TÁCH CHIẾT PROTEASE TỪ RUỘT CÁ

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO DỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
Bộ môn: Công Nghệ Protein & Enzyme
Giảng viên: ThS. Nguyễn Thị Thu Sang
TÁCH CHIẾT PROTEASE TỪ
RUỘT CÁ
Sinh viên thực hiện:
Trần Thị Tuyết Nhung 072524S
Trần Dương Thùy 072589S
Lương Minh Vân 072648S
Cao Đình Vũ 072658S
Nguyễn Khánh Vũ 072660S
TPHCM 2009
Công nghệ protein-enzyme
MỤC LỤC
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguyên liệu dùng để chiết tách Protease
1.1.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu
1.1.2. Đặc điểm cá tra, cá basa
1.1.3. Hệ tiêu hóa cá tra, cá basa
1.1.3.1. Ống tiêu hóa
1.1.3.2. Tuyến tiêu hóa
1.2. Phân loại - cấu tạo - chức năng Protease
1.2.1. Phân loại protease
1.2.2. Đặc điểm của protease
1.2.2.1. Đặc điểm chung
1.2.2.2. Trypsin
1.2.2.3. Chymotripsin
1.2.3. Chức năng protease
1.2.3.1. Hoạt hóa zymogen

1.2.3.2. Kích thích đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông
1.2.3.3. Giải phóng hormon và các peptide từ các tiền chất
1.2.3.4. Inhibitor Protease có khả năng ức chế tế bào ung thư
Phần 2 : QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
2.1. Sơ đồ thu nhận protease
2.2. Thuyết minh quy trình thu nhận
2.2.1. Thu ruột cá
2.2.2. Nghiền
2.2.3. Điều chỉnh pH, nhiệt độ
2.2.4. Ly tâm lần 1
2.2.5. Tinh sạch
2.2.6. Ly tâm lần 2
2.2.7. Sấy khô
2.2.8. Sản phẩm
1.2.9. Các sản phẩm Protease trên thị trường
1.210. Tình hình sản xuất
Phần 3 : ĐÁNG GIÁ CHẤT LƯỢNG PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG
3.1. Đánh giá chất lượng Protease
3.1.1. Hoạt tính xúc tác của enzyme
3.1.2. Độ tinh sạch của enzyme
3.2. Ứng dụng của Protease
3.2.1. Trong công nghiệp
3.2.2. Trong hóa học
3.2.3. Trong y dược
3.2.4. Trong nông nghiệp
3.2.5. Trong hương phẩm – mỹ phẩm.
Trang
2
Công nghệ protein-enzyme
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NGUYÊN LIỆU DÙNG ĐỂ CHIẾT TÁCH PROTEASE:
1.1.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu:
• Nguồn enzyme protease có trong nội tạng tất cả các loài cá. Vì vậy để sản xuất
enzyme protease ta có thể dùng nội tạng của tất cả các loài cá sau khi chế biến (phụ phẩm
trong sản xuất), nhưng hầu hết chúng đều được chế biến để tạo thành những sản phẩm
cũng có giá trị thương phẩm tốt nên nguồn nguyên liệu sẽ bị hạn chế (ví dụ: nội tạng cá
ngừ đại dương, cá cờ, cá đuối… đều là những nguyên liệu chế biến những món đặc sản,
gia vị đặc biệt).
• Tuy nhiên đối với nội tạng cá tra và cá basa thì không bởi vì:
 Hiện nay chúng chỉ được chế biến thành thức ăn gia súc, gia cầm và thủy sản nên
giá trị có được không cao.
 Theo hiệp hội thủy sản Việt
Nam (VASEP) cho biết năm 2006 cả
đồng bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL) sản xuất ra khoảng
800.000 tấn cá tra và basa nguyên liệu,
với kim ngạch xuất khẩu phi-lê cá đạt
khoảng 800 triệu USD. Năm nay, dự
báo sản lượng cá nguyên liệu đạt hơn
1 triệu tấn. Điều này cho thấy
không chỉ sản lượng cá thành phẩm
ngày càng tăng, mà cũng đồng nghĩa
với việc là số lượng phế phẩm ngày càng tăng lên, dẫn chứng cụ thể là để sản xuất
800.000 tấn cá nguyên liệu được đưa vào chế biến vào năm 2006 thì các nhà máy chỉ thu
được chưa đầy 300.000 tấn phi-lê và thải bỏ hơn 500.000 tấn phế phẩm. Năm 2007, nếu
sản lượng cá nguyên liệu đạt 1 triệu tấn như dự báo của VASEP thì các nhà máy chế biến
phải thải ra thị trường hơn 600.000 tấn phế phẩm.
 Như vậy, sẽ có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm sau xuất khẩu cần được nghiên cứu
ứng dụng để làm tăng hiệu quả sử dụng từ nguồn lợi thủy sản này. Vấn đề được đặt ra ở đây
là làm thế nào để tận thu, chế biến những phụ phẩm của ngành như xương, da, nội tạng

cho có hiệu quả cao để không làm ô nhiễm môi trường vừa thu thêm nguồn lợi kinh tế.
• Một trong những phương án triển vọng có thể tận thu nguồn nội tạng cá basa, cá tra là
chiếc tách enzyme protease để dùng trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm… mang lại
hiệu quả kinh tế cao.
1.1.2. Đặc điểm cá tra, cá basa:
Trang
3
Công nghệ protein-enzyme
Cá basa
Cá tra
• Về mặt phân loại, 2 loài này thuộc bộ cá nheo (Siluriformes), họ cá tra (Pangasidae),
loài Pangasius.
• Giống nhau:
 Cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá basa (Pangasius bocourti) đều là cá da
trơn (không vẩy).
 Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10%) và
nước phèn (pH>4).
• Khác nhau:
Cá Basa Cá Tra
Trang
4
Công nghệ protein-enzyme
 Cá basa (tên tiếng Anh: Yellowtail
catfish) là loài được nuôi truyền thống
trong bè trên sông Mekong ở Việt Nam,
Lào, Thái Lan và Campuchia.
 Ngược lại, cá basa còn gọi là cá bụng
vì có lá mỡ rất lớn, không có cơ quan
hô hấp phụ, chịu đựng kém ở môi
trường nước có hàm lượng oxy hòa tan

