Nghiên cứu phân lập và đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh ở thực vật

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ
NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT”

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ
NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT”

Người thực hiện

: Trần Thị Bảo Yến

Lớp

: K64CNSHB

Mã số sinh viên

: 640836

Người hướng dẫn

: TS. Đặng Thị Thanh Tâm

Bộ môn

: Công nghệ sinh học thực vật

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả và báo cáo được đề cập trong này là hoàn toàn trung thực và chưa được sử
dụng cơng bố trong các khóa luận, luận án và cơng trình nghiên cứu khoa học
trước đây.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn được sử dụng trong khóa
luận đều được ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày … tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Trần Thị Bảo Yến

i

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình hồn thành báo cáo này, ngồi sự nỗ lực cố gắng của bản
thân, tơi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên, tơi xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Thị Thanh Tâm ̶ Giảng viên
Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện
Nông nghiệp Việt Nam ̶ là người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến
thức quý giá trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tạo mọi điều
kiện về cơ sở vật chất và thiết bị giúp tơi có thể hồn thành tốt đề tài được giao.
Đồng thời, tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô tại
Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ,
truyền đạt những kiến thức quý giá cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại
học viện.
Cuối cùng tôi xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã hết lịng giúp đỡ,
động viên tơi trong q trình học tập cũng như hồn thành báo cáo này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày … tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Trần Thị Bảo Yến

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
TĨM TẮT ........................................................................................................... vii
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 4
2.1. Chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh ........................... 4
2.1.1. Giới thiệu về các lồi vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây
bệnh ................................................................................................................. 4
2.1.2. Khả năng ứng dụng của một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm
gây bệnh, hại và kích thích sinh trưởng cây trồng. ......................................... 6
2.2. Nấm gây bệnh................................................................................................. 8
2.2.1. Nấm Alternaria alternata ............................................................................ 8
2.2.2. Nấm Fusarium oxysporum .......................................................................... 9
2.2.3. Nấm Fusarium solani ................................................................................ 10
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 12
3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 12
3.1.1. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 12
3.1.2. Các chủng nấm gây bệnh thực vật ............................................................ 12
3.1.3. Mẫu đất ...................................................................................................... 14
3.1.4. Dụng cụ, hóa chất ...................................................................................... 15
3.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 15
iii


3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 15
3.3.1. Phương pháp phân lập ............................................................................... 15
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy nấm ....................................................................... 16

3.3.3. Phương pháp nhuộm Gram ....................................................................... 16
3.3.4. Phương pháp thử hoạt tính catalase .......................................................... 17
3.3.5. Phương pháp khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) ..... 18
3.3.6. Phương pháp sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính đối
kháng với nấm gây bệnh ............................................................................... 20
3.3.7. Trồng dâu tây ............................................................................................ 21
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 23
4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm ......... 23
4.2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính đối
kháng với nấm bệnh Alternaria alternata..................................................... 24
4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá đặc điểm hóa sinh của 15 chủng vi khuẩn tiềm
năng ............................................................................................................... 27
4.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Alternaria
alternata của các chủng vi khuẩn tiềm năng ................................................ 30
4.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium
oxysporum của các chủng vi khuẩn tiềm năng.............................................. 32
4.6. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium solani
của các chủng vi khuẩn tiềm năng ................................................................ 34
4.7. Thí nghiệm 7: Đánh giá ảnh hưởng của 3 chủng TV1.1, TV2.5, TV2.12
đến sự sinh trưởng trên cây dâu tây .............................................................. 38
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................. 41
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 41
5.2. Đề xuất ......................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm ..................................... 23

Bảng 4.2. Tóm tắt các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm đã qua sàng lọc ... 25
Bảng 4.3. Đặc điểm sinh hóa của 15 chủng vi khuẩn tiềm năng ........................ 27
Bảng 4.4. Sự sản sinh IAA của 15 chủng tiềm năng .......................................... 28
Bảng 4.5. Hoạt tính kháng nấm Alternaria alternata của các chủng vi khuẩn
tiềm năng (3-5-7 ngày)........................................................................ 31
Bảng 4.6. Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của các chủng vi
khuẩn tiềm năng (3-5-7 ngày) ............................................................. 33
Bảng 4.7. Hoạt tính kháng nấm Fusarium solani của các chủng vi khuẩn
tiềm năng (3-5-7 ngày)........................................................................ 35
Bảng 4.8. Khả năng ức chế và hàm lượng sản sinh IAA của 15 chủng tiềm năng ... 37
Bảng 4.9. Đặc điểm phát triển của cây dâu tây ................................................... 39

