Công nghệ Enzyme

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 1
c lc
Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B 3
1.1. Ngun ng vt: 3
1.2. Ngun gc thc vt: 4
1.3. Ngun vi sinh vt: 4
Chng 2: N XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT 5
2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi sinh vt 5
2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao: 11
2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt : 12
2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim: 13
2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt: 17
2.6. Tách và làm sch ch phm enzym : 22
Chng 3:  THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY MM (MALT) 24
3.1. Nguyên liu i mch: 24
3.2. Làm sch và phân loi ht: 25
3.3. a, sát trùng và ngâm ht: 26
3.4. y mm: 28
3.5. y malt: 34
3.6. Tách mm, r, bo qun malt: 37
3.7.  thut sn xut mt s loi malt c bit: 38
Chng 4: N XUT ENZIM T THC VT 40
4.1. n xut ureaza tu ra: 40
4.2. Thu nhn bromelain t da: 40
Chng 5: ENZIM CNH 44
5.1. Gii thiu chung: 44
5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh : 44
5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim. 45
5.4. nh hng ca s cnh n hottính ca enzim 46
5.5. Các reactor cha enzim cnh: 48

5.6. . S dng enzim cnh trong y hc và trong công nghip: 50
Chng 6: GII THIU MT S LOI ENZIM CH YU VÀ KH NNG NG
NG 55
6.1. Amylaza 55
6.2. Proteaza 58
6.3. Pectinaza 60
6.4. Xenluloza: 64
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 2
6.5. Saccaraza và glucooxydaza 66
Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM 68
7.1. n vo hot : 68
7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim: 69
7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho 71
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 3
Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B
1.1. Ngun ng vt:
1.1.1. Tu tng: (Pan creas)
ây là ngun enzim sm nht, lâu dài nht, có cha nhiu loi enzim nht nh:
tripxin, kimotripxin, cacboxy pectidaza A và B, ribonucleaza, amilaza, lipaza.
+ Tripxin y hc phi là loi tinh ch.
+ ng dng u tiên ca ch phm tripxin là làm mn da  lt da, kh các vt nt
trên da.
+ Sn xut sn phm thu phân protein y hc (dch truyn y t) và môi trng nuôi cy
vsv.
+ Ch phm dch tu y hc  cha bnh v tu (ri lon chc nng, b ct b tu).
+ Sn xut ch phm enzim ty ra (vt bn, màu khó tan)  nhit  va phi, không
thích hp vi nhit  cao và pH thay i.
1.1.2. Màng nhy d dày ln:

Là ngun enzim pepxin A, B, C, D, gastrisin. Các enzim này c tit ra ngoài t bào
cùng vi dch v ( khi tiêu hoá thc n). i vi các typ pepxin có pH
opt
=1.3÷2.2.
1.1.3.  dày bê:
Trong ngn th t ca d dày bê có tn ti enzim thuc nhóm Proteaza tên là renin.
Enzim này ã t lâu c s dng ph bin trong công ngh phomat. Renin làm bin i
cazein thành paracazein có kh nng kt ta trong môi trng sa có  nng  Ca
2+
.
ây là quá trình ông t sa rt n hình, c nghiên cu và ng dng y  nht.
Trong thc t nu ch phm renin b nhim pepxin (trong trng hp thu ch phm renin
 bê quá thì. Khi ó, d dày bê ã phát trin y  có kh nng tit ra pepxin) thì kh
ng ông t sa kém i.
n ây có nghiên cu sn xut proteaza t vsv có c tính renin nh  các loài
Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
1.1.4. Các loi ni tng khác:
Gan, lá lách, thn, phi, c hoành tim, d con, huyt. Các loi này u có cha enzim,
a s tn ti trong t bào. Ch có mt s loi c sn xut di dng ch phm nh: gan,
tim ln  tách aspartat-glutamat aminotransferaza, huyt tng (t huyt)  tách ra
trombia (Proenzim chng ông máu)
Nhìn chung nguyên liu ng vt dùng  tách enzim phi ti tt (ly ngay sau khi
git m) hoc gi -20
0
C có thc 1÷12 tháng vn không làm gim hot tính enzim.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 4
1.2. Ngun gc thc vt:
1.2.1. Cây u ra (Canavalin ensifirmis):
ây là cây thuc hu Canavalia – có nhiu  châu Phi,  Vit Nam có nòi k trên.

Trong tt c các nòi u ra u rt giàu enzim Ureaza, hàm lng có thn 20% cht
khô.
1.2.2.  da (Bromalaceae):
Bao gm tt c các nòi da trng ly qu, ly si (k c các nòi da di). Trong các b
phn khác nhau ca cây da (v, lõi, chi, thân, lá,…) u có cha enzim bromelain.
Trong ó nhiu nht là phn lõi u qu da. Hot tính ca enzim bromelain ph thuc
nhiu vào trng thái và u kin bo qun nguyên liu. Các nghiên cu ã ch ra rng
các nguyên liu sy khô  nhit  400C s gi c hot tính enzim tt hn so vi
nguyên liu ã c bo qun lnh  nhit  4
0
C.
1.2.3. Nha u  (Carica Papaya. L):
ây là loi cây n qu ph bin  các nc nhit i. T qu ti hoc thân thu c
nha (latex) chính là ch phm papain thô  tó tinh ch thành papain thng phm.
Hin nay ngi ta ã to ra c các ging u  có sn lng m và hot tính papain
cao  khai thác có hiu qu ngun enzim này (không t vn  ly qu).
1.2.4. t s loi nguyên liu thc vt khác:
Khi tin hành nghiên cu khoa hc, y sinh hc, nhiu khi cn xem xét (nh tính, nh
ng, cu trúc phân t,  hot ng enzim, …) ca mt s loi enzim có trong bn thân
nguyên liu ó nh lng s dng. áng chú ý hn c là:
Ch phm enzim Polyphenoloxydaza (EPPO): n hình nht là eppo ca lá chè, ca
i nh ht ca cao ti, nc ép qu nho. Ch phm loi này ph bin hn c là loi “bt
axeton”.
1.2.5. t cc và mt s loi c cha tinh bt:
Trong ht cc ny mm (malt) và mt s loi c ny mm (n hình là khoai lang) có
t h enzim rt phong phú c ngi ta s dng t rt lâu trong các lnh vc: mt tinh
t (mch nha), ru và bia (thm chí có mt phng pháp sn xut ru etylic mang tên là
phng pháp maltaza hay phng pháp malt)
1.3. Ngun vi sinh vt:
ây là ngun enzim phong phú nht, có  hu ht các loài vi sinh vt nh: nm mc,

vi khun và mt s loài nm men. Có th nói vi sinh vt là ngun nguyên liu thích hp
nht  sn xut enzim  qui mô ln dùng trong công ngh và i sng. Dùng ngun vi
sinh vt có nhng li ích chính nh sau:
+ Chng v nguyên liu nuôi cy vi sinh vt và ging vi sinh vt.
+ Chu k sinh trng ca vi sinh vt ngn: 16÷100 gi nên có th thu hoch nhiu ln
quanh nm.
+ Có thu khin sinh tng hp enzim d dàng theo hng có li (nh hng s
ng và tng hiu sut tng thu hi).
+ Giá thành tng i thp vì môt trng tng i r, n gin, d t chc sn xut.
Tuy nhiên trong mi trng hp cn lu ý kh nng sinh c t (gây c, gây bnh) 
có bin pháp phòng nga, x lý thích hp.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 5
 sn xut ch phm enzim, ngi ta có th phân lp các ging vi sinh vt có trong t
nhiên hoc các ging t bin có la chn theo hng có li nht, ch tng hp u th
t loi enzim nht nh cn thit nào ó.
Chng 2: SN XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT
2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi
sinh vt
i mc ích nuôi cy thu hi enzim vi hiu sut cao, cn phi nhn r quá trình u
hoà sinh tng hp enzim  có các nh hng tác ng thích hp trong công ngh. T
bào vi sinh vt ch tng hp enzim khi cn thit vi s lng thích hp mong mun.
2.1.1. u hoà theo hng óng m bi gen operator (gen u khin) _hin
ng trn áp :
+ hin tng trn áp (c ch) (repression): là làm gim quá trình sinh tng hp do sn
phm cui cùng ca quá trình nuôi cy. Hin tng này thng gp i vi các enzym
xúc tác quá trình sinh tng hp mt chiu nh: quá trình sinh tng hp axit amin,
nucleotit.
Ví d: khi thêm mt axit amin nào ó vào môi trng nuôi cy thì t bào s không cn
ng hp này na. Do ó cng sình ch quá trình sinh tng hp enzym, xúc tác cho quá

trình tng hp nên chính axit amin ó. Enzym này chc tng hp tr li khi có nhu
u ngha là khi làm gim nng  axit amin tng ng. i vi h thng phân nhánh
ngha là quá trình dn n vic to thành nhiu sn phm cui cùng khác nhau t mt c
cht chung ban u thì c ch trn áp có thc thc hin theo các cách khác nhau.
Ví d: Phn ng u tiên ca quá trình sinh tng hp các axit amin lizin, methionin,
treonin u do enzym aspactokinaza xúc tác. Enzym này có 3 izoenzim.
Ký hiu: a
l
, a
m
, a
t
. Quá trình sinh tng hp a
l
s b trn áp bi nng  lizin. a
m
ca
methionin. Riêng i vi a
t
thì treonin va là sn phm cui cùng ca c quá trình va là
 cht ban u  sinh tng hp izolxin. Do ó quá trình sinh tng hp axit
t
ch b trn
áp khi c treonin và izolexin t nng  cao vt quá nhu cu ca t bào. Có th minh
ho c ch trn áp này theo s:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 6
al
am
at