thấp.
 Thức ăn cho cá basa thường là hỗn
hợp tấm, cám, rau và cá vụn (nấu chín)
nên phù hợp với nuôi dưỡng trong bè
trên sông nước chảy mạnh.
 Cá tra (tên tiếng Anh: Shutchi
catfish) trước đây được nuôi nhiều trong
ao, ở đồng bằng Nam bộ Việt Nam.
 Cá tra có cơ quan hô hấp phụ, có thể
hô hấp bằng bóng khí và da, nên chịu
đựng được môi trường nước thiếu oxy
hòa tan.
 Ngoài ra, cá tra có khả năng thích
nghi với nhiều loại thức ăn như mùn bã
hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn
hỗn hợp.
 Cá tra có thể nuôi trong môi trường
chật hẹp với mật độ cao (50 con/m
2
)
như bè, ao hầm, gần đây là nuôi cồn và
đăng quần cũng cho hiệu quả cao.
 Vì điều kiện chế độ nuôi dễ dàng nên ngành nuôi cá tra và basa phát triển rất nhanh
trong những năm vừa qua do có thị trường xuất khẩu lớn.
1.1.3. Hệ tiêu hóa cá tra, cá basa:
• Hệ tiêu hóa của cá tra, cá Basa tương tự nhau bao gồm ống tiêu hóa và tuyến tiêu
hóa.Ống tiêu hóa bắt đầu từ miệng rồi đến thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già, và kết
thúc ở hậu môn. Các tuyến tiêu hóa bao gồm tuyến nước bọt, tuyến tụy ngoại tiết dịch
tụy, gang bài tiết dịch tụy.
1.1.3.1 Ống tiêu hóa.

 Miệng: nằm ở mút đầu khoang miệng, hầu khá rộng, trong răng có lưỡi và các lược
mang.
 Răng: chưa có phân hóa nên về hình dạng thì giống nhau, thường có hình côn dính
lên xương hàm, xương khẩu cái, xương lá mía, phần trên và dưới cung mang…đỉnh
nhọn hướng vào trong, có tác dụng giữ mồi, chưa có vai trò tiêu hóa về mặt cơ học.
Hình dạng và kích thước răng thay đổi tùy theo loài và độ tuổi của cá.
 Lưỡi: là lưỡi giả do khúc sụn gốc móng phủ lên niêm mạc tạo thành, cơ lưỡi không
phát triển nên lưỡi ít cử động hoặc không cử động được. Trên mặt lưỡi cũng chưa có các
chồi cảm thụ vị giác.
 Hầu: cuối khoang miệng là hầu, có thủng 5 đôi khe mang thông sang hai bên, các
cung mang mặt trong gắn với các que mang kề liền nhau tạo thành lược mang, ngăn
không cho thức ăn từ khoang miệng lọt vào buồng mang.
 Thực quản: kế tiếp khoang miệng là thực quả. Thực quản thường ngắn và rộng,
thành có ba lớp, ngoài cùng là màng quánh mỏng do mô liên kết tạo thành, giữa là lớp
cơ khá dày và trong là lớp niêm mạc gấp nếp, thành lớp này có tế bào biểu bì xen kẽ, có
các chồi vị và có nhiều tuyến nhày tiết chất nhày làm trơn đường dẫn thức ăn.
Trang
5
Công nghệ protein-enzyme
 Dạ dày: chưa phân hóa, thường chỉ là đoạn cuối của thực quản phình to hơn nên
cũng chưa có vai trò cơ học rõ rệt trong tiêu hóa thức ăn. Thành dạ dày chắc hơn thành
ruột, nó gồm 4 lớp: lóp màng quánh, lớp cơ đều dày hơn, lớp dưới màng nhày có rất
nhiều mạch máu nuôi dạ dày, và cuối cùng là lớp màng nhày cũng có nhiều lớp dọc
ngang và có nhiều tuyến vị hình ống làm nhiệm vụ tiết dịch tiêu hóa.
 Ruột: cấu tạo thành ruột giống thành thực quản, gồm 3 lớp, khác nhau lớn nhất là
lớp niêm mạc có nhiều nếp gấp dọc ngang và có nhiều tuyến ruột, tiết dịch.Tiêu hóa.ruột
là chặng đường tiêu hóa quang trọng vì đổ vào đây ngoài dịch ruột còn có dịch mật và
dịch tụy đều có vai trò quan trọng trong tiêu hóa thức ăn. Ruột chưa phân hóa thành ruột
non và ruột già rõ rệt. Cuối cùng chất cặn bã được đổ ra lỗ hậu môn .
1.1.3.2 Tuyến tiêu hóa.

