thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê

Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Mục lục
I. Tổng quan:
1. Giới thiệu chung về enzyme rennin:
• Cấu trúc phân tử
• Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin
• Sự họat hóa prorennin thành rennin
• Các yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của enzyme rennin
• Bảo quản rennin
2. Dạ dày bê:
• Cấu trúc dạ dày
• Sự tiêu hóa thức ăn trong dạ dày
• Mối liên hệ của dạ dày bê và rennin
II. Phương pháp thu nhận rennin:
Quy trình:
1. Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet
2. Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết
III. Các phương pháp phân tích chất lượng chế phẩm enzyme
− Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford
− Xác định hoạt lực đông tụ sữa của enzyme
− Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
IV. Ứng dụng:
Trong công nghiệp sản xuất phomat.
Tài liệu tham khảo:
− Nguyễn Đức Lựợng – công nghệ enzyme- NXBĐHQG
− Ðồng Thị Thanh Thu , Sinh hóa ứng dụng, Nhà XB ÐHQG -TPHCM( 2002 )
− Bài giảng cn protein – enzyme- www.ebook.edu.vn/
− Các hình ảnh trên google
− METHOD FOR THE PURIFICATION OF CALF RENNET- Inventor:
Sethuraman Subramanian, Elkhart,ind – Oct 16/1985 –
/>Nhóm 10 – 07SH1D

1
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
THU NHẬN ENZYME RENNIN TỪ DẠ DÀY BÊ
I. Tổng quan:
1. Giới thiệu chung về enzyme rennin:
Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa được tìm thấy ở dịch
tiêu hóa của ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin.
Rennin do tế bào chính của tuyến dạ dày tiết ra có để tiêu hóa sữa cho động
vật mới sinh, đặc biệt ở ngăn thứ tư dạ dày bê dưới 5 tháng tuổi. Khi bê càng gần 5
tháng tuổi, bắt đầu ăn, thành phần rennin trong rennet giảm dần và được thay thế
bằng pepsin.
a. Phân lọai:
Rennin là một protease tính acid, số phân lọai E.C.3.4.4.3.
Rennin là thành phần chủ yếu của rennet.
Rennin là enzyme đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein
(đặc biệt là casein của sữa).
b. Cấu trúc phân tử :
-Rennin là enzyme thủy phân liên kết peptide, có trọng lượng phân tử
khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể lập phương.
-Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptide có gắn glycine trong
mạch có vòng carbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trong việc
bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng họat động. Cấu trúc bậc nhất của rennin
cũng có nét tương tự pepsin ở phân đọan mạch đầu C, ở đọan mạch gần liên kết
disulfur và phần đọan mạch chứa aspartic acid ở trung tâm họat động.
-Thành phần hóa học rennin chứa nhiều amino acid có tính acid hơn amino
acid kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn so với pepsin. Trong thành phần của rennin
còn chứa nhiều prolin, serin và trong phân tử có chứa tới 3 cầu disulfur. Do đó,
rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin.
c. Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin:
• Đặc tính:

Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện pI=4.5. Rennin
thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường
kiềm.
Nhóm 10 – 07SH1D
2
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
• Đặc hiệu thủy phân:
Rennin chỉ thủy phân liên kết peptide và không làm ảnh hưởng đến liên kết
ester và amin. Rennin đặc hiệu có tác dụng mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi
tyrosine và phenyl alanine (tạo mùi vị đặc trưng cho phomai)
Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc
tính thủy phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH 6.8 rennin phân
cắt trung bình 1/33 còn ở pH= 2.3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptide trong phân tử
casein.
d. Sự họat hóa prorennin thành rennin:
Rennin có trong màng nhày dạ dày ở dạng tiền enzyme là prorennin, gồm 2
phân đọan là prorennin A và B.
Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite, nó được giữ lại
trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.
Prorennin ổn định ở pH = 5.3 – 9, dạng thô hòan tòan ổn định ở pH = 8.
Prorennin ở môi trường có ure 6M thì nhanh chóng bị phân hủy và có thể trở
thành dạng họat động.
 Quá trình họat hóa prorennin:
Sự họat hóa prorennin thành rennin xảy ra ở pH <5, xảy ra rất mạnh ở pH <3.
Trong quá trình họat hóa prorennin, 10-15% protein được tách ra dưới dạng peptide.
Họat động của prorennin bao gồm sự phân tách chuỗi peptide từ đầu cuối N của
prorennin, với sự giảm trọng lượng phân tử từ 36.000 còn 31.000, đầu N của phân tử
prorennin là alanine, còn của phân tử rennin họat động là glycine.
Khác với quá trình họat hóa pepsinogen, quá trình họat hóa prorennin không phải
là quá trình tự xúc tác và peptide được giải phóng ra không có tác động kìm hãm với