A B C D Methionin
E
G
Lizin
Treonin
Izoloxin
Ghi chú: A – C cht Aspartic ban u.
B, C, D, G là các sn phm trung gian có tác dng trn áp.
Nh vy ây s trn áp ch xy ra khi có s hp ng tác dng ca c 2 sn phm.
u trn áp hp ng này cùng xy ra i vi quá trình sinh tng hp enzym ging nhau
xúc tác cho các phn ng song song to thành 2 sn phm cui cùng khác nhau. Ví d:
quá trình sinh tng hp valin và izolxin do 4 enzym ging nhau xúc tác theo s sau:
Valin
Izoloxin
432
1
Hin nay ngi ta cho rng ARN mi là yu t trn áp thc s cho quá trình sinh tng
p các enzym xúc tác  tng hp các axit amin tng ng.
+ Hin tng cm ng (induction): là hin tng ngc li vi hin tng trn áp làm
ng lng enzym ca t bào
(Ghi chú  s trên: 1: -axeto.-oxyaxítintetaza
2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza)
3: hydrooxyaxit dehydrataza
4: amino transpheraza
4 Phn ng
4 Phn ng
6 Phn ng
-axetolactat
-axeto
-Oxybutirat

-Dioxy
 metylvalerat
-Xeto
 - metyl
-Xeto
izovalerat
-Dioxy
izovalerat
CH
3
CHO
hot ng
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 7
Ngha là khi trong môi trng nuôi cy có cht cm ng s kích thích cho vi sinh vt
sinh tng hp nên nhiu enzym hn so vi bình thng.
Cht cm ng c xem nh là mt cht nn (Cht c s, b khung cácbon)  sinh
ng hp enzym. Hin nay, ngi ta ch ra rng có th các sn phm trung gian ca quá
trình bin i óng vai trò là cht cm ng, thm chí nhiu c cht ca enzym cng có
th là cht cm ng. n hình là các gluxit (monosaccarit và polysaccarit).
Trong s các enzim do vi sinh vt tng hp, có nhng enzim bình thng chc
ng hp rt ít i nhng khi thêm mt s cht nht nh vào môi trng nuôi cy thì hàm
ng ca chúng có th tng lên rt nhiu ln. Monod và Cohn (1925) gi các enzim này
là enzim cm ng, cht gây nên hiu qu này là gi là cht cm ng. Các enzim cm ng
thng là nhng enzim xúc tác cho quá trình phân gii nh: Proteinaza, amylaza,
pectinaza, penixilinaza, _galactosidaza  t bào E. coli. Khi nuôi cy E. coli trong môi
trng glucoza và glyxerin, vi khun ch tng hp khong 10 phn t_galactosidaza/t
bào. Nu nuôi cy trên môi trng lactoza là ngun các bon duy nht thì hàm lng
enzim là 6÷7% tng hp lng protein ca t bào. Trích ra t t bào cha n 6000 phn
 enzim, ngha là tng lên gn 1000 ln so vi khi nuôi cy trong môi trng c.

 cm ng thng có tính cht dây chuyn. Trong h thng gm nhiu phn ng, c
cht u tiên ca h thng có th cm ng quá trình sinh tng hp tt c các enzim xúc
tác cho quá trình chuyn hoá ca nó. u này c thc hin theo c ch sau: Trc ht
cht cm ng làm tng quá trình sinh tng hp enzim tng ng, sau ó sn phm này li
m ng tng hp enzim  phá hu nó, tip theo sn phm th 2 này li cm ng tng
p nên enzim th 3,…
Ví d: Histidin có tác dng cm ng hàng lot các enzim xúc tát cho quá trình chuyn
hoá nó thành axít glutamic (Chasin và Magasamil (1968)).
+ C chu hòa theo kiu trn áp và cm ng:
Zocob và Monod ã  ra mô hình gii thích c ch ca 2 hin tng trn áp và cm
ng trên c s di truyn. Theo mô hình này, s trn áp và cm ng sinh tng hp enzim
c thc hin theo cùng mt c ch chung da trên c su hoà hot ng ca các
gene di tác dng ca các cht phân t thp. Nhng cn c chính ca thuyt này nh
sau:
1) Có s phân hoá chc nng ca các giai n khác nhau trong phân t AND trong
nhim sc th, da vào chc phn ca chúng trong qui trình sinh tng hp Protein có th
chia thành các loi gene sau:
- Gene cu trúc (ký hiu: S
1
,S
2
,S
3
) : mã hoá phân t protein enzim c tng hp, tc
là th t các axit amin trong phân t enzim c tng hp là tu thuc vào th t các
nucleotit ca n gene này. Các gene mã hóa các enzim c íp xp lin nhau thành
t nhóm trên nhim sc th. Chúng là khuôn  tng hp phân t ARN
tt
.
- Gene Operator (ký hiu: O):  cnh nhóm gene cu trúc, không mã hoá protein

nhng m bo cho quá trình sao chép mã  gene cu trúc theo c ch “óng m” ta
nh công tc ca mt dây èn. Quá trình sao chép ch có th tin hành khi gene operator
 trng thái “m” (không kt vi cht nào c) và ngng li khi nó b “óng” (kt hp vi
t cht c bit gi là cht trn áp represson). Mt gene operator có th “ph trách” mt
nhóm gene cu trúc các gene cu trúc này cùng vi gene operator ca chúng hp thành
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 8
t n v sao chép s cp gi là mt operon. S tng hp ARN
tt
c bt u  mt
u ca operon và chuyn qua các gene cu trúc n u kia ca operon.
- Gene Promotor (gene hot hoá ký hiu P) ng trc gene operator là n And mà
ARN-polimeraza s kt hp và bt u quá trình sao chép các gene cu trúc.
- Gene u hoà regulator (ký hiu R): Gene này mã hoá cho mt protein c bit gi
là cht trn áp (repressor). Cht trn áp có vai trò “óng-m” gene operator. Do ó gene
u hoà có th kim tra quá trình sao chép gene cu trúc thông qua cht trn áp này.
+ Không có repressor (sn phm cui cùng)
R P O S1 S2 S3 ADN
E3E2E1
A BC
D
ARNtt
+ Có repressor (sn phm cui cùng):
Phiên mã
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 9
R P
O S1 S2 S3
ADN
: ARN-polymeraza