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Nấm Alternaria alternata .................................................................... 13
Hình 3.2. Nấm Fusarium oxysporum .................................................................. 13
Hình 3.3. Nấm Fusarium solani .......................................................................... 14
Hình 3.4. 6 mẫu đất ............................................................................................. 14
Hình 3.5. Phương pháp pha lỗng và cấy mẫu đất.............................................. 16
Hình 3.6. Các bước tiến hành nhuộm Gram ....................................................... 17
Hình 3.7. Thử nghiệm catalase............................................................................ 18
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn ............................................................................. 20
Hình 3.9. Hình ảnh bố trí thí nghiệm .................................................................. 21
Hình 4.1. Một số các đĩa xuất hiện các chủng có khả năng kháng bệnh ............ 24
Hình 4.2. Hình thiết kế thí nghiệm 2................................................................... 24
Hình 4.3. 15 chủng phân lập có khả năng kháng nấm Alternaria alternata sau
7 ngày ni cấy ................................................................................... 26
Hình 4.4. Kết quả nhuộm Gram của 15 chủng được soi qua kính hiển vi .......... 29

Hình 4.5. Kết quả của 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính catalase ......................... 29
Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc đơn của 15 chủng trên mơi trường NA............... 30
Hình 4.7. 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Alternaria
alternata sau 7 ngày ni cấy ............................................................. 32
Hình 4.8. 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Fusarium
oxysporum sau 7 ngày ni cây. ......................................................... 34
Hình 4.9. 15 chủng vi khuẩn sàng lọc có hoạt tính kháng nấm Fusarium
solani sau 7 ngày ni cấy .................................................................. 36
Hình 4.10. Cây dâu tây in vitro thích nghi ở vườn ươm một tháng tuổi ............ 38
Hình 4.11. Cây dâu tây sau khi bố trí thí nghiệm ............................................... 38

vi


TĨM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành với mục đích sàng lọc các chủng vi khuẩn
tiềm năng ức chế nấm gây bệnh ở thực vật và đánh giá đặc điểm hình thái, hóa
sinh của các chủng phân lập được.
Từ 6 mẫu đất ở 3 tỉnh thành (Hà Nội, Thái Bình, Phú n), chúng tơi phân
lập được 43 chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm bệnh trên thực vật. Các
chủng này được đánh giá khả năng ức chế nấm trên nấm mục tiêu Alternaria
alternata. Từ đó, chúng tơi đánh giá được 15 chủng có khả năng đối kháng mạnh
nhất được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và đánh giá hình thái, đặc điểm hóa
sinh (nhuộm Gram, thử nghiệm catalase và khả năng sản sinh IAA).
Để đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh của các chủng vi khuẩn tiềm
năng, các chủng này được đồng nuôi cấy lần lượt đối với các nấm Alternaria
alternata, Fusarium oxysporum và Fusarium solani trên môi trường PDA, SDA
và theo dõi ở các thời điểm thời gian khác nhau. Kết quả của thí nghiệm, chúng
tơi đã lựa chọn được một số chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ. Đối với
nấm Alternaria alternata, chúng tôi chọn được 5 chủng có hoạt tính ức chế nấm

cao nhất TV1.1 (68,08%), TV2.12 (67,27%), TV2.5 (66,39%), H2 (64,12%),
TV2.1(63,29%) Các chủng vi khuẩn ức chế nấm Fusarium oxysporum mạnh
nhất là TV2.5 (59,34%), H2 (56,47%), TV1.1 (54,40%), TV2.12 (51,78%), H1
(49,98%). Nấm Fusarium solani có các chủng ức chế tỷ lệ cao là TV2.5
(65,99%), TV2.12 (63,41%), H2 (59,96%), TV1.1 (57,98%), TV2.1 (57,16%).
Trong số các chủng trên, xác định được các chủng có hoạt tính ức chế ba
nấm Alternaria alternata, Fusarium oxysporum và Fusarium solani là TV1.1,
TV2.5, TV2.12 và H2. Bốn chủng này có hàm lượng sản sinh IAA lần lượt là
13,32µg/mL, 11,67 µg/mL, 17,17 µg/mL, 2,57 µg/mL. Các chủng TV1.1, TV2.5,
TV2.12 có hàm lượng sản sinh IAA cao nên được chọn là nguồn vật liệu quan
trọng để tiếp tục đánh giá. Ngoài ra, chủng H2 cũng là một trong số các chủng có

