Tóm tắt luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ của Virus Vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGÔ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP
VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành

: Khoa học y sinh

Mã số

: 9720101

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2020


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH
TẠI HỌC VIỆN QN Y

Hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. NGUYỄN LĨNH TOÀN
2. PGS.TS. HỒ ANH SƠN

Phản biện 1: GS. TS. VĂN ĐÌNH HOA
Phản biện 2: PGS. TS. TRỊNH TUẤN DŨNG
Phản biện 3: PGS. TS. PHẠM TUẤN CẢNH

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
họp tại Học viện Quân y vào hồi

giờ

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Học viện Quân y

ngày tháng

năm 2020.


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh ung thư là một vấn đề sức khỏe lớn, ngày càng được quan
tâm ở tất cả các nước trên thế giới. Ung thư đầu cổ (UTĐC) là khối u
ác tính phát triển trong khu vực này của cơ thể, 90% UTĐC có mơ
bệnh học là ung thư biểu mô tế bào vảy. Trên thế giới, UTĐC đứng
hàng thứ 7 với 4,8% tổng số các ca ung thư mới chẩn đoán. Trị liệu
bằng virus ly giải tế bào (Oncolytic virus –OLV) dựa trên cơ chế
chính là các OLV có khả năng xâm nhập và nhân lên đặc hiệu trong
các tế bào ung thư của khối u gây ly giải tế bào, kích thích các tế bào
ung thư chết theo chương trình, kích thích đáp ứng miễn dịch chống
ung thư.

Nimotuzumab là kháng thể đơn dịng hướng đích là thụ thể tăng
trưởng biểu bì (EGFR) có tác dụng chống tăng sinh mạch, kìm hãm
tăng sinh tế bào, cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis),
làm tế bào tăng nhạy cảm với xạ trị và hóa trị liệu
Chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư
đầu cổ của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên thực
nghiệm” nhằm 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối
hợp với Nimotuzumab in vitro.
2. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối
hợp với Nimotuzumab trên mơ hình chuột thiếu hụt miễn
dịch mang khối ung thư đầu cổ (in vivo).
 Tính cấp thiết:
Nghiên cứu tác dụng kháng UTĐC người của virus vaccine sởi
(MeV) phối hợp Nimotuzumab cả in vitro và trên mơ hình cấy ghép
trên chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp


2
theo về cơ chế tác dụng phối hợp MeV và Nimotuzumab kháng u, tiến
tới các thử nghiệm lâm sàng sử dụng phối hợp MeV và Nimotuzumab
điều trị bệnh nhân ung thư nói chung và UTĐC nói riêng.
 Đóng góp mới của luận án:
Luận án là nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác dụng kháng ung thư
đầu cổ người dòng tế bào Hep2 của phối hợp MeV và Nimotuzumab
cả in vitro cũng như trên mơ hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn
dịch. Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tiến tới các thử
nghiệm lâm sàng điều trị ung thư.
 Bố cục luận án:
Luận án có 150 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1:

Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên
cứu (27 trang), Chương 3: Kết quả (47 trang), Chương 4: Bàn luận
(35 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang).
Luận án có 175 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 171).
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về ung thư đầu cổ
Ung thư đầu cổ (UTĐC) là những khối u ác tính phát sinh trong
vùng đầu cổ như: ung thư khoang miệng, mũi, xoang cạnh mũi, lưỡi,
họng, tuyến nước bọt và thanh quản.
Tỉ lệ mắc UTĐC ngày càng gia tăng cả ở Việt Nam và trên một
số khu vực thế giới. Đây là một bệnh ác tính có tiên lượng xấu, nguy
hiểm và có nhiều biến chứng lớn. Các yếu tố nguy cơ chính liên quan
đến UTĐC bao gồm sử dụng thuốc lá, uống rượu, nhiễm HPV - đối
với ung thư họng miệng, nhiễm EBV- đối với ung thư vòm họng.