rennin.
e. Các yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của enzyme rennin:
-Họat động xúc tác tối ưu của rennin ở pH=3.7; pH tối ưu của rennin nằm ở
vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tùy theo cơ chất vào khoảng 3.4- 4.
Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện
Ca
2+
. Ở pH =3.7, các ion Ca
2+
làm tăng họat độ rennin, những cation hóa trị +1 làm
giảm hoạt độ của nó.
-Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H
2
S
0.0001M và MgCl
2
. Rennin và prorennin bị bất họat nhanh chóng bởi ure.
-pH :
Ở pH = 2 trong NaCl
rennin họat động nhanh
nhưng hình thể không ổn
định.
Ở pH = 5 rennin họat
động chậm nhưng hình thể
ổn định và được bảo vệ tốt,
thêm vào đó ở nồng độ NaCl
2M sẽ tăng khả năng họat
động của enzyme.(Rand và
Ernstron chứng minh)
Ở pH = 7 có sự tự phân

hủy và hoạt tính thủy phân
Nhóm 10 – 07SH1D
3
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
của rennin ở pH này rất thấp. Họat tính bị giảm khi pH >6 kèm theo sự xuất hiện
protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
Rennin bị mất họat tính nếu để lâu trong môi trường kiềm yếu pH = 9 , bị bất họat
nhanh chóng trong môi trường acid mạnh.
f. Bảo quản rennin:
Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15
o
C. Dịch rennet được bảo quản ở nồng
độ muối cao 14-20% và có thể thêm Na-benzoate và propylene-glycol để bảo quản.
2. Dạ dày bê:
a. Cấu trúc dạ dày:
-Dạ dày là một đọan phình ra
của ống tiêu hóa có tác dụng:
chứa đựng thức ăn, nhào trộn
thức ăn để thấm qua dịch vị.
Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hóa
của các enzyme tiêu hóa chứa
trong dịch vị, chuẩn bị giai
đoạn chính của việc tiêu hóa ở
ruột non.
-Hệ dạ dày kép gồm 4 túi: trong đó 3 túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách)
gọi chung là dạ dày trước, không có tuyến tiêu hóa riêng, có chức năng tích trữ,
nhào trộn và chuyển hóa thức ăn. Túi thứ 4 gọi là dạ múi khế tương tự dạ dày đơn,
có hệ thống tuyến tiêu hóa phát triển mạnh.
 Các tuyến chính của dạ dày:
Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhầy.

Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin, galactinase.
Tế bào viền bài tiết HCl.
Tế bào bài tiết gastrin.
b. Sự tiêu hóa thức ăn trong dạ dày:
Các men tiêu hóa cơ bản trong dịch dạ dày là protease và lipase
Các protease được tiết ra trong dạ dày là các enzyme: pepsin, rennin,
gelatinase và cathepsin.
Dạ dày bê có cấu trúc khác so với dạ dày bò: bê mới đẻ sự phát triển về hình
thái và chức năng của cơ quan tiêu hóa chưa đầy đủ: dạ cỏ và dạ tổ ong chiếm 30%
tổng số dung tích dạ dày, dạ múi khế và lá
lách chiếm 70%, đặc biệt là ngăn thứ tư
của dạ dày bê chứa lượng rennin rất cao
giúp cho bê tiêu hóa sữa.
Sự tiêu hóa của chúng cũng giống
như sự tiêu hóa của gia súc có dạ dày đơn.
Sữa được dẫn trực tiếp qua rãnh thực quản
xuống dạ lá sách và dạ múi khế để tiêu hóa
nhờ có men tiêu hóa là rennin.
c. Mối liên hệ giữa enzyme rennin và dạ dày bê:
− Rennin có vai trò chuyển hóa sữa trong dạ dày ở ngăn thứ 4 của bê bởi sự thay
đổi sữa từ dạng dịch sang dạng khối (gel).
Nhóm 10 – 07SH1D
4
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
− Họat động đông tụ sữa diễn ra trong dạ múi khế bào thai của bò khỏang 6 tháng
và tăng cao trong khỏang giữa thai bò tháng thứ 9 và bê non đang bú sữa 3 -4
ngày tuổi.
− Ở động vật còn non, cấu trúc dạ dày có phần thay đổi và có hàm lượng rennin
phụ thuộc vào tuổi sinh lý và phụ thuộc vào loài động vật.
Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ

nồng độ Ca
2+
. Ca kết tủa ở dạ dày, phần nhũ thanh còn lại của sữa chuyển xuống ruột
non để tiêu hóa. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng
đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin (trong trường hợp thu chế
phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì
khả năng đông tụ sữa kém đi.
II. Phương pháp thu nhận:
 Hóa chất:
− Muối NaCl, HCl sử dụng để kết tủa thu enzyme, nên hóa chất phải tinh khiết,
khô, không lẫn tạp chất, nhất là kim lọai nặng vì gây tủa và bất họat enzyme.
− Na-benzoate: chất bảo quản.
 Thiết bị: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hóa,
máy đo pH, cân Mettler K7, cân Prolabo.
 Nguyên liệu:
Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi.
 Quy trình: gồm 2 giai đọan: thu nhận dung dịch rennet (có chứa rennin) và thu
nhận rennin.
1. Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet


*Giải thích quy trình:
 Xử lý sơ bộ:
Tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay
để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh,
không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
 Xay nhuyễn:
Nhóm 10 – 07SH1D
5
Dạ dày bê

Xử lý sơ bộ
Xay nhuyễn
Trích ly
Lọc
HCl 0.2% và
0.7% acid boric
Tỷ lệ 1:3 theo V
HCl 6M
NaCl 15%
Bã
Hoặc nước
muối 10%
Tỷ lệ 1:3
theoV
Dịch rennet
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
− Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ khoảng 1cm rồi xay
nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá trình trích ly.
 Trích ly:
− Thêm HCl 0.2% để chỉnh pH 2 – 3 và 0.7% acid boric trên tổng V (có tác dụng
bảo quản), tỷ lệ 1:3 theo V. Hoặc thêm dung dịch nước muối 10%, tỷ lệ 1:3 theo
V.
− Giữ mẫu trong tủ ấm 35-40
o
C qua 30 giờ.
 Mục đích: ở pH từ 2 – 3 và nhiệt độ 35 – 40
o
C giúp quá trình họat hóa
prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh.
− Thêm HCl 6M chỉnh lại pH của dung dịch về 4 sẽ cho họat tính enzyme cao, khả

năng hòa tan tốt.
 Lọc: Vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc bằng vải màn và vải nhiều lớp
ta thu được dịch rennet chứa rennin họat động và tiền rennin bất họat.
− Dung dịch rennet thu nhận có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột
màu trắng đến nâu nhạt, được bảo quản ở nồng độ muối cao 14-20% và thêm chất
bảo quản như sodium benzoate, propylene glycol.
2. Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết
*Giải thích quy trình:
Nhóm 10 – 07SH1D
5000 vòng/phút
45 phút
6
Natribenzoate
Propylene glycol
Dịch rennet
Khuấy
Kết tủa
NaCl 22-
23%, Gelatin
Ly tâm thu tủa
Tinh sạch
Sấy khô
Rennin tinh
khiết
Rennin thô
Sấy khô
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
 Khuấy:
Dịch rennet được khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri bezoat 1% và
propylene glycol để tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hóa…