vii


khả năng kháng nấm cao nhưng hàm lượng sảnh sinh IAA thấp (2,57 µg/mL)
nên khơng được chọn lọc.

viii


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, ngành nông nghiệp Việt Nam đang được đánh giá là một trong
những ngành kinh tế quan trọng, có nhiều những thành tựu và bước tiến mới
trong các lĩnh vực nuôi trồng. Đặc biệt, năm 2018 Việt Nam đã đứng vị trí thứ 7
trên thế giới và đã trở thành một cường quốc về xuất khẩu rau quả. Ngồi ra cịn
là nước có tốc độ xuất khẩu tăng nhanh thứ 2 thế giới sau Mehico (danviet.vn).
Để đạt được những thành tựu trên không hề dễ dàng vì đó là cả q trình mà
Việt Nam đang từng bước xây dựng. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới ẩm

gió mùa nên rất thuận lợi cho sự phát triển của nhiều các loài thực vật nên hệ
sinh thái của Việt Nam vô cùng phong phú. Nhưng đó cũng là lý do tạo điều
kiện cho các tác nhân gây bệnh trên thực vật cũng rất phát triển. Tác nhân gây
bệnh cho thực vật gồm 3 nhóm chính là nấm, vi khuẩn và virus. Những tác nhân
này sẽ gây ra các bệnh như đốm lá, thối cành, thối quả… ảnh hưởng trực tiếp
đến năng suất cây trồng và cịn có thể lây bệnh cho các cây khác hay mùa vụ sau
rất nhanh chóng (vbio.vn). Đặc biệt nấm gây bệnh cho thực vật ở Việt Nam còn
rất phổ biến mặc dù đã có nhiều biện pháp nhưng chưa đạt hiệu quả tối đa.
Trong đó, nấm gây bệnh trên thực vật phổ biến là các nấm Alternaria alternata,
Fusarium oxysporum và Fusarium solani gây ra.
Nấm Alternaria alternata gây ra nhiều loại bệnh ảnh hưởng tới cây trồng.
Trong đó, phổ biến nhất là một số bệnh đốm nâu ở lá, bệnh mốc đen trên quả cà
chua, bệnh thối ngọn cành trên cây thanh long,… Đặc điểm nhận biết cây khi bị
bệnh do nấm Alternaria alternata gây ra trên quả hoặc lá cây là những đốm trịn
có màu nâu đỏ hoặc đen với kích thước từ 1-3mm. Cây bị bệnh do nấm
Alternaria alternata có thể bị chết ở giai đoạn cây con, khi lớn bị rụng
lá và thối quả, gây thiệt hại từ 35 ̶ 80% sản lượng (Bessadat & cs.,
2016). Loại nấm này chủ yếu tồn tại trong tàn dư của những cây bị bệnh trong
mùa vụ trước và trên mặt đất.

1


Để kiểm soát các bệnh do nấm Alternaria alternata gây ra, điều quan
trọng là phải cải thiện các kỹ thuật hiện tại để xác định loài này
(Rosalbatroncoso-Rojas & Ernestotiznado-Hernández, 2014). Hiện nay, biện
pháp phòng trị bệnh do nấm Alternaria alternata chủ yếu là sử dụng các thuốc
hóa học nhưng chưa mang lại hiệu quả cao vì thuốc khơng thể thấm sâu xuống
đất và sử dụng các thuốc hóa học có thể gây hình thành các chủng vi sinh kháng
thuốc, cũng như gây ơ nhiễm mơi trường và an tồn vệ sinh thực phẩm. Vì thế