3
Các gen gây ung thư trong HNSCC thường liên quan đến 4 con
đường chức năng chính: tăng sinh tế bào, sự biệt hóa biểu mơ vảy, sự
tồn tại của tế bào và xâm lấn/di căn.
1.2. Liệu pháp hướng đích thụ thể yếu tố phát triển biểu
bì
1.2.1. Vai trị của EGFR trong ung thư biểu mô vảy đầu cổ
Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor
receptor - EGFR) có trọng lượng phân tử 170 kiloDaltons (kDa).
Khi yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF) liên kết vào thụ thể
(EGFR), hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hóa) từ đó tự
phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase gây hoạt hố các tyrosin đặc
hiệu và các protein tín hiệu nội bào phụ thuộc thụ thể EGFR gây
phiên mã các gen đích thúc đẩy q trình tăng sinh tế bào, sống sót (ức

chế chết tế bào theo chương trình - apoptosis), xâm lấn và di căn tế bào.
EGFR đặc biệt quan trọng trong bệnh sinh của ung thư biểu mô tế
bào vảy đầu cổ (HNSCC). Sự biểu hiện của EGFR gặp ở 92% trong
các khối HNSCC. Hơn nữa, sự biểu hiện của EGFR tăng cao trong các
khối u trong giai đoạn tiến triển hoặc trong các khối u kém biệt hóa.
1.2.2. Nimotuzumab trong điều trị ung thư đầu cổ
Nimotuzumab là một kháng thể đơn dịng có khả năng gắn kết đặc
hiệu với EGFR, ngăn chặn kích hoạt thụ thể. Nó nhận ra miền ngoại bào
của EGFR và cạnh tranh vị trí gắn của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF),
ngăn ngừa EGF liên kết và kích hoạt EGFR tiếp theo, ức chế hoạt tính
của tyrosin kinase, do đó ức chế sự tăng trưởng của các tế bào khối u.
Ngoài ra để đáp ứng với EGFR bị phong tỏa bởi Nimotuzumab,
các tế bào khối u giảm khả năng tiết ra các yếu tố tăng sinh mạch


4
máu, như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), dẫn đến giảm
sự hình thành mạch máu và tăng số lượng tế bào apotosis.
Nimotuzumab (Cimaher) được chứng minh có hiệu quả trong
điều trị HNSCC tiến triển không phẫu thuật được. Nimotuzumab
được chứng minh là an tồn và ít biến chứng nặng.
1.3. Virus vaccine Sởi (MeV) trong liệu pháp virus điều trị
ung thư
1.3.1. Virus sởi
Virus sởi là virus có đường kính khoảng 100-300 nm, với một lõi
RNA sợi đơn (-), thuộc chi Morbillivirus và họ Paramyxoviruses,
được bao quanh bởi một capsid xoắn. Các glycoprotein vỏ bọc của
MeV là protein hemagglutinin (H) và fusion (F) làm trung gian cho
sự gắn và sự hòa hợp của virus với tế bào.
Trong liệu pháp OLV hiện nay, sử dụng các chủng vaccine MeV

thuộc các dịng Edmonston bao gồm một số chủng biến đổi thích
nghi trong thí nghiệm, liên quan chặt chẽ nguồn gốc từ một chủng
lâm sàng lấy từ họng của một em bé có tên là David Edmonston
(năm 1954) được cấy truyền trong các tế bào khác nhau, tạo ra chủng
MeV giảm độc lực hơn và không gây bệnh.
1.3.2. Thụ thể của MeV
MeV sử dụng ba thụ cảm thể là CD46, CD150 và nectin-4 để xâm
nhập vào tế bào đích, trong đó quan trọng nhất là thụ thể CD46.
CD46 là một glycoprotein xuyên màng type 1 biểu hiện phổ biến
ở tất cả các tế bào có nhân. Thụ thể CD46 được tìm thấy biểu hiện ở
mức cao ở các tế bào ung thư. Ở các tế bào bình thường có biểu hiện
CD46 thấp, MeV có khả năng lây nhiễm nhưng sự hình thành hợp
bào là không đáng kể. Ở các tế bào ung thư có biểu hiện thụ thể