: Repressor
: coreressor
R: Gene u hoà, P: Gene promotor, O: Gene Operator,
S1, S2, S3: Các gene cu trúc.
2) Trong trng hp u hoà sinh tng hp enzim theo c ch trn áp, repressor do
gene u hoà tng hp còn  dng không hot ng (aporepessor) cha có kh nng kt
p vi gene operator nên quá trình sao chép các gene cu trúc tin hành bình thng.
Các enzim c tng hp xúc tác cho các phn ng  to thành các sn phm cui cùng,
n phm cui cùng này li có kh nng kt hp vi aporepessor và hot hoá nó.
Aporepessor ã c hot hoá s kt hp vi operator ngn cn quá trình sao chép các
gene cu trúc, làm ngng vic tng hp ARN
tt
tng ng do ó ình ch quá trình sinh
ng hp các enzim tng ng. Trong trng hp này các sn phm mi c coi nh là
cht trn áp (repressor).
3) i vi trng hp cm ng:
+ Không có cht cm ng
R P O S1 S2 S3 ADN
+ Có cht cm ng:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 10
ADNS3S2S1OPR
ARNtt
A
BC D
E1
E2 E3
 minh ho c ch cm ng sinh tng hp enzim
: Cht cm ng
Khi không có mt cht cm ng, cht trn áp (repressor) c tng hp ã  trng thái

hot ng, nó kt hp vi gene u khin operator, quá trình sao chép mã ca gene cu
trúc b bao vây nên các enzim tng ng không c tng hp.
Khi có mt cht cm ng thì cht trn áp repressor b mt hot ng, tách khi gene
u khin operator và quá trình sao chép mã bt u, kt qu làm tng lng enzim c
ng hp.
Nh vy ta thy hin tng trn áp và cm ng sinh tng hp enzim là hai mt i lp
a mt quá trình hoá sinh thng nht c thc hin thông qua hot ng “óng-m”
gene di tác dng ca các cht phân t thp
2.1.2. u hoà tng tác gia ARN-polymeraza vi gene promotor:
Nhiu du hiu thc nghim cho thy các gene bo m sinh tng hp mt s enzim
m ng xúc tác cho quá trình phân gii không ch chu s kim tra theo c ch cm ng
nhã trình bày  trên mà còn chu s kim tra theo mt c ch khác nh tác dng ca
AMP vòng (AMP
v
) gi là “trn áp phân gii” (cactabolic repressor) AMP
v
có tác dng
kích thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã ca các operon phân gii. Hin tng
này ã c nghiên cu nhiu i vi operon lactoza. Theo nhiu tác gi, tác dng kích
thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã c thc hin nh mt protein c bit
làm trung gian gi là protein nhn AMP
v
, hay còn gi là protein hot hoá gene phân gii
CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMP
v
kt hp vi CAP to thành phc hp

có tác dng hot hoá gene promotor làm cho ARN-polymeraza d dàng kt hp vi nó 
t u quá trình sao chép mã. Nh vy AMP
v
có tác dng làm tng cng quá trình sao
chép. Cng có ý kin cho rng phc hp AMP
v
-CAP-ARN-polymeraza cho phép bt u
quá trình sao chép mã.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 11
CAP
P
O Zi
i ZO
ARN-Polymeraza
CAP
a)
b)
c)
i ZO
CAP
AMPv
AMPv
AMPv
ARN
Pol
Pol
ARN
CAP
O Z

i
d)
ARNtt
Mô hình bt u sao chép mã ca operon lactoza
a – Phc hp CAP-AMP
v
chun b kt hp vào min c bit ca ADN.
b – Sau khi phc CAP-AMP
v
kt hp vào, nó làm yu n ADN.
c - ARN-polymeraza kt hp vào min c bit ca nó.
d - ARN-polymeraza “trc” dc theo n ADN nh mt “cái bt” n min bt u.
Ngi ta cng nhn thy glucza và mt s loi ng khác khi thêm vào môi trng
nuôi cy vi khun thng làm giàu lng AMP
v
trong t bào, do ó làm gim quá trình
sinh tng hp nhiu enzim cm ng, ngay c khi nó có cht cm ng trong môi trng.
Hin tng này còn gi là “hiu ng glucoza” c quan sát thy  E. coli và mt s vi
khun. Tuy nhiên cho n nay vn cha bit rõ c ch làm giàu AMP
v
do glucoza và các
ng khác
2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao:
 chn ging vi sinh vt có kh nng sinh tng hp enzim cao, ngi ta có th phân
p t môi trng t nhiên hoc có th dùng các tác nhân gây t bin tác ng lên b
máy di truyn hoc làm thay i c tính di truyn  to thành các bin chng có kh
ng tng hp c bit hu hiu mt loi enzim nào ó, cao hn hn chng gc ban u.
2.2.1. Phng pháp gây t bin:
ây là phng pháp hay c dùng nht nhm :
- To nhng t bin b gim kh nng sinh tng hp repressor hoc tng hp

repressor có ái lc thp vi gene opertor.
- To nhng t bin tng hp enzim có cu trúc bc 1 thay i do ó có th gim 
thay i vi kiu kìm hãm theo c ch liên h ngc.
u vào
Min bt u vào
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 12
u s thay i cu trúc bc 1 xy ra  vùng trung tâm hot ng hoc  gn ó thì có
th làm thay i rõ rt hot tính ca enzim.
- Gây t bin n gene hot hoá promotor  làm tng áp lc ca nó i vi ARN-
polymaraza do ó làm tng tc  sao chép mã Dùng bin pháp này có th làm tng
ng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 ln.
Hin tng t bin thng liên h vi s thay i mt gene, chng hn b “li” mt
baz khi tái to phân t ADN. Ví d mt v trí nào ó trên gene có th t nucleotit là
G-X, nu nó b thay th bng A-T, T-A hoc X-G thì phân t ARN
tt
c tng hp trên
n gene b li này cng s khác vi ARN
tt
bình thng  v trí tng ng vi ch “li”
trên gene. Do ó s tng hp nên phân t enzim khác vi bình thng  mt s gc axít
amin.
 to mt t bin gene có th dùng tác nhân vt lý (tia t ngoi, tia phóng x) hay
hoá hc (các hoá cht) tác dng lên t bào sinh vt.
2.2.2. Phng pháp bin np:
Là s bin i tính trng di truyn ca mt nòi vi sinh vt di nh hng ca ADN
trong dch chit nhn c t t bào ca vi sinh vt khác. ây yu t bin np là ADN.
 chuyn vt liu di truyn (ADN) t t bào cho n t bào nhn có th xy ra trong ng
nghim (invitro) khi cho t bào nhn tip xúc vi dch chit t t bào cho mà không có s
tip xúc gia các t bào.

Các t bào có th nhn bt k loi ADN nào ch không òi hi phi là ADN t các
ging h hàng. Tuy nhiên t bào ch có th nhn mt sn ADN nht nh, thng
không quá 10 n. Các n ADN c di truyn trong bin np có M=10
6
-10
7
và phi
có câu trúc xon kép. T bào không tip nhn các n ADN có kích thc nh hn hoc
các n không có cu trúc xon kép. Hin tng bin np ph bin  nhiu loài vi sinh
t nh: Diplococus, Staphylococus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,
Xantomonas.
2.2.3. Phng pháp tip hp gene:
Khác vi bin np, ây vt liu di truyn chc truyn t t bào cho n t bào
nhn khi hai t bào tip xúc vi nhau. Do vy các vi sinh vt có kh nng bin np thì s
không có kh nng tham gia tip hp gene na. Hin nay quá trình tip hp gene ã c
nghiên cu  mt s loài vi khun nh E. coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.
2.2.4. Phng pháp ti np:
t liu di truyn (ADN) c chuyn t t bào cho sang t bào nhn nh vai trò trung
gian ca thc khun th (phage). Trong quá trình ti np, các n ADN c chuyn t
 bào cho n t bào tip hp vi ADN ca t bào nhn. Do ó làm bin i tính cht di
truyn ca t bào nhn.
2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt :
Khi s dng vi sinh vt  sn xut enzim cn chn ging thun chng, ã c kim
tra y  v các c tính hoá sinh, vi sinh, nuôi cy và cn c bit lu ý n u kin
o qun ging. Thc t khi bo qun ging gc trong mt thi gian dài có th to ra các
bin d ngu nhiên không mong mun do ó nh k phi cy chuyn và kim tra li các
c tính ban u.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 13
2.3.1. Phng pháp cy chuyn:

ây là phng pháp ph bin nht d thc hin bng cách gi ging trên môi trng
thch (thch nghiêng, hp petri,…) vi thành phn môi trng nuôi cy và u kin nuôi
y thích hp cho ging vi sinh vt ó. Sau khi ging ã mc tt cn bo qun  nhit 
nh 3-4
0
C và sau mi tun phi cy chuyn li. Khi cy chuyn ch ly bào t hoc
khun lc mà không nên ly c môi trng dinh dng  bo m không chuyn các sn
phm trao i cht vào môi trng mi (có th gây nên nhng bin i bt li không th
ng ht c). Nu là x khun thì không nên bo qun ging trên môi trng thch
mà nên gi trong t ã kh trùng.
 kéo dài thi gian bo qun ging t hàng tháng n 1 nm, ngi ta ph mt lp
paraphin lng ã tit trùng trên b mt ging  hn ch s phát trin ca nó. Cn lu ý
ch ph lp du sau khi cy vi sinh vt t n  chín sinh lý.
Phng pháp cy chuyn rt có hiu qu bo qun các ging nm men, vi khun và
t hu hiu, d dàng trin khai ging ra sn xut ln, hn ch các tai bin có th dn n
 hng ging gc.
2.3.2. Phng pháp làm khô:
ng cách gi ging trên cát, t, silicagen trong u kin khô ráo (tt cu c
kh trùng cn thn). Trong u kin nh vy s hn ch s phát trin tip tc ca ging
khi bo qun. Phng pháp này rt hay c s dng  bo qun nm mc, x khun,
t vài loài nm men, vi khun thi gian gi ging có thc 1 nm.
Phng pháp làm khô cng thc hin n gin, không cn dng ct tin. Tuy nhiên
ging nh phng pháp cy chuyn thi gian bo qun tng i ngn.
2.3.3. Phng pháp ông khô:
c là làm khô bng sy chân không thng hoa (nêu nguyên tc), còn gi là sy lnh
 to nên sn phm ông khô (thc phm ông khô, các vt phm sinh hc, y hc ông
khô…). ây là phng pháp bo qun lâu dài n 10 nm mà không làm cho ging b
bin i c tính nhng òi hi công ngh cao, thit bt tin, chi phí bo qun ln.
n na mt s loài vi sinh vt nh nm mc không có bào t và mt s loi vi rút t ra
không thích hp khi bo qun ông khô.