 Tuyến miệng: trong miệng và cả trong thực quản cá có nhiều tuyến nhờn tiết chất
nhờn làm trơn thức ăn dễ nuốt. Cá không có tuyến nước bọt.
 Tuyến dạ dày: tiết ra acid và pepsin, tiêu hóa thức ăn, acid có tác dụng làm mềm và
làm nở thức ăn , đồng thời kích thích pepsin hoạt động mạnh.
 Tuyến ruột: có dạng túi xen kẽ trong lớp niêm mạc, chất tiết ra có tác dụng tiêu hóa
trực tiếp thức ăn từ dạ dày đưa xuống.
 Tuyến gan và tụy: gan là tuyến tiêu hóa lớn nhất. Chức năng chính của gan là tiết
dịch mật, mật thường tích lũy trong túi mật trước khi cho vào ruột, nhưng trong trường
hợp cần thiết cũng có thể đổ trực tiếp vào ruột. Mật có vai trò nhũ tương hóa mỡ giúp
lipase hoạt động dễ dàng. Ngoài ra mật còn kích thích nhu động ruột và làm tiệt trùng
đường tiêu hóa. Gan có vai trò vô cùng quan trọng đối với cá, nếu cắt gan đi cá sẽ chết
nhanh chóng.
1.2. PHÂN LOẠI – ĐẶC ĐIỂM – CHỨC NĂNG PROTEASE: 1.2.1.
Phân loại:
* Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên liên kết peptide trong phân tử protein, người
ta chia protease làm 2 nhóm chính:
Endopeptidase(Proteinase)
Chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những
đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ hơn (polypeptide mạch ngắn, pepton ). Nhóm
các protease tiêu hóa chủ yếu ở người và động vật gồm có: pepsin và rennin có trong dịch
dạ dày. Ngoài ra, tripsin và chymotripsin của tuyến tụy và niêm mạc ruột non cũng thuộc
nhóm enzyme này.
Exopeptidase (Polypeptidase)
Chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở 2 đầu mạch.
* Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm
các nhóm sau:
Protease acid: rennin, pepsin, hoạt động ở vùng pH acid 2,5 – 3
Protease kiềm: tripsin, chymotripsin, hoạt động ở vùng pH kiềm 6 – 7,5
Protease trung tính: amylase, papain, hoạt động ở vùng pH trung tính 8 – 11

* Trong nội tạng cá, protease gồm 3 hệ enzym lớn:
Trang
6
Công nghệ protein-enzyme
Hệ enzym Metalo-protease (Aminodipeptidase)
Hệ enzym này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên
ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzym này
có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptide. Đây là
nhóm thủy phân enzym trung tính, pH tối thích từ 5-7, pI = 4-5, nó ổn định với ion Mg
2+
,
Ca
2+
và mất hoạt tính với Zn
2+
, Ni
2+
, Pb
2+
, Hg
2+

Hệ enzym Serin-protease
Điển hình là enzym trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu
của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần
đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như
hoàn toàn không còn ở dạng peptol). Hệ enzym này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin
trong cấu trúc của enzym. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men
cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men
cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần. Enzym

serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH=9.
Hệ enzym acid-protease
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzym cathepsin D. Hệ enzym này dễ bị
ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu
thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản
xuất nước mắm.
1.2.2. Đặc điểm của Protease:
1.2.2.1. Đặc điểm chung:
Enzyme mang đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác, nó là một trong những chất
xúc tác sinh học có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường.
Thực tế ở nước ta, các chế phẩm enzyme hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá
thành rất cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất chưa được rộng rãi.
* Enzyme protease ( proteolytic enzym ) – là enzyme xúc tác quá trình thủy phân
các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và các polipeptid. Sản phẩm của quá
trình này có thể là các acid amin, peptide, các chuỗi polypeptide ngắn…

* Cơ chế thủy phân như sau:
1.2.2.2.Trypsin:
Trang
7
Công nghệ protein-enzyme
Tripsin
* Trypsin là enzyme tiết ra từ tuyến tụy. Trong tuyến tụy, trypsin được tiết ra dưới
dạng không hoạt động là trypsinogen, sau đó được chuyển thành trypsin hoạt động dưới
tác dụng của enzyme đường ruột enterokinase, thrombin.
* Cấu trúc: Trypsin là một chuỗi polypeptide có 249 amino acid trọng lượng phân tử
là 22680-23400.
* Tính chất:
+ Trypsin là một enzyme hoạt động trong môi trường tương đối kiềm, có pH = 7,8-
9,5, pH= 8 là tối ưu. Tuy nhiên hoạt tính của trypsin cũng ổn định ở pH= 3-5.

Trang
8
Công nghệ protein-enzyme
+ Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của trypsin là 30-40. Trong môi trường có
pH= 8 và có sự hiện diện của Ca thì enzyme chuyển từ dạng không hoạt động thành dạng
hoạt động, các kim loại nặng cũng có tác dụng là hoạt hóa trypsin như Co,Mn.
• Hoạt động và tính đặc hiệu:

Trypsin là một endopeptidase phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử
protein tạo thành các liên kết có trọng lượng nhỏ. Trypsin có tác dụng lên hầu hết các cơ
chất protein, cả protein có phân tử lượng nhỏ và các protein có phân tử lượng lớn, nhưng
nó tác dụng lên protein đã bị biến tính rồi tốt hơn là trên protein chưa biến tính.
Trypsin là một loại enzyme thủy phân không triệt để, khi sử dụng trypsin thì chỉ có
1/3 liên kết peptide trong phân tử protein là bị thủy phân, phần còn lại là các peptide có
phân tử ngắn hơn. Các phân tử protein khi bị phân cắt bởi trypsin sẽ tạo ra những peptide
có trọng lượng phân tử nhỏ và đôi khi tạo các amino acid tự do như trytophan, tyrosine.
Ngoài tác động lên liên kết peptide, trypsin còn có thể thủy phân các liên kết ester.
Các polypeptide cao phân tử, các peptone khi xuống ruột non sẽ được hệ thống enzyme
của dịch tụy và dịch ruột phân giải triệt để thành amino acid. Trypsin trong dịch tụy và
dịch ruột khi mới tiết ra ở dạng chưa hoạt động là trypsinogen. Dưới tác động của
Trang
9
Công nghệ protein-enzyme
enzyme enterokinase, trypsinogen biến thành trypsin hoạt động, sau đó quá trình này có
thể xảy ra theo phương thức tự hoạt hóa, nghĩa là chịu tác động ngay của enzyme trypsin.
Trypsin hoạt động tốt nhất trong môi trường pH= 7 - 8. Dưới tác dụng của trypsin, các
protein còn sót, các peptide lớn sẽ bị thủy phân đến dạng peptide có trọng lượng phân tử
thấp hơn và một phần thành amino acid. Trypsin thể hiện hoạt lực cao nhất đối với các
liên kết peptide có chứa nhóm carboxyl của amino acid diamin (lysine, arginine).