5
CD46 cao, nhiễm MeV dẫn đến phản ứng hợp bào mạnh mẽ: MeV
gắn với thụ thể xâm nhập vào tế bào, tăng sinh trong tế bào, hình
thành hợp bào và tiêu diệt tế bào qua trung gian CD46 tăng lên rõ rệt.
1.3.3. Tính an tồn của vaccine sởi giảm độc lực
MeV đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn của một OLV lý tưởng phải có
được tính lựa chọn các khối u cao, không gây bệnh cho các mô lành
cơ thể, ổn định về mặt di truyền và khơng có nguy cơ gây bệnh cho
cộng đồng.
1.3.4. Các cơ chế gây ly giải tế bào ung thư
1.3.4.1. MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp
bào
Sự hợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân
cận tạo thành hợp bào. Một tế bào bị nhiễm virus có thể hợp nhất 50100 tế bào lân cận với nhau tạo thành một hợp bào. Đây là một cơ
chế lây lan virus mà khơng cần giải phóng các hạt virus trưởng thành

ra khỏi tế bào. Quá trình hợp nhất tế bào làm cho virus giảm tiếp xúc
với kháng thể trung hòa của cơ thể vật chủ, virus tránh được sự kiểm
soát của hệ miễn dịch.
1.3.4.2. Ly giải tế bào u qua trung gian kích thích miễn dịch
đặc hiệu kháng u
MeV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm nội
sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng
kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế
bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực
bào, tế bào DC, tế bào lympho T.
1.4. Sử dụng phối hợp virus vaccine sởi và kháng thể đơn
dòng Nimotuzumab trong điều trị ung thư


6
Có 2 thử nghiệm sử dụng MeV có khả năng nhắm mục tiêu là
EGFR để xâm nhập và ly giải tế bào ung thư nguyên bào thần kinh
và 1 thử nghiệm với đối tượng là tế bào HNSCC. Cả 3 thử nghiệm
đều cho thấy khả năng ức chế và gây chết tế bào ung thư của MeV
nhắm mục tiêu EGFR trên cả in vitro và in vivo. Nimotuzumab là
kháng thể đơn dịng ức chế EGFR đã được chứng minh có hiệu quả
trong điều trị HNSCC. Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành phối
hợp MeV với kháng thể đơn dịng Nimotuzumab nhằm mục đích cộng
hợp tác dụng điều trị ung thư theo cơ chế của hai liệu pháp trên để có
thể đem lại hiệu quả tốt trong điều trị HNSCC in vitro và in vivo.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Động vật: Chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch chủng
BALB/c, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 18-22g, đủ tiêu chuẩn thí

nghiệm
2.1.2. Vaccine sởi (MeV): virus vaccine sởi chủng
Edmonton
2.1.3. Các dịng tế bào: Tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ
người dòng Hep2, tế bào thận khỉ (tế bào Vero)
2.1.4. Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab:chế phẩm
CIMAher
2.1.5. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
2.1.5.1. Thiết bị sử dụng:
Thước kẹp NSK 150mm, cân điện tử TE3102S Sartorius, phịng
sạch ni chuột, phịng ni cấy tế bào, máy li tâm, máy đo mật độ


7
quang, máy realtime PCR, máy flow cytometry, pipet các kích cỡ khác
nhau.
2.1.5.2. Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao: Phiến 6, 96 giếng,
đầu côn, các đĩa nuôi cấy, lọc vi khuẩn, ống falcon, eppendorf ...
2.1.5.3. Hóa chất:
Mơi trường ni cấy tế bào M199, EMEM, bộ kít làm thử nghiệm
MTT, Annexin V/PI Fluorescein isothiocyanate; bộ kít tách RNA,
chuyển cDNA, primers, master Mix, cồn 70, 900...
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến
cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, trong và sau điều trị.
2.2.1. Đánh giá khả năng ức chế tế bào và chết theo
chương trình của virus vaccine sởi phối hợp Nimotuzumab trên
dịng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2
2.2.1.1. Các chỉ tiêu đánh giá
-

Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ
CCID50

-

Đánh giá khả năng ức chế tế bào Hep2 bằng thử nghiệm
MTT

-

Đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và hoại tử bằng
phương pháp flow cytometry
- Đánh giá tế bào chết theo chương trình (sự tăng cường biểu

hiện phiên mã gen STAT3 và ISG15) bằng kỹ thuật Realtime PCR.
2.2.1.2. Các kỹ thuật thực hiện
a, Kỹ thuật nuôi cấy các dòng tế bào ung thư
Tế bào Hep2 và Vero được lấy từ nguồn bảo quản âm sâu (80 C), rã đông thật nhanh (<1 phút). Đưa tế bào vào đĩa nuôi cấy
0