nên cần có những nghiên cứu về việc ức chế nấm Alternaria alternata bằng các
phương pháp sinh học bảo vệ mơi trường. Do đó, việc nghiên cứu chọn lựa
những chủng vi khuẩn Bacillus sp., Pseudomonas sp. từ đất có khả năng ức chế
nấm Alternaria alternata và kháng đa nấm là cần thiết và phù hợp với xu hướng
nơng nghiệp bền vững.
Ngồi ra, một số vi khuẩn có các chất kích thích sinh trưởng thực vật
chẳng hạn như khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA), naphthaleneacetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA), Siderophore, Gibberellin và
Cytokinin (Glick, 2012). Kết quả thực nghiệm các nghiên cứu về các chất đối
kháng vi sinh vật chống lại mầm bệnh nấm thực vật đang có triển vọng. Chính vì
vậy, chúng tơi tiếp cận hướng nghiên cứu này và lựa chọn đề tài “Nghiên cứu
phân lập và đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh
ở thực vật”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phân lập và đánh giá đặc điểm của một số chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt
tính đối kháng nấm Alternaria alternata và kháng đa nấm gây bệnh ở thực vật.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được một số chủng vi khuẩn tiềm năng có khả năng ức chế nấm
từ 6 mẫu đất khác nhau.

2


- Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính đối kháng với nấm
Alternaria alternata gây bệnh ở thực vật.
- Đánh giá đặc điểm sinh hóa và khả năng ức chế sự phát triển hệ sợi nấm
của các chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính đối kháng với các nấm bệnh gây
bệnh (Alternaria alternata, Fusarium oxysporum và Fusarium solani).
- Đánh giá ảnh hưởng của 3 chủng TV1.1, TV2.5, TV2.12 đến sinh
trưởng của cây dâu tây.

3


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh
2.1.1. Giới thiệu về các lồi vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây
bệnh
2.1.1.1. Bacillus sp.
Bacillus sp. là một chi vi khuẩn, tế bào có hình que (trực khuẩn), Gram
dương, ưa khí khơng bắt buộc và thuộc họ Bacillaceae trong ngành Firmicutes.
Vi khuẩn có kích thước 0,5-2,5 µm x 1,2-10 µm và đa số chúng đều dương tính
với hoạt tính catalase (Holt & cs., 1994).
Giới (Domain)

Bacteria

Ngành (Phylum)

Firmicutes

Lớp (Class)

Bacilli

Bộ (Order)

Bacillales

Họ (Family)

Bacillaceae

Chi ( Genus)

Bacillus

(Nguồn: vi.wikipedia.org)
Bacillus sp. chỉ là chung loài Bacillus (chữ "sp" là viết tắt của "species"nghĩa là loài). Một số loài phổ biến thuộc chi Baciilus bao gồm Bacillus
thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenformis…
* Vai trò của vi khuẩn Bacillus sp.
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn hiếu khí, sống trong đất. Nó được sử
dụng chế tạo thuốc trừ sâu và mang lại hiệu quả cao. Trong quá trình sinh
trưởng, một loại protein được gọi là delta-endotoxin hoặc Cry protein được
chúng sinh ra và các protein này có đặc tính diệt cơn trùng mạnh mẽ
(Niederhuber, 2015).

4


Bacillus subtilis thường được tìm thấy trong cỏ, rơm rạ và đất trồng.
Chủng này mang lại nhiều lợi ích trong nông nghiệp như: cải tạo đất, ủ phân hữu
cơ, sản xuất phân bón vi sinh, kiểm sốt nấm gây hại (Hashem & cs., 2019).
Bacillus amyloliquefaciens là một loại vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối
kháng trong phịng trừ sâu bệnh hại. Chúng giúp cây trồng tăng khả năng chống
chịu mặn, hạn hán hay mơi trường nhiệt độ thấp, có khả năng kháng nấm, virus
hay vi khuẩn. Ngồi ra cịn có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật
(Chowdhury & cs., 2015).
Bacillus lichenformis cũng là một trong số các vi khuẩn có khả năng đề
kháng bệnh cho cây trước các tác nhân mơi trường mặn, kiềm, hạn hán… Ngồi

ra, chủng tiết hoocmone kích thích sinh trưởng thực vật, giúp tăng đề kháng và
tăng năng suất cây trồng (Akhtar & cs., 2020).
2.1.1.2. Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp. là một chi vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi
trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể
sống ở nhiều mơi trường khác nhau như đất, nước, trên thực vật và trong các
động vật. Chúng thuộc họ Pseudomonadaceae trong ngành Proteobacteria, có
khả năng hơ hấp hiếu khí hay kỵ khí và phát triển thuận lợi ở 30-37ºC (Ngô
Thanh Phong, 2012).
Giới (Domain)