 Tủa:
Dung dịch rennet được thực hiện sự kết tủa bằng cách bão hòa dung dịch với
NaCl hoặc acid hóa dung dịch hoặc cả 2 cách. Gelatin được thêm vào thường xuyên có
tác dụng là giá để hấp thụ các chất cặn bã, giúp cho quá trình tủa enzyme được dễ
dàng hơn.
− Tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng
cách cho từ từ một lượng NaCl tinh thể nồng độ khỏang 22-23% vào, khuấy nhẹ
cho đến khi dung dịch bão hòa, để tủ lạnh 20 phút.
 Ly tâm:
Hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm trong 45 phút, tốc độ 5000
vòng/phút để thu tủa. Tủa thu được là rennin thô (chứa muối, các protein lạ và ít
protein tinh khiết)
 Sấy khô: Sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô ở nhiệt độ phòng.
 Tinh sạch rennin thô:
Có thể sử dụng bằng 2 phương pháp sau:
+Phương pháp 1: Thẩm tích bằng màng bán thấm( cellophan)
− Nguyên tắc:
Màng bán thấm (cellophan) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dung để tách muối và
cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo
nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp
(bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ.
− Thực hiện:
Cho rennin thô vào giấy cellophane, đặt vào nước cất lạnh ở nhiệt độ 0-4
o
C, khuấy
và thay nước cất lạnh (2 ngày đêm) cho đến khi thử âm tính với AgNO
3
, làm khô
nhanh túi bằng sấy quạt gió, nhiêt độ 30-40
o

C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.
Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl đã thẩm tích qua
màng.
+Phuơng pháp 2: phương pháp sắc kí DEAE sephadex G-50
− Nguyên tắc:
Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột
chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích
thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên
trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di
chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau
đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng.
Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo
trình tự các phân đọan có trọng lượng phân tử lớn ra truớc, các phân đọan có trọng
lượng phân tử nhỏ ra sau.
− Thực hiện:
 Hòa tan tủa trở lại bằng 50ml dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 ta
được dung dịch A. Hút 5ml dung dịch A thêm vào dung dịch đệm citrate
0.025M, pH 5.1 (để qua đêm).
Nhóm 10 – 07SH1D
7
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
 Sau đó đem ly tâm 15000 vòng/phút trong 50 phút bỏ cặn. Phần dịch thu
được cho qua cột DEAE sephadex G-50 (từ 1-5% thể tích cột) và được cân
bằng bởi dung dịch đệm citrate 0.025M
 Sau đó enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-18%.
 Thu mẫu qua cột: Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của
muối NaCl từ 0-18% với tốc độ chảy 30ml/h.Ta thu được 15phân đọan và
2 peak A, B. Hiệu suất về họat tính enzyme: pepsin 20% và chymosin 72%.
Xác định hoạt tính thủy phân(proteolytic activity) của enzyme bằng cách ủ
với hemoglobin trong 10 phút, đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm.

Thu được bảng kết quả sau:
Độ tinh sạch của enzym:
tinhsach
R
E
η =
E
E
tinh sạch
: hoạt lực đông tụ riêng của enzym sau khi tinh sạch (UI/ mg protein)
E
R
: Hoạt lực đông tụ riêng của dịch enzym thô (UI/mg protein)
 Sấy đông khô:
 Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô:
Nguyên tắc của phương pháp sấy đông khô là nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách
chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không làm hỏng nguyên liệu.
 Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn:
o Giai đoạn 1 – làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu
xuống điểm eutectic (điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha
rắn cùng tồn tại) - đảm bảo quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp.
o Giai đoạn 2 – sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống – 40
o
C
để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh.
Nhóm 10 – 07SH1D
Sample
Clotting
activity
(%) C

Proteolytic
activity (P)
(OD
280nm/ml)
C/P
Stock
rennet
33.2 11.1 3.0
Peak A 22.4 2.0 11.2
Peak B 3.7 - -
8
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
o Giai đoạn 3 – sấy bậc 2 : giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc
1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất
hóa lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục
thúc đẩy quá trình thăng hoa.
 Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:
Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng,
mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho
enzyme giữ nguyên liệu được tính chất hóa lý và có thể bảo
quản trong thời gian dài.
Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng.
Xác định hiệu suất thu hồi enzym sau quá trình sấy đông khô:
enzymesausay
ngandaday
m
H
m
=
H: hiệu suất thu hồi enzym (%)

