Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi in vitro cây ba gạc hoa đỏ (rauvolfia serpentina)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ
NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO CÂY BA GẠC
HOA ĐỎ (RAUVOLFIA SERPENTINA)”

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ
NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO CÂY BA GẠC HOA
ĐỎ (RAUVOLFIA SERPENTINA)”

Người thực hiện

:

Phùng Văn Duy

Khóa

:

64

MSV

:

640972

Ngành

:

Cơng nghệ sinh học

Người hướng dẫn

:

ThS. Vũ Hoài Sâm
TS. Nguyễn Thị Thúy Hạnh

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu do chính tơi thực hiện. Các số

liệu và kết quả trong khóa luận này là hồn tồn trung thực và chưa từng được
sử dụng, công bố trong các luận văn, luận án và cơng trình khoa học nào trước
đây.
Tơi xin cam đoan các thơng tin trích dẫn được sử dụng trong khóa luận
đều được chỉ rõ nguồn gốc, đảm bảo theo đúng quy định.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!
Hà Nội, ngày 25 tháng 01 năm 2023
Sinh viên thực hiện

Phùng Văn Duy

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập tại khoa Cơng nghệ sinh học, đặc biệt là q
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trung tâm Nghiên cứu Nguồn gen và
Giống cây trồng Quốc gia (Viện dược liệu), được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình
của Cơ và các anh chị cán bộ trong trung tâm cùng với tất cả sự cố gắng, phấn
đấu và rèn luyện, tôi đã hồn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Lời đầu tiên, tôi xin phép chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy, Cô
và các anh chị cán bộ tại Trung tâm Nghiên cứu Nguồn gen và Giống cây trồng
Quốc gia (Viện Dược liệu) đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận
lợi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Học Viện Nông Nghiệp Việt
Nam, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, các Thầy, Cô giáo và cán bộ
thuộc bộ môn Sinh học đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Vũ Hoài
Sâm, TS. Nguyễn Thị Thúy Hạnh đã chỉ bảo và giúp đỡ tơi trong suốt q trình

học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, bằng tất cả lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi
lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị em và bạn bè trong suốt q trình học tập và
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 01 năm 2023
Sinh viên thực hiện

Phùng Văn Duy

ii


TÓM TẮT
Đề tài này được thực hiện nhằm bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro
cây Ba gạc hoa đỏ (Rauvolfia serpentina) - một lồi cây dược liệu có giá trị kinh
tế cao ở Việt Nam. Nội dung của đề tài gồm nghiên cứu khử trùng vật liệu ban
đầu, nghiên cứu tái sinh và nghiên cứu nhân nhanh mẫu vật liệu cây Ba gạc hoa
đỏ. Kết quả đã xác định được thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thủy
ngân clorua (HgCl2) 0,1% trong 7 phút cho kết quả tốt nhất với vật liệu khử
trùng là chồi ngọn và đoạn thân mang mắt ngủ cho tỉ lệ mẫu sạch là 93,33% và
tỉ lệ mẫu tái sinh là 86,67%. Môi trường tái sinh chồi in vitro cây Ba gạc hoa đỏ
là MS + 30 g/l sucrose cho tỷ lệ tái sinh đạt 82,22%. Mơi trường nhân nhanh
thích hợp nhất với cây Ba gạc hoa đỏ là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BAP,
cho hệ số nhân chồi cao đạt 7,0 chồi/mẫu, chất lượng chồi tốt, các chồi phát
triển đồng đều.

iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
TÓM TẮT ............................................................................................................ iii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học......................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về cây Ba gạc hoa đỏ.......................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................... 3
2.1.2. Phân bố ........................................................................................................ 3
2.1.3. Phân loại ...................................................................................................... 4
2.1.4. Đặc điểm thực vật học................................................................................. 5
2.1.5. Yêu cầu ngoại cảnh ..................................................................................... 6
2.2. Giá trị của cây Ba gạc hoa đỏ......................................................................... 7
2.3. Các phương pháp nhân giống truyền thống cây Ba gạc hoa đỏ................... 12
2.4. Nhân giống cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ......... 13
2.4.1. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................... 13
2.4.2. Quy trình nhân giống bằng kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật ............. 14

