Tải bản đầy đủ (.pdf) (75 trang)

Công nghệ Enzyme

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (456.31 KB, 75 trang )

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 1
c lc
Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B 3
1.1. Ngun ng vt: 3
1.2. Ngun gc thc vt: 4
1.3. Ngun vi sinh vt: 4
Chng 2: N XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT 5
2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi sinh vt 5
2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao: 11
2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt : 12
2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim: 13
2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt: 17
2.6. Tách và làm sch ch phm enzym : 22
Chng 3:  THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY MM (MALT) 24
3.1. Nguyên liu i mch: 24
3.2. Làm sch và phân loi ht: 25
3.3. a, sát trùng và ngâm ht: 26
3.4. y mm: 28
3.5. y malt: 34
3.6. Tách mm, r, bo qun malt: 37
3.7.  thut sn xut mt s loi malt c bit: 38
Chng 4: N XUT ENZIM T THC VT 40
4.1. n xut ureaza tu ra: 40
4.2. Thu nhn bromelain t da: 40
Chng 5: ENZIM CNH 44
5.1. Gii thiu chung: 44
5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh : 44
5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim. 45
5.4. nh hng ca s cnh n hottính ca enzim 46
5.5. Các reactor cha enzim cnh: 48


5.6. . S dng enzim cnh trong y hc và trong công nghip: 50
Chng 6: GII THIU MT S LOI ENZIM CH YU VÀ KH NNG NG
NG 55
6.1. Amylaza 55
6.2. Proteaza 58
6.3. Pectinaza 60
6.4. Xenluloza: 64
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 2
6.5. Saccaraza và glucooxydaza 66
Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM 68
7.1. n vo hot : 68
7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim: 69
7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho 71
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 3
Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B
1.1. Ngun ng vt:
1.1.1. Tu tng: (Pan creas)
ây là ngun enzim sm nht, lâu dài nht, có cha nhiu loi enzim nht nh:
tripxin, kimotripxin, cacboxy pectidaza A và B, ribonucleaza, amilaza, lipaza.
+ Tripxin y hc phi là loi tinh ch.
+ ng dng u tiên ca ch phm tripxin là làm mn da  lt da, kh các vt nt
trên da.
+ Sn xut sn phm thu phân protein y hc (dch truyn y t) và môi trng nuôi cy
vsv.
+ Ch phm dch tu y hc  cha bnh v tu (ri lon chc nng, b ct b tu).
+ Sn xut ch phm enzim ty ra (vt bn, màu khó tan)  nhit  va phi, không
thích hp vi nhit  cao và pH thay i.
1.1.2. Màng nhy d dày ln:

Là ngun enzim pepxin A, B, C, D, gastrisin. Các enzim này c tit ra ngoài t bào
cùng vi dch v ( khi tiêu hoá thc n). i vi các typ pepxin có pH
opt
=1.3÷2.2.
1.1.3.  dày bê:
Trong ngn th t ca d dày bê có tn ti enzim thuc nhóm Proteaza tên là renin.
Enzim này ã t lâu c s dng ph bin trong công ngh phomat. Renin làm bin i
cazein thành paracazein có kh nng kt ta trong môi trng sa có  nng  Ca
2+
.
ây là quá trình ông t sa rt n hình, c nghiên cu và ng dng y  nht.
Trong thc t nu ch phm renin b nhim pepxin (trong trng hp thu ch phm renin
 bê quá thì. Khi ó, d dày bê ã phát trin y  có kh nng tit ra pepxin) thì kh
ng ông t sa kém i.
n ây có nghiên cu sn xut proteaza t vsv có c tính renin nh  các loài
Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
1.1.4. Các loi ni tng khác:
Gan, lá lách, thn, phi, c hoành tim, d con, huyt. Các loi này u có cha enzim,
a s tn ti trong t bào. Ch có mt s loi c sn xut di dng ch phm nh: gan,
tim ln  tách aspartat-glutamat aminotransferaza, huyt tng (t huyt)  tách ra
trombia (Proenzim chng ông máu)
Nhìn chung nguyên liu ng vt dùng  tách enzim phi ti tt (ly ngay sau khi
git m) hoc gi -20
0
C có thc 1÷12 tháng vn không làm gim hot tính enzim.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 4
1.2. Ngun gc thc vt:
1.2.1. Cây u ra (Canavalin ensifirmis):
ây là cây thuc hu Canavalia – có nhiu  châu Phi,  Vit Nam có nòi k trên.

Trong tt c các nòi u ra u rt giàu enzim Ureaza, hàm lng có thn 20% cht
khô.
1.2.2.  da (Bromalaceae):
Bao gm tt c các nòi da trng ly qu, ly si (k c các nòi da di). Trong các b
phn khác nhau ca cây da (v, lõi, chi, thân, lá,…) u có cha enzim bromelain.
Trong ó nhiu nht là phn lõi u qu da. Hot tính ca enzim bromelain ph thuc
nhiu vào trng thái và u kin bo qun nguyên liu. Các nghiên cu ã ch ra rng
các nguyên liu sy khô  nhit  400C s gi c hot tính enzim tt hn so vi
nguyên liu ã c bo qun lnh  nhit  4
0
C.
1.2.3. Nha u  (Carica Papaya. L):
ây là loi cây n qu ph bin  các nc nhit i. T qu ti hoc thân thu c
nha (latex) chính là ch phm papain thô  tó tinh ch thành papain thng phm.
Hin nay ngi ta ã to ra c các ging u  có sn lng m và hot tính papain
cao  khai thác có hiu qu ngun enzim này (không t vn  ly qu).
1.2.4. t s loi nguyên liu thc vt khác:
Khi tin hành nghiên cu khoa hc, y sinh hc, nhiu khi cn xem xét (nh tính, nh
ng, cu trúc phân t,  hot ng enzim, …) ca mt s loi enzim có trong bn thân
nguyên liu ó nh lng s dng. áng chú ý hn c là:
Ch phm enzim Polyphenoloxydaza (EPPO): n hình nht là eppo ca lá chè, ca
i nh ht ca cao ti, nc ép qu nho. Ch phm loi này ph bin hn c là loi “bt
axeton”.
1.2.5. t cc và mt s loi c cha tinh bt:
Trong ht cc ny mm (malt) và mt s loi c ny mm (n hình là khoai lang) có
t h enzim rt phong phú c ngi ta s dng t rt lâu trong các lnh vc: mt tinh
t (mch nha), ru và bia (thm chí có mt phng pháp sn xut ru etylic mang tên là
phng pháp maltaza hay phng pháp malt)
1.3. Ngun vi sinh vt:
ây là ngun enzim phong phú nht, có  hu ht các loài vi sinh vt nh: nm mc,

vi khun và mt s loài nm men. Có th nói vi sinh vt là ngun nguyên liu thích hp
nht  sn xut enzim  qui mô ln dùng trong công ngh và i sng. Dùng ngun vi
sinh vt có nhng li ích chính nh sau:
+ Chng v nguyên liu nuôi cy vi sinh vt và ging vi sinh vt.
+ Chu k sinh trng ca vi sinh vt ngn: 16÷100 gi nên có th thu hoch nhiu ln
quanh nm.
+ Có thu khin sinh tng hp enzim d dàng theo hng có li (nh hng s
ng và tng hiu sut tng thu hi).
+ Giá thành tng i thp vì môt trng tng i r, n gin, d t chc sn xut.
Tuy nhiên trong mi trng hp cn lu ý kh nng sinh c t (gây c, gây bnh) 
có bin pháp phòng nga, x lý thích hp.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 5
 sn xut ch phm enzim, ngi ta có th phân lp các ging vi sinh vt có trong t
nhiên hoc các ging t bin có la chn theo hng có li nht, ch tng hp u th
t loi enzim nht nh cn thit nào ó.
Chng 2: SN XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT
2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi
sinh vt
i mc ích nuôi cy thu hi enzim vi hiu sut cao, cn phi nhn r quá trình u
hoà sinh tng hp enzim  có các nh hng tác ng thích hp trong công ngh. T
bào vi sinh vt ch tng hp enzim khi cn thit vi s lng thích hp mong mun.
2.1.1. u hoà theo hng óng m bi gen operator (gen u khin) _hin
ng trn áp :
+ hin tng trn áp (c ch) (repression): là làm gim quá trình sinh tng hp do sn
phm cui cùng ca quá trình nuôi cy. Hin tng này thng gp i vi các enzym
xúc tác quá trình sinh tng hp mt chiu nh: quá trình sinh tng hp axit amin,
nucleotit.
Ví d: khi thêm mt axit amin nào ó vào môi trng nuôi cy thì t bào s không cn
ng hp này na. Do ó cng sình ch quá trình sinh tng hp enzym, xúc tác cho quá

