Tải bản đầy đủ (.pdf) (15 trang)

Bài giảng công nghệ protein – enzyme chương 7

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.06 MB, 15 trang )

1
1
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng v
ng v
à
à
đ
đ
á
á
nh gi
nh gi
á
á
đ
đ


tinh
tinh
s
s



ch c
ch c


a ch
a ch
ế
ế
ph
ph


m protein
m protein
2
2
C
C
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p x
p x
á
á
c đ

c đ


nh
nh
h
h
à
à
m lư
m lư


ng protein
ng protein
Protein sau khi đã đư
Protein sau khi đã đư


c t
c t
á
á
ch chi
ch chi
ế
ế
t v
t v
à

à
l
l
à
à
m s
m s


ch c
ch c
ó
ó
th
th


đ
đ


nh lư
nh lư


ng đư
ng đư


c. N

c. N
ế
ế
u protein nghiên c
u protein nghiên c


u l
u l
à
à
enzyme th
enzyme th
ì
ì
vi
vi


c đ
c đ


nh lư
nh lư


ng thông qua x
ng thông qua x
á

á
c đ
c đ


nh
nh
ho
ho


t đ
t đ


c
c


a enzyme
a enzyme
(theo
(theo
quy ư
quy ư


c qu
c qu



c t
c t
ế
ế
:
:
1
1
đơn v
đơn v


ho
ho


t đ
t đ


enzyme l
enzyme l
à
à







ng enzyme l
ng enzyme l
à
à
m chuy
m chuy


n ho
n ho
á
á
1
1
mol cơ ch
mol cơ ch


t
t
trong 1 ph
trong 1 ph
ú
ú
t
t


c

c
á
á
c đi
c đi


u ki
u ki


n tiêu chu
n tiêu chu


n
n
).
).
3
3
C
C
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p x

p x
á
á
c đ
c đ


nh
nh
h
h
à
à
m lư
m lư


ng protein
ng protein
Như v
Như v


y c
y c


sau c
sau c
á

á
c bư
c bư


c t
c t
á
á
ch chi
ch chi
ế
ế
t v
t v
à
à
l
l
à
à
m s
m s


ch
ch
protein ngư
protein ngư



i ta th
i ta th


y t
y t


ng lư
ng lư


ng protein gi
ng protein gi


m
m
nhưng ho
nhưng ho


t đ
t đ


enzyme tăng ngh
enzyme tăng ngh
ĩ

ĩ
a l
a l
à
à
ho
ho


t đ
t đ


riêng
riêng
tăng r
tăng r


t cao.
t cao.


Protein đư
Protein đư


c coi l
c coi l
à

à
s
s


ch n
ch n
ế
ế
u nh
u nh


ng bư
ng bư


c t
c t
á
á
ch chi
ch chi
ế
ế
t
t
v
v
à

à
l
l
à
à
m s
m s


ch sau
ch sau
không l
không l
à
à
m tăng
m tăng
ho
ho


t đ
t đ


riêng c
riêng c


a

a
ch
ch
ú
ú
ng n
ng n


a, v
a, v
à
à
ch
ch


khi đ
khi đ
ó
ó
ta m
ta m


i ho
i ho
à
à
n th

n th
à
à
nh vi
nh vi


c
c
t
t
á
á
ch chi
ch chi
ế
ế
t v
t v
à
à
l
l
à
à
m s
m s


ch protein

ch protein
4
4
C
C
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p x
p x
á
á
c đ
c đ


nh
nh
h
h
à
à
m lư
m lư


ng protein

ng protein


N
N
ế
ế
u protein không ph
u protein không ph


i l
i l
à
à
enzyme th
enzyme th
ì
ì
ta c
ta c
ó
ó
th
th


đ
đ



nh
nh




ng ch
ng ch
ú
ú
ng b
ng b


ng c
ng c
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p kh
p kh
á
á
c.
c.



