Nghiên cứu phân lập và đánh giá đặc điểm của một số chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với nấm fusarium solani

ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM
FUSARIUM SOLANI

Hà Nội, tháng 2 năm 2023


ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHỦ ĐỀ: “: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM
FUSARIUM SOLANI”

Tên sinh viên

: Phạm Ngọc Anh

Mã sinh viên

: 637201

Lớp

: K63CNSHC

Giảng viên hướng

: TS Đặng Thị Thanh Tâm

dẫn
khoa

: Công nghệ sinh học

Thời gian thực hiện

: 07/2022 – 2/2022

Hà Nội – 22/2/2023


CAM KẾT
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả và
báo cáo nêu ở đây là trung thực và chưa được sử dụng để công bố trong các luận
văn, luận án và cơng trình nghiên cứu khoa học trước đây.
Tơi xin cam đoan các thơng tin trích dẫn sử dụng trong luận văn đều được ghi
rõ nguồn gốc, đảm bảo việc trích dẫn đúng theo quy định.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời hứa này!
Hà Nội, tháng2 năm 2023

Phạm Ngọc Anh
0

2


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình hồn thành báo cáo này, ngồi sự nỗ lực cố gắng của bản thân,
tơi cịn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên, tơi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Đặng Thị Thanh Tâm - Giảng
viên Bộ môn Thực vật học, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông
nghiệp Việt Nam - người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức
quý báu. Trong thời gian hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo mọi điều kiện về
cơ sở vật chất, trang thiết bị giúp tơi hồn thành đề tài được giao.
Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo tại Khoa
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giúp
đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lịng giúp đỡ, động viên tơi
trong q trình học tập và hồn thành bài báo cáo này.
Hà Nội, tháng2 năm 2023

Phạm Ngọc Anh

3


TÓM TẮT
Từ 02 mẫu đất thu tập ở TP Tuyên Quang, chúng tôi đã sàng lọc ra được 30
chủng vi khuẩn có khả năng ức chế được nấm trên đĩa sàng lọc(NA). Các chủng
vi khuẩn này được đánh giá sơ bộ với nấm Fusarium solani,chọn ra các chủng
có khả năng ức chế mạnh với nấm bệnh. Kết quả chọn được 8 chủng tiềm năng.
Đồng thời, xác định đặc điểm, hình thái, phân tử, hóa sinh,… Từ 8 chủng được

chọn tiếp tục so sánh và đánh giá hoạt tính kháng nấm với nấm Fusarium solani
trong 3,5,7 ngày. Tiếp tục, đánh giá hoạt tính kháng nấm với các nấm khác
Fusarium oxysporum và Altermaria alternata trong 3,5,7 ngày. Kết quả thu
được, các chủng vi khuẩn K2, K3, M1 có hoạt tính kháng nấm mạnh với
Fusarium solani. Các chủng vi khuẩn K1, K3, M1 có hoạt tính kháng nấm mạnh
với Fusarium oxysporum và các chủng có khả năng kháng nấm mạnh với
Altermaria alternata là K1, K2, M1. Tám chủng tiềm năng được tuyển trọn có
hoạt tính IAA, castalase, gram. Kết luận, đây là nguồn nguyên liệu có giá trị
trong các nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành các chế phẩm sinh học.

4


MỤC LỤC
CAM KẾT ............................................................................................................. 2
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... 3
TÓM TẮT ............................................................................................................. 4
MỤC LỤC............................................................................................................. 5
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. 8
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. 9
PHẦN 1: MỞ ĐẦU............................................................................................. 11
1.1.

GIỚI THIỆU ....................................................................................... 11

1.2.

MỤC ĐÍCH ......................................................................................... 12

1.3.

YÊU CẦU ........................................................................................... 12

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 13
2.1 Các nấm gây bệnh phổ biến ở cây trồng ................................................. 13
2.1.1 Nấm Fusarium solani ..................................................................... 13
2.1.2 Nấm Fusarium oxysporum.............................................................. 14
2.1.3 Nấm Alternaria alternata ............................................................... 14
2.1.4 Khả năng gây bệnh.......................................................................... 15
2.1.5 Kiểm soát bệnh Fusarium ............................................................... 16
2.1.6 Các nghiên cứu khả năng ức chế Fusarium solani trong in vitro,
đồng ruộng .................................................................................................. 19
2.2 Một số chủng vi khuẩn phổ biến có khả năng kháng nấm gây bệnh ...... 19
2.2.1 Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh ..... 19
2.2.2 Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium
solani 21
5


PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 21
3.1.