m
enzymsausay
: khối lượng enzym thu được sau khi sấy đông khô (g)
m
ngandaday
: khối lượng ngăn dạ dày chứa enzym đang khảo sát (g)
III. Các phương pháp phân tích chất lượng enzyme.
− Dịch rennet bê tiêu chuẩn (1000 IMCU): chứa 98% chymosin và <2%
pepsin.
− Họat tính của rennin: trong 10 phút có thể làm đông tụ sữa với số lượng
gấp 72 triệu lần khối lượng enzyme. Hoạt động mạnh ở pH 3.8 và 40
o
C.
1) Khảo sát hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:
• Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue –
G250 liên kết với protein trong môi trường acid. Thuốc nhuộm này sẽ tạo với protein,
tương tác với các nhóm kị nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein
thành một phức chất màu xanh, có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 595nm. Cường độ
màu này tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên bằng phương pháp so màu có thể xác
định được hàm lượng protein.
• Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao, chính xác vài g, hóa chất
đơn giản, ít tốn kém.
Xác định hàm lượng protein có trong mẫu enzyme:
3
Δ
× ×10
PU
OD b F
P

a V
−
−
=
P: hàm lượng protein của mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein (mg/mL)
OD: hiệu suất mật độ quang của mẩu enzyme đo được ở λ = 605nm (A)
F: độ pha loãng mẫu enzyme.
V
PU
: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein.
Nhóm 10 – 07SH1D
9
×
×
s
E
V
E F
T V
=
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Xác định hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme:
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
P P m
m

−
=
V
mau
: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzym
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg proetin)
2) Khảo sát hoạt lực đông tụ sữa của enzyme:
Protease ngoài khả năng thủy phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tùy mức
độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá trình
đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất phomai.
• Nguyên tắc:
Xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một
thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định.
Đơn vị hoạt lực đông tụ sữa: là lượng enzyme cần đủ để đông tụ 1.0mL sữa
trong 1 phút ở 50
o
C
Hoạt lực đông tụ sữa của enzyme trong 1mL
E: hoạt lực đông tụ sữa (UI/mL)
V
S
: thể tích dung dịch sữa (mL)

V
E
: thể tích dung dịch enzyme sử dụng (mL)
T: thời gian đông tụ sữa (phút)
F: độ pha loãng dịch enzyme
Tổng hoạt lực đông tụ sữa
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
E E m
m
−
=
(UI)
E
t
: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)
V
mau
: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
Hoạt lực đông tụ riêng của enzyme

t
R
t
E
E
P
=
(UI/mg protein)
E
R
: hoạt lực đông tụ riêng của enzyme (UI/mg protein)

E
t
: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)
Nhóm 10 – 07SH1D
10
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
3) Khảo sát hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến:
• Mục đích :
Khảo sát hoạt lực proteolytic để biết được khả năng thủy phân liên kết peptide.
• Nguyên tắc:
Cho protease tác dụng với cơ chất casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa
protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm được tạo thành bằng phản ứng màu với
thuốc thử Folin – Ciocalteu. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với
sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Đơn vị họat độ protease: là lượng enzyme trong 1phút ở 30

o
C phân giải được 1
lượng protein tương đương với 1 µmol tyrosin.
Hoạt lực proteolytic cuả enzyme trong 1 mL
sin
µ ×
tyro PU
mol V
H
t
=
(UI/mL)
V
PU
: thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng
t: thời gian thủy phân (phút)
Tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
H H m
m
−
=
(UI)
H
t

: tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme (UI)
V
mau
: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzym
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
Hoạt lực proteolytic riêng của enzyme
H
R
: hoạt lực proteolytic riêng của enzyme (UI/mg protein)
Ht: tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme (UI)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)
IV. Ứng dụng:
Enzyme rennin có họat tính đông tụ sữa rất cao, thường phối trộn với pepsin theo tỉ lệ
1:1 để sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa như sản xuất phomai….
− Quá trình đông tụ sữa dưới tác dụng của rennin thực chất là quá trình thủy phân
hạn chế κ- casein, vỏ háo nước bị phá hủy do đó ion Ca dễ dàng tiếp cận với các α,
β và paracasein.
− Rennin thủy phân liên kết peptid tại một vị trí đặc hiệu (liên kết giữa Phe – Met
ở vị trí 105 – 106) của κ- casein để tạo ra glycomacropeptid hòa tan và para-κ-
casein không hòa tan. Sự đông tụ tạo ra là do một phần glycomacropeptid, làm
giảm sự tích điện bề mặt vủa micelle. Bề mặt các micelle trở nên ưa béo, các
micelle liên hợp một cách dễ dàng.
Nhóm 10 – 07SH1D

11
t
R
t
H
H
P
=
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Nhóm 10 – 07SH1D
12