N
N
ế
ế
u protein ta nghiên c
u protein ta nghiên c


u l
u l
à
à
hormon ho
hormon ho


c c
c c
á
á
c đ
c đ


c t
c t


th

th
ì
ì
ch
ch
ú
ú
ng đư
ng đư


c x
c x
á
á
c đ
c đ


nh qua hi
nh qua hi


u
u


ng sinh h
ng sinh h



c m
c m
à
à
ch
ch
ú
ú
ng gây ra; v
ng gây ra; v
í
í
d
d


như hormon sinh trư
như hormon sinh trư


ng (growth
ng (growth
hormone) s
hormone) s


k
k
í

í
ch th
ch th
í
í
ch s
ch s


sinh trư
sinh trư


ng c
ng c


a c
a c
á
á
c t
c t
ế
ế
b
b
à
à
o

o
đ
đ
í
í
ch nuôi c
ch nuôi c


y.
y.


N
N
ế
ế
u l
u l
à
à
protein v
protein v


n chuy
n chuy


n th

n th
ì
ì
c
c
ó
ó
th
th


x
x
á
á
c đ
c đ


nh ch
nh ch
ú
ú
ng
ng
thông qua n
thông qua n


ng đ

ng đ


ch
ch


t m
t m
à
à
ch
ch
ú
ú
ng v
ng v


n chuy
n chuy


n
n
5
5
Đ
Đ



nh lư
nh lư


ng nitrogen theo
ng nitrogen theo
phương ph
phương ph
á
á
p Kjeldahl
p Kjeldahl


Ph
Ph


n l
n l


n c
n c
á
á
c phương ph
c phương ph
á

á
p gi
p gi
á
á
n ti
n ti
ế
ế
p x
p x
á
á
c đ
c đ


nh protein
nh protein
đ
đ


u d
u d


a trên cơ s
a trên cơ s



x
x
á
á
c đ
c đ


nh lư
nh lư


ng nitrogen.
ng nitrogen.






ng nitrogen c
ng nitrogen c
ó
ó
trong c
trong c
á
á
c protein l

c protein l
à
à
g
g


n gi
n gi


ng
ng
nhau không ph
nhau không ph


thu
thu


c v
c v
à
à
o ch
o ch


t lư

t lư


ng v
ng v
à
à
ngu
ngu


n
n
protein.
protein.
Đương nhiên trên cơ s
Đương nhiên trên cơ s






ng nitrogen c
ng nitrogen c
ó
ó
th
th



x
x
á
á
c đ
c đ


nh ch
nh ch


c
c
á
á
c protein đã đư
c protein đã đư


c tinh s
c tinh s


ch ho
ch ho


c lư

c lư


ng
ng
protein c
protein c


a c
a c
á
á
c m
c m


u nghiên c
u nghiên c


u m
u m
à
à
ngo
ngo
à
à
i protein ra

i protein ra
không ch
không ch


a nh
a nh


ng ch
ng ch


t ch
t ch


a nitrogen kh
a nitrogen kh
á
á
c.
c.
6
6
Đ
Đ


nh lư

nh lư


ng nitrogen theo
ng nitrogen theo
phương ph
phương ph
á
á
p Kjeldahl
p Kjeldahl
Trong nông nghi
Trong nông nghi


p v
p v
à
à
công nghi
công nghi


p th
p th


c ph
c ph



m,
m,
protein thô đư
protein thô đư


c đ
c đ


nh lư
nh lư


ng b
ng b


ng c
ng c
á
á
ch x
ch x
á
á
c
c
đ

đ


nh lư
nh lư


ng nitrogen to
ng nitrogen to
à
à
n ph
n ph


n v
n v
à
à
k
k
ế
ế
t qu
t qu


nhân
nhân
v

v


i
i
6,25
6,25
,
,
ngh
ngh
ĩ
ĩ
a l
a l
à
à
coi protein luôn luôn ch
coi protein luôn luôn ch