2.3.4. Phng pháp làm lnh ông trong nit lng:
Khí nit hoá lng  nhit  rt thp -165
0
C n -196
0
C nên nu bo qun vi sinh vt
 môi trng này s rt tt vì ging c gi bt bin trên 10 nm. Tuy nhiên ây là lnh
c công ngh cao (cn nit nguyên cht và lnh thâm ) nên chi phí bo qun rt cao.
2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim:
ây là yu tu tiên nh hng trc tip n hot ng sng cng nh kh nng sinh
ng hp enzim ca vi sinh vt. Môi trng chn cha y  các cht C, N, H, O. Các
cht vô c: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các cht vi lng khác.
2.4.1. Ngun cácbon:
Thng là hp cht hu c trong ó ch yu là gluxit, tu thuc vào c tính ca
enzim và nòi vi sinh vt mà ngi ta la chn cho thích hp.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim amylaza: ây là enzim cm ng n hình vì
y môi trng nuôi cy phi có các cht cm ng: tinh bt, dextrin, mantoza. Qua
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 14
nghiên cu ngi ta nhn thy ba loi gluxit là ngun cácbon tt nht  sinh tng hp
amylaza t hiu qu cao. Chng hn hiu sut sinh tng hp trên môi trng gluxit khác
nhau vi mt s loi enzim amylaza nh sau:
+ i vi -amylaza:
Tinh bt > dextrin > mantoza > glucoza > saccaroza > galactoza > manit > avabinoza.
+ i vi Oligo-1,6-glucoridaza (dextrinaza):
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza > glucoza > lactoza > galactoza > orabinoza
> manit.
+ i vi -1,4-amyloglucoridaza :
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza, glucoza, lactoza, orabinoza > rabinoza >
lactoza > manit.

Khi nuôi cy theo phng pháp b mt nu dùng cám thì không cn b sung tinh bt,
ngun tinh bt rt ph bin, ngoài cám có th dùng bt ngô, bt mì, bo bo.
n chú ý trong a s trng hp, mt s loi ng, n hình nht là ng glucoza
i kìn hãm sinh tng hp các enzim thu phân nói chung (chng hn theo c ch trn áp
phân gii do làm giàu lng AMP
v
trong t bào).
i vi các h vi sinh vt sinh enzim Proteaza:
Có mt s ngun gluxit khi dùng nuôi cy nm mc có kh nng sinh tng hp enzim
Proteaza có hot lc cao, chng hn theo th t sau:
+ i vi Asp. Flavus 74: fructoza > glucoza > saccaroza > ramnoza > mantoza >
galactoza > orabinoza > lactoza.
+ i vi Asp. Awamori 200: fructoza > manit > saccaroza > orabinoza > galactoza >
lactoza.
+ i vi Asp. Oryae 79: fructoza > saccaroza > mantoza > glucoza > manit >
orabinoza > galactoza > lactoza.
Tinh bt là ngun cácbon ca nhiu chng vi khun sinh tng hp enzim proteaza. Ví
: Vi khun Bac. Subtilis có kh nng sinh tng hp proteaza  môi trng tinh bt
>8%, ging x khun a nhit Micromonospora vulgaricus sinh tng hp proteaza trong
môi trng 0.15-0.25% tinh bt.
Ngoài ra mt s loi hydrocacbon cng có ngun cácbon cho 125 chng vi sinh vt.
Chng hn, mt s ging vi khun Pseudomonas semginosa có kh nng sinh tng hp
proteinaza hot lc cao trên môi trng n-paraphin vi 12, 14, 16 nguyên t C hoc
proplylenglycol, hydrocacbon thm.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim Pectinaza:
Quá trình sinh tng hp enzim pectinaza có liên quan n cht cm ng. ó chính là
pectin, ng nhiên ó là ngun cácbon. Nu s dng hn hp gluxit trong ó có pectin,
 nuôi cy vi sinh vt thì hot lc ca pectinaza ngoi bào có th tng 4-6 ln so vi khi
nuôi cy không có pectin.
Ging Asp. Niger c nuôi cy trên môi trng có nhiu ngun cácbon nh: Pectin,

tình bt, isulin, lactoza, saccaroza, mantoza, galactoza nng  2, 4, 6% s cho pectinaza
có hiu sut cao. Tuy nhiên nên nuôi cy trên môi trng ch có monosacarit và glyxerin
thì hoàn toàn không th sinh tng hp enzim này. ng glucoza có tác dng kìn hãm
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 15
(cht trn áp) sinh tng hp enzim pectinaza trên môi trng nuôi cy là pectin và lactoza
ôi vi loài Asp. Niger, Asp. Awamori.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim xenluloza.
Enzim xenluloza là enzim cm ng vì vy trong môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh
enzim này nht thit phi có xenluloza là cht cm ng và là ngun cácbon.
Ngun xenluloza rt phong phú: giy lc, bông, bt xenluloza, lõi ngô, cám, mùn ca,
m r, than bùn. Ngoài ra có th k thêm chit xut xenlobiozo-octa axetat, cám mì,
lactoza, balixyl cng có ngun cácbon tt. i vi ging Stachybotris atra, ngun gluxit
t nht  sinh tng hp enzim xenluloza là tinh bt 1%.
Các ngun cácbon khác nói chung (glucoza, xenlobioza, axetat, xitrat, oxalat,…). Li
kìm hãm sinh tng hp xenluloza, glyxerin không phi là cht cm ng cho enzim này.
- Ngoài ngun gluxit là ch yu còn phi kn các ngun cácbon khác nh:
+ Các axit béo phân t lng ln (oleic, stearic, miniotic). Ví d: axit oleic có tác dng
kích thích tng hp glucoamylaza lên 2.5-3.5 ln so vi nng  thích hp 2-3%.
+ Etanol và glyxerin trong nhiu trng hp nuôi cy c dùng làm cácbon b sung.
+ Trong s các axit hu c thì axit lactic hay c vi sinh vt hp th tng hp
enzim. Tuy nhiên ngi ta thng không b sung trc tip axit này vào môi trng nuôi
y mà ch b sung loi nguyên liu hay ch phm có cha nó hoc s gây sinh ra nó
trong quá trình nuôi cy.
2.4.2. Ngun nit:
- i vi h vi sinh vt sinh enzim amylaza:
 nhiu loài nm mc, ngun nit tt nht là NaNO
3
và NH
4

NO
3
, nng  nit di
c 0.05% nm mc vn phát trin c nhng sinh tng hp amylaza rt kém.
 l ti u gia tinh bt và NaNO
3
trong môi trng Zapec nuôi cy nm mc sinh
ng hp amylaza t hiu qu cao nht là 18:1.
Các mui amoni vô c (NH
4
H
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
Cl), mt s ngun nit hu c
(gelatin, cazein, cao ngô) cho hiu qu sinh tng hp amylaza thp.
Trong thc t, ngi ta thng dùng ngun nit là các axit amin có ngun gc t dch
thu phân protein (dch t phân nm men, nc chm, cao ngô, dch chit malt) ây va
là ngun nit va là ngun cácbon và cht cm ng sinh enzim.
Các axit amin có tác dng tt nht trong nhng trng hp này là asparagin, axit
glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thm chí là c ch thì dch thu
phân casein li cm ng sinh tng hp amylaza lên gp 2 ln so vi ban u.