Vật liệu ................................................................................................ 21

3.1.1 Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu .................... 21
3.1.2 Nấm bệnh ........................................................................................ 22
3.1.3 Mẫu đất ........................................................................................... 24
3.1.4 Dụng cụ, hóa chất ........................................................................... 24
3.2 Phương pháp ....................................................................................... 24
3.2.1 Phương pháp pha loãng................................................................... 24

3.2.2 Nhuộm gram ................................................................................... 25
3.2.3 Thí nghiệm catalase ........................................................................ 26
3.2.4 Xác địch khả năng tổng hợp Inol – 3 – axit axetic (IAA) .............. 27
3.2.5 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính đối kháng với
nấm gây bệnh .............................................................................................. 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 30
4.1 Kết quả .................................................................................................... 30
4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
30
4.1.2 kháng với nấm bệnh ........................................................................ 32
4.1.3 Thí nghiệm 3 : Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng tiềm
năng với nấm Fusarium solani .................................................................... 34
4.1.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hoạt tính của các chủng tiềm năng với nấm
Fusarium oxysporum .................................................................................. 37
4.1.5 Thí nghiệm 5: Đánh giá hoạt tính của các chủng tiềm năng với nấm
Alternaria alternata .................................................................................... 39
4.1.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu tác động của dịch khuẩn đến khả năng
kích thích sinh trưởng của cây cà chua ....................................................... 41
4.2 Thảo luận................................................................................................. 43

6


Phần 5. Kết luận và đề xuất ................................................................................ 43
5.1 Kết luận ................................................................................................... 43
5.2 Đề xuất .................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 45

7

DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1 Các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm được phân lập .............. 31
Bảng 4.2 Đặc điểm của các chủng vi khuẩn tiềm năng ...................................... 32
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm
Fusarium solani sau (3, 5, 7 ngày) nuôi cấy. ...................................................... 34
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm
Fusarium oxysporum sau (3, 5, 7 ngày) nuôi cấy. .............................................. 37
Bảng 4. 5 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm
Alternaria alternata sau (3, 5, 7 ngày) nuôi cấy .................................................. 39
Bảng 4. 6 Đánh giá sinh trưởng của cây con cà chua sau xử lý dịch khuẩn....... 42

8


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Các triệu chứng của bệnh thối rễ, vàng lá do nấm fusarium solani gây
ra .......................................................................................................................... 15
Hình 2.2 Một số chế phẩm sinh học được ứng dụng từ chủng trực khuẩn có khả
năng kháng nấm .................................................................................................. 18

Hình 3.1 Fusarium oxysporum ........................................................................... 22
Hình 3.2 Fusarium solani .................................................................................... 23
Hình 3.3 Alternaria alternata............................................................................... 23
Hình 3.4 Hai mẫu đất ở Tuyên quang ................................................................. 24
Hình 3.5 Pha lỗng và cấy mẫu đất..................................................................... 25
Hình 3.6 Các bước nhuộm Gram ........................................................................ 26
Hình 3.7 Thí nghiệm Catalase ............................................................................ 27
Hình 3.8 Đường chuẩn ........................................................................................ 29
Hình 3.9 Hình ảnh thiết kế thí nghiệm................................................................ 30

Hình 4. 1 Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm với nấm
Fusarium solani ................................................................................................... 31
Hình 4.2 Hoạt tính đối kháng của các chủng sàng lọc Fusarium solani ............. 33
Hình 4.3 Thử nghiệm Catalase của 8 chủng vi khuẩn tiềm năng ....................... 33
Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc của 8 chủng phân lập tiềm năng có hoạt tính
kháng nấm gây bệnh ........................................................................................... 33
Hình 4.5 Tám chủng phân lập có hoạt tính kháng nấm Fusarium solani mạnh
nhất ...................................................................................................................... 36
Hình 4. 6 Tám chủng phân lập có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum
mạnh nhất ............................................................................................................ 38
Hình 4. 7 Tám chủng phân lập cho thấy hoạt tính kháng nấm mạnh nhất đối với
Alternaria alternata .............................................................................................. 40
9


Hình 4. 8 Hạt cà chùa trước và sau khi nảy mầm ............................................... 41
Hình 4. 9 Cây cà chua sau 16 ngày ..................................................................... 42

10


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1.