trình tng hp nên chính axit amin ó. Enzym này chc tng hp tr li khi có nhu
u ngha là khi làm gim nng  axit amin tng ng. i vi h thng phân nhánh
ngha là quá trình dn n vic to thành nhiu sn phm cui cùng khác nhau t mt c
cht chung ban u thì c ch trn áp có thc thc hin theo các cách khác nhau.
Ví d: Phn ng u tiên ca quá trình sinh tng hp các axit amin lizin, methionin,
treonin u do enzym aspactokinaza xúc tác. Enzym này có 3 izoenzim.
Ký hiu: a
l
, a
m
, a
t
. Quá trình sinh tng hp a
l
s b trn áp bi nng  lizin. a
m
ca
methionin. Riêng i vi a
t
thì treonin va là sn phm cui cùng ca c quá trình va là
 cht ban u  sinh tng hp izolxin. Do ó quá trình sinh tng hp axit
t
ch b trn
áp khi c treonin và izolexin t nng  cao vt quá nhu cu ca t bào. Có th minh
ho c ch trn áp này theo s:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 6
al
am
at

A B C D Methionin
E
G
Lizin
Treonin
Izoloxin
Ghi chú: A – C cht Aspartic ban u.
B, C, D, G là các sn phm trung gian có tác dng trn áp.
Nh vy ây s trn áp ch xy ra khi có s hp ng tác dng ca c 2 sn phm.
u trn áp hp ng này cùng xy ra i vi quá trình sinh tng hp enzym ging nhau
xúc tác cho các phn ng song song to thành 2 sn phm cui cùng khác nhau. Ví d:
quá trình sinh tng hp valin và izolxin do 4 enzym ging nhau xúc tác theo s sau:
Valin
Izoloxin
432
1
Hin nay ngi ta cho rng ARN mi là yu t trn áp thc s cho quá trình sinh tng
p các enzym xúc tác  tng hp các axit amin tng ng.
+ Hin tng cm ng (induction): là hin tng ngc li vi hin tng trn áp làm
ng lng enzym ca t bào
(Ghi chú  s trên: 1: -axeto.-oxyaxítintetaza
2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza)
3: hydrooxyaxit dehydrataza
4: amino transpheraza
4 Phn ng
4 Phn ng
6 Phn ng
-axetolactat
-axeto
-Oxybutirat

-Dioxy
 metylvalerat
-Xeto
 - metyl
-Xeto
izovalerat
-Dioxy
izovalerat
CH
3
CHO
hot ng
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 7
Ngha là khi trong môi trng nuôi cy có cht cm ng s kích thích cho vi sinh vt
sinh tng hp nên nhiu enzym hn so vi bình thng.
Cht cm ng c xem nh là mt cht nn (Cht c s, b khung cácbon)  sinh
ng hp enzym. Hin nay, ngi ta ch ra rng có th các sn phm trung gian ca quá
trình bin i óng vai trò là cht cm ng, thm chí nhiu c cht ca enzym cng có
th là cht cm ng. n hình là các gluxit (monosaccarit và polysaccarit).
Trong s các enzim do vi sinh vt tng hp, có nhng enzim bình thng chc
ng hp rt ít i nhng khi thêm mt s cht nht nh vào môi trng nuôi cy thì hàm
ng ca chúng có th tng lên rt nhiu ln. Monod và Cohn (1925) gi các enzim này
là enzim cm ng, cht gây nên hiu qu này là gi là cht cm ng. Các enzim cm ng
thng là nhng enzim xúc tác cho quá trình phân gii nh: Proteinaza, amylaza,
pectinaza, penixilinaza, _galactosidaza  t bào E. coli. Khi nuôi cy E. coli trong môi
trng glucoza và glyxerin, vi khun ch tng hp khong 10 phn t_galactosidaza/t
bào. Nu nuôi cy trên môi trng lactoza là ngun các bon duy nht thì hàm lng
enzim là 6÷7% tng hp lng protein ca t bào. Trích ra t t bào cha n 6000 phn
 enzim, ngha là tng lên gn 1000 ln so vi khi nuôi cy trong môi trng c.

 cm ng thng có tính cht dây chuyn. Trong h thng gm nhiu phn ng, c
cht u tiên ca h thng có th cm ng quá trình sinh tng hp tt c các enzim xúc
tác cho quá trình chuyn hoá ca nó. u này c thc hin theo c ch sau: Trc ht
cht cm ng làm tng quá trình sinh tng hp enzim tng ng, sau ó sn phm này li
m ng tng hp enzim  phá hu nó, tip theo sn phm th 2 này li cm ng tng
p nên enzim th 3,…
Ví d: Histidin có tác dng cm ng hàng lot các enzim xúc tát cho quá trình chuyn
hoá nó thành axít glutamic (Chasin và Magasamil (1968)).
+ C chu hòa theo kiu trn áp và cm ng:
Zocob và Monod ã  ra mô hình gii thích c ch ca 2 hin tng trn áp và cm
ng trên c s di truyn. Theo mô hình này, s trn áp và cm ng sinh tng hp enzim
c thc hin theo cùng mt c ch chung da trên c su hoà hot ng ca các
gene di tác dng ca các cht phân t thp. Nhng cn c chính ca thuyt này nh
sau:
1) Có s phân hoá chc nng ca các giai n khác nhau trong phân t AND trong
nhim sc th, da vào chc phn ca chúng trong qui trình sinh tng hp Protein có th
chia thành các loi gene sau:
- Gene cu trúc (ký hiu: S
1
,S
2
,S
3
) : mã hoá phân t protein enzim c tng hp, tc
là th t các axit amin trong phân t enzim c tng hp là tu thuc vào th t các
nucleotit ca n gene này. Các gene mã hóa các enzim c íp xp lin nhau thành
t nhóm trên nhim sc th. Chúng là khuôn  tng hp phân t ARN
tt
.
- Gene Operator (ký hiu: O):  cnh nhóm gene cu trúc, không mã hoá protein

nhng m bo cho quá trình sao chép mã  gene cu trúc theo c ch “óng m” ta
nh công tc ca mt dây èn. Quá trình sao chép ch có th tin hành khi gene operator
 trng thái “m” (không kt vi cht nào c) và ngng li khi nó b “óng” (kt hp vi
t cht c bit gi là cht trn áp represson). Mt gene operator có th “ph trách” mt
nhóm gene cu trúc các gene cu trúc này cùng vi gene operator ca chúng hp thành
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 8
t n v sao chép s cp gi là mt operon. S tng hp ARN
tt
c bt u  mt
u ca operon và chuyn qua các gene cu trúc n u kia ca operon.
- Gene Promotor (gene hot hoá ký hiu P) ng trc gene operator là n And mà
ARN-polimeraza s kt hp và bt u quá trình sao chép các gene cu trúc.
- Gene u hoà regulator (ký hiu R): Gene này mã hoá cho mt protein c bit gi
là cht trn áp (repressor). Cht trn áp có vai trò “óng-m” gene operator. Do ó gene
u hoà có th kim tra quá trình sao chép gene cu trúc thông qua cht trn áp này.
+ Không có repressor (sn phm cui cùng)
R P O S1 S2 S3 ADN
E3E2E1
A BC
D
ARNtt
+ Có repressor (sn phm cui cùng):
Phiên mã
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 9
R P
O S1 S2 S3
ADN
: ARN-polymeraza