- i vi h vsv sinh enzyme proteaza:
Ngun nit s dng rt phong phú, bao gm 2 nhóm: vô c và hu c.
+ i vi mt s loài nm mc thuc h Asp. (oryzae, awamori, niger, flavas) nu môi
trng có ngun nit hu c thì s sinh tng hp proteinaza axit tính cao. Trên môi
trng Czapek nu thay NaNO3 bng cazein thì hot lc proteinaza có th tng lên 3,5
n. Sinh tng hp enzyme proteaza c nâng cao khi môi trng nuôi cy có c hai
ngun nit hu c và vô c. Nu môi trng ch có ngun nit vô c s dn n ngng
sinh tng hp enzyme này.
+ Trong quá trình nuôi cy vi khun, trong s các ngun nit vô c thì NH
4
, H
2
PO
4
là
t hn c. Các mui amon và nitrat khác u làm gim hot lc enzyme.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 16
+ i vi x khun a nhit Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là cht cm ng 
sinh tng hp enzyme proteaza là tt nht.
+ Các axit amin có nh hng rõ rt nht n quá trình sinh tng hp enzyme vsv nói
chung. Chng hn glyxin, alanin, metionin, lxin làm tng hot lc proteaza ca chng
t bin Asp. Oryzae 251-90 lên 16% và chng nguyên thu Asp. Oryzae 132-63 lên 7 -
14%. Nhiu axit amin li có tác dng c ch sinh tng hp enzyme nh: valin, axit
glutamic, izolxin, treonin. Nói chung có khong 10 axit amin nh vy. Axit amin có tác
ng kích thích sinh tng hp enzyme khi trong t bào vsv không t tng lng  lng
axit amin t do so vi môi trng nuôi cy.
+ Ngoài ra, các baz purin nh A (adenin), G (guanin) và các dn xut ca chúng,
ARN và các sn phm thu phân cng làm tng áng k sinh tng hp proteinaza vsv.
- i vi h vsv sinh tng hp enzyme pectinaza:

ng ging nhi vi h vsv sinh tng hp enzyme proteaza, nu dùng kt hp nit
u c và vô c s có tác dng tt n quá trình sinh tng hp pectinaza. Tuy nhiên,
mui nitrat kim loi kim li kim hãm enzyme này. i vi Asp. Niger, ngun nit tn
kém nht  sinh tng hp pectinaza la NH
4
H
2
PO
4
. i vi Asp. Awamori thì li là
(NH
4
)
2
SO
4
. Trong khi ó thì N t pepton, cazein thu phân là hoàn toàn c ch s to
thành enzyme.
- i vi nm mc Asp. Foetidus thì (NH
4
)
2
SO
4
, nc chit cám, nc chit nm men
có tác dng nâng cao hot lc polygalacturonaza. Nói chung, t l thích hp nht i vi
C/N khi tng hp pectinaza trong khong 7/1- 13/1.
- i vi h vsv sinh enzyme xenlulaza.:
Ngun nit thíh hp nht i vi nhóm vsv này là ngun mui nitrat. Trong ó NaNO
3

làm cho môi trng kim hoá to u kin thun li cho s to thành xenlulaza. Cao ngô
và cao nm men ( k c nc chit nm men) cng có tác ng khác nhau n kh nng
sinh tng hp xenlulaza tu thuc ging vsv. Các mui amoni ã có tác dng thm chí c
ch quá trình sinh tng hp vì chúng làm cho môi trng b axit hoá gây c ch quá trình
sinh tng hp thm chí làm mt hot tính enzyme ngay sau khi to thành trong môi
trng.
2.4.3. Ngun các nguyên t khoáng và các yu t (cht) kích thích sinh trng:
- Mui khoáng rt cn thit cho hot ng ca vsv, c bit là i vi các quá trình
sinh tng hp các enzyme kim loi.  sinh tng hp α-amylaza và glucoamylaza, nng
 MnSO
4
thích hp nht là 0,05%. Nu thiu mui này và mui photphat kali thì vsv
không th sinh tng hp c dextrinaza. Hot lc α-amylaza và dextrinaza c nâng
cao  nng  KH
2
PO
4
1% và hot lc glucoamylaza  nng  KCl 0,05%, dextrinaza 
ng  thích hp nht là 0,15%.
-Ion Mg
2+
có tác dng sinh tng hp và n nh các enzyme có hot tính  nhit 
cao. c bit Ca
2+
có trong thành phn ca α-amylaza (trong 1 phân t gam α-amylaza
a Asp. Oryzae có 20g Ca, ca Bac. Subtilis có 4g Ca). Trong môi trng nuôi cy Ca2+
nâng cao kh nng tng hp α-amylaza, bo v enzyme này khi s nh hng ca
proteaza.
-Lu hunh S vi ngun ch yu là các axit amin cha S nh metionin, cystein, sistin,
và các mui sunphat (CuSO

4
). Các mui khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu nh hng
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 17
n kh nng sinh tng hp xenlulaza. Trong a s trng hp biotin (VTM H) và mt s
VTM cng rt cn thit cho quá trình sinh tng hp enzyme .
Khi la chn môi trng cn chú ý n c thành phn nh tính và nh lng sao cho
quá trình sinh tng hp enzyme mong mun là cao nht. Mun vy ngi ta có th s
ng mt s phng pháp sau:
1) Phng pháp ti u hoá quy hoch thc nghim toàn phn ( yu t): òi hi
nhiu thi gian và không c chính xác lm.
2) Phng pháp toán hc mô hình hoá thc nghim: cho phép xác nh nhanh chóng
và úng n t l các thành phn môi trng nuôi cy và các yu t công ngh bo m
cho hot ng sng và sinh tng hp enzyme cao nht.
2.4.4. Các loi môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzyme :
Có th chia làm 2 loi: môi trng tng hp và môi trng t nhiên (phc hp).
- Môi trng tng hp: là môi trng bao gm các cht vi liu lng xác nh (qua
tìm hiu, nghiên cu), chng hn ngun cacbon có th là tinh bt, xenlulolaza, ng,
axit, ru, ngun Nit vô c hoc hu c (axit amin, peptin ). Loi môi trng này
c s dng cho mc ích nghiên cu (có khi nó mang tên nhà nghiên cu ra nó:
Czêpk-Dobrovonxki, Hasen ).
- Môi trng t nhiên: thng dùng các lai ph liu, nguyên liu( a s trong ó là
thc phm) có cha các ngun cacbon, nit, khoáng(a lng, vi lng), các yu t sinh
ng hp trng. Mt khác, các nguyên liu này li có sn, r tin nên c s dng rt
nhiu trong công nghip sn xut các ch phm enzyme vi sinh vt.
- Các nguyên liu d chun b làm môi trng t nhiên bao gm: cám và bt ht cc,
c chit ngô, dch ép hoa qu, rau, khô du, bã ru, rng, sn phm phân hu nm
men bia, tru, lõi ngô(  làm cht n, to xp). Khi la chn s dng môi trng cn
chú ý n các cht có tác dng u hoà sinh tng hp enzyme, c bit các cht cm
ng. Bng thc nghim, ngi ta thy rng cht cm ng (tng cng sinh tng hp

enzyme) thng là c cht ch yu, các sn phm thu phân ca nó hoc cht tng t c
cht.  trên ta ã bit là cht cm ng thng kt hp vi cht trn áp repressor làm cho
nó không hot ng( mt kh nng kt hp vi gene u khin operator). Nh vy, cht
m ng phi i vào bên trong t bào do ó không th là nhng cht i phân t nh
protein, tinh bt, xenluloza, pectin. Theo mt s tác gi thì các c cht này là các c cht
'tin cm ng', di tác dng ca enzyme gc chúng b thu phân mt phn to thành
cht có phân t lng bé hn óng vai trò là cht cm ng thc s. Chng hn, t nm
1972 Iurikievits cho rng cht cm ng thc s ca α-amylaza không phi là tinh bt mà
là sn phm thu phân mt phn ca nó: erytrodextrin. Tng t nh vy, cht cm ng
a enzyme proteinaza là các polypeptin, protein có phân t lng nh.
- Khi la chn môi trng nuôi cy và c bit là cht cm ng cn xem xét cn thn
các yu t chi phí, giá thành sn xut ra sn phm.
2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt:
 nguyên tc có 2 phng pháp nuôi cy vsv thu enzyme là: phng pháp nuôi cy
 mt (còn gi là phng pháp ni) và phng pháp b sâu (còn gi là phng pháp
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 18
nuôi cy chìm), trong ó  phng pháp b sâu còn có th chia ra 2 phng pháp c th
n: là nuôi cy chìm 1 bc (1pha) và nuôi cy chìm 2 bc (2 pha).
2.5.1. Phng pháp nuôi cy b mt:
- Phng pháp này rt thích hp  nuôi cy các loi nm mc (sinh tng hp các h
enzyme amylaza, xenlulaza, pectinaza, proteaza) do kh nng phát trin nhanh, mnh,
nên ít b tp nhim. Khi nuôi, nm mc phát trin bao ph b mt ht cht dinh dng
n, các khun ty cng phát trin âm sâu vào lòng môi trng ã c tit trùng, làm m
(khun ty c cht). i vi mt s mc ích c bit, ngi ta nuôi vsv trc tip trên b
t ht go (sn xut tng), ht u tng (u tng lên men - misô) ã c nu chín
trn ht cc còn sng (làm men thuc bc, men dân tc, làm tng).
- Ngi ta thng dùng cám mì, cám go, ngô mnh, bt ngô, mnh ht bo bo có cht
ph gia là tru. Cám, tru, có b mt tip xúc ln, mông, to c  xp nhiu, không
có nhng cht gây nh hng xu n s phát trin ca nm mc. T l các cht ph gia