GIỚI THIỆU

Cây thường bị các bệnh do nấm, vi khuẩn, sinh vật nguyên sinh, tuyến trùng
và vi rút gây ra. Các mầm bệnh thực vật được các nhà khoa học quan tâm vì
một số lý do, từ lo ngại về hệ sinh thái mỏng manh đến mong muốn bảo vệ

nguồn cung cấp thực phẩm. Mầm bệnh thực vật gây bệnh cho cây trồng làm
giảm khả năng sản xuất cây trồng của người trồng trọt và có thể lây nhiễm cho
hầu hết các loại cây trồng. Mầm bệnh thực vật gây bệnh cho cây trồng và gây
thiệt hại về lương thực và các vật dụng cần thiết khác. Tổn thất có thể nhẹ hoặc
rất nghiêm trọng, đơi khi phá hủy toàn bộ thực vật và gây ra nạn đói, chết đói và
nạn đói. Một số bệnh hại cây trồng phổ biến như: Đốm đen, đốm lá khác, phấn
trắng, sương mai, bạc lá… Ở Việt Nam, bệnh hại cây trồng do nấm rất phổ biến
và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nơng nghiệp và kinh tế. Một trong số đó là
bệnh hại cây trồng do Fusarium oxysporum, Fusarium solani và Alternaria
alternata gây ra.
Thối rễ và vàng lá là một loại bệnh xuất hiện nhiều trên cây có múi. Bệnh
đặc trưng bởi các vết bệnh hình trịn với các vịng đồng tâm màu nâu sẫm và
nâu nhạt cùng với các lỗ sâu ở phần bên trong của rễ (Yang và cs., 2018), biểu
hiện ở một số lá có gân trở màu trắng, phiến lá màu vàng cam và dễ rụng, cây
sinh trưởng yếu. Khi nặng hơn xuất hiện nhiều cành bị khô héo, trái rụng, tất cả
các rễ bị thối đen. Bệnh vàng lá, thối rễ gây ra bởi nhiều tác nhân gây bệnh, chủ
yếu là các chủng nấm Fusarium, Alternaria và Phytopythium spp. (Jahén-Rivera
và cs., 2020).
Để hạn chế bệnh một trong những biện pháp hữu hiệu nhất là sử dụng gốc
ghép kháng bệnh nhưng hiện nay cũng chưa có giống kháng bệnh này mà chủ
yếu là sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học trong
phịng trừ bệnh này tỏ ra kém hiệu quả và làm ô nhiễm môi trường đất và nước,

11


ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sản xuất và người tiêu dùng (JAA và
cs., 2018)
Hiện nay, nhiều giải pháp đã được áp dụng nhằm kiểm soát sự lây lan của
bệnh vàng lá, thối rễ ở các vùng sản xuất tập trung (Suksiri và cs., 2018). Trong

đó, chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh vàng lá, thối rễ, chủ yếu là nấm
Trichoderma spp. đối kháng với tác nhân gây bệnh (Belete và cs., 2015) được
xem là một trong những biện pháp sinh học được sử dụng phổ biến hiện nay
Trong nghiên cứu này, chúng tơi muốn tìm hiểu khả năng sử dụng các chủng
vi khuẩn phân lập tự nhiên được thu thập từ các mẫu đất khác nhau ở các khu
vực phía Đơng Bắc để đối kháng nấm Fusarium solani. Sau đó, chúng tơi chọn
8 dịng phân lập có tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium solani. Ngồi ra,
các chủng phân lập này cịn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật. Với 2
đặc điểm này sẽ giúp cây trồng dễ dàng chống lại các loại nấm bệnh hại cây
trồng. Nghiên cứu này rất hữu ích để bước đầu đánh giá tiềm năng kiểm soát
sinh học của các chủng đối kháng này.
1.2.

MỤC ĐÍCH

Phân lập và đánh giá đặc điểm của chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm
Fusarium solani trong điều kiện in vitro
1.3.