Bacteria

Ngành (Phylum)

Proteobacteria

Lớp (Class)

Gammaproteobacteria

Bộ (Order)

Pseudomonadales

Họ (Family)

Pseudomonadaceae

Chi ( Genus)

Pseudomonas

(Nguồn: vi.wikipedia.org)
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di động nhờ roi ở đầu và khơng có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị
5


dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định
nitrogen (Holt & cs., 1994).
Trong số những chi thuộc Pseudomonas sp., một số chi tiêu biểu được
ứng dụng trong công nghệ sinh học là Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas chlororaphis, …
* Vai trò của vi khuẩn Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp. trong nông nghiệp được coi là các tác nhân sinh học
tiềm năng trong việc kháng các nấm gây bệnh. Bên cạnh đó, nó cịn có khả năng
cố định đạm, phân hủy hay chuyển hóa các chất độc hay tàn dư thuốc bảo vệ
thực vật có trong đất trồng (Ngô Thanh Phong, 2012).
2.1.2. Khả năng ứng dụng của một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế
nấm gây bệnh, hại và kích thích sinh trưởng cây trồng.
2.1.2.1. Bacillus sp.
Việc sử dụng chủng Bacillus sp. để tiết ra kháng sinh tiêu diệt hoặc gây
ức chế tác động tới các loại vi sinh vật gây bệnh, gây hại khác đang là hướng đi
mới được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một số nghiên cứu được thực hiện để
chứng minh về lợi ích của chúng trong việc ức chế các sinh vật gây bệnh, gây
hại ảnh hưởng đến thực vật.
Basurto-Cadena và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thành công một đề tài về
việc phân lập chủng Bacillus subtilis của Mexico có khả năng kháng nấm và kháng
khuẩn.

Năm 2020, Trần Thùy Trang và cộng sự đã nghiên cứu vi khuẩn Bacillus
subtilis có hiệu quả kháng nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên
ớt (Trần Thùy Trang & cs., 2020). Bên cạnh đó, Nguyễn Bá Thọ và cộng sự
(2020) cũng đã nghiên cứu thành cơng và góp phần cung cấp thêm thơng tin về
sử dụng vi khuẩn các chủng Bacillus sp. có khả năng đối kháng trong phịng
chống nấm Colletotrichum gây bệnh khơ cành khô quả cây cà phê. (Nguyễn Bá
Thọ & cs., 2020).

6


2.1.2.2. Pseudomonas sp.
Có rất nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng Pseudomonas sp.
có khả năng kháng các nấm bệnh trên cây trồng. Năm 1991, Lim và cộng sự
nghiên cứu thành công Pseudomonas stutzeri YPL-1 được phân lập từ rễ nhân
sâm có hoạt tính ức chế nấm Fusarium solani bằng cách tạo ra các enzyme
ngoại bào (Lim & cs., 1991).
Chủng Pseudomonas aeruginosa có khả năng đối kháng nấm Candila sp.
gây bệnh bằng các phương pháp thử nghiệm đối kháng khác nhau nhưng đều
cho kết quả ức chế được nấm gây bệnh (Xu & cs., 2014).
Bên cạnh đó, Pour và cộng sự (2019) đã nghiên cứu thành công hai chủng
Pseudomonas fluorescens (VUPF5 và T17-4) đã được sử dụng cho hạt
nanocompozit alginate-gelatin với nồng độ gelatin 1,5% trong hai điều kiện in
vitro và in vivo. Thí nghiệm của họ cho thấy việc cấy khoai tây với các chủng vi
khuẩn và hạt nanocompozit của các chủng này làm giảm tỷ lệ mắc bệnh nấm
Fusarium solani (Pour & cs, 2019).
Ngoài ra, nghiên cứu của Trương Chí Hiền & Lê Thanh Tồn (2020) đã
đánh giá thành cơng chủng Pseudomonas mosselii có hoạt tính kháng nấm
Fusarium solani là 65,76% và nấm Colletotrichum gloeosporioides là 42,76%
(Trương Chí Hiền & Lê Thanh Tồn, 2020).