iv

2.4.3. Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô
tế bào thực vật ..................................................................................................... 15
2.5. Các nghiên cứu về cây Ba gạc hoa đỏ trên thế giới và trong nước.............. 16
2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 16
2.5.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ...................................................................... 17
PHẦN III. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 18
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 18
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................... 18
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 18
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 18
3.2.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 18
3.3. Điều kiện nghiên cứu ................................................................................... 18
3.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
3.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro .................................................................. 19
3.5.2. Phương pháp khử trùng mẫu cấy .............................................................. 19
3.5.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm.................................................................. 20
3.6. Các chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 21
3.7. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................ 22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 23
4.1. Tạo vật liệu khởi đầu .................................................................................... 23
4.2. Tái sinh chồi in vitro cây Ba gạc hoa đỏ ...................................................... 24
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đến khả năng tái sinh chồi in vitro cây Ba
gạc hoa đỏ............................................................................................................ 25
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tái sinh chồi in vitro cây Ba
gạc hoa đỏ............................................................................................................ 26
4.3. Nhân nhanh cây Ba gạc hoa đỏ .................................................................... 28

v


4.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Ba gạc
hoa đỏ .................................................................................................................. 29
4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Ba
gạc hoa đỏ............................................................................................................ 32
4.3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây
Ba gạc hoa đỏ ...................................................................................................... 35
4.3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin + α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Ba gạc hoa đỏ................................................................................................ 37
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 40
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 40
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 41
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 45

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

1

BAP

6-Benzyl amino purine

2

cm

Centimet

3

CT

Cơng thức

4

CV%

Sai số thí nghiệm

5

ĐC

Đối chứng

6

IAA

3-Indole acetic acid

7

Kin

Kinetin

8

LSD0,05

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

9

mg/l

Miligram/lít

10

MS

Murashige and Skoog

11

TCN

Trước công nguyên

12

α-NAA

α-Naphtalene acetic acid

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu bằng HgCl2 0,1% đến hiệu
quả khử trùng chồi Ba gạc hoa đỏ (theo dõi sau 4 tuần) .................. 24
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đến khả năng tái sinh chồi in vitro
cây Ba gạc hoa đỏ sau 4 tuần nuôi cấy ............................................. 25
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tái sinh chồi in vitro
cây Ba gạc hoa đỏ sau 4 tuần nuôi cấy ............................................. 27
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi in vitro cây Ba gạc
hoa đỏ sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................ 30
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự nhân nhanh chồi in vitro cây Ba
gạc hoa đỏ sau 6 tuần nuôi cấy ......................................................... 33
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + α-NAA đến sự nhân nhanh chồi in
vitro cây Ba gạc hoa đỏ sau 6 tuần nuôi cấy..................................... 35
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin + α-NAA đến sự nhân nhanh chồi
in vitro cây Ba gạc hoa đỏ sau 6 tuần nuôi cấy ................................ 37

viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cây Ba gạc hoa đỏ................................................................................. 3
Hình 4.1. Chồi ngọn cây Ba gạc hoa đỏ.............................................................. 23
Hình 4.2. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên mơi trường có nồng độ khống khác nhau
sau 4 tuần ni cấy .............................................................................. 26
Hình 4.3. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên mơi trường có nồng độ đường khác nhau
sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................. 27
Hình 4.4. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên mơi trường bổ sung BAP sau 6 tuần ni
cấy ....................................................................................................... 31
Hình 4.5. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên môi trường bổ sung Kinetin sau 6 tuần
ni cấy ............................................................................................... 34
Hình 4.6. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên môi trường bổ sung BAP + α-NAA sau 6
tuần ni cấy ....................................................................................... 36
Hình 4.7. Chồi Ba gạc hoa đỏ trên môi trường bổ sung Kinetin + α-NAA sau
6 tuần nuôi cấy .................................................................................... 38