: Repressor
: coreressor
R: Gene u hoà, P: Gene promotor, O: Gene Operator,
S1, S2, S3: Các gene cu trúc.
2) Trong trng hp u hoà sinh tng hp enzim theo c ch trn áp, repressor do
gene u hoà tng hp còn  dng không hot ng (aporepessor) cha có kh nng kt
p vi gene operator nên quá trình sao chép các gene cu trúc tin hành bình thng.
Các enzim c tng hp xúc tác cho các phn ng  to thành các sn phm cui cùng,
n phm cui cùng này li có kh nng kt hp vi aporepessor và hot hoá nó.
Aporepessor ã c hot hoá s kt hp vi operator ngn cn quá trình sao chép các
gene cu trúc, làm ngng vic tng hp ARN
tt
tng ng do ó ình ch quá trình sinh
ng hp các enzim tng ng. Trong trng hp này các sn phm mi c coi nh là
cht trn áp (repressor).
3) i vi trng hp cm ng:
+ Không có cht cm ng
R P O S1 S2 S3 ADN
+ Có cht cm ng:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 10
ADNS3S2S1OPR
ARNtt
A
BC D
E1
E2 E3
 minh ho c ch cm ng sinh tng hp enzim
: Cht cm ng
Khi không có mt cht cm ng, cht trn áp (repressor) c tng hp ã  trng thái

hot ng, nó kt hp vi gene u khin operator, quá trình sao chép mã ca gene cu
trúc b bao vây nên các enzim tng ng không c tng hp.
Khi có mt cht cm ng thì cht trn áp repressor b mt hot ng, tách khi gene
u khin operator và quá trình sao chép mã bt u, kt qu làm tng lng enzim c
ng hp.
Nh vy ta thy hin tng trn áp và cm ng sinh tng hp enzim là hai mt i lp
a mt quá trình hoá sinh thng nht c thc hin thông qua hot ng “óng-m”
gene di tác dng ca các cht phân t thp
2.1.2. u hoà tng tác gia ARN-polymeraza vi gene promotor:
Nhiu du hiu thc nghim cho thy các gene bo m sinh tng hp mt s enzim
m ng xúc tác cho quá trình phân gii không ch chu s kim tra theo c ch cm ng
nhã trình bày  trên mà còn chu s kim tra theo mt c ch khác nh tác dng ca
AMP vòng (AMP
v
) gi là “trn áp phân gii” (cactabolic repressor) AMP
v
có tác dng
kích thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã ca các operon phân gii. Hin tng
này ã c nghiên cu nhiu i vi operon lactoza. Theo nhiu tác gi, tác dng kích
thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã c thc hin nh mt protein c bit
làm trung gian gi là protein nhn AMP
v
, hay còn gi là protein hot hoá gene phân gii
CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMP
v
kt hp vi CAP to thành phc hp

có tác dng hot hoá gene promotor làm cho ARN-polymeraza d dàng kt hp vi nó 
t u quá trình sao chép mã. Nh vy AMP
v
có tác dng làm tng cng quá trình sao
chép. Cng có ý kin cho rng phc hp AMP
v
-CAP-ARN-polymeraza cho phép bt u
quá trình sao chép mã.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 11
CAP
P
O Zi
i ZO
ARN-Polymeraza
CAP
a)
b)
c)
i ZO
CAP
AMPv
AMPv
AMPv
ARN
Pol
Pol
ARN
CAP
O Z

i
d)
ARNtt
Mô hình bt u sao chép mã ca operon lactoza
a – Phc hp CAP-AMP
v
chun b kt hp vào min c bit ca ADN.
b – Sau khi phc CAP-AMP
v
kt hp vào, nó làm yu n ADN.
c - ARN-polymeraza kt hp vào min c bit ca nó.
d - ARN-polymeraza “trc” dc theo n ADN nh mt “cái bt” n min bt u.
Ngi ta cng nhn thy glucza và mt s loi ng khác khi thêm vào môi trng
nuôi cy vi khun thng làm giàu lng AMP
v
trong t bào, do ó làm gim quá trình
sinh tng hp nhiu enzim cm ng, ngay c khi nó có cht cm ng trong môi trng.
Hin tng này còn gi là “hiu ng glucoza” c quan sát thy  E. coli và mt s vi
khun. Tuy nhiên cho n nay vn cha bit rõ c ch làm giàu AMP
v
do glucoza và các
ng khác
2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao:
 chn ging vi sinh vt có kh nng sinh tng hp enzim cao, ngi ta có th phân
p t môi trng t nhiên hoc có th dùng các tác nhân gây t bin tác ng lên b
máy di truyn hoc làm thay i c tính di truyn  to thành các bin chng có kh
ng tng hp c bit hu hiu mt loi enzim nào ó, cao hn hn chng gc ban u.
2.2.1. Phng pháp gây t bin:
ây là phng pháp hay c dùng nht nhm :
- To nhng t bin b gim kh nng sinh tng hp repressor hoc tng hp

repressor có ái lc thp vi gene opertor.
- To nhng t bin tng hp enzim có cu trúc bc 1 thay i do ó có th gim 
thay i vi kiu kìm hãm theo c ch liên h ngc.
u vào
Min bt u vào
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 12
u s thay i cu trúc bc 1 xy ra  vùng trung tâm hot ng hoc  gn ó thì có
th làm thay i rõ rt hot tính ca enzim.
- Gây t bin n gene hot hoá promotor  làm tng áp lc ca nó i vi ARN-
polymaraza do ó làm tng tc  sao chép mã Dùng bin pháp này có th làm tng
ng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 ln.
Hin tng t bin thng liên h vi s thay i mt gene, chng hn b “li” mt
baz khi tái to phân t ADN. Ví d mt v trí nào ó trên gene có th t nucleotit là
G-X, nu nó b thay th bng A-T, T-A hoc X-G thì phân t ARN
tt
c tng hp trên
n gene b li này cng s khác vi ARN
tt
bình thng  v trí tng ng vi ch “li”
trên gene. Do ó s tng hp nên phân t enzim khác vi bình thng  mt s gc axít
amin.
 to mt t bin gene có th dùng tác nhân vt lý (tia t ngoi, tia phóng x) hay
hoá hc (các hoá cht) tác dng lên t bào sinh vt.
2.2.2. Phng pháp bin np:
Là s bin i tính trng di truyn ca mt nòi vi sinh vt di nh hng ca ADN
trong dch chit nhn c t t bào ca vi sinh vt khác. ây yu t bin np là ADN.
 chuyn vt liu di truyn (ADN) t t bào cho n t bào nhn có th xy ra trong ng
nghim (invitro) khi cho t bào nhn tip xúc vi dch chit t t bào cho mà không có s
tip xúc gia các t bào.

Các t bào có th nhn bt k loi ADN nào ch không òi hi phi là ADN t các
ging h hàng. Tuy nhiên t bào ch có th nhn mt sn ADN nht nh, thng
không quá 10 n. Các n ADN c di truyn trong bin np có M=10
6
-10
7
và phi
có câu trúc xon kép. T bào không tip nhn các n ADN có kích thc nh hn hoc
các n không có cu trúc xon kép. Hin tng bin np ph bin  nhiu loài vi sinh
t nh: Diplococus, Staphylococus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,
Xantomonas.
2.2.3. Phng pháp tip hp gene:
Khác vi bin np, ây vt liu di truyn chc truyn t t bào cho n t bào
nhn khi hai t bào tip xúc vi nhau. Do vy các vi sinh vt có kh nng bin np thì s
không có kh nng tham gia tip hp gene na. Hin nay quá trình tip hp gene ã c
nghiên cu  mt s loài vi khun nh E. coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.
2.2.4. Phng pháp ti np:
t liu di truyn (ADN) c chuyn t t bào cho sang t bào nhn nh vai trò trung
gian ca thc khun th (phage). Trong quá trình ti np, các n ADN c chuyn t
 bào cho n t bào tip hp vi ADN ca t bào nhn. Do ó làm bin i tính cht di
truyn ca t bào nhn.
2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt :
Khi s dng vi sinh vt  sn xut enzim cn chn ging thun chng, ã c kim
tra y  v các c tính hoá sinh, vi sinh, nuôi cy và cn c bit lu ý n u kin
o qun ging. Thc t khi bo qun ging gc trong mt thi gian dài có th to ra các
bin d ngu nhiên không mong mun do ó nh k phi cy chuyn và kim tra li các
c tính ban u.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 13
2.3.1. Phng pháp cy chuyn:

ây là phng pháp ph bin nht d thc hin bng cách gi ging trên môi trng
thch (thch nghiêng, hp petri,…) vi thành phn môi trng nuôi cy và u kin nuôi
y thích hp cho ging vi sinh vt ó. Sau khi ging ã mc tt cn bo qun  nhit 
nh 3-4
0
C và sau mi tun phi cy chuyn li. Khi cy chuyn ch ly bào t hoc
khun lc mà không nên ly c môi trng dinh dng  bo m không chuyn các sn
phm trao i cht vào môi trng mi (có th gây nên nhng bin i bt li không th
ng ht c). Nu là x khun thì không nên bo qun ging trên môi trng thch
mà nên gi trong t ã kh trùng.
 kéo dài thi gian bo qun ging t hàng tháng n 1 nm, ngi ta ph mt lp
paraphin lng ã tit trùng trên b mt ging  hn ch s phát trin ca nó. Cn lu ý
ch ph lp du sau khi cy vi sinh vt t n  chín sinh lý.
Phng pháp cy chuyn rt có hiu qu bo qun các ging nm men, vi khun và
t hu hiu, d dàng trin khai ging ra sn xut ln, hn ch các tai bin có th dn n
 hng ging gc.
2.3.2. Phng pháp làm khô:
ng cách gi ging trên cát, t, silicagen trong u kin khô ráo (tt cu c
kh trùng cn thn). Trong u kin nh vy s hn ch s phát trin tip tc ca ging
khi bo qun. Phng pháp này rt hay c s dng  bo qun nm mc, x khun,
t vài loài nm men, vi khun thi gian gi ging có thc 1 nm.
Phng pháp làm khô cng thc hin n gin, không cn dng ct tin. Tuy nhiên
ging nh phng pháp cy chuyn thi gian bo qun tng i ngn.
2.3.3. Phng pháp ông khô:
c là làm khô bng sy chân không thng hoa (nêu nguyên tc), còn gi là sy lnh
 to nên sn phm ông khô (thc phm ông khô, các vt phm sinh hc, y hc ông
khô…). ây là phng pháp bo qun lâu dài n 10 nm mà không làm cho ging b
bin i c tính nhng òi hi công ngh cao, thit bt tin, chi phí bo qun ln.
n na mt s loài vi sinh vt nh nm mc không có bào t và mt s loi vi rút t ra
không thích hp khi bo qun ông khô.

2.3.4. Phng pháp làm lnh ông trong nit lng:
Khí nit hoá lng  nhit  rt thp -165
0
C n -196
0
C nên nu bo qun vi sinh vt
 môi trng này s rt tt vì ging c gi bt bin trên 10 nm. Tuy nhiên ây là lnh
c công ngh cao (cn nit nguyên cht và lnh thâm ) nên chi phí bo qun rt cao.
2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim:
ây là yu tu tiên nh hng trc tip n hot ng sng cng nh kh nng sinh
ng hp enzim ca vi sinh vt. Môi trng chn cha y  các cht C, N, H, O. Các
cht vô c: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các cht vi lng khác.
2.4.1. Ngun cácbon:
Thng là hp cht hu c trong ó ch yu là gluxit, tu thuc vào c tính ca
enzim và nòi vi sinh vt mà ngi ta la chn cho thích hp.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim amylaza: ây là enzim cm ng n hình vì
y môi trng nuôi cy phi có các cht cm ng: tinh bt, dextrin, mantoza. Qua
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 14
nghiên cu ngi ta nhn thy ba loi gluxit là ngun cácbon tt nht  sinh tng hp
amylaza t hiu qu cao. Chng hn hiu sut sinh tng hp trên môi trng gluxit khác
nhau vi mt s loi enzim amylaza nh sau:
+ i vi -amylaza:
Tinh bt > dextrin > mantoza > glucoza > saccaroza > galactoza > manit > avabinoza.
+ i vi Oligo-1,6-glucoridaza (dextrinaza):
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza > glucoza > lactoza > galactoza > orabinoza
> manit.
+ i vi -1,4-amyloglucoridaza :
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza, glucoza, lactoza, orabinoza > rabinoza >
lactoza > manit.

Khi nuôi cy theo phng pháp b mt nu dùng cám thì không cn b sung tinh bt,
ngun tinh bt rt ph bin, ngoài cám có th dùng bt ngô, bt mì, bo bo.
n chú ý trong a s trng hp, mt s loi ng, n hình nht là ng glucoza
i kìn hãm sinh tng hp các enzim thu phân nói chung (chng hn theo c ch trn áp
phân gii do làm giàu lng AMP
v
trong t bào).
i vi các h vi sinh vt sinh enzim Proteaza:
Có mt s ngun gluxit khi dùng nuôi cy nm mc có kh nng sinh tng hp enzim
Proteaza có hot lc cao, chng hn theo th t sau:
+ i vi Asp. Flavus 74: fructoza > glucoza > saccaroza > ramnoza > mantoza >
galactoza > orabinoza > lactoza.
+ i vi Asp. Awamori 200: fructoza > manit > saccaroza > orabinoza > galactoza >
lactoza.
+ i vi Asp. Oryae 79: fructoza > saccaroza > mantoza > glucoza > manit >
orabinoza > galactoza > lactoza.
Tinh bt là ngun cácbon ca nhiu chng vi khun sinh tng hp enzim proteaza. Ví
: Vi khun Bac. Subtilis có kh nng sinh tng hp proteaza  môi trng tinh bt
>8%, ging x khun a nhit Micromonospora vulgaricus sinh tng hp proteaza trong
môi trng 0.15-0.25% tinh bt.
Ngoài ra mt s loi hydrocacbon cng có ngun cácbon cho 125 chng vi sinh vt.
Chng hn, mt s ging vi khun Pseudomonas semginosa có kh nng sinh tng hp
proteinaza hot lc cao trên môi trng n-paraphin vi 12, 14, 16 nguyên t C hoc
proplylenglycol, hydrocacbon thm.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim Pectinaza:
Quá trình sinh tng hp enzim pectinaza có liên quan n cht cm ng. ó chính là
pectin, ng nhiên ó là ngun cácbon. Nu s dng hn hp gluxit trong ó có pectin,
 nuôi cy vi sinh vt thì hot lc ca pectinaza ngoi bào có th tng 4-6 ln so vi khi
nuôi cy không có pectin.
Ging Asp. Niger c nuôi cy trên môi trng có nhiu ngun cácbon nh: Pectin,

tình bt, isulin, lactoza, saccaroza, mantoza, galactoza nng  2, 4, 6% s cho pectinaza
có hiu sut cao. Tuy nhiên nên nuôi cy trên môi trng ch có monosacarit và glyxerin
thì hoàn toàn không th sinh tng hp enzim này. ng glucoza có tác dng kìn hãm
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 15
(cht trn áp) sinh tng hp enzim pectinaza trên môi trng nuôi cy là pectin và lactoza
ôi vi loài Asp. Niger, Asp. Awamori.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim xenluloza.
Enzim xenluloza là enzim cm ng vì vy trong môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh
enzim này nht thit phi có xenluloza là cht cm ng và là ngun cácbon.
Ngun xenluloza rt phong phú: giy lc, bông, bt xenluloza, lõi ngô, cám, mùn ca,
m r, than bùn. Ngoài ra có th k thêm chit xut xenlobiozo-octa axetat, cám mì,
lactoza, balixyl cng có ngun cácbon tt. i vi ging Stachybotris atra, ngun gluxit
t nht  sinh tng hp enzim xenluloza là tinh bt 1%.
Các ngun cácbon khác nói chung (glucoza, xenlobioza, axetat, xitrat, oxalat,…). Li
kìm hãm sinh tng hp xenluloza, glyxerin không phi là cht cm ng cho enzim này.
- Ngoài ngun gluxit là ch yu còn phi kn các ngun cácbon khác nh:
+ Các axit béo phân t lng ln (oleic, stearic, miniotic). Ví d: axit oleic có tác dng
kích thích tng hp glucoamylaza lên 2.5-3.5 ln so vi nng  thích hp 2-3%.
+ Etanol và glyxerin trong nhiu trng hp nuôi cy c dùng làm cácbon b sung.
+ Trong s các axit hu c thì axit lactic hay c vi sinh vt hp th tng hp
enzim. Tuy nhiên ngi ta thng không b sung trc tip axit này vào môi trng nuôi
y mà ch b sung loi nguyên liu hay ch phm có cha nó hoc s gây sinh ra nó
trong quá trình nuôi cy.
2.4.2. Ngun nit:
- i vi h vi sinh vt sinh enzim amylaza:
 nhiu loài nm mc, ngun nit tt nht là NaNO
3
và NH
4

NO
3
, nng  nit di
c 0.05% nm mc vn phát trin c nhng sinh tng hp amylaza rt kém.
 l ti u gia tinh bt và NaNO
3
trong môi trng Zapec nuôi cy nm mc sinh
ng hp amylaza t hiu qu cao nht là 18:1.
Các mui amoni vô c (NH
4
H
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
Cl), mt s ngun nit hu c
(gelatin, cazein, cao ngô) cho hiu qu sinh tng hp amylaza thp.
Trong thc t, ngi ta thng dùng ngun nit là các axit amin có ngun gc t dch
thu phân protein (dch t phân nm men, nc chm, cao ngô, dch chit malt) ây va
là ngun nit va là ngun cácbon và cht cm ng sinh enzim.
Các axit amin có tác dng tt nht trong nhng trng hp này là asparagin, axit
glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thm chí là c ch thì dch thu
phân casein li cm ng sinh tng hp amylaza lên gp 2 ln so vi ban u.