7


2.2. Nấm gây bệnh
2.2.1. Nấm Alternaria alternata
2.2.1.1. Giới thiệu về nấm Alternaria alternata
Giới (Kingdom)

Nấm (Fungi)

Ngành (Phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Dothideomycetes

Bộ (Order)

Pleosporales

Họ (Family)

Pleosporaceae

Chi ( Genus)

Alternaria

Lồi (Species)

A. alternaria

(Nguồn: vi.wikipedia.org)
Nấm Alternaria alternata có màu tối khác nhau, từ xám, ơ liu đến nâu ơ liu.
Chúng có sợi nấm màu sẫm chia theo vách ngăn và hình thành các bào tử tự hoại.
Các bào tử có màu nâu trung bình với mỏ ngắn, hình trụ (Solutions, 2021).
Chúng thuộc họ Pleosporaceae, chi Alternaria bao gồm hơn 270 loài
hyphomycetes dematiaceous. Các bào tử Alternaria alternata lây lan rộng rãi
vào những ngày khơ, ấm và có gió. Và thường đạt đỉnh trong mùa hè và đầu
mùa thu, chúng còn thường được tìm thấy trong đất (Solutions, 2021).
Sự phát triển của sợi nấm Alternaria alternata bị ức chế ở nhiệt độ 35ºC,
trong khi nhiệt độ 25ºC khá thích hợp cho sự phát triển của chúng. Nhiệt độ
30ºC là thuận lợi cho sự phát triển của Alternaria alternata. Trong điều kiện pH
khác nhau, sự phát triển của nấm Alternaria alternata hầu hết bị ức chế cực đại
ở pH4. Hơn nữa, kết quả thử nghiệm độ mặn cho thấy Alternaria alternata
không bị ảnh hưởng nhiều bởi các nồng độ muối được thử nghiệm. Trong khi
đó, việc kiểm tra vi khuẩn đối kháng trong ống nghiệm cho kết quả là cả EC120
và EC121 đều có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của loại nấm được
khảo sát (Trung & cs., 2021).

8


Nấm Alternaria alterta là một mầm bệnh phổ biến trên nhiều loại cây
quan trọng về kinh tế, bao gồm ngũ cốc, cải dầu, táo, bông cải xanh, súp lơ,
khoai tây, cà chua, trái cây họ cam quýt, lê, dâu tây và thuốc lá. Trong những
năm gần đây, Alternaria alternata được báo cáo là tác nhân gây bệnh cháy lá

của cây hướng dương và rau mùi ở Nam Phi, bệnh đốm nâu trên cây gang
(Aspidistra elatior) ở Ý, bệnh thối trái sau thu hoạch của đào ở Pakistan, đốm lá
Hibiscus syriacus ở Ý, đốm lá Abelmoschus esculentus và đốm nâu trên quýt ở
Tây Ban Nha (Wachowska & cs., 2021).
Nấm Alternaria alternata gây ra các tổn thương nhỏ hình trịn hay hình
dạng khơng đều và lan ra tồn bộ lá. Thoạt đầu, các tổn thương ấy có biểu hiện
úa vàng và sũng nước làm giảm bề mặt sinh hoạt. Về sau, chúng lan rộng và có
biểu hiện hiện hoại tử và ảnh hưởng đến các gân lá liền kề. Các vết tổn thương
sẽ nhanh chóng khơ lại và phân rã khiến lá trơng xơ xác và gãy rụng.
2.2.1.2. Các nghiên cứu phịng trừ nấm Aternaria alternata
Năm 2007, Feng và Zheng đã tiến hành nghiên cứu năm loại tinh dầu
(húng tây, cây xô thơm, hạt nhục đậu khấu, eucaptus và cassia) có tác dụng ức
chế, chống lại Alternaria alternata ở các nồng độ khác nhau (100–500 ppm)
trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy, dầu cassia và dầu húng tây đều thể hiện
hoạt tính kháng nấm chống lại Alternaria alternata. Dầu cassia ức chế hoàn toàn
sự phát triển của Alternaria alternata ở 300–500 ppm. Dầu húng tây có mức độ
ức chế thấp hơn 62% ở mức 500 ppm (Feng & Zheng, 2007).
2.2.2. Nấm Fusarium oxysporum
2.2.2.1. Giới thiệu về nấm Fusarium oxysporum
Nấm Fusarium oxysporum là một lồi nấm gây nhiều bệnh phổ biến trong
nơng nghiệp. Các bệnh mà nấm gây ra trên thân và rễ của các cây trồng như
bệnh héo vàng trên chuối, bệnh héo rũ trên cây cà chua, cây ớt…