(cht n) phi bo m so cho hàm lng tinh bt trong khi nguyên liu không c
thp hn 20%, có th b sung thêm ngun nit vô c ((NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
CO), photpho
(P
2
O
5
, H
3
PO
4
k thut), nit hu c và các cht kích thích sinh trng nh malt, nc
chit ngô, nc lc bã ru.
*Quy trình công ngh:
Nguyên liu
Trn
Làm m
Thanh trùng bng nhit
Làm ngui, làm ti
Gieo ging vsv Nuôi cy ging
Chuyn vào dng c nuôi cy

Nuôi cy, theo dõi, x lý
+ Làm m môi trng :
Có ý ngha quan trng, trong u kin sn xut ln, hàm m ti u ca môi trng
cám là 58-60%. Khi c nuôi cy trong u kin tit trùng nghiêm ngt thì st hot
 enzyme cao nht khi hàm m 65-68%. Tuy nhiên nu môi trng quá m s b dính
t (khi hp thanh trùng, làm ti, khi nuôi cy), d b nhim vi sinh vt tp (b lên men
u, lên men dm ).  làm m có th dùng nc trn vi nguyên liu (nhào) ri
thanh trùng hoc làm m s b ri thanh trùng sau ó dùng nc vô trùng (nc ngng
, nc un sôi  ngui) u chnh li m ca khi nguyên liu. Cách sau có th
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 19
rút ngn thi gian làm ngui, khng chc m chính xác hn nhng òi hi phi
thanh trùng  nhit  và áp sut sao hn.
+ Thanh trùng bng hi nhit:
Làm cho môi trng c tinh khit hn v phng din vsv và làm cho chín (bin
hình) môi trng (tinh bt, protein). Thông thng ngi ta thanh trùng bng hi nc
trc tip  nhit  120- 130
0
C trong 2-3h.
+ Làm ngui và làm ti môi trng  gieo ging:
Khi môi trng va hp xong còn nóng và dính bt. Vì vy phi làm ngui và làm
i  thun tin cho vic gieo ging và phân phi vào các dng c nuôi. Yêu cu thi
gian này phi ngn  hn ch nhim khun t bên ngoài. Nhit  yêu cu t c 
gieo ging là 35-39
0
C.
+ Nuôi cy nm mc ging:
Nhm  lng bào t ging cho toàn b môi trng nuôi cy. Quy trình công ngh
thc hin tng t nh trong sn xut ln nhng phi thc hin các u kin k thut
c bit và khc khe hn nh: nguyên liu phi tt, giàu cht dinh dng hn, u kin

nuôi cy khng ch nghiêm ngt hn, thi gian nuôi cy dài hn (gn gp ôi)  nm
c hình thành nhiu bào t và u.
+ Tin hành quá trình nuôi cy :
Sau khi gieo ging và phân phi vào các dng c nuôi (mành hay khay c l) ri
chuyn vào phòng nuôi có u chnh nhit  và m tng i ca không khí (ϕ)
ng nh mc  thông khí. Quá trình nuôi cy nm mc kéo dài 33-48h/mc tri
qua 3 giai n:
*Giai n 1: T khi nuôi cy mc gng n gi nuôi th 10-12. Xy ra s trng n
bào t và xut hin cung nm.  bo m s ny mm nhanh và hn ch nhim tp,
n gim nguyên liu 55-60%, ϕ=96-100%, T=30-32
o
C.
*Giai n 2: kéo dài trong 10-18h. Nm mc phát trin mnh, lan khp b mt và
trong toàn khi môi trng trng (khun ty n sâu vào c cht) dn n hin tng kt
bánh. Quá trìnhhô hp và to nhit mnh làm môi trng trng b khô xp, tng hàm
ng CO
2
, nhit  phòng nuôi tng lên n 38-40
o
C.  khng ch nhit  thích hp
28-30
o
C càn thông gió (qut) và bão hoà m không khí phòng nuôi.
Giai n 3: kéo dài trong 10-20h và c trng nht vì to ra enzyme nhiu nht.
ng  trao i cht gim i chút ít, nhit to ra ít hn nên tc  bc hi nc ca
môi trng nuôi cy cng gim theo. Quá trình nuôi cy c chm dt khi nm mc t
 già chín sinh lý và bt u to thành bào t.
2.5.2. Phng pháp nuôi cy chìm:
- Vi sinh vt c nuôi cy trong môi trng lng vi c cht ch yu trong a s
trng hp là tinh bt. Ch có mt s ít ging vsv dùng ngun c cht cacbon là ng

glucoza, saccharoza. Thc t, trong mt s trng hp ngi ta ng hoá s b tinh bt
trc khi thanh trùng (bng ch phm enzyme amylaza). Khi ó ng maltoza c to
thành là cht cm ng tt, môi trng trng b gim  nht nên d dàng cho quá trình
khuy trn và sc khí.
-Mt s loi môi trng dinh dng  sn xut ch phm enzyme amylaza dng trong
CNSX ru etylic nh sau:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 20
+Môi trng nuôi cy 40m
3
ca Trung Quc:
t khoai lang : 400kg
t bánh mì : 240kg
Cám : 160kg.
NaNO
3
: 1,2kg
c va  hàm lng cht khô:3,33%
+ Môi trng sn xut th nhà máy ru Hà Ni:
c bã ru trong : 100 phn
t ngô mn :1,5-2 phn
c ng hoá t ngô16% : 5-10 phn
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,4-0,5 phn
P

2
O
5
: 0,4-0,5 phn
MgO : 0,15-0,20 phn
u chnh pH t 5-5,5
- Phng pháp nuôi cy b sâu òi hi phi c vô trùng tuyt i  các khâu v sinh
ng hp, thanh trùng thit b, thanh trùng môi trng dinh dng, thao tác nuôi cy ,
không khí cung cp cho quá trình nuôi cy .
Các giai n ca quá trình nuôi cy chìm 1 bc (1pha) gm: chun b môi trng
nuôi cy, nuôi cy nm mc ging, nuôi cy nm mc sn xut.
+ Chun b môi trng nuôi cy :
Sau khi ã phi trn úng t l các thành phn sc khuy trn k ri thanh trùng
ng hi nhit (trc tip hay gián tip bng ni 2 v), nhit  118-125
o
C, thi gian 15-
60phút, sau ó c làm ngui n nhit  30
o
C thì tin hành gieo cy nm mc ging
vào.
+ Nuôi cy nm mc ging:
c tin hành qua 2 cp  (bc), phòng thí nghim và men ging trung gian.  cp
PTN c thc hin trong các bình cu, tit trùng môi trng làm ngui, cy ging ri
nuôi trên máy lc (150-200ln/phút). Nm mc s dng oxy không khí qua nút bông và
quá trình lc, thi gian nuôi 46-50h.  cp phát trin ging trung gian ngi ta chuyn
c ging PTN vào thit b nuôi ã cha sn môi trng tit trùng và làm ngui. Nuôi
y có sc khí vô trùng vi lu lng 15-20m
3
/m
3

h, thi gian 36-40h. Th tích dch men
ging bng 10% so vi dch men sn xut v sau.
+ Nuôi cy nm mc sn xut:
Trong quá trình nuôi cy cn phi sc khí vô trùng và khuy trn, tip du phá bt nu
có hin tng to bt trào ra khi ni lên men. Thi gian nuôi 1-4 ngày tu theo ging vi
sinh vt. Vic khng ch pH, ch sc khí và bo m vô trùng là nhng yu t quan
trng quyt nh hiu qu quá trình. Chng hn nu môi trng c thêm mui amôni
a NH
4
NO
3
thì khi NH
4
+
c vi sinh vt s dng s chuyn môi trng v axit. Nu
 axit hoá thng này có nh hng su n sinh tng hp enzym thì cn phi b sung
CaCO
3
 trung hoà hoc duy trì tng pH
opt
cho sinh tng hp. Nu ngun NaNO
3
thì
khi vi sinh vt s dng NO
3
-
s còn li Na
+
s kim hoá môi trng, lúc ó li phi dùng
axit  trung hoà. Tr s pH ban u ca môi trng nuôi cy có nh hng nht nh n