- i vi h vsv sinh enzyme proteaza:
Ngun nit s dng rt phong phú, bao gm 2 nhóm: vô c và hu c.
+ i vi mt s loài nm mc thuc h Asp. (oryzae, awamori, niger, flavas) nu môi
trng có ngun nit hu c thì s sinh tng hp proteinaza axit tính cao. Trên môi
trng Czapek nu thay NaNO3 bng cazein thì hot lc proteinaza có th tng lên 3,5
n. Sinh tng hp enzyme proteaza c nâng cao khi môi trng nuôi cy có c hai
ngun nit hu c và vô c. Nu môi trng ch có ngun nit vô c s dn n ngng
sinh tng hp enzyme này.
+ Trong quá trình nuôi cy vi khun, trong s các ngun nit vô c thì NH
4
, H
2
PO
4

t hn c. Các mui amon và nitrat khác u làm gim hot lc enzyme.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 16
+ i vi x khun a nhit Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là cht cm ng 
sinh tng hp enzyme proteaza là tt nht.
+ Các axit amin có nh hng rõ rt nht n quá trình sinh tng hp enzyme vsv nói
chung. Chng hn glyxin, alanin, metionin, lxin làm tng hot lc proteaza ca chng
t bin Asp. Oryzae 251-90 lên 16% và chng nguyên thu Asp. Oryzae 132-63 lên 7 -
14%. Nhiu axit amin li có tác dng c ch sinh tng hp enzyme nh: valin, axit
glutamic, izolxin, treonin. Nói chung có khong 10 axit amin nh vy. Axit amin có tác
ng kích thích sinh tng hp enzyme khi trong t bào vsv không t tng lng  lng
axit amin t do so vi môi trng nuôi cy.
+ Ngoài ra, các baz purin nh A (adenin), G (guanin) và các dn xut ca chúng,
ARN và các sn phm thu phân cng làm tng áng k sinh tng hp proteinaza vsv.
- i vi h vsv sinh tng hp enzyme pectinaza:

ng ging nhi vi h vsv sinh tng hp enzyme proteaza, nu dùng kt hp nit
u c và vô c s có tác dng tt n quá trình sinh tng hp pectinaza. Tuy nhiên,
mui nitrat kim loi kim li kim hãm enzyme này. i vi Asp. Niger, ngun nit tn
kém nht  sinh tng hp pectinaza la NH
4
H
2
PO
4
. i vi Asp. Awamori thì li là
(NH
4
)
2
SO
4
. Trong khi ó thì N t pepton, cazein thu phân là hoàn toàn c ch s to
thành enzyme.
- i vi nm mc Asp. Foetidus thì (NH
4
)
2
SO
4
, nc chit cám, nc chit nm men
có tác dng nâng cao hot lc polygalacturonaza. Nói chung, t l thích hp nht i vi
C/N khi tng hp pectinaza trong khong 7/1- 13/1.
- i vi h vsv sinh enzyme xenlulaza.:
Ngun nit thíh hp nht i vi nhóm vsv này là ngun mui nitrat. Trong ó NaNO
3

làm cho môi trng kim hoá to u kin thun li cho s to thành xenlulaza. Cao ngô
và cao nm men ( k c nc chit nm men) cng có tác ng khác nhau n kh nng
sinh tng hp xenlulaza tu thuc ging vsv. Các mui amoni ã có tác dng thm chí c
ch quá trình sinh tng hp vì chúng làm cho môi trng b axit hoá gây c ch quá trình
sinh tng hp thm chí làm mt hot tính enzyme ngay sau khi to thành trong môi
trng.
2.4.3. Ngun các nguyên t khoáng và các yu t (cht) kích thích sinh trng:
- Mui khoáng rt cn thit cho hot ng ca vsv, c bit là i vi các quá trình
sinh tng hp các enzyme kim loi.  sinh tng hp α-amylaza và glucoamylaza, nng
 MnSO
4
thích hp nht là 0,05%. Nu thiu mui này và mui photphat kali thì vsv
không th sinh tng hp c dextrinaza. Hot lc α-amylaza và dextrinaza c nâng
cao  nng  KH
2
PO
4
1% và hot lc glucoamylaza  nng  KCl 0,05%, dextrinaza 
ng  thích hp nht là 0,15%.
-Ion Mg
2+
có tác dng sinh tng hp và n nh các enzyme có hot tính  nhit 
cao. c bit Ca
2+
có trong thành phn ca α-amylaza (trong 1 phân t gam α-amylaza
a Asp. Oryzae có 20g Ca, ca Bac. Subtilis có 4g Ca). Trong môi trng nuôi cy Ca2+
nâng cao kh nng tng hp α-amylaza, bo v enzyme này khi s nh hng ca
proteaza.
-Lu hunh S vi ngun ch yu là các axit amin cha S nh metionin, cystein, sistin,
và các mui sunphat (CuSO

4
). Các mui khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu nh hng
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 17
n kh nng sinh tng hp xenlulaza. Trong a s trng hp biotin (VTM H) và mt s
VTM cng rt cn thit cho quá trình sinh tng hp enzyme .
Khi la chn môi trng cn chú ý n c thành phn nh tính và nh lng sao cho
quá trình sinh tng hp enzyme mong mun là cao nht. Mun vy ngi ta có th s
ng mt s phng pháp sau:
1) Phng pháp ti u hoá quy hoch thc nghim toàn phn ( yu t): òi hi
nhiu thi gian và không c chính xác lm.
2) Phng pháp toán hc mô hình hoá thc nghim: cho phép xác nh nhanh chóng
và úng n t l các thành phn môi trng nuôi cy và các yu t công ngh bo m
cho hot ng sng và sinh tng hp enzyme cao nht.
2.4.4. Các loi môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzyme :
Có th chia làm 2 loi: môi trng tng hp và môi trng t nhiên (phc hp).
- Môi trng tng hp: là môi trng bao gm các cht vi liu lng xác nh (qua
tìm hiu, nghiên cu), chng hn ngun cacbon có th là tinh bt, xenlulolaza, ng,
axit, ru, ngun Nit vô c hoc hu c (axit amin, peptin ). Loi môi trng này
c s dng cho mc ích nghiên cu (có khi nó mang tên nhà nghiên cu ra nó:
Czêpk-Dobrovonxki, Hasen ).
- Môi trng t nhiên: thng dùng các lai ph liu, nguyên liu( a s trong ó là
thc phm) có cha các ngun cacbon, nit, khoáng(a lng, vi lng), các yu t sinh
ng hp trng. Mt khác, các nguyên liu này li có sn, r tin nên c s dng rt
nhiu trong công nghip sn xut các ch phm enzyme vi sinh vt.
- Các nguyên liu d chun b làm môi trng t nhiên bao gm: cám và bt ht cc,
c chit ngô, dch ép hoa qu, rau, khô du, bã ru, rng, sn phm phân hu nm
men bia, tru, lõi ngô(  làm cht n, to xp). Khi la chn s dng môi trng cn
chú ý n các cht có tác dng u hoà sinh tng hp enzyme, c bit các cht cm
ng. Bng thc nghim, ngi ta thy rng cht cm ng (tng cng sinh tng hp