YÊU CẦU

Phân lập các chủng vi khuẩn thể hiện khả năng kháng nấm bệnh (Fusarium
solani, Fusarium oxysporum, Alternaria alternata) từ 02 mẫu đất
Sàng lọc các dịng vi khuẩn phân lập tiềm năng có hoạt tính đổi kháng với nấm
bệnh Fusarium solani và đánh giá với các nấm khác (Fusarium oxysporum,
Alternaria alternata)
Đánh giá đặc điểm hình thái, hóa sinh của các chủng vi khuẩn thể hiện khả năng
kháng nấm bệnh
Đánh giá hoạt tính khả năng sản sinh IAA, castalase, gram của các chủng vi
khuẩn tiềm năng có hoạt tính kháng nấm bệnh (Fusarium solani, Fusarium

oxysporum, Alternaria alternata).
12


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Các nấm gây bệnh phổ biến ở cây trồng

Chất lượng, số lượng và lợi nhuận của sản xuất cây trồng bị ảnh hưởng bởi
mầm bệnh nấm thực vật. Những tác nhân gây bệnh thực vật này liên tục tránh
được sự bảo vệ của thực vật, gây ra bệnh tật và tổn thất về chất lượng trên khắp
thế giới. Để kiểm soát tai họa của bệnh nấm thực vật, nông dân đã sử dụng
thuốc diệt nấm để quản lý thiệt hại của nấm gây bệnh thực vật. Các nhà nghiên
cứu và người trồng trọt đã tìm kiếm các giải pháp thay thế cho các hóa chất này
do những nhược điểm như phát triển sức đề kháng và độc tính mơi trường.
Trong nghiên cứu này, để đánh giá hoạt tính kháng nấm của 20 chủng phân lập,
chúng tơi sử dụng 3 lồi nấm: Fusarium solani, Fusarium oxysporum và
Alternaria alternata.
2.1.1 Nấm Fusarium solani
Nấm Fusarium solani là tên của một lồi nấm sợi thuộc một phức hợp gồm ít
nhất 26 lồi có mối liên hệ với nhau thuộc ngành Ascomycota, họ Nectriaceae.
Chúng là lồi sinh sản vơ tính và thường được biết đến là loài nấm sinh sống
đất. Fusarium solani gây bệnh cho cả cây trồng và cả con người, đáng chú ý
nhất là màng mắt sẽ bị viêm khi tiếp xúc với chúng, và đối với thực vật là bệnh
vàng lá và thối rễ.
Giới (regnum): Fugi
Ngành (phylum): Ascomycota
Lớp (class): Ascomycetes
Bộ (ordo): Hypocreales

Họ (familia): Nectriaceae
Chi (genus): Fusarium
Loài (species): solani

13


Tương tự như nhiều loài cùng chi, thế hệ tiếp theo mà Fusarium solani sinh
sản ra thì có màu trắng và giống như sợi bơng. Tuy nhiên, thay vì phát triển
thành màu hồng hoặc màu tím như hầu hết các lồi thuộc chi này, chúng lại phát
triển có màu xanh lam hoặc màu nâu hơi xanh. Bên dưới có màu hơi nhạt, màu
trà có sắc của màu nâu sữa hoặc nâu đỏ. Khi tụ thành một đám, chúng có ít mào
lông, nhớt, xốp và rời rạc. Khi nuôi cấy bằng dung dịch nước đường-khoai tây
thì chúng phát triển rất nhanh chóng khi đạt đường kính là 64 – 70 mm chỉ trong
7 ngày. Nhưng nó phát triển khơng nhanh bằng một lồi cùng chi với nó
là Fusarium oxysporum (Burgess Knight, 2009)
2.1.2 Nấm Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum bao gồm nhiều dạng loài gây các bệnh héo do tắc bó
mạch và một số bệnh thối rễ. Tuy nhiên, F. oxysprorum cũng bao gồm nhiều
dạng hoại sinh có mặt phổ biến trên rễ cây bệnh sau khi tác nhân gây bệnh đã
làm thối mô rễ. Một số lồi hoại sinh này cũng có thể sống nội sinh trong các tế
bào lớp ngoài của rễ mà không làm tổn thương rễ.
Giới (regnum): Fungi
Ngành (phylum): Ascomycota
Lớp (class): Ascomycetes
Bộ (ordo): Hypocreales
Họ (familia): Nectriaceae
Chi (genus): Fusarium
Loài (species): F. oxysporum
2.1.3 Nấm Alternaria alternata

Giới (regnum): Fungi
Ngành (phylum): Ascomycota
Lớp (class): Dothideomycetes
Bộ (ordo): Pleosporaceae
Họ (familia): Alternaria
14