8
cùng với môi trường EMEM. Khi tế bào phát triển, tách tế bào bằng
trypsin-EDTA 1X.
b, Phương pháp tăng sinh MeV nguồn gốc vaccine

 Nhiễm MeV vào tế bào Vero. Sau 9-10 ngày nhiễm virus thu
dung dịch chứa MeV
 Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ CCID50

Đưa tế bào Vero vào phiến 96 giếng nồng độ 10 4/200µl/giếng.
Nhiễm MeV với nồng độ hịa lỗng của stock virus từ 10-2 -10-7.
Sau 5 ngày nhiễm MeV sử dụng xanh methylen làm chất hiện
màu, tính CCID50.
c, Đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT
Sử dụng MeV và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên phiến
96 giếng với nồng độ pha lỗng 10-2 -10-8. Chia 4 nhóm (chứng, chỉ
điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm kết hợp). Thời
điểm 72 và 96 giờ sau điều trị cho dung dịch MTT vào các giếng, đo
độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 570nm và tính kết quả.
d, Phương pháp flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo
chương trình và hoại tử
Tăng sinh tế bào Hep2 và đưa vào 6 phiến 6 giếng. Sử dụng MeV
và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên các phiến 6 giếng. Chia
4 nhóm (chứng, chỉ điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm
kết hợp). Thu tế bào ở các thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ để đánh giá
tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử.
e, Đánh giá tế bào chết theo chương trình thơng qua sự phiên mã
gen STAT3, ISG15 của tế bào nuôi cấy bằng kỹ thuật Realtime PCR
Tăng sinh tế bào Hep2 và đưa vào 6 phiến 6 giếng. Sử dụng MeV
và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên các phiến 6 giếng. Chia


9
4 nhóm (chứng, chỉ điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm
kết hợp). Thu tế bào ở các thời điểm 48, 72 giờ, tách RNA, chuyển
cDNA và tiến hành chạy realtime PCR đánh giá sự phiên mã của gen
STAT3 và ISG15 với GAPDH làm nội chứng
2.2.2. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của MeV phối hợp
Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối

u đầu cổ người Hep2
2.2.2.1. Chỉ tiêu đánh giá
 Theo dõi sự xuất hiện của khối u
 Theo dõi đáp ứng điều trị ở các nhóm chuột mang u:


So sánh kích thước u ở các nhóm theo thời gian điều trị



Theo dõi tỉ lệ sống chết của chuột



Phân tích tế bào khối u chết theo chương trình bằng phương
pháp flow cytomitry



Phân tích hình ảnh mơ bệnh học của tế bào khối u



Phân tích siêu cấu trúc tế bào
2.2.2.2. Các kỹ thuật thực hiện

a, Chăm sóc chuột thí nghiệm
Chuột nude được ni trong phịng sạch, đảm bảo tiêu chuẩn.
b, Phương pháp tạo khối ung thư đầu cổ người trên chuột nude
Chuột được cố định và tiêm 0,1 ml (10 6 tế bào) vào dưới da đùi

phải. Tính thể tích khối u theo cơng thức: V = (D x R2) x 0,5
Trong đó: V: thể tích khối u (mm3); D và R là chiều dài của và
chiều rộng của khối u (mm).
c, Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị


10
Khi khối u phát triển với kích thước khoảng 7-10 mm đường
kính, chuột được phân chia ngẫu nhiên vào 4 nhóm, mỗi nhóm 10
chuột:
- Nhóm chứng: tiêm TM đi 0,1 ml PBS/chuột, liều duy nhất.
- Nhóm MeV: tiêm MeV trực tiếp vào khối u 6 lần, 2 lần/tuần, liều
10

7pfu

/lần/con.

- Nhóm Nimotuzumab: tiêm tĩnh mạch đuôi 0,1 ml dung dịch
Nimotuzumab liều duy nhất 100μg/chuột.
- Nhóm MeV + Nimotuzumab: được tiêm MeV vào khối u 6 lần, 2
lần/tuần, liều 107pfu/lần/con và được tiêm tĩnh mạch đuôi 0,1 ml dung
dịch Nimotuzumab liều duy nhất 100μg/chuột.