1.2.2.3. Chymotrypsin :
Trang
10
Công nghệ protein-enzyme
Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tụy, chymotrypsin được tiết ra
dưới dạng không hoạt động là chymotrypsinogen, sau đó được chuyển sang dạng hoạt
động là chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin.
* Cấu Trúc: Chymotrypsin được cấu tạo từ ba sợi polypeptid:
- Sợi A : các acid amin từ 1-13
- Sợi B : các acid amin từ 16-146
- Sợi C: các acid amin từ 149-245
Các sợi này liên kết với nhau bởi cầu nối disulfite. Sự hiện diện của các nối đôi
disulfite là những đặc trưng của những protein có thể hiện hoạt tính ngoại bào. Các sợi
polypeptid liên kết với nhau tạo thành dạng hình cầu, enzyme có bộ ba súc tác phản ứng
là Ser195 - His57 - Asp102. Những vị trí này tạo thành vị trí hoạt động của protein hổ trợ
trong hoạt động xúc tác.

* Tính chất của chymotrypsin:
+ Chymotrypsin là protease hoạt động trong điều kiện môi trường pH kiềm 7-9 và
pH tối ưu là 8-9, điểm đẳng điện pI= 5,4. pH = 5 không thuận lợi cho sự hoạt động nhưng
lại làm cho chymotrypsin bền hơn.
+ Trong ruột, chymotrypsin thủy phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hóa
một phần. hoạt tính của chymotrypsin tương đối yếu hơn trysin, nhưng nó lại có khả năng
thủy phân protein sau hơn.
* Cơ chế hoạt động:
Trang
11
Công nghệ protein-enzyme
Trang

12
Công nghệ protein-enzyme
Sự phân cắt của chymotrypsin đối với insulin
Chymotrypsin là một endopeptidase phân giải các liên kết peptide nằm trong phân
tử protein tạo thành các liên kết có trong lượng nhỏ. Chúng cắt có chọn lọc những liên kết
peptide trong chuổi polypeptide ở vị trí –C của acid amin có nhân thơm ( tryptophan,
tyrosin, phenylain).
* Tính đặc hiệu:
Chymotrypsin phân cắt mạch polypeptide thành những peptide ngắn và tác dụng
lên những liên kết mà trypsin không phân cắt được.
Như vậy, dưới tác động của các enzyme tiêu hóa, các protein của thức ăn đã bị
thủy phân hoàn toàn thành các amino acid. Amino acid được hấp thu qua phần đáy và
phần bên của màng bào tương tế bào niêm mạc ruột vào máu để đến gan. Ở gan các
amino acid có thể biến đổi khác nhau: tổng hợp protein hoặc có thể theo máu đi đến mô
bào để tổng hợp các chất cần cho sự hoạt động như protein, các enzyme, hormon, kháng
thể, khi cần amino acid có thể dùng làm nguồn cung cấp năng lượng.
1.2.3. Chức năng Protease:
1.2.3.1. Hoạt hóa zymogen :
 Phần lớn các enzyme được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tử enzyme
có hoạt tính, nhưng có những enzyme như các protease của tụy tạng, dạ dày cũng như các
protease xúc tác cho quá trình đông máu thường được tổng hợp nên qua một dạng trung
gian chưa có hoạt tính xúc tác gọi là zymogen (proenzyme). Đó là những tiền chất để tạo
thành enzyme, chứ không phải là enzyme thực sự. Những chất này không có hoạt tính,
phải trải qua một quá trình biến đổi, sắp xếp lại cấu trúc phân tử mới trở thành enzyme
hoạt động được. Quá trình chuyển hóa pro-enzyme thành enzyme gọi là quá trình hoạt
hóa, được thực hiện nhờ sự tự xúc tác hoặc do các enzyme khác xúc tác.
Trang
13
Công nghệ protein-enzyme
 Quá trình hoạt hóa zymogen có một số đặc điểm chung như sau:

_ Là quá trình thủy phân giới hạn protein (limited proteolysis), cắt đứt một số liên
kết peptide ở gần đầu N của phân tử zymogen. Đoạn peptide được tạo thành có thể bị loại
ra hoặc vẫn gắn với phần còn lại của phân tử nhờ các cầu disulfide.
_ Khi liên kết peptide bị cắt đứt thường làm thay đổi cấu hình không gian của phân
tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, tạo thành phân tử enzyme.
_ Hiệu suất hoạt hóa zymogen phụ thuộc vào điều kiện hoạt hóa, nồng độ
zymogen, bản chất và nồng độ của enzyme xúc tác cho quá trình hoạt hóa, nhiệt độ, pH
và một số yếu tố khác.
 Ở người và nhiều loài động vật có vú, các protease trong ống tiêu hóa đều được
tổng hợp ra dưới dạng tiền chất của enzyme.
Ví dụ: Pepsinogen do những tế bào chính của tuyến dạ dày tổng hợp nên và là tiền
chất của pepsin, chymotrysinogen và trypsinogen của tuyến tụy theo thứ tự là tiền chất
của chymotrysin và trypsin. Các chất này đều chỉ được hoạt hóa thành dạng enzyme hoạt
động sau khi đã tiết vào lòng ống tiêu hóa. Pepsinogen được hoạt hóa thành trypsin dưới
tác dụng của chính trypsin hoặc enterokinase, còn chymotrypsinogen được hoạt hóa dưới
tác dụng của trypsin và chymotrysin.
Hiện tượng tổng hợp ra các zymogen có một ý nghĩa sinh học quan trọng. Có thể nói
rằng, các protease trong ống tiêu hóa được tổng hợp qua giai đoạn trung gian như vậy
chính là một cơ chế tự bảo vệ của cơ thể. Vì nếu không như vậy thì chính các tuyến đã
tổng hợp nên các loại enzyme này sẽ bị tiêu hủy bởi chính những enzyme do chúng tổng
hợp nên.
1.2.3.2. Kích thích quá trình đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu
đông