9


Giới (Kingdom)

Fungi

Ngành (Phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Ascomycetes

Bộ (Order)

Hypocreales

Họ (Family)

Nectriaceae

Chi ( Genus)

Fusarium

Loài (Species)

F. oxysporum

(Nguồn: vi.wikipedia.org)
Trong phịng thí nghiệm, nấm Fusarium oxysporum được ni cấy và
phát triển nhanh trên môi trường PDA ở nhiệt độ 26ºC. Nấm phát triển theo
dạng hình sao có màu đỏ hoặc tím củ dền. Các hệ sợi nấm có màu trong suốt
hoặc trắng tuyết.
2.2.2.2. Các nghiên cứu phòng trừ nấm Fusarium oxysporum

Theo Venkataramanamma và cộng sự (2022), đã tiến hành phân lập thành
cơng 4 chủng Bacillus cereus có hoạt tính kháng nấm cao Fusarium oxysporum.
Tỷ lệ kháng nấm của các chủng trong nghiên cứu này dao động từ 52,89 ̶
74,36% (Venkataramanamma & cs., 2022).
Nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế nấm Fusarium oxysporum trong
điều kiện in vitro của 12 loại tinh dầu thực vật ở dạng nano (EO-LNs). Kết quả
cho thấy, naTS hiệu quả kháng nấm tốt nhất trong điều kiện in vitro với hiệu quả
ức chế nấm Fusarium oxysporum đạt 88,14% ở độ pha loãng 500 lần. (Nguyễn
Minh Hiệp & Trần Thị Ngọc Mai, 2022).
2.2.3. Nấm Fusarium solani
2.2.3.1. Giới thiệu về nấm Fusarium solani
Nấm Furasium solani gây ra bệnh thối rễ trên cây kí chủ như khoai lang,
cà tím, cà chua, ớt… Chúng có các bào tử sợi nấm màu trắng giống những sợi
bông, các hệ sợi nấm phân nhánh và có hình thành vách ngăn.

10


Giới (Kingdom)

Fungi

Ngành (Phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Ascomycetes

Bộ (Order)

Hypocreales

Họ (Family)

Nectriaceae

Chi ( Genus)

Fusarium

Loài (Species)

F. sonali

(Nguồn: vi.wikipedia.org)
Nấm phát triển tốt ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới và ơn
hịa. Khi được ni cấy trong phịng thí nghiệm, nấm phát triển nhanh ở 26ºC và
thích hợp trên mơi trường PDA (Nguyễn Trường Sơn & Lê Minh Tường, 2020).
2.2.3.2. Các nghiên cứu phòng trừ nấm Fusarium solani
Trương Chí Hiền và Lê Thanh Tồn (2020), nghiên cứu của họ cho kết
quả trong 56 chủng phân lập được có 9 dịng Pseudomonas có hoạt tính kháng
nấm Fusarium solani dao động từ 28,34 ̶ 54,88% trong điều kiện in vitro
(Trương Chí Hiền & Lê Thanh Tồn, 2020).
Bên cạnh đó, nghiên cứu của Báez-Vallejo và cộng sự, (2020) cho thấy
chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sợi nấm Fusarium solani là Bacillus sp.
(CCeRi1-002) 62,5 % (Báez-Vallejo & cs., 2020).
Năm 1991, Lim và cộng sự đã nghiên cứu thành công Pseudomonas
stutzeri YPL-1 được phân lập từ rễ nhân sâm có hoạt tính ức chế nấm Fusarium

solani bằng cách tạo ra các enzyme ngoại bào (Lim & cs., 1991).
Pour và cộng sự (2019), hai chủng Pseudomonas fluorescens (VUPF5 và
T17-4) đã được sử dụng cho hạt nanocompozit alginate-gelatin với nồng độ
gelatin 1,5% trong hai điều kiện in vitro và in vivo. Thí nghiệm của họ cho thấy
việc cấy khoai tây với các chủng vi khuẩn và hạt nanocompozit của các chủng
này làm giảm tỷ lệ mắc bệnh nấm Fusarium solani (Pour & cs., 2019).