enzyme) thng là c cht ch yu, các sn phm thu phân ca nó hoc cht tng t c
cht.  trên ta ã bit là cht cm ng thng kt hp vi cht trn áp repressor làm cho
nó không hot ng( mt kh nng kt hp vi gene u khin operator). Nh vy, cht
m ng phi i vào bên trong t bào do ó không th là nhng cht i phân t nh
protein, tinh bt, xenluloza, pectin. Theo mt s tác gi thì các c cht này là các c cht
'tin cm ng', di tác dng ca enzyme gc chúng b thu phân mt phn to thành
cht có phân t lng bé hn óng vai trò là cht cm ng thc s. Chng hn, t nm
1972 Iurikievits cho rng cht cm ng thc s ca α-amylaza không phi là tinh bt mà
là sn phm thu phân mt phn ca nó: erytrodextrin. Tng t nh vy, cht cm ng
a enzyme proteinaza là các polypeptin, protein có phân t lng nh.
- Khi la chn môi trng nuôi cy và c bit là cht cm ng cn xem xét cn thn
các yu t chi phí, giá thành sn xut ra sn phm.
2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt:
 nguyên tc có 2 phng pháp nuôi cy vsv thu enzyme là: phng pháp nuôi cy
 mt (còn gi là phng pháp ni) và phng pháp b sâu (còn gi là phng pháp
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 18
nuôi cy chìm), trong ó  phng pháp b sâu còn có th chia ra 2 phng pháp c th
n: là nuôi cy chìm 1 bc (1pha) và nuôi cy chìm 2 bc (2 pha).
2.5.1. Phng pháp nuôi cy b mt:
- Phng pháp này rt thích hp  nuôi cy các loi nm mc (sinh tng hp các h
enzyme amylaza, xenlulaza, pectinaza, proteaza) do kh nng phát trin nhanh, mnh,
nên ít b tp nhim. Khi nuôi, nm mc phát trin bao ph b mt ht cht dinh dng
n, các khun ty cng phát trin âm sâu vào lòng môi trng ã c tit trùng, làm m
(khun ty c cht). i vi mt s mc ích c bit, ngi ta nuôi vsv trc tip trên b
t ht go (sn xut tng), ht u tng (u tng lên men - misô) ã c nu chín
trn ht cc còn sng (làm men thuc bc, men dân tc, làm tng).
- Ngi ta thng dùng cám mì, cám go, ngô mnh, bt ngô, mnh ht bo bo có cht
ph gia là tru. Cám, tru, có b mt tip xúc ln, mông, to c  xp nhiu, không
có nhng cht gây nh hng xu n s phát trin ca nm mc. T l các cht ph gia

(cht n) phi bo m so cho hàm lng tinh bt trong khi nguyên liu không c
thp hn 20%, có th b sung thêm ngun nit vô c ((NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
CO), photpho
(P
2
O
5
, H
3
PO
4
k thut), nit hu c và các cht kích thích sinh trng nh malt, nc
chit ngô, nc lc bã ru.
*Quy trình công ngh:
Nguyên liu
Trn
Làm m
Thanh trùng bng nhit
Làm ngui, làm ti
Gieo ging vsv Nuôi cy ging
Chuyn vào dng c nuôi cy

Nuôi cy, theo dõi, x lý
+ Làm m môi trng :
Có ý ngha quan trng, trong u kin sn xut ln, hàm m ti u ca môi trng
cám là 58-60%. Khi c nuôi cy trong u kin tit trùng nghiêm ngt thì st hot
 enzyme cao nht khi hàm m 65-68%. Tuy nhiên nu môi trng quá m s b dính
t (khi hp thanh trùng, làm ti, khi nuôi cy), d b nhim vi sinh vt tp (b lên men
u, lên men dm ).  làm m có th dùng nc trn vi nguyên liu (nhào) ri
thanh trùng hoc làm m s b ri thanh trùng sau ó dùng nc vô trùng (nc ngng
, nc un sôi  ngui) u chnh li m ca khi nguyên liu. Cách sau có th
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 19
rút ngn thi gian làm ngui, khng chc m chính xác hn nhng òi hi phi
thanh trùng  nhit  và áp sut sao hn.
+ Thanh trùng bng hi nhit:
Làm cho môi trng c tinh khit hn v phng din vsv và làm cho chín (bin
hình) môi trng (tinh bt, protein). Thông thng ngi ta thanh trùng bng hi nc
trc tip  nhit  120- 130
0
C trong 2-3h.
+ Làm ngui và làm ti môi trng  gieo ging:
Khi môi trng va hp xong còn nóng và dính bt. Vì vy phi làm ngui và làm
i  thun tin cho vic gieo ging và phân phi vào các dng c nuôi. Yêu cu thi
gian này phi ngn  hn ch nhim khun t bên ngoài. Nhit  yêu cu t c 
gieo ging là 35-39
0
C.
+ Nuôi cy nm mc ging:
Nhm  lng bào t ging cho toàn b môi trng nuôi cy. Quy trình công ngh
thc hin tng t nh trong sn xut ln nhng phi thc hin các u kin k thut
c bit và khc khe hn nh: nguyên liu phi tt, giàu cht dinh dng hn, u kin

nuôi cy khng ch nghiêm ngt hn, thi gian nuôi cy dài hn (gn gp ôi)  nm
c hình thành nhiu bào t và u.
+ Tin hành quá trình nuôi cy :
Sau khi gieo ging và phân phi vào các dng c nuôi (mành hay khay c l) ri
chuyn vào phòng nuôi có u chnh nhit  và m tng i ca không khí (ϕ)
ng nh mc  thông khí. Quá trình nuôi cy nm mc kéo dài 33-48h/mc tri
qua 3 giai n:
*Giai n 1: T khi nuôi cy mc gng n gi nuôi th 10-12. Xy ra s trng n
bào t và xut hin cung nm.  bo m s ny mm nhanh và hn ch nhim tp,
n gim nguyên liu 55-60%, ϕ=96-100%, T=30-32
o
C.
*Giai n 2: kéo dài trong 10-18h. Nm mc phát trin mnh, lan khp b mt và
trong toàn khi môi trng trng (khun ty n sâu vào c cht) dn n hin tng kt
bánh. Quá trìnhhô hp và to nhit mnh làm môi trng trng b khô xp, tng hàm
ng CO
2
, nhit  phòng nuôi tng lên n 38-40
o
C.  khng ch nhit  thích hp
28-30
o
C càn thông gió (qut) và bão hoà m không khí phòng nuôi.
Giai n 3: kéo dài trong 10-20h và c trng nht vì to ra enzyme nhiu nht.
ng  trao i cht gim i chút ít, nhit to ra ít hn nên tc  bc hi nc ca
môi trng nuôi cy cng gim theo. Quá trình nuôi cy c chm dt khi nm mc t
 già chín sinh lý và bt u to thành bào t.
2.5.2. Phng pháp nuôi cy chìm:
- Vi sinh vt c nuôi cy trong môi trng lng vi c cht ch yu trong a s
trng hp là tinh bt. Ch có mt s ít ging vsv dùng ngun c cht cacbon là ng

glucoza, saccharoza. Thc t, trong mt s trng hp ngi ta ng hoá s b tinh bt
trc khi thanh trùng (bng ch phm enzyme amylaza). Khi ó ng maltoza c to
thành là cht cm ng tt, môi trng trng b gim  nht nên d dàng cho quá trình
khuy trn và sc khí.
-Mt s loi môi trng dinh dng  sn xut ch phm enzyme amylaza dng trong
CNSX ru etylic nh sau:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 20
+Môi trng nuôi cy 40m
3
ca Trung Quc:
t khoai lang : 400kg
t bánh mì : 240kg
Cám : 160kg.
NaNO
3
: 1,2kg
c va  hàm lng cht khô:3,33%
+ Môi trng sn xut th nhà máy ru Hà Ni:
c bã ru trong : 100 phn
t ngô mn :1,5-2 phn
c ng hoá t ngô16% : 5-10 phn
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,4-0,5 phn
P

2
O
5
: 0,4-0,5 phn
MgO : 0,15-0,20 phn
u chnh pH t 5-5,5
- Phng pháp nuôi cy b sâu òi hi phi c vô trùng tuyt i  các khâu v sinh
ng hp, thanh trùng thit b, thanh trùng môi trng dinh dng, thao tác nuôi cy ,
không khí cung cp cho quá trình nuôi cy .
Các giai n ca quá trình nuôi cy chìm 1 bc (1pha) gm: chun b môi trng
nuôi cy, nuôi cy nm mc ging, nuôi cy nm mc sn xut.
+ Chun b môi trng nuôi cy :
Sau khi ã phi trn úng t l các thành phn sc khuy trn k ri thanh trùng
ng hi nhit (trc tip hay gián tip bng ni 2 v), nhit  118-125
o
C, thi gian 15-
60phút, sau ó c làm ngui n nhit  30
o
C thì tin hành gieo cy nm mc ging
vào.
+ Nuôi cy nm mc ging:
c tin hành qua 2 cp  (bc), phòng thí nghim và men ging trung gian.  cp
PTN c thc hin trong các bình cu, tit trùng môi trng làm ngui, cy ging ri
nuôi trên máy lc (150-200ln/phút). Nm mc s dng oxy không khí qua nút bông và
quá trình lc, thi gian nuôi 46-50h.  cp phát trin ging trung gian ngi ta chuyn
c ging PTN vào thit b nuôi ã cha sn môi trng tit trùng và làm ngui. Nuôi
y có sc khí vô trùng vi lu lng 15-20m
3
/m
3

h, thi gian 36-40h. Th tích dch men
ging bng 10% so vi dch men sn xut v sau.
+ Nuôi cy nm mc sn xut:
Trong quá trình nuôi cy cn phi sc khí vô trùng và khuy trn, tip du phá bt nu
có hin tng to bt trào ra khi ni lên men. Thi gian nuôi 1-4 ngày tu theo ging vi
sinh vt. Vic khng ch pH, ch sc khí và bo m vô trùng là nhng yu t quan
trng quyt nh hiu qu quá trình. Chng hn nu môi trng c thêm mui amôni
a NH
4
NO
3
thì khi NH
4
+
c vi sinh vt s dng s chuyn môi trng v axit. Nu
 axit hoá thng này có nh hng su n sinh tng hp enzym thì cn phi b sung
CaCO
3
 trung hoà hoc duy trì tng pH
opt
cho sinh tng hp. Nu ngun NaNO
3
thì
khi vi sinh vt s dng NO
3
-
s còn li Na
+
s kim hoá môi trng, lúc ó li phi dùng
axit  trung hoà. Tr s pH ban u ca môi trng nuôi cy có nh hng nht nh n