a
a
16% nitrgen.
16% nitrgen.
7
7
Đ
Đ



nh lư
nh lư


ng nitrogen theo
ng nitrogen theo
phương ph
phương ph
á
á
p Kjeldahl
p Kjeldahl


Th
Th


c t
c t
ế
ế
, trong th
, trong th


c ph
c ph



m, bên c
m, bên c


nh protein
nh protein
còn c
còn c
ó
ó
nh
nh


ng ch
ng ch


t h
t h


u cơ kh
u cơ kh
á
á
c c
c c
ó

ó
ch
ch


a
a
nitrogen như amid
nitrogen như amid
, alcaloid, ammonia (v
, alcaloid, ammonia (v
í
í
d
d




như trong th
như trong th


c ph
c ph


m lên men)
m lên men)
acid nitric

acid nitric
do
do


đ
đ
ó
ó
h
h
à
à
m lư
m lư


ng nitrogen to
ng nitrogen to
à
à
n ph
n ph


n ch
n ch
í
í
nh th

nh th


c
c
cao hơn
cao hơn
16% (16
16% (16
-
-
17%)
17%)
nhưng
nhưng


protein th
protein th


c
c
v
v


t th
t th
ì

ì
h
h
à
à
m lư
m lư


ng n
ng n
à
à
y l
y l


i th
i th


p hơn
p hơn
16%. H
16%. H


s
s



6,25 l
6,25 l
à
à
h
h


s
s


trung b
trung b
ì
ì
nh thô.
nh thô.
8
8
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng nitrogen theo

ng nitrogen theo
phương ph
phương ph
á
á
p Kjeldahl
p Kjeldahl


Nguyên lý c
Nguyên lý c


a phương ph
a phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y l
y l
à
à
vô cơ ho
vô cơ ho
á
á
m

m


u b
u b


ng H
ng H
2
2
SO
SO
4
4
đ
đ


m đ
m đ


c v
c v
à
à
ch
ch



t x
t x
ú
ú
c t
c t
á
á
c.
c.
D
D
ù
ù
ng m
ng m


t ki
t ki


m m
m m


nh (NaOH ho
nh (NaOH ho



c KOH)
c KOH)
đ
đ


y
y
NH
NH
3
3
t
t


mu
mu


i (NH
i (NH
4
4
)
)
2
2
SO

SO
4
4
. S
. S
au đ
au đ
ó
ó
h
h


ng NH
ng NH
3
3
v
v
à
à
o dung d
o dung d


ch acid c
ch acid c
ó
ó
n

n


ng đ
ng đ


x
x
á
á
c đ
c đ


nh. S
nh. S
au
au
đ
đ
ó
ó
d
d
ù
ù
ng ki
ng ki



m c
m c
ó
ó
n
n


ng đ
ng đ


x
x
á
á
c đ
c đ


nh đ
nh đ


chu
chu


n đ

n đ




acid dư
acid dư
. T
. T


đ
đ
ó
ó
t
t
í
í
nh đư
nh đư


c lư
c lư


ng nitrogen c
ng nitrogen c
ó

ó
trong nguyên li
trong nguyên li


u
u
9
9
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng protein theo
ng protein theo
phương ph
phương ph
á
á
p Lowry
p Lowry
Phương ph
Phương ph
á
á
p n

p n
à
à
y d
y d


a trên cơ s
a trên cơ s


d
d
ù
ù
ng m
ng m
á
á
y đo m
y đo m
à
à
u đ
u đ


x
x
á

á
c đ
c đ


nh m
nh m
à
à
u s
u s


n ph
n ph


m kh
m kh


c
c


a phosphomolipden
a phosphomolipden
-
-
phosphowolframate (

phosphowolframate (
thu
thu


c th
c th


Folin
Folin
-
-
Ciocalteau
Ciocalteau
)
)
v
v


i ph
i ph


c h
c h


p đ

p đ


ng
ng
-
-
protein. Ph
protein. Ph


c m
c m
à
à
u xanh t
u xanh t


o th
o th
à
à
nh
nh
c
c
ó
ó
th

th


đo
đo






c s
c s
ó
ó
ng 67
ng 67
5nm.
5nm.