 So sánh kích thước u ở các nhóm nghiên cứu theo thời gian
 Theo dõi tỉ lệ sống chết của chuột
d, Phân tích tế bào khối u chết theo chương trình bằng phương pháp
flow cytomitry: Tách tế bào từ mơ u của 4 nhóm chuột và sử dụng kit
Annexin V/PI để phân tích tế bào chết theo chương trình.
e, Phương pháp phân tích mơ bệnh học khối u: Khối u được tách từ

đùi chuột, đúc paraffin và nhuộm HE và đọc dưới kính hiển vi.
f, Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào
Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400,
JEOL, Nhật Bản (Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh).
2.3. Phương pháp phân tích kết quả, xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0 và GraphPad Prism 6.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối
hợp với Nimotuzumab trên in vitro
3.1.1. Tăng sinh virus vaccine và các dòng tế bào


11
Hình 3.1: Sau 24 giờ, các tế bào bám dính vào đĩa nuôi cấy,
tốc độ tăng sinh gấp đôi của dòng tế bào Hep2 khoảng 24 giờ, tế bào
phát triển tốt và đạt khoảng 80-90% bề mặt nuôi cấy sau 6-7 ngày. Sau
2 tuần nuôi cấy thu đủ số lượng tế bào Hep2 để làm các thí nghiệm.
Hình 3.2. Ngày thứ 6 nhiễm virus, tế bào Vero hoại tử và bong lên
khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Thu dịch tế bào nhiễm virus, ly tâm lấy phần
dịch nổi, lọc lại bằng màng lọc 0,45 µm ta có dung dịch virus vaccine.
3.1.2. Chuẩn độ virus CCID50
Hình 3.3. Kết quả chuẩn độ CCID50 của MeV
= 105+0,5/0,2 ml = 5x105,5/ml
3.1.3. Tế bào Hep2 điều trị bằng virus tạo hợp bào in vitro
Hình 3.4. Hình ảnh tế bào Hep2 nhiễm virus tạo hợp bào
Ngày 0

Ngày 1

Ngày 2

3.1.4. Đánh
giá khả năng
ức chế tế bào
Ngày 3

bằng thử

Ngày 5

Ngày 4

nghiệm MTT
3.1.4.1. Kết quả ức chế tế bào ở các nhóm nghiên cứu (hình
% Tế bào sống

% Tế bào sống
150

Nhóm chứng

150

Nhóm chứng
Nimotuzumab

Nimotuzumab
MeV

100

MeV

100

Kết hợp (MeV+Nimo)

Kết hợp (MeV+Nimo)
50

50
p<0,001

0

0
72 giờ

96 giờ


12
3.6, 3.8)
3.1.4.2. Kết quả ức chế tế bào ở các thời điểm điều trị bằng virus
bằng thử nghiệm MTT
Hình 3.9. Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm điều trị bằng virus ở
nhóm MeV và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab
% tế bào sống

Nimotuzumab

Hình 3.10. Tỷ lệ tế bào sống

Survival rate (%)

110
Control

100

ở các thời điểm nghiên cứu

72h

90

96h

của nhóm điều trị bằng

80

Nimotuzumab

70
60

50
400
µg/mL

% Tế bào sống

200
µg/mL

100
µg/mL

50
µg/mL

25
µg/mL

100

96h

80

p<0,0001

70

100

72h
96h

80

60

p<0,0001

40

60

20

50
40

% Tế bào sống
72h

90

-2

10

-3

10

10

-4

-5

10

10

Nhóm MeV

-6

-7

10

-8

10

0

10

-2

-3

10

-4

10

10

-5

10

-6

-7

10

-8

10

Nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab

3
.1.5. Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (chết apoptosis)
3.1.5.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường
Hình 3.11. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi
thường: 24 giờ sau điều trị bằng virus đã thấy tế bào có xu hướng co
nhỏ lại. 48, 72 giờ, tế bào Hep2 có những hình ảnh nhiễm virus rõ:
co trịn lại, tế bào hòa màng tạo thành những hợp bào. 96 giờ tế bào
bong ra, có nhiều tế bào hoại tử và nổi trên bề mặt môi trường nuôi
cấy.