Quá trình đông máu được chia làm 3 con đường: con đường yếu tố mô (con đường
ngoại sinh) và con đường hoạt hóa qua tiếp xúc (con đường nội sinh) cả hai cùng kích
hoạt con đường chung của yếu tố X, thrombin và fibrin dẫn tới sự hình thành sợi huyết.
Thrombin có hàng loạt chức năng khác nhau. Vai trò hàng đầu của nó là chuyển
fibrinogen thành fibrin, là chất liệu chính của cục máu đông.
Thực ra, con đường chủ yếu khởi phát sự đông máu là con đường yếu tố mô. Các con

đường đều là một chuỗi các phản ứng, trong đó một zymogen của một serine protease và
đồng yếu tố glycoprotein của nó được hoạt hóa để trở thành các thành phần hoạt động và
xúc tác cho phản ứng tiếp theo trong dòng thác, cuối cùng hình thành các sợi huyết liên
kết chéo với nhau.
Cuối cùng, các cục máu đông được tổ chức lại và tái hấp thu bằng một quá trình
gọi là sự tan fibrin. Enzyme chính của quá trình này (plasmin) được điều hòa bởi một số
chất kích thích và ức chế
1.2.3.3. Giải phóng hormon và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền
chất:
 Sự hình thành hormon của peptide như là insulin
Ví dụ: Insulin được tổng hợp như một chất tiền-protein 105 amino acids dài. Một
peptide tín hiệu 24 aa được khi nó đi vào mô lưới nội nhũ, cho chất tiền-insulin. Điều này
Trang
14
Công nghệ protein-enzyme
xếp và tạo ra những liên kết disulfide giữa Cysteins 7 và 67 và giữa 19 và 80. Một
protease giống trypsin phân chia Arg31 và Arg80. Chuỗi 32-60 đi xa, và arg31 được cắt
tỉa hết bởi một carboxypeptidase để cho insulin trưởng thành, với những chuỗi A và B giữ
chung nhau bởi liên kết disulfide. Điều này sẽ không xếp lại một cách tự nhiên trên việc
làm giảm disulfides, vì việc xếp thông tin trong chuỗi 32-60 không còn hiện diện nữa.
Homon của peptide và những peptides hoạt động sinh học khác thường được tạo ra một
cách giống nhau, bằng cách cắt hết một protein lớn tổng hợp đầu, ví dụ, chất tiền
proproopiomelanocortin có thể cho, trên những phân chia khác nhau, corticotropin và g-
lipotropin, a-MSH, b-MSH và g-MSH, enkephalin và endorphin.
 Nhện mạng phễu Agelenopsis aperta tạo ra một nọc độc có toxins peptide làm tê
liệt con mồi của nó bằng cách ngăn chặn kênh Ca
2+
nhạy điện thế. Toxins được tổng hợp
khi những chất tiền tố lớn hơn cũng có những chuỗi tín hiệu trong việc vận chuyển ngoại
bào và chuỗi acidic chia cắt hết để tạo ra toxins trưởng thành. Hai trong những toxins này,

IVB và IBC, có những chuỗi đồng nhất 48 a.a, dài và những liên kết đồng nhất. IVB có
độc tính nhiều hơn rất nhiều.Việc chia cắt protease ở Glu
42
hoặc chia cắt CNBr tử Met
43
cho
hexa- hoặc polypeotides đầu C- từ hai toxins có thể tách riêng bởi hplc, trong khi peptides
từ phần còn lại của toxin không thể phân biệt. Peptides với chuỗi đầu C-, Gly-Leu-Ser-
Phe-Ala, được tổng hợp với có hoặc không L- hoặc D-Ser ở vị trí 46 (hắn là chúng cố
gắng những D-amino acids khác nữa, nhưng báo cáo cấu trúc chưa được công bố) và cùng
tách rửa với peptides của toxins, leptide L-ser có chất của IVC, peptide D-ser có chất của
IVB hoạt động nhiều hơn. Sau đó chúng tổng hợp toxins hoàn toàn có L- hoặc D-ser ở vị
trí 46, và cho biết là chất gì xếp đúng giống nhau so với chất toxin tự nhiên. Nọc độc thô
qui đổi IVC thành IVB, điều này được minh chứng tốt nhiều hơn khi nọc độ bị chia bởi
lọc gel, tách riêng isomerase 30 kDa khỏi một metalloprotease 86 kDA trái lại làm xuống
cấp IVC. Những liên kết peptide D-amino acid không được chia cắt bởi proteases chia cắt
những liên kết peptide L-amino acid tự nhiên, con mồi côn trùng có thể dùng để khử độc
tố IVC. Nhưng quan trọng nhiều hơn, đảo đoạn cho phép độc tố sẽ thích hợp nhiều hơn
với những kênh Ca
2+
nó ngăn cản, làm cho nó một độc tố mạnh nhiều hơn, kho chứa thể
cấu tạo protein được thêm vào.