ng đ
ng đ


m
m
à

à
u c
u c


a h
a h


n
n
h
h


p ph
p ph


n
n


ng t
ng t


l
l



thu
thu


n v
n v


i n
i n


ng đ
ng đ


protein. D
protein. D


a v
a v
à
à
o
o
đ
đ



th
th


chu
chu


n protein (
n protein (
thông thư
thông thư


ng d
ng d
ù
ù
ng tinh th
ng tinh th


albumin huy
albumin huy
ế
ế
t thanh bò) ta c
t thanh bò) ta c
ó

ó
th
th


t
t
í
í
nh đư
nh đư


c h
c h
à
à
m lư
m lư


ng
ng
protein trong m
protein trong m


u nghiên c
u nghiên c



u.
u.
10
10
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng protein theo
ng protein theo
phương ph
phương ph
á
á
p Lowry
p Lowry
Phương ph
Phương ph
á
á
p Lowry đư
p Lowry đư


c d

c d
ù
ù
ng r
ng r


ng rãi đ
ng rãi đ


x
x
á
á
c đ
c đ


nh nhi
nh nhi


u lo
u lo


i
i
protein kh

protein kh
á
á
c nhau.
c nhau.
Phương ph
Phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y c
y c
ó
ó
đ
đ


nh
nh


y cao, cho ph
y cao, cho ph
é
é
p

p
ph
ph
á
á
t hi
t hi


n đư
n đư


c protein trong dung d
c protein trong dung d


ch
ch


n
n


ng đ
ng đ


1

1
g/ml.
g/ml.
Tuy
Tuy
nhiên cư
nhiên cư


ng đ
ng đ


m
m
à
à
u còn tu
u còn tu


thu
thu


c nhi
c nhi


u v

u v
à
à
o lo
o lo


i protein.
i protein.
V
V
í
í
d
d


,
,


c
c
ù
ù
ng m
ng m


t n

t n


ng đ
ng đ


, dung d
, dung d


ch trypsin cho cư
ch trypsin cho cư


ng đ
ng đ


m
m
à
à
u
u
cao g
cao g


p 3 l

p 3 l


n gelatin,
n gelatin,
hemoglobin cho cư
hemoglobin cho cư


ng đ
ng đ


m
m
à
à
u th
u th


p hơn
p hơn
trypsin nhưng cao hơn gelatin
trypsin nhưng cao hơn gelatin
.
.
Ngo
Ngo
à

à
i ra, nhi
i ra, nhi


u ch
u ch


t kh
t kh
á
á
c c
c c
ó
ó
th
th


l
l
à
à
m tăng hay gi
m tăng hay gi


m cư

m cư


ng đ
ng đ


m
m
à
à
u
u
ph
ph


n
n


ng, v
ng, v
ì
ì
v
v


y phương ph

y phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y cho k
y cho k
ế
ế
t qu
t qu


ch
ch
í
í
nh x
nh x
á
á
c khi x
c khi x
á
á
c
c
đ

đ


nh protein đã đư
nh protein đã đư


c tinh s
c tinh s


ch.
ch.
11
11
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng protein b
ng protein b


ng
ng
phương ph

phương ph
á
á
p quang ph
p quang ph


Phương ph
Phương ph
á
á
p đơn gi
p đơn gi


n nh
n nh


t đ
t đ


đo n
đo n


ng đ
ng đ



protein trong dung d
protein trong dung d


ch l
ch l
à
à
đ
đ


h
h


p th
p th


tia c
tia c


c t
c t
í
í
m

m
c
c


a n
a n
ó
ó
.
.
N
N
ế
ế
u protein tinh s
u protein tinh s


ch th
ch th
ì
ì
n
n


ng đ
ng đ



tuy
tuy


t đ
t đ


i c
i c


a
a
n
n
ó
ó
đư
đư


c t
c t
í
í
nh theo gi
nh theo gi
á

á
tr
tr


đo đư
đo đư


c.
c.
N
N
ế
ế
u protein không tinh s
u protein không tinh s


ch (v
ch (v
í
í
d
d


, d
, d



ch chi
ch chi
ế
ế
t t
t t


m
m


t s
t s


c ký) th
c ký) th
ì
ì
n
n


ng đ
ng đ


c

c


a protein t
a protein t


ng đư
ng đư


c
c
t
t
í
í
nh tương đ
nh tương đ


i t
i t


đ
đ


h

h


p th
p th


12
12
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng protein b
ng protein b