Chi (genus): A. alternata
Loài (species): F. oxysporum
Alternaria alternata là một loại nấm đã được ghi nhận gây bệnh đốm lá và
các bệnh khác trên hơn 380 loài cây ký chủ. Là tác nhân gây bệnh cơ hội trên
nhiều ký chủ gây bệnh đốm lá, thối nhũn và cháy lá trên nhiều bộ phận của cây
gây thiệt hại về năng suất cây trồng nông nghiệp. Alternaria alternata gây ra
đốm đen trên nhiều loại trái cây và rau quả trên khắp thế giới. Để tồn tại,
Alternaria alternata cần một môi trường ấm áp ẩm ướt. Nó thường được tìm
thấy ở những khu vực có khí hậu ẩm ướt, hoặc nơi có lượng mưa đáng kể. Nấm
sống trong hạt và cây con, đồng thời lây lan bằng bào tử.
2.1.4 Khả năng gây bệnh
Phổ biến là bệnh vàng lá, thối rễ do nấm Fusarium solani gây hại. Triệu
chứng đầu tiên là lá chuyển màu vàng, dễ rụng khi bị lay nhẹ. Các lá già rụng
trước sau đó đến các lá trên. Lúc đầu chỉ có vài nhánh biểu hiện lá vàng, cây
vẫn sống nhưng ở phần rễ cây thì bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, bên trong có
sọc nâu lan dần vào rễ cái. Khi bệnh nặng tất cả các rễ đều bị thối và cây chết.

Hình 2.1 Các triệu chứng của bệnh thối rễ, vàng lá do nấm fusarium solani
gây ra
Bệnh thường gây hại nặng ở những vùng thường xuyên ngập nước. Đất bị
ngập nước rễ cây sẽ bị thiếu oxy, làm rễ suy yếu. Nấm Fusarium solani có sẵn
trong đất sẽ dễ dàng tấn cơng vào chóp rễ , làm rễ bị thối. Ngoài ra, ở những

15


vùng đất có tuyến trùng thì khi chúng chích hút tạo vết thương, thuận lợi cho
nấm xâm nhập gây hại trầm trọng hơn.
Triệu chứng:
Bệnh do nấm Fusarium solani gây hại. Triệu chứng đầu tiên là lá chuyển màu
vàng, dễ rụng khi bị lay nhẹ. Các lá già rụng trước sau đó đến các lá trên. Lúc
đầu chỉ có vài nhánh biểu hiện lá vàng, cây vẫn sống nhưng ở phần rễ cây thì bị
thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, bên trong có sọc nâu lan dần vào rễ cái. Khi bệnh
nặng tất cả các rễ đều bị thối và cây chết.
Bệnh thường gây hại nặng ở những vùng thường xuyên ngập nước. Đất bị ngập
nước thì rễ cây sẽ bị thiếu oxy, làm rễ suy yếu. Nấm Fusarium solani có sẵn
trong đất sẽ dễ dàng tấn cơng vào chóp rễ , làm rễ bị thối. Ngoài ra, ở những
vùng đất có tuyến trùng thì khi chúng chích hút tạo vết thương, thuận lợi cho
nấm xâm nhập gây hại trầm trọng hơn.
2.1.5 Kiểm soát bệnh Fusarium
Một khi các mầm bệnh trong đất phát tán trên đồng ruộng, việc loại bỏ chúng
là rất khó khăn. Hiện nay, để kiểm sốt các bệnh do mầm bệnh từ đất gây ra,
việc khử trùng đất bằng các chất xông hơi như chloro pickin, nước nóng, hoặc
phơi nắng, hoặc sử dụng các giống cây trồng kháng bệnh là phổ biến. Tuy
nhiên, hiệu quả thu được từ các phương pháp điều trị này thường không tốt như
mong đợi. Ngoài ra, cần phải giảm việc sử dụng chúng vì những tác động xấu
đến mơi trường.
Để giải quyết những vấn đề này, các kỹ thuật khác để kiểm soát Fusarium
đang được phát triển. Ở đây, các nghiên cứu về kiểm sốt sinh học và tạo ra tính
kháng bệnh ở thực vật như là các biện pháp thay thế để kiểm sốt bệnh fusarium
được trình bày.
Biện pháp phịng trừ:
Biện pháp canh tác:

+ Vệ sinh đồng ruộng: Sau thu hoạch hoặc trước khi canh tác cần thu dọn, tiêu

16


hủy tàn dư thực vật và làm sạch cỏ dại vì đây là nguồn lưu tồn và lây lan quan
trọng nhất. Thu nhổ và tiêu hủy các cây rau đã biểu hiện triệu chứng nhiễm
bệnh.
+ Làm đất: Đất trồng rau phải tiêu thoát nước tốt, đất tơi và xốp. Khi đất quá ẩm
hãy đào rãnh quanh luống rau để nước thoát xuống mương. Biện pháp này sẽ
giúp làm chậm quá trình lây bệnh sang các cây khác trong vườn rau.
Trong mùa mưa nếu lứa rau trước đó đã nhiễm bệnh trước khi gieo trồng từ 1520 ngày nên đặt những tấm nhựa lên đất sau đó bón vơi vào đất và cuốc lật phơi
đất thêm vài ngày để ánh sáng sẽ làm nóng đất và nhiệt độ cao sẽ giết chết nhiều
vi sinh vật trong đó có cả những tác nhân gây bệnh ở tầng đất bề mặt.
+ Về giống : Luân canh cây trồng khác họ. Sử dụng giống kháng. Khơng dùng
hạt giống có mầm bệnh (lấy ở ruộng có cây bị bệnh). Xử lý hạt giống bằng nước
nóng 500C trong 25 phút.
+ Mật độ trồng vừa phải không quá dày để tránh bớt ẩm độ khi lá giao tán;
+ Phân bón: Nên bón lót phân hữu cơ vi sinh hoặc phân chuồng đã ủ hoai cho
rau. Sử dụng cân đối N-P-K, khơng bón nhiều phân đạm cho rau. Ngưng bón
phân đạm khi bệnh đang phát triển. Bón vơi trước khi trồng và xử lý đất trước
khi xuống giống bằng các loại thuốc gốc đồng. Dùng phân hữu cơ hoai mục, có
nhiều vi sinh vật đối kháng làm hạn chế nguồn bệnh. Bón phân cân đối hợp lý,
tránh bón đạm quá nhiều.
Biện pháp cơ giới vật lý:
+ Nhổ bỏ cây bị bệnh kịp thời, phải hạn chế tưới nước, tránh bệnh lây lan trên
ruộng. Tránh gây tổn thương rễ trong q trình trồng trọt, chăm sóc.
Biện pháp sinh học:
+ Để diệt nấm khuẩn trong vườn và xử lý nấm khuẩn trong đất trồng, bà con
tham khảo bộ đôi đặc trị nấm khuẩn Nano bạc đồng & Nano đồng oxyclorua

HLC với tác dụng diệt nấm khuẩn sâu rộng chuyên tính đặc biệt khơng gây độc
hại, khơng tồn dư, an tồn cho con người và môi trường.

17


Biện pháp hóa học:
+ Biện pháp hóa học thường có hiệu quả thấp do tác nhân gây bệnh tồn tại chủ
yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân sát mặt đất. Tuy
nhiên, trong những trường hợp bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc
phun để tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế bệnh lây lan như: Rovral,
Ridomil MZ, Viroval, Benlat... (dùng đối với bệnh do nấm Sclerotium rolfsii);
Aliette, Ridomil, Phosacide... (dùng đối với bệnh do nấm Phytophthora
capsici); Streptomycine 50-200ppm, Kasamin, Starner... (dùng đối với bệnh do
vi khuẩn).

Hình 2.2 Một số chế phẩm sinh học được ứng dụng từ chủng trực khuẩn có
khả năng kháng nấm
(Nguồn: vinong.net hlc.net.vn)
Hiện tại, chiến lược chính để quản lý nhiễm Fusarium là thuốc diệt nấm hóa
học. Vì vậy, việc sử dụng các tác nhân kiểm sốt sinh học trong các chương
trình quản lý dịch bệnh đã cung cấp một phương tiện hiệu quả, an tồn và bền
vững để kiểm sốt các bệnh thực vật do Fusarium gây ra. Các chủng Bacillus có
lợi được xếp hạng cao về tiềm năng của chúng nhưng cũng bởi vì chúng là vi
khuẩn hình thành bào tử, giúp chúng dễ dàng tạo công thức và bảo quản dưới
dạng chế phẩm. Do khả năng tạo ra một loạt các chất chuyển hóa thúc đẩy sự
phát triển của cây trồng và giảm sự tấn công của mầm bệnh, bằng cách ngăn
chặn sự phát triển của nấm hoặc bằng cách kích thích hệ thống miễn dịch của
cây trồng chống lại mầm bệnh. Cuối cùng, các tập đồn vi sinh vật có thể làm
18