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 21
 to thành enzym. Ví d: i vi enzym -amylaza thì pH
opt
ca cácloi vi khun là 7,
a các loi nm mc là 5.6–5.7.
2.5.3. Phng pháp nuôi cy chìm 2 bc: (lên men 2 pha)
Vi sinh vt c nuôi trong thit bu tiên (giai n u, bc u tiên, pha th
nht)  phát trin n mc  cn thit, sau ó c chuyn sang thit b lên men tip
theo (giai n sau, bc th hai, pha th hai) có thành phn khác vi thit bu  sinh
ng hp enzym.
Pha th nht c gi là pha sinh trng (trophophase), pha th hai c gi là pha
ch to enzym (idiophase).
n hình cho phng pháp này xut phát t vic phát minh quá trình lên men cht
kháng sinh streptomixin bi x khun streptomyces griseus vào nm 1944 bi Schatz,
Bugie và Waksman.
Ngun gluxit mà ging x khun này ng hoá c  sinh tng hp streptomixin là:
glucoza, tinh bt, dextrin, mantoza, galactoza, mannoza. Ngun Nit c s dng là
protein ca bt u nành, bt cá, men khô, bt ht bông, gluten bt mì (nhóm x khun
sinh tng hp kháng sinh streptomixin nói chung u có hot lc proteaza rt mnh 
thu phân các protein nói trên thành các axit amin cn thit). Ngun Nit vô c bao gm
các mui amoni, photpho hoà tan.
n thân quá trình lên men streptomixin là các quá trình lên men 2 pha n hình. Pha
sinh trng mnh, bào t ny chi và mc thành si sau 6-8
h
. Pha th 2, khun ty phát
trin và bt u sinh tng hp kháng sinh. Trong quá trình này ( pha th 2) ng thi
o thành mt phc ca mannoza vi streptomixin gi là manozilostreptomixin có hot
tính kháng sinh kém hn 6 ln so vi streptomixin và có th coi ây là tp cht không
mong mun trong quá trình sinh tng hp. Tuy nhiên phc này di tác dng ca enzym

- manozilostreptomixinaza có tình D-manoza  gii phóng streptomixin vào nm 1969
Inamine và các cng sã nghiên cu sn xut enzym - manozilostreptomixinaza theo
phng pháp nôi cy chìm 2 bc nh sau:
Pha th nht: T bào streptomyces gricus c nuôi trong môi trng dinh dng có
khuy trn và sc khí trong 17
h
 nhit  28
0
C  to nhiu bào t. Sau ó bào tc
a sch và chuyn sang thit b tip theo.
Pha th 2: Tip tc nuôi cy  sinh tng hp enzym - manozilostreptomixinaza
trong 18-24
h
. Lúc này tc  phát trin ca vi khun chm li, nhng s chuyn hoá phc
cht manozidosteptomixin nhanh chóng din ra di tác dng ca enzym thành kháng
sinh streptomixin.
2.5.4. So sánh phng pháp nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzym :
- Phng pháp nuôi cy b mt có nhng u nhc m sau:
+ Nng  enzym to thành cao hn nhiu ln so vi dch nuôi cy chìm sau khi ã
tách t bào vi sinh vt. Trong công nghip ru mun ng hoá 100kg tinh bt ch cn
5kg ch phm nm mc b mt nhng phi cn n 100lít nm mc chìm ã lc bã và t
bào vi sinh vt.
+ Ch phm d dàng sy khô mà không làm gim áng k hot tính enzym, ch phm
khô, d bo qun, vn chuyn, nghin nh hoc s dng trc tip nu không cn khâu
tách và làm sch enzym.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 22
+ Tn ít nng lng (n, hi nc, công nhân) thit b, dng c nuôi cy n gin,
có th thc hin  qui mô gia ình, trang tri cng nh qui mô ln n 20T/ngày.
+ Nuôi cy trong u kin không cn vô trung tuyt i và trong quá trình nuôi cy

u có nhim trùng phn nào, khu vc nào thì ch cn loi b canh trng phn ó.
+ Tuy nhiên phng pháp b mt có nng sut thp, khó c khí hoá, tng hoá, cn
din tích nuôi ln, cht lng ch phm  các m không ng u.
- Phng pháp nuôi cy b sâu có nhng u nhc m sau:
+ Phng pháp nuôi cy hin i (công ngh cao) d c khí hoá, tng hoá, nng
sut cao, d t chc sn xut tit kim din tích sn xut.
+ Có th nuôi cy d dàng các chng vi sinh vt t bin có kh nng sinh tng hp
enzym cao và la chn ti u thành phân môi trng, các u kin nuôi cy, enzym thu
c tinh khit hn, m bo u kin v sinh, vô trùng.
+ Tuy nhiên do thu c canh trng có nng  enzym thp nên khi tách thu hi
enzym s có giá thành cao (có t trc). Tn n nng cho khuy trn, nu không bo
m vô trùng s b nhim hàng lot, toàn b gây tn tht ln.
2.6. Tách và làm sch ch phm enzym :
(xem s tng quát  trang 200 ca giáo trình)
- Mc ích yêu cu: Các ch phm enzym c s dng  các dng khác nhau theo
c  tinh khit (hot  riêng). Trong mt s trng hp, canh trng nuôi cy vi sinh
t có cha enzym c s dng trc tip di dng thô không cn tách tp cht nu
chúng không gây nh hng áng kn sn phm và quy trình công ngh sau này (Ví
: sn xut ru, nc chm thc vt, da). Cng có khi ngi ta cn s dng ch phm
enzym tinh khit trong công nghip dt, công nghip mch nha, y hc, nghiên cu khoa
c.
Enzym nói chung rt d b gim hot tính di tác dng ca các tác nhân bên ngoài do
ó khi tách và tinh ch enzym  tránh s bin hình protein nh hng ln n hot tính
enzym cn tin hành nhanh chóng  nhit  thp,  pH thích hp không có mt các
cht gây bin hinh enzym.
2.6.1. Thu dch enzym :
- i vi trng hp enzym còn nm trong t bào (enzym ni bào nuôi bng phng
pháp b mt) thì cn phi gii phóng enzym bng cách phá v t bào thu nhiu cách nh:
+ Nghin nh, nghin vi cát, nghin vi vn thu tinh, nghin bi.
+  t bào t phân hu.

+ Dùng tác dng ca siêu âm hoc to áp sut thm thu cao, trích ly (chiên) bng
mui, dung dch mui trung tính, dung môi hu c
+ Kt ta enzym bng các cht n ly thích hp.
- i vi trng hp enzym tit ra môi trng (enzym ngoi bào nuôi theo phng
pháp chìm), ngi ta thng tách sinh khi và cn bã khoi canh trng bng cách
c li tâm, lc ép có s dng tác nhân tr lc (diatomit, t hot tính) hoc các tác
nhân tr kt ta (Ví d: hn hp CaCl
2
+(NH
4
)
2
SO
4
 CaSO
4
: lng cn kéo theo
sinh khi nên lc d hn)
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 23
2.6.2. Thu nhn ch phm k thut:
Ch phm k thut là ch phm enzym cha c tinh ch; có th cha mt vài loi
enzym ch yu, mt s loi protein không phi enzym, các cht n nh và các tp cht
khác. Dch enzym thu c  trên thng có nng  cht khô thp 4-6g/l, bc u
ngi ta cô c chân không  nhit  35
0
C n nng  15-20g/l ri tip tc x lý nh
sau:
- Tip tc cô c chân không  nhit  40-45
0