ix


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ba gạc hoa đỏ có tên khoa học là Rauvolfia serpentina thường được gọi là
cây rắn hổ mang, cây thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), có tầm quan trọng về
mặt y học vơ cùng lớn, Ba gạc hoa đỏ có xuất xứ từ Ấn Độ và được tìm thấy
nhiều ở vùng nhiệt đới Himalaya, đồng bằng sông Hằng, lãnh thổ cận Himalaya
bao gồm Shimla đến Assam và Sikkim đến Nepal và Bhutan. Từ năm 1958 đã di
thực vào miền Bắc của Việt Nam bằng hạt giống của Ấn Độ và được trồng tại
nhà kính của Liên Xô cũ.
Nhờ vào nguồn phong phú của nhiều chất chuyển hóa thứ cấp như
ajmaline, ajmalicine, reserpine và serpentine, lồi cây này đã được sử dụng từ

thời cổ đại để điều trị sốt, tăng huyết áp, mất ngủ, động kinh, rối loạn tâm thần,
tâm thần phân liệt và các rối loạn hệ thần kinh trung ương khác. Thuốc thảo
dược vẫn là cơ sở chăm sóc sức khỏe hàng đầu cho 75 – 80% dân số thế giới vì
tính tương thích tốt hơn với cơ thể con người và ít tác dụng phụ hơn. Vì vậy,
chúng ta cần phải tìm kiếm các phương pháp thay thế, có sẵn trong tự nhiên để
chữa khỏi bệnh cho hàng triệu người trên toàn thế giới.
Trong chi ba gạc có rất nhiều lồi khác nhau như ba gạc 4 lá (Rauvolfia
tetraphylla), ba gạc Châu Đốc (Rauvolfia chaudocensis), ba gạc Vân Nam
(Rauvolfia yunnanensis), ba gạc lá nhỏ (Rauvolfia indosinensis) và nhiều loài
khác. Tiêu biểu nhất là Ba gạc hoa đỏ (Rauvolfia serpentina), loài này phù hợp
với điều kiện khí hậu tại Việt Nam và chứa hàm hượng alkaloid cao. Rễ cây Ba
gạc hoa đỏ có vị đắng, tính hàn và được bán với giá tương đối cao.
Tại Việt Nam, cây Ba gạc hoa đỏ chủ yếu mọc hoang tại Kon Tum và
Đăk Lăk nhưng trữ lượng cịn lại khơng đáng kể do việc cân bằng giữa khai thác
và nhân giống còn chưa được chú trọng. Cây thường được nhân giống bằng hạt,
rễ và giâm cành nhưng các phương pháp nhân giống truyền thống này cho hiệu
quả khá thấp, cho hệ số nhân không cao, lượng hạt ít và rễ kém phát triển, tỉ lệ
biến dị di truyền cao trong các quần thể được nhân giống bằng hạt.
1


Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những phương pháp
nhân giống vơ tính có nhiều ưu điểm nổi bật so với các phương pháp nhân giống
truyền thống như sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, cho hệ số nhân cao,
việc nhân giống không phụ thuộc vào vụ mùa, chiếm ít diện tích để sản xuất.
Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào thực vật còn giúp việc vận chuyển giống đi xa
dễ dàng hơn. Tại Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào liên quan đến
nhân giống in vitro cây Ba gạc hoa đỏ. Dựa trên những cơ sở đó, chúng tơi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh in vitro cây Ba
gạc hoa đỏ (Rauvolfia serpentina)”.

1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng trong quy trình nhân giống cây
Ba gạc hoa đỏ bằng phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật, từ đó góp phần
vào xây dựng thành cơng quy trình nhân giống in vitro cây Ba gạc hoa đỏ có hệ
số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định được thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% thích hợp.
Xác định được mơi trường nền thích hợp ni cấy in vitro cây ba gạc
hoa đỏ.
Xác định được môi trường cho hệ số nhân nhanh in vitro tốt nhất đối với
cây Ba gạc hoa đỏ.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Bổ sung những cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy
mơ cây Ba gạc hoa đỏ trong phịng thí nghiệm.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng quy trình nhân nhanh chồi in vitro cây Ba gạc hoa đỏ, thơng
qua đó cung cấp nguồn vật liệu chất lượng cao dồi dào cho việc hồn thiện quy
trình nhân giống in vitro cây Ba gạc hoa đỏ.
2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Ba gạc hoa đỏ