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 21
 to thành enzym. Ví d: i vi enzym -amylaza thì pH
opt
ca cácloi vi khun là 7,
a các loi nm mc là 5.6–5.7.
2.5.3. Phng pháp nuôi cy chìm 2 bc: (lên men 2 pha)
Vi sinh vt c nuôi trong thit bu tiên (giai n u, bc u tiên, pha th
nht)  phát trin n mc  cn thit, sau ó c chuyn sang thit b lên men tip
theo (giai n sau, bc th hai, pha th hai) có thành phn khác vi thit bu  sinh
ng hp enzym.
Pha th nht c gi là pha sinh trng (trophophase), pha th hai c gi là pha
ch to enzym (idiophase).
n hình cho phng pháp này xut phát t vic phát minh quá trình lên men cht
kháng sinh streptomixin bi x khun streptomyces griseus vào nm 1944 bi Schatz,
Bugie và Waksman.
Ngun gluxit mà ging x khun này ng hoá c  sinh tng hp streptomixin là:
glucoza, tinh bt, dextrin, mantoza, galactoza, mannoza. Ngun Nit c s dng là
protein ca bt u nành, bt cá, men khô, bt ht bông, gluten bt mì (nhóm x khun
sinh tng hp kháng sinh streptomixin nói chung u có hot lc proteaza rt mnh 
thu phân các protein nói trên thành các axit amin cn thit). Ngun Nit vô c bao gm
các mui amoni, photpho hoà tan.
n thân quá trình lên men streptomixin là các quá trình lên men 2 pha n hình. Pha
sinh trng mnh, bào t ny chi và mc thành si sau 6-8
h
. Pha th 2, khun ty phát
trin và bt u sinh tng hp kháng sinh. Trong quá trình này ( pha th 2) ng thi
o thành mt phc ca mannoza vi streptomixin gi là manozilostreptomixin có hot
tính kháng sinh kém hn 6 ln so vi streptomixin và có th coi ây là tp cht không
mong mun trong quá trình sinh tng hp. Tuy nhiên phc này di tác dng ca enzym

- manozilostreptomixinaza có tình D-manoza  gii phóng streptomixin vào nm 1969
Inamine và các cng sã nghiên cu sn xut enzym - manozilostreptomixinaza theo
phng pháp nôi cy chìm 2 bc nh sau:
Pha th nht: T bào streptomyces gricus c nuôi trong môi trng dinh dng có
khuy trn và sc khí trong 17
h
 nhit  28
0
C  to nhiu bào t. Sau ó bào tc
a sch và chuyn sang thit b tip theo.
Pha th 2: Tip tc nuôi cy  sinh tng hp enzym - manozilostreptomixinaza
trong 18-24
h
. Lúc này tc  phát trin ca vi khun chm li, nhng s chuyn hoá phc
cht manozidosteptomixin nhanh chóng din ra di tác dng ca enzym thành kháng
sinh streptomixin.
2.5.4. So sánh phng pháp nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzym :
- Phng pháp nuôi cy b mt có nhng u nhc m sau:
+ Nng  enzym to thành cao hn nhiu ln so vi dch nuôi cy chìm sau khi ã
tách t bào vi sinh vt. Trong công nghip ru mun ng hoá 100kg tinh bt ch cn
5kg ch phm nm mc b mt nhng phi cn n 100lít nm mc chìm ã lc bã và t
bào vi sinh vt.
+ Ch phm d dàng sy khô mà không làm gim áng k hot tính enzym, ch phm
khô, d bo qun, vn chuyn, nghin nh hoc s dng trc tip nu không cn khâu
tách và làm sch enzym.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 22
+ Tn ít nng lng (n, hi nc, công nhân) thit b, dng c nuôi cy n gin,
có th thc hin  qui mô gia ình, trang tri cng nh qui mô ln n 20T/ngày.
+ Nuôi cy trong u kin không cn vô trung tuyt i và trong quá trình nuôi cy

u có nhim trùng phn nào, khu vc nào thì ch cn loi b canh trng phn ó.
+ Tuy nhiên phng pháp b mt có nng sut thp, khó c khí hoá, tng hoá, cn
din tích nuôi ln, cht lng ch phm  các m không ng u.
- Phng pháp nuôi cy b sâu có nhng u nhc m sau:
+ Phng pháp nuôi cy hin i (công ngh cao) d c khí hoá, tng hoá, nng
sut cao, d t chc sn xut tit kim din tích sn xut.
+ Có th nuôi cy d dàng các chng vi sinh vt t bin có kh nng sinh tng hp
enzym cao và la chn ti u thành phân môi trng, các u kin nuôi cy, enzym thu
c tinh khit hn, m bo u kin v sinh, vô trùng.
+ Tuy nhiên do thu c canh trng có nng  enzym thp nên khi tách thu hi
enzym s có giá thành cao (có t trc). Tn n nng cho khuy trn, nu không bo
m vô trùng s b nhim hàng lot, toàn b gây tn tht ln.
2.6. Tách và làm sch ch phm enzym :
(xem s tng quát  trang 200 ca giáo trình)
- Mc ích yêu cu: Các ch phm enzym c s dng  các dng khác nhau theo
c  tinh khit (hot  riêng). Trong mt s trng hp, canh trng nuôi cy vi sinh
t có cha enzym c s dng trc tip di dng thô không cn tách tp cht nu
chúng không gây nh hng áng kn sn phm và quy trình công ngh sau này (Ví
: sn xut ru, nc chm thc vt, da). Cng có khi ngi ta cn s dng ch phm
enzym tinh khit trong công nghip dt, công nghip mch nha, y hc, nghiên cu khoa
c.
Enzym nói chung rt d b gim hot tính di tác dng ca các tác nhân bên ngoài do
ó khi tách và tinh ch enzym  tránh s bin hình protein nh hng ln n hot tính
enzym cn tin hành nhanh chóng  nhit  thp,  pH thích hp không có mt các
cht gây bin hinh enzym.
2.6.1. Thu dch enzym :
- i vi trng hp enzym còn nm trong t bào (enzym ni bào nuôi bng phng
pháp b mt) thì cn phi gii phóng enzym bng cách phá v t bào thu nhiu cách nh:
+ Nghin nh, nghin vi cát, nghin vi vn thu tinh, nghin bi.
+  t bào t phân hu.

+ Dùng tác dng ca siêu âm hoc to áp sut thm thu cao, trích ly (chiên) bng
mui, dung dch mui trung tính, dung môi hu c
+ Kt ta enzym bng các cht n ly thích hp.
- i vi trng hp enzym tit ra môi trng (enzym ngoi bào nuôi theo phng
pháp chìm), ngi ta thng tách sinh khi và cn bã khoi canh trng bng cách
c li tâm, lc ép có s dng tác nhân tr lc (diatomit, t hot tính) hoc các tác
nhân tr kt ta (Ví d: hn hp CaCl
2
+(NH
4
)
2
SO
4
 CaSO
4
: lng cn kéo theo
sinh khi nên lc d hn)
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 23
2.6.2. Thu nhn ch phm k thut:
Ch phm k thut là ch phm enzym cha c tinh ch; có th cha mt vài loi
enzym ch yu, mt s loi protein không phi enzym, các cht n nh và các tp cht
khác. Dch enzym thu c  trên thng có nng  cht khô thp 4-6g/l, bc u
ngi ta cô c chân không  nhit  35
0
C n nng  15-20g/l ri tip tc x lý nh
sau:
- Tip tc cô c chân không  nhit  40-45
0