C t nng  cht khô 30-35g/l,
 sung thêm cht bo qun nh NaCl, glyxerin, sorbitol, benzoat ta s thu c
ch phm enzym k thut  dng có th bo qun  nhit  thng c 1-2 nm.
-  sung thêm các cht n nh t nng  cht khô 30-40g/l ri sy phun 
nhiêt  120
0
C (nhit  khí thi 60
0
C), ch phm k thut thu c  dng bt .
- t ta enzym bng các dung môi thích hp nh: dung môi hu c (etanol,
izopropanol, axeton), dùng mui trung tính ph bin nht là (NH
4
)
2
SO
4
dung dch
bão hoà. Sau khi li tâm tách kt ta có th trn thêm các cht n nh ri sy khô
và nghin mn  thu c ch phm dng bt.
2.6.3. Thu ch phm enzym tinh khit:
Vic tinh ch enzym có th tin hành bng nhiu phng pháp qua nhiu giai n:
- Hoà tan ch phm k thut vào nc hoc dung dch nui CaCl
2
 nng  thích
p hoc dung dch m, kt ta tr li bng etanol, axeton hay (NH
4
)
2
SO
4

. Quá
trình này cn tin hành nhanh chóng  nhit  thp  tránh s vô hot enzym.
Ngoài ra mui NaCl cng c hay c dùng  kt ta các enzym ngun gc
ng vt. Kt ta  pH gn m ng n ca enzym. Sau khi kt ta các mui vô
c loi i bng phng pháp thm tích, thm thu ngc hoc lc gel.
- Tách enzym bng phng pháp hp ph chn lc:
Cho dch enzym chy t t qua ct cht hp ph (thng là hydrat oxit-nhôm,
silicagel) các enzym khác nhau sc hp ph vi kh nng khác nhau, sau ó dùng các
dung dch m thích hp  chit rút enzym ra khi ct. Phng pháp dùng  làm m
c enzym.
- Tách enzym bng phng pháp trao i ion:
a vào s trao i ion gia enzym có n tích vi các ion trái du ca cht nha khi
cho dung dch enzym chy t t qua ct cha các cht nha trao i ion. Sau khi ct ã
no (ht hiu lc) cho dung dch ra (dung dch cht n gii) có nng  tng dn chy
qua ct y ra khi nha các enzym va liên kt vi chúng. Khi ó enzym nào có áp
c (liên kt) vi nha kém nht s by ra khi ct nha trc. Nh vy các enzym
khác nhau sc chit ra khi ct theo tng phn chit khác nhau trong ó ca phn
chit cha enzym cn thu vi nng  cao nht.
Các nha trao i ion thng là các cht nha tng hu c : Dowex, Amberlit,
Wolfatit, Permuit, các dn xut ca xenluloza.
Sau khi làm sch cn sy khô chân không  nhit  thp hoc sy thng hoa. Enzym
tinh khit có hot tính cao hn nhiu so vi ch phm ban u. Nhng do quá trình làm
ch rt khc khe và tn kém nên loi này chc dùng trong y hc, trong nghiên cu
khoa hc  xác nh khi lng phân t, cu trúc enzym.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 24
Chng 3: K THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY
M (MALT)
Malt là loi ht hoà tho (ht cc) ny mm trong nhng u kin nhân to (nhit ,
m, thi gian) xác nh gi tc là quá trình  malt. Mc ích chính trong quá trình 

malt là trích luc mt lng ln các enzym (ch yu là enzym amylaza) trong ht,
c s dng trong các lnh vc sau:
- Trong công nghip sn xut ru etylic (cn, ru etylic) t nguyên liu tinh bt.
Malt là tác nhân ng hoá tinh bt (phng pháp sn xut ru này có tên là
phng pháp maltaza hay phng pháp malt). Có th dùng các loi ht nh: i
ch, lúa mch en, yn mch, kê, ngô  sn xut malt loi này.
- Trong công nghip sn xut bia malt va là tác nhân ng hoá tinh bt va là
nguyên liu chính (cùng vi hoa houblon và nc) và có th có nguyên liu thay
th (Không phi malt i mch). Malt bia ch yu c sn xut ti mch, ngoài
ra ngi ta có th dùng mt t l malt thay th nh thóc mm.
- Trong công nghiêp sn xut mt tinh bt (ng nha, mch nha): malt va là tác
nhân ng hoá tinh bt va là nguyên liu chính. Malt loi này c sn xut t
lúa, lúa mì, ngô, i mch, kê thm chí t c khoai lang ny mm. Mch nha sn
xut t malt vn là ngon nht, cho cht lng tt nht.
- Trong mt s ngành sn xut thc n sinh dng, thc n kiên (cho ngi bnh,
ngi già, tr em, gia xúc, gia cm non). Malt c dùng  phi ch vào thc n
a thc n.
Quá trình sn xut malt bao gm các khâu sau:
Thu nhn, x lý, làm sch, phân loi và bo qun ht,
a, xát trùng và ngâm ht.
m mm (ny mm) ta s thu c malt ti.
y malt ti.
 lý và bo qun malt khô.
3.1. Nguyên liu i mch:
i mch là cây ht cc  các nc ôn i, có khong 30 ging khác nhau nhng ch
có mt ging có ý ngha kinh t là i mch mùa (Hordeum sativum) còn li u là i
ch di. Hin nay din tích trng và sn lng i mch trên th gii ng v trí th 4
sau lúa mì, lúa, ngô. Thuc ging i mch mùa có 130 loi khác nhau và c chia làm
3 nhóm chính: i mch nhiu hàng (6 hàng và 4 hàng)-Hordium hexatichum; i mch 2
hàng (Hordium disstichum) và i mch trung gian (H. intermedium). Nhóm có giá tr

trong sn xut malt và bia là i mch nhiu hàng.
i mch sau khi thu hoch c phi sy n m di 13%  bo qun cùng
ging nh các ht hoà tho khác, cu to ht i mch gm v tru, v qu, v ht,
alrông, ni nh và phôi. T l trung bình trong các phn nh sau:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 25
Tên b phn ht % khi lng toàn ht
 tru
 qu
 ht
Alrông
Phôi
i nh
12
3,5 ÷ 4
2 ÷2,5
12 ÷14
2,5 ÷ 3
64,5 ÷ 6,8
Thành phn hoá hc trung bình ca i mch theo % cht khô nh sau:

phn ht
Protein
(N*5,7)
Chtbéo
tinh
t
Pentosan Xenluloza Tro
t


Phôi
13,4
7,1
28,6
2,0
2,1
7,6
54,0
8,2
46,0
9,0
20,0
20,0
5,7
22,6
1,1
3,0
10,0
10,0
Khi lng 1000 ht c trng cho  my ca ht nm trong khong 15 ÷ 60 gam và
ngi ta chia thành các loi:
i mch ht nh: Khi lng 1000 ht ti 30 gam
i mch tng i nh: Khi lng 1000 ht ti 31 ÷40 gam
i mch nng: Khi lng 1000 ht ti > 51gam
Kích thc ht dài 8 ÷ 10 mm, rng 3 ÷ 4 mm, dày 2 ÷3 mm.
Ch s cht lng quan trng ca i mch  sn xut malt và bia là  ny mm và
ng lc ny mm. Ngoài ra, i mch còn c c trng bi  chit và hàm lng
protein. i mch tt có  chit t ti 82% và hàm lng protein không quá 12%. Nu
hàm lng t quá 12 % thì  chit s thp, bia s bc; còn nu hàm lng protein
quá thp s làm gim  bt và v bia.

3.2. Làm sch và phân loi ht:
Khi ht có cha nhiu tp cht (bi, tp cht nh nh c, rm r; tp cht nng nh
i á, vn kim loi ) do ó cn phi c làm sch trc khi a vào sn xut. Mt
khác, khi ht phi m bo ng u  quá trình ngâm và ny mm c thun li và
ng u.
Thông thng ngi ta làm sch và phân loi bng các h thng sàng thích hp:
- Sàng khí ng: dùng  tách tp cht và phân loi ht theo chiu dày, chiu rng ca
nó theo các tính cht khi ng (dùng qut).
u ht c phân loi theo chiu dày ht  sn xut malt bia, ngi ta c 3 nhóm:
+ Loi I : b dày ht > 2,5 mm Dùng  sn xut malt bia tt nht.
+ Loi II : b dày ht > 2,2 ÷ 2, 5 mm Dùng  sn xut malt bia tt nht.
+ Loi III : b dày < 2,2 mm Dphi liu, c dùng  làm vic khác.
- Sàng ng (Trier):  phân loi ht theo chiu dài
- Tách tp cht kim loi dùng nam châm kin trng.

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay
×