1.2.3.4. Protease hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào
bình thường :
 Khi so sánh tế bào bình thường và tế bào ác tính, người ta nhận thấy các tế bào ác tính
chứa nhiều protease hơn tế bào bình thường. Sự tăng của các enzym protease đã được
phát hiện thấy ở các tế bào ác tính cũng như ở máu, dịch tổ chức khác nhau của nhiều loại
động vật mang khối u ác tính. Tế bào các khối u nuôi cấy bài tiết một protease đặc hiệu
(chất hoạt hóa plasminogen) có hoạt tính tăng từ 10-100 lần so với tế bào bình thường.

Trang
15
Công nghệ protein-enzyme
Protease này nằm ở bề mặt màng tế bào, được bài tiết và xuất hiện rất sớm trong các tế
bào chuyển dạng ác tính.
Ví dụ : Phân đoạn màng tế bào tách chiết từ tế bào sợi (fibroblast) bào thai gà được
gây chuyển dạng bởi virut Rouss Sarcoma có hoạt tính protease cao hơn 40 lần so với
phân đoạn màng tế bào bình thường.
 Sự tăng hoạt tính các loại protease ở khối u được giải thích trên cơ sở tác dụng
sinh học của chúng. Các protease được bài tiết bởi các tế bào khối u có khả năng phá hủy
sự gắn của tế bào vào những bề mặt rắn. Các protease như collagenase, cathepsin B, chất
hoạt hóa plasminogen có vai trò phá hủy rào chắn là màng tế bào bao quanh các tế bào
khối u. Khả năng của tế bào khối u phá hủy màng nền và khuôn ngoại bào đã được chứng
minh là có liên quan rõ rệt với khả năng di căn của các khối u.
1.2.3.5. Inhibitor protease có khả năng ức chế tế bào ung thư :
 Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm 1894 bởi
Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính chống trypsin trong huyết
thanh người. Vai trò sinh học chính xác của các chất ức chế protease trong thực vật vẫn
chưa được hiểu biết đầy đủ. Có lẽ chúng có vai trò bảo vệ thực vật chống lại sự tấn công
của các côn trùng, vật nuôi Việc tìm hiểu tác dụng của các chất ức chế protease chống
lại sự xâm lấn của các khối u ở người và động vật còn đang được nghiên cứu
Ví dụ: Một chất ức chế protease có khả năng ức chế hơn 80% hoạt tính toàn phần
elastase, collagenase và một protease giống chymotrysin đã được tách chiết từ tế bào bạch
cầu (Leucocyte Neutral Protease Inhibitor- LNPI) và sử dụng trong nghiên cứu chống ung
thư. So sánh hai nhóm chuột cái được cấy ghép tế bào ung thư phổi Lewis, trong đó một
nhóm có sử dụng LPNI trong 14 ngày sau khi cấy ghép thì khối lượng của khối u di căn
nhóm này chỉ bằng khoảng 50% so với nhóm chứng.
 Một số thực nghiệm trên động vật gặm nhấm và các loại động vật khác có khả
năng làm giảm sự phát sinh khối u, số lượng khối u và kéo dài thời gian im lặng phát sinh
u ở động vật được cấy ghép tế bào ung thư. Ví dụ, ở loài chuột C3H/HeN có hệ di truyền

rất dễ bị ung thư tế bào gan nguyên phát khi được ăn thêm Edi pro A (một protein tách
chiết từ đậu tương) đã giảm sự xuất hiện của khối u: cụ thể, nhóm chuột không nhận
protein Edi pro A thì sau 18 tháng tuổi đều xuất hiện ung thư gan nguyên phát, trong khi
nhóm chuột được cho ăn thêm 2,6% Edi pro A thì chỉ 25% chuột có phát sinh u, nếu cho
ăn thêm 3,9% Edi pro A thì chỉ 12,5% chuột có phát sinh u và nếu ăn thêm 5,2% Edi pro
A thì tất cả chuột (8con) đều không xuất hiện ung thư gan.
 Kết quả trên dẫn đến một khả năng là các chất ức chế protease tự nhiên nếu đưa
vào động vật trước hoặc cùng lúc với tác nhân gây ung thư có thể ức chế hoặc làm chậm
sự phát sinh khối u. Tác dụng này có thể là do các chất ức chế protease ức chế sự phá hủy
ngoại bào, màng tế bào bình thường trong quá trình xâm lấn di căn của tế bào ung thư.
Trang
16
Công nghệ protein-enzyme
 Các chất ức chế protease tác dụng theo 2 cách sau:
- Ức chế (khóa) hoạt động của các protease bởi phản ứng tương tác protein-
protein.
- Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào trung tâm hoạt động
của các protease
chất ức chế protease
1.3. CÁC SẢN PHẨM PROTEASE TRÊN THỊ TRƯỜNG :
1.3.1 Chế phẩm sinh học cho gia súc gia cầm và thủy sản
• Enzyme proteasse được bổ sung vào thức
ăn hoặc chất trộn vào thức ăn cho vật nuôi
để tăng hiệu xuất hấp thụ các chất dinh
dưỡng có trong thức ăn nhờ họat tính kích
thích tiêu hóa của enzyme và những loại
vitamin thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát
triển tốt của vật nuôi. Ví dụ
Men vi sinh dùng cho Tôm-Cá
Sản phẩm đoạt huy chương vàng Hội chợ