ng
ng
phương ph
phương ph
á
á
p quang ph
p quang ph



Nguyên t
Nguyên t


c c
c c


a phương ph
a phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y l
y l
à
à
c
c
á
á
c protein
c protein
h
h



p th
p th


tia c
tia c


c t
c t
í
í
m c
m c


c đ
c đ


i
i






c s

c s
ó
ó
ng
ng
280nm do c
280nm do c
á
á
c acid amin thơm như
c acid amin thơm như
tryptophan, tyrosine v
tryptophan, tyrosine v
à
à
phenylalanine
phenylalanine
.
.
Đ
Đ


h
h


p
p
th

th




280
280
nm thay đ
nm thay đ


i tu
i tu


lo
lo


i protein nhưng h
i protein nhưng h


s
s


t
t



t đo đư
t đo đư


c (ngh
c (ngh
ĩ
ĩ
a l
a l
à
à
đ
đ


h
h


p th
p th


c
c


a dung d

a dung d


ch
ch
protein 1% v
protein 1% v


i đư
i đư


ng s
ng s
ó
ó
ng truy
ng truy


n qua 1cm) cho
n qua 1cm) cho
m
m


i protein cho ph
i protein cho ph
é

é
p t
p t
í
í
nh n
nh n


ng đ
ng đ


c
c


a protein
a protein
tinh s
tinh s


ch.
ch.
13
13
Đ
Đ



nh lư
nh lư


ng protein b
ng protein b


ng
ng
phương ph
phương ph
á
á
p quang ph
p quang ph


V
V


i m
i m


t h
t h



n h
n h


p c
p c
á
á
c protein ho
c protein ho


c v
c v


i b
i b


t c
t c


m
m


t

t
loai protein n
loai protein n
à
à
o m
o m
à
à
không bi
không bi
ế
ế
t h
t h


s
s


t
t


t th
t th
ì
ì
n

n


ng
ng
đ
đ


protein đư
protein đư


c t
c t
í
í
nh như sau
nh như sau
:
:
N
N


ng đ
ng đ


protein

protein
(mg/ml)=1,55xA280
(mg/ml)=1,55xA280
-
-
0,77xA260
0,77xA260
Trong đ
Trong đ
ó
ó
: A
: A
280:
280:
đ
đ


h
h


p th
p th









c s
c s
ó
ó
ng 28
ng 28
0nm
0nm
A260:
A260:
đ
đ


h
h


p th
p th









c s
c s
ó
ó
ng 260nm
ng 260nm
14
14
Đ
Đ


nh lư
nh lư


ng protein b
ng protein b


ng
ng
phương ph
phương ph
á
á
p quang ph
p quang ph



Phương ph
Phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y
y
không d
không d
ù
ù
ng
ng
đư
đư