C t nng  cht khô 30-35g/l,
 sung thêm cht bo qun nh NaCl, glyxerin, sorbitol, benzoat ta s thu c
ch phm enzym k thut  dng có th bo qun  nhit  thng c 1-2 nm.
-  sung thêm các cht n nh t nng  cht khô 30-40g/l ri sy phun 
nhiêt  120
0
C (nhit  khí thi 60
0
C), ch phm k thut thu c  dng bt .
- t ta enzym bng các dung môi thích hp nh: dung môi hu c (etanol,
izopropanol, axeton), dùng mui trung tính ph bin nht là (NH
4
)
2
SO
4
dung dch
bão hoà. Sau khi li tâm tách kt ta có th trn thêm các cht n nh ri sy khô
và nghin mn  thu c ch phm dng bt.
2.6.3. Thu ch phm enzym tinh khit:
Vic tinh ch enzym có th tin hành bng nhiu phng pháp qua nhiu giai n:
- Hoà tan ch phm k thut vào nc hoc dung dch nui CaCl
2
 nng  thích
p hoc dung dch m, kt ta tr li bng etanol, axeton hay (NH
4
)
2
SO
4

. Quá
trình này cn tin hành nhanh chóng  nhit  thp  tránh s vô hot enzym.
Ngoài ra mui NaCl cng c hay c dùng  kt ta các enzym ngun gc
ng vt. Kt ta  pH gn m ng n ca enzym. Sau khi kt ta các mui vô
c loi i bng phng pháp thm tích, thm thu ngc hoc lc gel.
- Tách enzym bng phng pháp hp ph chn lc:
Cho dch enzym chy t t qua ct cht hp ph (thng là hydrat oxit-nhôm,
silicagel) các enzym khác nhau sc hp ph vi kh nng khác nhau, sau ó dùng các
dung dch m thích hp  chit rút enzym ra khi ct. Phng pháp dùng  làm m
c enzym.
- Tách enzym bng phng pháp trao i ion:
a vào s trao i ion gia enzym có n tích vi các ion trái du ca cht nha khi
cho dung dch enzym chy t t qua ct cha các cht nha trao i ion. Sau khi ct ã
no (ht hiu lc) cho dung dch ra (dung dch cht n gii) có nng  tng dn chy
qua ct y ra khi nha các enzym va liên kt vi chúng. Khi ó enzym nào có áp
c (liên kt) vi nha kém nht s by ra khi ct nha trc. Nh vy các enzym
khác nhau sc chit ra khi ct theo tng phn chit khác nhau trong ó ca phn
chit cha enzym cn thu vi nng  cao nht.
Các nha trao i ion thng là các cht nha tng hu c : Dowex, Amberlit,
Wolfatit, Permuit, các dn xut ca xenluloza.
Sau khi làm sch cn sy khô chân không  nhit  thp hoc sy thng hoa. Enzym
tinh khit có hot tính cao hn nhiu so vi ch phm ban u. Nhng do quá trình làm
ch rt khc khe và tn kém nên loi này chc dùng trong y hc, trong nghiên cu
khoa hc  xác nh khi lng phân t, cu trúc enzym.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 24
Chng 3: K THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY
M (MALT)
Malt là loi ht hoà tho (ht cc) ny mm trong nhng u kin nhân to (nhit ,
m, thi gian) xác nh gi tc là quá trình  malt. Mc ích chính trong quá trình 

malt là trích luc mt lng ln các enzym (ch yu là enzym amylaza) trong ht,
c s dng trong các lnh vc sau:
- Trong công nghip sn xut ru etylic (cn, ru etylic) t nguyên liu tinh bt.
Malt là tác nhân ng hoá tinh bt (phng pháp sn xut ru này có tên là
phng pháp maltaza hay phng pháp malt). Có th dùng các loi ht nh: i
ch, lúa mch en, yn mch, kê, ngô  sn xut malt loi này.
- Trong công nghip sn xut bia malt va là tác nhân ng hoá tinh bt va là
nguyên liu chính (cùng vi hoa houblon và nc) và có th có nguyên liu thay
th (Không phi malt i mch). Malt bia ch yu c sn xut ti mch, ngoài
ra ngi ta có th dùng mt t l malt thay th nh thóc mm.
- Trong công nghiêp sn xut mt tinh bt (ng nha, mch nha): malt va là tác
nhân ng hoá tinh bt va là nguyên liu chính. Malt loi này c sn xut t
lúa, lúa mì, ngô, i mch, kê thm chí t c khoai lang ny mm. Mch nha sn
xut t malt vn là ngon nht, cho cht lng tt nht.
- Trong mt s ngành sn xut thc n sinh dng, thc n kiên (cho ngi bnh,
ngi già, tr em, gia xúc, gia cm non). Malt c dùng  phi ch vào thc n
a thc n.
Quá trình sn xut malt bao gm các khâu sau:
Thu nhn, x lý, làm sch, phân loi và bo qun ht,
a, xát trùng và ngâm ht.
m mm (ny mm) ta s thu c malt ti.
y malt ti.
 lý và bo qun malt khô.
3.1. Nguyên liu i mch:
i mch là cây ht cc  các nc ôn i, có khong 30 ging khác nhau nhng ch
có mt ging có ý ngha kinh t là i mch mùa (Hordeum sativum) còn li u là i
ch di. Hin nay din tích trng và sn lng i mch trên th gii ng v trí th 4
sau lúa mì, lúa, ngô. Thuc ging i mch mùa có 130 loi khác nhau và c chia làm
3 nhóm chính: i mch nhiu hàng (6 hàng và 4 hàng)-Hordium hexatichum; i mch 2
hàng (Hordium disstichum) và i mch trung gian (H. intermedium). Nhóm có giá tr

trong sn xut malt và bia là i mch nhiu hàng.
i mch sau khi thu hoch c phi sy n m di 13%  bo qun cùng
ging nh các ht hoà tho khác, cu to ht i mch gm v tru, v qu, v ht,
alrông, ni nh và phôi. T l trung bình trong các phn nh sau:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 25
Tên b phn ht % khi lng toàn ht
 tru
 qu
 ht
Alrông
Phôi
i nh
12
3,5 ÷ 4
2 ÷2,5
12 ÷14
2,5 ÷ 3
64,5 ÷ 6,8
Thành phn hoá hc trung bình ca i mch theo % cht khô nh sau:

phn ht
Protein
(N*5,7)
Chtbéo
tinh
t
Pentosan Xenluloza Tro
t


Phôi
13,4
7,1
28,6
2,0
2,1
7,6
54,0
8,2
46,0
9,0
20,0
20,0
5,7
22,6
1,1
3,0
10,0
10,0
Khi lng 1000 ht c trng cho  my ca ht nm trong khong 15 ÷ 60 gam và
ngi ta chia thành các loi:
i mch ht nh: Khi lng 1000 ht ti 30 gam
i mch tng i nh: Khi lng 1000 ht ti 31 ÷40 gam
i mch nng: Khi lng 1000 ht ti > 51gam
Kích thc ht dài 8 ÷ 10 mm, rng 3 ÷ 4 mm, dày 2 ÷3 mm.
Ch s cht lng quan trng ca i mch  sn xut malt và bia là  ny mm và
ng lc ny mm. Ngoài ra, i mch còn c c trng bi  chit và hàm lng
protein. i mch tt có  chit t ti 82% và hàm lng protein không quá 12%. Nu
hàm lng t quá 12 % thì  chit s thp, bia s bc; còn nu hàm lng protein
quá thp s làm gim  bt và v bia.

3.2. Làm sch và phân loi ht:
Khi ht có cha nhiu tp cht (bi, tp cht nh nh c, rm r; tp cht nng nh
i á, vn kim loi ) do ó cn phi c làm sch trc khi a vào sn xut. Mt
khác, khi ht phi m bo ng u  quá trình ngâm và ny mm c thun li và
ng u.
Thông thng ngi ta làm sch và phân loi bng các h thng sàng thích hp:
- Sàng khí ng: dùng  tách tp cht và phân loi ht theo chiu dày, chiu rng ca
nó theo các tính cht khi ng (dùng qut).
u ht c phân loi theo chiu dày ht  sn xut malt bia, ngi ta c 3 nhóm:
+ Loi I : b dày ht > 2,5 mm Dùng  sn xut malt bia tt nht.
+ Loi II : b dày ht > 2,2 ÷ 2, 5 mm Dùng  sn xut malt bia tt nht.
+ Loi III : b dày < 2,2 mm Dphi liu, c dùng  làm vic khác.
- Sàng ng (Trier):  phân loi ht theo chiu dài
- Tách tp cht kim loi dùng nam châm kin trng.