giảm bệnh cây, cải thiện sự phát triển của cây trồng và duy trì sức khỏe mơi
trường bằng cách giảm bệnh cây và cải thiện sản lượng cây trồng (Khan và cs.,
2017)
2.1.6 Các nghiên cứu khả năng ức chế Fusarium solani trong in vitro, đồng
ruộng
Cây Sưa (Dalbergia tonkinensisPrain) là loài cây gỗ quý, hiếm, có giá trị
kinh tế cao ở Việt Nam và đã được xếp vào nhóm IA trong sách đỏ. Tuy nhiên,
cây con ở vườn ươm thường bị bệnh thối cổ rễ do nấm F.solani gây ra.
Rừng trồng Sưa tập trung ở Phú Thọ, cây trồng phân tán ở Hà Nội và cây con đã
bị nấm Fusarium decemcellulare và F. lateritium gây bệnh loét thân cành.
Các loài nấm thuộc chi Fusariumneu trên cũng là sinh vật gây bệnh trên
một số loài cây trồng khác, nấm F. decemcellulare gây bệnh trên cây xoan mộc
ở Australia, gây bệnh loét thân cành xoài ở Hồ Bắc, ở Hàn Quốc. F.solani gây
chết ngược Sưa sissoo ở Bangladesh, Pakistan và Ấn Độ. Vi khuẩn nội sinh
trong cây có thể có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, chúng trải qua
phần lớn thời gian của vòng đời ở bên trong cây chủ. Đã có nhiều nghiên cứu về
vi khuẩn nội sinh cho thấy, nhiều loài vi khuẩn nội sinh hoàn toàn hơng
gây hại cho cây mà trái lại, chúng cịn tăng sức đề kháng chống lại sinh vật gây
bệnh cho cây chủ. Các nghiên cứu trên Keo lai và Keo tai tượng cho thấy
cây càng khỏe, mật độ vi sinh vật nội sinh càng cao. Vi khuẩn Bacillus subtilis
được xác định là một trong những yếu tố quyết định tính kháng bệnh
chết héo do nấm Ceratocystis manginecans của cây Keo lá tràm.(Trần Thị
Thanh Tâm tuấn, 2020)
2.2

Một số chủng vi khuẩn phổ biến có khả năng kháng nấm gây bệnh

2.2.1 Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh

Thuốc trừ sâu hóa học và nó là một phương pháp hấp dẫn để bảo vệ thực vật
khỏi mầm bệnh vì việc sử dụng rộng rãi hóa chất có tác động tiêu cực đến môi
trường và sức khỏe con người. Vi khuẩn sinh ra từ đất đối kháng với mầm bệnh
19


thực vật có thể đóng góp đáng kể vào việc ngăn ngừa bệnh thực vật, và do đó
đại diện cho một giải pháp thay thế cho việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học
trong nơng nghiệp Nhiều tác nhân kiểm soát sinh học đã được phân lập bằng
cách sàng lọc một số lượng lớn đất hoặc thực vật liên quan. vi sinh vật đối
kháng với phytopathogens trong ống nghiệm hoặc thực vật. Một số lồi vi
khuẩn có hoạt tính đối kháng đã được phân lập từ vùng rễ của các lồi thực vật
khác nhau. Trong số đó, trực khuẩn và pseudomonas là những chủng phân lập
phổ biến nhất. Trên thế giới, các lồi thuộc chi Bacillus có tác dụng kích thích
sinh trưởng thực vật. Sự phát triển của thực vật có thể được thúc đẩy bởi vi
khuẩn thơng qua một số cơ chế, bao gồm cải thiện dinh dưỡng, sức đề kháng
tồn thân, độc tính chống lại sâu bệnh và đối kháng với mầm bệnh. Nhiều dòng
Bacillus phân lập đã được chứng minh là có hoạt tính kháng nấm chống lại các
loại nấm gây bệnh thực vật, khiến chúng trở thành ứng cử viên kiểm soát sinh
học tốt (Mardanova và cs., 2016)
 Bacillus
Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, khơng khí do chúng
có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí. Bacillus có khả năng sinh bào
tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát triển
mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một
bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải
phóng ra khỏi tế bào mẹ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ
và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều
năm. Bào tử của vi khuẩn khơng phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là
một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất

lợi (Thụy, 2009)
Vi khuẩn Bacillus được biết là có khả năng ngăn chặn các bệnh thực vật khác
nhau, chẳng hạn như bệnh thán thư ở ớt đỏ, xoài và táo sáp. Nhiều nghiên cứu
trên thế giới cho thấy Bacillus thân thiện với mơi trường và có thể được kết hợp
20