c cho c
c cho c
á
á
c dung d
c dung d


ch

ch
c
c
ó
ó
n
n


ng đ
ng đ


protein th
protein th


p hơn
p hơn
0,1mg/ml
0,1mg/ml
ho
ho


c khi c
c khi c
ó
ó
m

m


t
t
nhi
nhi


u ch
u ch


t kh
t kh
á
á
c m
c m
à
à
h
h


p th
p th


c

c
ù
ù
ng m
ng m


t v
t v
ù
ù
ng c
ng c


c t
c t
í
í
m (v
m (v
í
í
d
d


,
,
đ

đ


m, acid nucleic v
m, acid nucleic v
à
à
m
m


t s
t s


ch
ch


t b
t b
é
é
o), ho
o), ho


c khi
c khi
protein

protein


trong d
trong d


ch truy
ch truy


n ph
n ph
ù
ù
ch
ch


không ph
không ph


i trong
i trong
dung d
dung d


ch. (V

ch. (V
í
í
d
d


, trong m
, trong m
à
à
ng ho
ng ho


c c
c c
á
á
c ph
c ph


c h
c h


p c
p c
ó

ó
tr
tr


ng lư
ng lư


ng phân t
ng phân t


l
l


n). C
n). C
ũ
ũ
ng c
ng c


n ch
n ch
ú
ú
ý l

ý l
à
à
n
n
ế
ế
u t
u t


l
l


A280/A260 th
A280/A260 th


p hơn
p hơn
0,6
0,6
ngh
ngh
ĩ
ĩ
a l
a l
à

à
dung d
dung d


ch protein
ch protein
chưa s
chưa s


ch, b
ch, b


l
l


n c
n c
á
á
c ch
c ch


t kh
t kh
á

á
c,
c,
đ
đ


c bi
c bi


t v
t v


i acid nucleic
i acid nucleic
th
th
ì
ì
nên s
nên s


d
d


ng phương ph

ng phương ph
á
á
p Lowry đ
p Lowry đ


đo n
đo n


ng đ
ng đ


protein.
protein.
15
15
Đ
Đ
á
á
nh gi
nh gi
á
á
t
t
í

í
nh đ
nh đ


ng th
ng th


c
c


a protein
a protein
Khi đã nh
Khi đã nh


n đư
n đư


c m
c m


t protein enzyme
t protein enzyme



tr
tr


ng th
ng th
á
á
i k
i k
ế
ế
t
t
tinh, n
tinh, n




i ta ph
i ta ph


i th
i th


l

l


i m
i m


c đ
c đ


tinh khi
tinh khi
ế
ế
t hay t
t hay t
í
í
nh
nh
đ
đ


ng th
ng th


c

c


a n
a n
ó
ó
.
.
Đ
Đ


đ
đ


ng th
ng th


c
c


a ch
a ch
ế
ế
ph

ph


m protein
m protein
enzyme ph
enzyme ph


i đư
i đư


c ki
c ki


m tra b
m tra b


ng m
ng m


t s
t s


phương ph

phương ph
á
á
p
p
d
d


a trên nh
a trên nh


ng nguyên lý kh
ng nguyên lý kh
á
á
c nhau. Trong m
c nhau. Trong m


t s
t s




trư
trư



ng h
ng h


p protein enzyme đư
p protein enzyme đư


c coi l
c coi l
à
à
đ
đ


ng th
ng th


khi ly
khi ly
tâm, n
tâm, n
hưng l
hưng l


i c

i c
ó
ó
th
th


phân chia th
phân chia th
à
à
nh m
nh m


t s
t s


isoenzyme
isoenzyme
b
b


ng phương ph
ng phương ph
á
á
p đi

p đi


n di trên gel. Ch
n di trên gel. Ch
í
í
nh v
nh v
ì
ì
v
v


y, n
y, n
ế
ế
u
u
d
d
ù
ù
ng nhi
ng nhi


u lo

u lo


i phương ph
i phương ph
á
á
p kh
p kh
á
á
c nhau đ
c nhau đ


ki
ki


m tra đ
m tra đ


s
s


ch c
ch c



a protein m
a protein m
à
à
k
k
ế
ế
t qu
t qu


đ
đ


u cho l
u cho l
à
à
đ
đ


ng th
ng th


th

th
ì
ì


protein đ
protein đ
ó
ó
c
c
ó
ó
th
th


đư
đư


c công nh
c công nh


n l
n l
à
à
tinh khi

tinh khi
ế
ế
t. Nh
t. Nh


ng
ng
phương ph
phương ph
á
á
p đ
p đ


ki
ki


m tra t
m tra t
í
í
nh đ
nh đ


ng th

ng th


hay d
hay d
ù
ù
ng l
ng l
à
à
xây
xây
d
d


ng đ
ng đ


th
th


v
v


đ

đ


ho
ho
à
à
tan
tan
,
,
đi
đi


n di v
n di v
à
à
siêu ly tâm.
siêu ly tâm.

×