amylase
cực lớn phải là 80 giờ.
5. Ứng dụng của enzyme amylase:
Amilaza thường được sử dụng trong những lĩnh vực:
Lĩnh vực sử dụng Enzym đươch sửdụng
của vi khuẩn của nấm mốc
Sản xuất bnh mì
Cơng nghiệp bnh kẹo
Cơng nghệp rượu
Sản xuất bia
Sản xuất cc sản phẩm rau
Chế biến thức ăn cho trẻ con
Sản xuất cc mặt hang từ quả
Sản xuất nước ngọt
Cơng nghiệp dệt
Cơng nghiệp giấy
Y học
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
a) Trong sản xuất rượu:
Vi mươi năm trở lại đy chế phẩm amilaza của nấm mốc đ hồn tồn thay thế
malt. V kết quả đ đem lại:
 Để dnh được hng chục nghìn tấn hạt cĩ chất lượng cao.
 Tăng hiệu suất rượu
 Rt ngắn thời gian sản xuất(sản xuất malt cần 7 - 8 ngy, sản xuất nấm
mốc chỉ hng chục giờ
 Giảm diện tích sản xuất, lao động v điện năng
Nguồn enzyme thường l: Aspergillus awamori, A. oryzae, A. usamii.
A. awamori tạo được nhiều glucoamilaza hoạt động cao m lượng chế phẩm
từ A. awamori cần thiết để đường hố giảm bớt đi 2-2.5 lần. Song chế phẩm
ny lại khơng cĩ enzyme proteaza hoạt động trong mơi trường axit yếu của
hạt(5.5 - 6.0). Do đĩ người ta dung hỗn hợp 4 phần canh trương bề mặt của
A. awamori v 1 phần canh trường bề mặt của A. oryzae để bổ sung lẫn nhau.
Ở cc nh my rượu của Việt Nam thường dng chế phẩm enzyme từ A.
usamii vì chng cĩ chứa nhiều glucoamilaza hoạt động.
b) Trong sản xuất bia:
Hiện nay ở nhiều nước trn thế giới người ta thay thế 25 - 50% malt bằng

cc nguyn liệu phi malt, nghĩa l bằng cc hạt chưa nảy mầm như đại mạch loại
2 v loại 3, ngơ đ lấy hết chất bo, … Trong trường hợp ny, người ta phải dung
chế phẩm amilaza để cĩ được mức độ đường hố cần thiết cho chất lượng bia.
Để đạt mục đích ny, người ta dung chế phẩm của A. oryzae. Khi dng 50%
nguyn liệu từ malt thì phải cho khoảng 1% canh trường A. oryzae khơ v một
ít axit lactic để tạo pH cần thiết cho enzyme hoath động.
Ở một số nước như Đan Mạch, Php, Nhật, Mỹ, để đường hố cc nguyn liệu
phi malt người ta thường dng cc chế phẩm amilaza của vi khuẩn. Trong
trường hợp đĩ cĩ thể thay thế 20 – 30% malt v đơi khi đến 80 – 90% malt
bằng nguyn liệu phi malt.
c) Trong sản xuất bnh mì:
Thm vo bột nho 0.002 - 0.003% chế phẩm amilaza, nghĩa l khoản 20 –
30g chế phẩm khơ cho 1 tấn bột sẽlm thay đổi hồn tồn chất lượng của bnh
mì: hương vị, mu sắc, thể tích ring, độ xốp, … tăng ln 1 cch r rệt.
Để đạt mục đích đĩ, người ta dng amilaza của nấm mốc. Vì amilaza ny
vượt xa amilaza của thực vật hoặc của vi khuẩn. Nhiệt độ vơ hoạt của α-
amilaza của nấm mốc tương đối thấp (gần 70
o
C) do đĩ cĩ thể dng enzym ny
với một liều lượng lớn m vẫn khơng cĩ hiện tượng dextrin hố khi nướng.
Hơn nữa hoạt độ của nĩ lại cao cho nn cĩ thể đạt đến độ đường hố cần thiết
rất nhanh chĩng sau đĩ bị vơ hoạt ngay. Cịn amilaza của vi khuẩn cĩ nhiệt độ
vơ hoạt khoản 80 – 90
o
C nn chỉ cĩ thể dng một lượng nhỏ.
Trong sản xuất bnh mì người ta thường dng chế phẩm enzym từ A.
oryzae.
d) Trong sản xuất glucoza v mật:
Khi thuỷ phn tinh bột bằng axit cũng như bằng enzym của malt ta sẽ thu
đựợc mật: mật glucoza hay mật maltoza. Mật maltoza thường đựoc dung

trong cản xuất cc sản phẩm ăn king cho trẻ con v người bệnh.
Hiện nay nhiều nước (Nhật, Mỹ, Canada, …) đ sản xuất glucoza đi từ
tinh bột bằng enzyme glucoamilaza.
Nhưng nấm mốc chứa nhiều glucoamilaza l A. awamori, Rhizopus.
e) Trong cơng nghiệp dệt:
Trong cơng nghiệp dệt, chế phẩm amilaza được dng để rũ hồ vải trước
khi tẩy trắng v nhuộm. Chng ta đều biết trong vải mộc thường chứa 5% tinh
bột v nhiều tạp chất khc. Để lm cho vải mềm, cĩ khả năng nhng ướt, tẩy
trắng v bắt mu tốt thì cần phải tch tinh bột. Để rũ hồ, người ta thường dung
amilaza của vi khuẩn (Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.amylosolvens).
Cc chế phẩm amilaza dng trong cơng nghiệp dệt đa phần l ở dạng dịch cơ
đặc thu được từ canh trường bề su của vi khuẩn. Cũng cĩ thể dng chế phẩm
amilaza của nấm mốc.
Rũ hồ bằng enzym khơng những nhanh, khơng hại vải, độ mao dẫn tốt m
cịn đảm bảo vệ sinh do đĩ tăng được năng suất lao động.