13
3.1.5.2. Đánh giá tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương
pháp flow cytometry
Hình 3.12. Ở cả 3 thời điểm 48, 72 và 96 giờ, tỷ lệ tế bào chết ở
nhóm chứng thấp hơn ở 3 nhóm điều trị, tỷ lệ tế bào chết ở nhóm
phối hợp MeV+Nimotuzumab cao hơn nhóm điều trị đơn. (p nhóm
phối hợp - nhóm chứng: p < 0,05).
Hình 3.13, Hình 3.14, Hình 3.15. Ở thời điểm 48 giờ, tỷ lệ tế bào
apoptosis, apoptosis sớm, apoptosis muộn và tế bào hoại tử ở các
nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng, ở nhóm điều trị phối hợp cao
hơn nhóm điều trị đơn (p < 0,05).

Hình 3.15. Kết quả chạy flow cytometry tế bào Hep2 ở các
thời điểm sau điều trị MeV và Nimotuzumab liều 2 MOI
Q1 là vùng tế bào apoptosis giai đoạn sớm
**:p < 0,01; ***:p < 0,0001
Hình 3.16. Ở thời điểm 72 giờ, tỷ lệ tế bào apoptosis, apoptosis
sớm, apoptosis muộn ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng, ở
nhóm điều trị phối hợp cao hơn nhóm điều trị đơn (p < 0,05).


14
Hình 3.17, Hình 3.18. Ở thời điểm 96 giờ, tỷ lệ tế bào chết hoại
tử ở các nhóm điều trị MeV (nhóm MeV và nhóm phối hợp) đều tăng
cao hơn có ý nghĩa thống kê với p<0,05 so với nhóm chứng (p
(MeV-Control) = 0,006; p (MeV+ Nimotuzumab -Control) = 0,001).
Hình 3.19. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần theo thời gian điều trị bằng
MeV và Nimotuzumab, cao nhất ở thời điểm 96 giờ và thấp nhất ở
thời điểm 48 giờ; (p < 0,05 ở nhóm MeV và nhóm kết hợp).

Hình 3.20. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis đạt mức cao nhất ở thời
điểm 72 giờ, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 ở nhóm
MeV và Nimotuzumab)
3.1.5.3. Kết quả đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng kỹ
thuật realtime PCR
Bieu hien tuong doi cua STAT3
50

***
Control 48h
MeV 48h
Nimo 48h
Combination 48h

40
30
20

ISG15
80

20

0

0

48 giờ

***

40

10

0

Control 48h
MeV 48h
Nimo 48h
Combination 48h

***

60

72 giờ

Hình 3.24. So sánh sự phiên mã của STAT3 theo
thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab

0

48 giờ

72 giờ

Hình 3.25. So sánh sự phiên mã của ISG15 theo
thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab

*: p< 0,05; **:p<0,01; ***:p<0,001

3.2. Kết quả tác dụng kháng ung thư của MeV và
Nimotuzumab trên mô hình
chuột

thiếu hụt miễn dịch

mang khối ung thư đầu cổ
người


15
3.2.1. Kết quả tạo khối u tế bào Hep2 trên chuột nude
Bảng 3.5. Ba ngày sau khi ghép 10 6 tế bào Hep2/chuột tại vị trí dưới
da đùi phải, 13/40 con (32,5%) chuột xuất hiện khối u tại vị trí tiêm,
ngày 11 sau ghép thì cả 40/40 chuột (100%) có u. Tại vị trí tiêm và
xuất hiện khối u khơng có biểu hiện viêm lt, hoại tử, chảy máu.
Hình 3.26. Kết quả ghép u dưới da đùi của chuột C2
(A) ngày thứ 3; (B) ngày thứ 5;
(C) ngày thứ 7; (D) ngày thứ 11
3.2.2. Kết quả tác dụng kháng ung thư của MeV và
Nimotuzumab
3.2.2.1. Tình trạng tồn thân chuột trong q trình thí
nghiệm
Bảng 3.6. Sau khi ghép tế bào Hep2, chuột vẫn ăn uống, vận động,
đáp ứng với kích thích bình thường, hậu mơn khơ, khơng đi lỏng.
3.2.2.2. Diễn biến trọng lượng cơ thể ở chuột nghiên cứu
Bảng 3.7. Ở hầu hết các thời điểm, trọng lượng trung bình chuột
ở các nhóm khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.2.3.Kết quả thể tích trung bình khối u ở các chuột nghiên
cứu
Bảng 3.8. Ở thời điểm ngày 0 - ngày đầu tiên phân nhóm điều trị,
thể tích trung bình ở tất cả 4 nhóm chuột đều tương đương nhau, sự
khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p > 0,05.
Hình 3.28, hình 3.29. Ở tất cả các thời điểm, thể tích trung bình
khối u ở các nhóm điều trị đều thấp hơn nhóm chứng; nhóm điều trị
phối hợp MeV+Nimotuzumab thấp hơn nhóm điều trị đơn MeV và
Nimotuzumab (Hình 3.29)