thương mại quốc tế tại Cần Thơ năm 2003
Sản phẩm được Bộ trưởng Bộ Thủy sản
chứng nhận "Sản phẩm không chứa các chất
cấm sử dụng" theo Quyết định số
Trang
17
Công nghệ protein-enzyme
01/2002/QĐ-BTS ngày 22/01/2002
Thành phần:
+Bacillus Subtilis 10
8
CFU/gr
+Lactobacillus acidophilus 10
8
CFU/gr
+Lactobacillus sporogenes 10
8
CFU/gr
+Men tiêu hóa Amilase, Protease, Pectinase
+Tá dược vừa đủ
1.3.2 Thuốc, chế phẩm bổ trợ tiêu hóa và điều trị bệnh.
Nhờ những đặc tính quí báu của proteasse mà nó được ứng dụng rất nhiều trong y
học để phục vụ con người. Proteasse được phối trộn chung với các chất khoáng tạo thành
một loại men tiêu hóa bổ trợ cho việc hấp thu protein, hoặc protease ở dạng tinh khiết thì
làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống
viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và
mỹ phẩm
BioSET Protease là một hỗn hợp của những protease và
canxi citrate từ cây xanh. Nó là cơ sở cho các protease hoạt động
trong mô của cơ thể, nó thực sự là một công cụ hỗ trợ tiêu hóa

hữu hiệu. Nghiên cứu cho rằng nó có thể giúp làm giảm sự viêm,
làm mạnh thêm hệ miễn dịch và tăng cường quá trình sữa chữa
mô cơ quan. Protease có thể giúp đỡ giải độc máu và điều chỉnh
hiệu ứng của hoocmon, tăng cường sức hoạt động cho tất cả các
hệ cơ quan trọng cơ thể. Ngoài ra số lượng protease cần cho sự
hoạt động bình thường của cơ thể thì thường nhiều hơn, việc này
thì cần thiết cho sự tiêu hóa. Tuy thế các sản phẩm protease trên
thị trường thường chứa đựng cùng hỗn hợp protease được tìm
thấy trong các sản phẩm tiêu hóa. Canxi được thêm vào để giúp đỡ ngăn ngừa sự hấp phụ
hết canxi vào trong tế bào, mà có thể là do sự có mặt của hỗn hợp tích điện cao này trong
máu.
Through Proper Digestion.
Benefits:
- Hỗ trợ sự miễn dịch nhờ sự kích hoạt những tế bào giết tự nhiên.
- Tăng thêm tính linh hoạt của tế bào máu, cải thiện sự lưu thông máu.
Trang
18
Công nghệ protein-enzyme
1.3.3 chế
phẩm enzyme phục vụ cho công nghiệp
• Enzyme còn được sản xuất với một lượng lớn để phục vụ cho công nghiệp thực phẩm,
công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da thành phần của các chế phẩm này đa số là các
enzym được chiết tách từ vi sinh vật và ở dạng thô hoặc bán tinh khiết, ngoài ra một số
loại proteasse còn được cải biến để phù hợp với những điều kiện sản xuát công nghiệp.
• Ngoài ra còn có rất nhiều loại sản phẩm có thành phần là proteasse thuộc nhiều lĩnh
vực khác nhau nhưng ưu điểm chung của chúng là thân thiện với môi trường và có hoạt
tính tốt( tùy thuộc vào nhà sản xuất và mục đích sử dụng).
1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT :
Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực
khác nhau, nhưng trong đó có lẽ enzyme protease thì được ứng dụng một cách rộng rãi và

phổ biến hơn cả.
Theo báo cáo của Frost và Sullivan trong tạp chí Chemistry in Britain, 1992 thì
trong năm 1991, ở các nước Châu Âu doanh số thu được từ việc bán enzyme protease là
140,85 triệu USD lớn hơn rất nhiều so với enzyme khác và chiếm khoảng 50% tổng
doanh thu từ các enzyme.
Loại enzyme Doanh thu (triệu USD)
Protease 149,85
Carbohydrase 62,6
Lipase 31,31
Pectinase 31,3
Các enzyme khác 31,31
Trang
19
Công nghệ protein-enzyme
Cũng theo báo cáo của tạp chí này, năm 1995 tổng doanh thu từ các enzyme cũng
tăng lên rất nhanh ở các nước Châu Âu. Trong đó, doanh thu của protease là 187,2 triệu
USD, chiếm 50% tổng doanh thu.
Loại enzyme Doanh thu (triệu USD)
Protease 187,2
Carbohydrase 83,2
Ligase 41,6
Các enzyme khác 41,6
Các enzyme đặc biệt 20,8
Hiện vẫn chưa có số liệu chính xác về doanh thu từ enzyme ở các nước Châu Á,
Châu Mỹ và Châu Phi.
Khi xem xét khả năng ứng dụng của các loại enzyme công nghiệp, Gogfacy và
Reichelt (1983) cho biết số lượng enzyme Protease được sử dụng nhiều nhất, chiếm 59%,
trong đó :
Tên enzyme Tỉ lệ (%)
Trypsine 3

Rennet 10
Protease acid 3
Protease trung tính 12
Protease kiềm 31
Theo thời gian, số liệu thu nhập trên có thể thay đổi, song điều dễ nhận thấy là
tổng doanh thu hay khả năng buôn bán các enzyme công nghiệp ngày càng tăng, khả năng
ứng dụng của enzyme protease vẫn là cao nhất.
Trang
20
Công nghệ protein-enzyme
Chương 2 : QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
2.1. SƠ ĐỒ THU NHẬN PROTEASE:

Trang
21
Nguyên liệu
Thu ruột cá
Nghiền
Trích ly
Ly tâm lấy dịch chiết
Tinh sạch
Dung dịch đệm 0,2 N
glycine NaOH pH 9,5
Isopropanol lạnh
Vmẫu / Vdm
(15/85) khuấy để
lắng trong vòng
30.
bã
Dịc

h
Cắt nhỏ( 4x8 mm )
Công nghệ protein-enzyme
2.2.THUYẾT MINH QUY TRÌNH:
2.2.1. Thu ruột cá :
Cá ba sa được làm chết nhanh để tránh làm mất hoạt tính enzyme, tiến hành mổ và
thu lấy ruột, làm sạch sơ bộ sau đó rửa lại bằng nước cất. Nếu ruột cá sau khi mổ chưa
làm tiến hành thu nhận ngay, thì phãi bảo quản ở nhiệt độ lạnh -20
o
C. thời gian bảo quản
càng ngắn càng tốt nhầm hạng chế tối đa việc mất hoạt tính của enzyme.
2.2.2. Cắt nhỏ
Ruột cá sau khi thu xong đem đi cắt nhỏ với kích thước 4x8 mm. Mục đích làm
cho quá trình nghiền dễ dàng hơn.
. Nghiền:
máy nghiền đồng thể model t18 máy nghiền đồng hóa tb OV5

Ruột cá ba sa sau đó phối chế với dung môi theo tỷ lệ thích hợp, sau đó hỗn hợp sẽ được
nghiền trong thiết bị T25 (Đức) với vận tốc 9000 vòng/phút trong vòng 3 phút. Nhiệt độ
trong lúc phối trộn là 2-4
o
C.
2.2.3. Trích ly
Trang
22
Ly tâm lấy tủa
Sấy
Enzym
protease bán
tinh khiết

Công nghệ protein-enzyme
Trong các yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trích ly, thì nhiệt độ và pH nên
chúng ta cần hết sức lưu tâm.
Sau khi được nghiền dung dịch enzyme sẽ được trích ly bằng dung dịch đệm với tỷ
lệ ruột cá/ dung dich đệm là 1/1(w/w),về mặt lý thuyết nếu tăng lượng dung môi lên thì
quá trình trích ly enzyme từ nguyên liệu vào dung môi sẽ dễ dàng hơn, nhưng vì khi thay
đổi lượng dung môi trong quá trình trích ly thì sẽ thay đôi giá trị pH làm ảnh hưởng đến
độ hòa tan và khả năng khuếch tán của protein vào dịch chiết và thực tế khảo sát thì tổng
hoạt tính của protease tỷ lệ nghịch với dung môi sau khi vượt qua tỷ lệ 1/1(w/w). Vậy nên
tỷ lệ 1/1 (w/w) được lựa chọn. Dung dịch đệm được sử dụng trong quá trình trích ly là 0.2
N glycerine NaOH có giá trị pH 9.5, nhiệt độ 35
O
C và thời gian trích ly là 10 phút.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
2.2.4.
Ly tâm lấy dich chiết:
Sau khi trích ly chúng ta thu được một dung dịch gồm enzyme, protein,các chất hòa
tan, nước, và chất rắn từ ruột cá. Dung dịch này sẽ được đem đi ly tâm ở 4

O
C, với vận tốc
ly tâm là 10000/1ph trong 20 phút. Sau khi ly tâm chúng ta sẽ thu dịch nổi ở trên và bỏ đi
cặn ở dưới, dịch nổi thu được bao gồm các protein có hoạt tính (enzyme) và không có
hoạt tính, nước và các chất hòa tan khác.
Trang
23
Công nghệ protein-enzyme
2.2.5. Tinh sạch:
Quá trình tinh sạch được thực hiện bằng dung môi hữu cơ là isopropanol, dịch chiết
enzyme (V
mẩu
) và dung môi hưu cơ (V
dm
) được làm lạnh lần lược về 2
O
C và -18
O
C trước
khi phối trôn với nhau. Sau khi phối trộn cần giử hổn hộp ở 2
O
C và quá trình tủa được
thực hiện trong vòng 30 phút. Qua khảo sát thực nghiệm nhận thấy khi tăng dần tỷ lệ
isopropanol trong tổng thể tích hổn hộp thì sẽ tăng dần hiệu suất thu hồi enzyme cũng
như mức độ tinh sạch của chế phẩm, khi tỷ lệ V
dm
/V
mẩu
là 15/85 thì hiệu suất thu hồi là
cao nhất (90,46%) và mức tinh sạch là cao nhất(1,65 lần), nhưng nếu chúng ta tiếp tục

tăng tỷ lệ isopropanol trong thể tích vượt qua 85% thì hiệu suất thu hồi enzyme và mức
độ tinh sạch của chế phẩm sẽ giãm.
2.2.6. Ly tâm lấy tủa:
Sau khi tủa chúng ta tiến hành tách tủa ra khổi hỗn hợp bằng cách ly tâm, quá
trình ly tâm được thực hiện trong vòng 10 phút và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút.
Với tốc độ ly tâm cao như vậy sẽ làm lắng các phân tử trong dịch enzyme theo thang tỷ
trọng, phân tử có tỷ trọng lớn sẽ lắng xuống đấy các phận tử có tỷ trọng nhỏ hơn sẽ nằm ờ
các vùng trên. Kết quả ta sẽ thu được phần enzyme lắng ở đáy.
Máy ly tâm lạnh
Trang
24
Công nghệ protein-enzyme
2.2.7. Sấy khô:
Sau khi chúng ta ly tâm sẽ thu lấy phần tủa và đem đi sấy khô có thổi ở nhiệt độ từ
30-40
O
C. trong quá trình sấy để tránh làm mất hoạt tính, ta cần thêm vào chất độn như
tinh bột hòa tan, maltose dextrin.
Tủ sấy Memmert

2.2.8. Sản phẩm:
Sau khi sấy chúng ta sẽ thu được sản phẩm và việc quan trọng là làm sao để bảo
quản tốt được sản phẩm, sản phẩm sẽ được bảo quản ở điều kiện khộ, lạnh tránh tiếp súc
trực tiếp với ánh sáng, các tác nhân vật lý, hóa học làm ảnh hưởng đến hoạt tính
.
Phần 3 : ĐÁNG GIÁ CHẤT LƯỢNG PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG
Trang
25