11


PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
3.1.1. Môi trường nuôi cấy
Để phân lập, sàng lọc và đánh giá khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn
chúng tôi sử dụng một số loại môi trường: NA, PDA, SDA, LB.
➢ Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): Potato Dextrose Agar - 39g,
Nước -1L, pH = 7.
➢ Môi trường NA (Nutrient Agar): Peptone - 5g, Beef Extract - 63g,
Sodium Chloride - 5g, Agar - 20g, nước - 1L, pH = 7.
➢ Môi trường LB (Luria Bertani): Tryptone - 10g, Yeast Extract - 5g,
Sodium Chloride - 10g, Nước - 1L, Agar - 15g, pH = 7.
➢ Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose Agar): Agar - 20g, Sabourand
Dextrose Broth - 30g, Nước - 1L, pH=7.
➢ Môi trường thạch nước: Agar - 20g, Nước - 1L, pH=7.
➢ Môi trường LB + L-trytophan: Tryptone - 10g, Yeast Extract - 5g, Sodium
Chloride - 10g, Nước - 1L, Agar - 15g, L-Trytophan (100 mg/L), pH = 7.
3.1.2. Các chủng nấm gây bệnh thực vật
Để sàng lọc vi khuẩn kháng nấm bệnh thực vật, chúng tôi sử dụng nấm
gây bệnh Alternaria alternata. Và để đánh giá hoạt tính kháng nấm của một số
chủng tiềm năng, chúng tôi tiếp tục tiến hành đối kháng các chủng vi khuẩn tiềm

năng với 3 chủng nấm Alternaria alternata, Fusarium oxysporum và Fusarium
solani (được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Khoa Công
nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam). Các mầm bệnh nấm được
nuôi cấy trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) ở nhiệt độ phịng trong
bóng tối.

12


Nấm Alternaria alternata được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
30ºC và khơng có ánh sáng trong phịng thí nghiệm.

Hình 3.1. Nấm Alternaria alternata
Nấm Fusarium oxysporum được ni cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
30ºC và không có ánh sáng trong phịng thí nghiệm.

Hình 3.2. Nấm Fusarium oxysporum

13


Nấm Fusarium solani được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
30ºC và khơng có ánh sáng trong phịng thí nghiệm.

Hình 3.3. Nấm Fusarium solani
3.1.3. Mẫu đất
Các mẫu đất được thu thập từ 3 tỉnh thành khác nhau: Thái Bình, Hà Nội,
Phú Yên.

Hình 3.4. 6 mẫu đất

14


3.1.4. Dụng cụ, hóa chất
•

Dụng cụ

+ Bình Duran, bình tam giác (Erlenmeyer) 250ml, pipet, ống eppendorf,
ống ly tâm, rây lọc, đĩa Petri, que cấy, đầu côn.
+ Máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ nuôi cấy, máy hấp khử trùng hơi nước...
•

Hóa chất:

+ Nước cất
+ Dung dịch nước muối sinh lý vơ trùng (NaCl-0,85%)
+ Glycerol, Fuschine, Lugol, thuốc Gentian tím
+ Thuốc thử Salkowski, bột IAA
+ H2O2
•

Phần mềm phân tích dữ liệu

+ Image J
+ GraphPad Prism
+ Excel
3.2. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật,

Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp phân lập
Chúng tơi sử dụng phương pháp Fcna (2014) để pha lỗng các mẫu đất
cần nghiên cứu. Đầu tiên, rây đất qua sàng có kích thước 2mm và cân mỗi mẫu
được 1g đất. Cho 1g đất đã được xử lý vào 90ml dung dịch nước muối sinh lý đã
hấp khử trùng (NaCl-0,85%) trong bình tam giác 250ml và lắc đều trong 2 phút.
Tiếp theo pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau, dùng pipet vơ trùng hút
1000µl dung dịch trên cho vào bình tam giác có chứa 9ml NaCl (0,85%) được
dung dịch pha lỗng có nồng độ 10-3. Tương tự, hút 1000µl từ dung dịch có

15