16

**

*

**

*

*

**

**

**

*

***

***

***

***
*

***

Hình 3.29. Thể tích trung bình khối u ở các thời điểm (mm3)
*: p < 0,05; **:p < 0,01; ***:p < 0,001
3.2.2.4. Kết quả thời gian sống, tỉ lệ chết của chuột nude sau
thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab
Hình 3.30. Sau thời gian 60 ngày theo dõi, thời gian sống trung
bình của chuột ở các nhóm điều trị dài hơn so với nhóm chứng
(nhóm phối hợp là 58,1 ± 4,33 ngày; nhóm MeV là: 49,1 ± 16,50
ngày; nhóm Nimotuzumab là: 45,4 ± 18,66 ngày; nhóm chứng là
38,6 ± 18,76 ngày). Tuy nhiên sự khác biệt này chỉ có ý nghĩa thống
kê ở nhóm chứng và nhóm điều trị phối hợp với p = 0,009.
3.2.2.5. Tỷ lệ sống tích lũy của chuột thí nghiệm giữa nhóm
chứng và các nhóm điều trị
Sau 60 ngày theo dõi các nhóm chuột, số chuột chết và tỷ lệ thời
gian sống tích lũy ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng; ở
nhóm điều trị phối hợp cao hơn ở nhóm điều trị đơn, cụ thể:
-

Nhóm chứng: 8 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,2.

17
-

Nhóm MeV: 4 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,6.

-

Nhóm Nimo: 6 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,4.

-

Nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab có 2 chuột chết: 2
chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,8.
3.2.3. Kết quả đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng

phương pháp Flow cytometry trên tế bào tách ra từ mô ung thư
% Apoptosis
Ty le apoptosis (%)

100
80
60

p p<0.001
<
73,3“6,95

75,56“7,84

0,001

46,02“10,49
40
39,56“
13,5
20
0

Hình 3.32. Tỷ lệ apoptosis tế bào Hep2 tách từ mơ khối u các nhóm chuột

3.2.4. Hình ảnh mơ bệnh học khối ung thư đầu cổ người Hep 2
trên chuột thiếu hụt miễn dịch ghép dị lồi
Hình 3.33. Hình ảnh mơ bệnh học khối ung thư đầu cổ người
Hep2 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ghép dị lồi là hình ảnh tế bào
ung thư biểu mơ kém biệt hóa.


18
3.2.5. Đánh giá siêu cấu trúc tế bào ung thư đầu cổ người Hep2
sau điều trị bằng MeV phối hợp với Nimotuzumab dưới kính hiển
vi điện tử truyền qua

Hình 3.35. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u Hep2 sau điều trị
bằng MeV kết hợp với Nimotuzumab (mẫu KH4, KH5)
(A) Tế bào Hep2 bình thường;
(B) Tế bào Hep2 sau điều trị bằng bởi virus vaccine sởi;
(C), (D) Tế bào Hep2 tạo thành hợp bào;
(E) Tế bào Hep2 ngưng tụ nhiễm sắc thể;

(F) Tế bào Hep2 phân mảnh nhiễm sắc thể;
(G) Tế bào Hep2 xuất hiện nhiều không bào;
(H) Tế bào Hep2 hoại tử.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ
CCID50