với các hệ thống kiểm sốt hóa học truyền thống để giảm khả năng phát triển
tính kháng của vi sinh vật (Huỳnh và cs., 2023)
 Pseudomonas
Là vi khuẩn vùng rễ biểu hiện có lợi cho sợ tăng trưởng của cây trồng cịn
được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (Kloepper, 1978).
Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do trong đất, có sự ảnh hưởng có lợi cho cây
trồng thông việc nâng cao sự nảy mầm của hạt, sự phát triển của rễ, sự hấp thu
của nước và dinh dưỡng khống và đóng vai trị quan trọng trong phòng trừ các
tác nhân gây bệnh trên cây trồng (Hiền, 2020)
2.2.2 Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani
Các chủng vi khuẩn Paenibacillus sp, P. xylanilyticus, Burkholderia cepacia,
Pseudomonas luteliola, Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của
một số nấm gây bệnh thực vật như F. oxysporum, F. solani, Phytophthora sp
(Hồng và cs., 2014)
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.

Vật liệu

3.1.1 Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu
Để phân lập, sàng lọc và đánh giá khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn
chúng tôi sử dụng một số loại môi trường: NA, PDA, SDA, LB.
Môi trường PDA ( Potato Dextrose Agar ): Potato Dextrose Agar = 39g, Nước

=1 L, pH = 7.
Môi trường NA (Nutrient agar): Peptone = 5g, Beef Extract = 3g, Sodium
Chloride = 5g, Agar = 20g, Nước = 1 L, pH = 7.
Môi trường LB (Luria Bertani): Tryptone = 10g, Yeast Extract = 5g, Sodium
Chloride = 10g, Nước = 1L, Agar = 5g pH = 7.
Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose Agar): Agar = 20g, Sabourand
Dextrose broth = 30g, Nước = 1L
Môi trường thạch nước: Agar = 20g, Nước = 1L
21


Môi trường LB + L-trytophan: Tryptone = 10g, Yeast Extract = 5g, Sodium
Chloride = 10g, Nước = 1L, Agar = 15g, L-Trytophan (100mg/L) pH = 7.
3.1.2 Nấm bệnh
Để sàng lọc vi khuẩn kháng nấm bệnh thực vật, chúng tôi sử dụng 3 loại nấm
gây bệnh: Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Alternaria alternata (đều của
Bộ môn Thực vật học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt
Nam). Các mầm bệnh nấm được duy trì trên mơi trường thạch dextrose khoai
tây (PDA) ở nhiệt độ phịng trong bóng tối.
Fusarium oxysporum : Trong phịng thí nghiệm, chúng tơi ni cấy trên mơi
trường PDA ở 30°C trong bóng tối.

Hình 3.1 Fusarium oxysporum
Fusarium solani : Trong phịng thí nghiệm, chúng tơi ni cấy trên mơi
trường PDA ở 30°C trong bóng tối.

22


Hình 3.2 Fusarium solani

Alternaria alternata : Trong phịng thí nghiệm, chúng tôi nuôi cấy trên môi
trường PDA ở 30°C trong bóng tối.

Hình 3.3 Alternaria alternata

23


3.1.3 Mẫu đất
Chuẩn bị 02 mẫu đất ở TP.Tuyên quang : Rau muống (Tỉnh Hàm Yên, TP Tuyên
Quang), rau mồng tơi ( Huyện Yên Sơn, Tp Tuyên Quang)

Hình 3.4 Hai mẫu đất ở Tun quang
3.1.4 Dụng cụ, hóa chất
 Cơng cụ
+ Schott duran, pipet, eppendorf, Micro Ly Tâm Tube, rây, đĩa Petri
+ Máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ thổi khí tầng, tủ tiệt trùng hơi nước tải
đứng…
 Hóa chất: Nước cất , Dung dịch muối sinh lý vô trùng (NaCl-0.85%),
glycerol, Fuschine, Lugol, Salkowski test, IAA, Gentian violet…
 Phần mềm phân tích dữ liệu
+ Imange J
+ Lăng kính GraphPad
+ Excel
3.2

Phương pháp

3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn (Pha loãng )
Phương pháp đĩa pha loãng: Rây đất qua rây 2 mm và cân mỗi gam một gam

(6 mẫu) trong các vật chứa vô trùng đã được cân trước. Cho 1 gam mẫu vào 90
ml dung dịch muối sinh lý vô trùng (NaCl-0,85%) trong bình Erlynmeyer 250
24