Hình 2.1. Cây Ba gạc hoa đỏ
(Hình ảnh được chụp tại vườn bảo tồn, Viện Dược Liệu)

2.1.1. Nguồn gốc

Loại cây này được đề cập tới lần đầu tiên bởi Sushruta, một người bác sĩ
cổ đại ở Ấn Độ, được mệnh danh là “Cha đẻ của Y học Ấn Độ” và “Cha đẻ của
nhựa phẫu thuật” để phát minh và khám phá quy trình phẫu thuật. Rễ của loài
này đã được sử dụng từ thời kỳ trước như một thuốc chữa rắn cắn và sốt cao
(Kiran và cộng sự, 2018). Các nhà khoa học cũng tìm thấy thơng tin của nó
trong văn học cổ đại (Charaka, 1000 đến 800 năm TCN) khi đó, Rauvolfia
serpentina được để ngăn ngừa côn trùng đốt (Panday, 1984). Rễ của cây đã
được sử dụng ở Ấn Độ trong hàng trăm năm và thậm chí cả ấn phẩm tiếng Anh
của một báo cáo lâm sàng cho thấy cây này đã được sử dụng như một liệu pháp
cần thiết trong 50 trường hợp tăng huyết áp. Thời gian trơi qua, nó được ứng
dụng nhiều và có tên trong hệ thống dược liệu Ấn Độ (ayurveda, siddha, unani)
và hệ thống dược liệu phương Đông (Benjamin và cộng sự, 1993, Ajayi và cộng
sự, 2011).
2.1.2. Phân bố
Có hơn 100 lồi trong chi Rauvolfia và chúng được tìm thấy ở các vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á, Úc,
Trung và Nam Mỹ. Rauvolfia serpentina có nguồn gốc từ các khu rừng ẩm ướt,

3


rụng lá ở Đông Nam Á, bao gồm Ấn Độ, Miến Điện, Bangladesh, Sri Lanka và
Malaysia.
Ở Ấn Độ, nó được tìm thấy ở khu vực trung tâm, giữa huyện Sirmor và
Gorakhpur của Utter Pradesh. Nguồn cung cấp rễ thương mại ngày nay chủ yếu
từ Uttar Pradesh, Bihar, Orissa, Tây Bengal, Assam, Andhra Pradesh, Tamil
Nadu, Kerala, Karnataka và Maharashtra.
Tại Việt Nam, Ba gạc hoa đỏ mọc dại ở Krông Buk, Buôn Ma Thuột tỉnh
Đăk Lăk. Cây được nhập nội, trồng và bảo tồn tại Viện Dược liệu.
2.1.3. Phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật quốc tế Classification USDA PLANTS
cây Ba gạc hoa đỏ được phân loại như sau:
• Giới Plantae – Thực vật
• Phân giới Tracheobionta – Thực vật bậc cao
• Ngành Tracheophyta – Thực vật có mạch
• Lớp Magnoliopsida – Thực vật 2 lá mầm
• Bộ Gentianales – Bộ Long đởm
• Họ Apocynaceae – Họ Trúc đào
• Chi Rouvofia – Chi ba gạc
• Lồi Rouvolfia serpentina – Ba gạc hoa đỏ
Chi ba gạc có số lượng lồi tương đối phổ biến, tiêu biểu như:
• Rauvolfia chaudocensis
• Rauvolfia cubana
• Rauvolfia indosinensis
• Rauvolfia micrantha
• Rauvolfia nitida
• Rauvolfia polyphylla
• Rauvolfia pentaphylla
• Rauvolfia sachetiae
• Rauvolfia serpentina
4


• Rauvolfia tetraphylla
• Rauvolfia verticillata
2.1.4. Đặc điểm thực vật học
Thân
Cây bụi thân gỗ mọc thẳng đạt chiều cao khoảng 60 - 90 cm, ít phân cành,
thân có những nốt sần nhỏ màu lục xám, vỏ màu nâu hay nâu xám, nhiều bì
khổng (Rajbhandari, 2001).

Lá
Lá của Ba gạc hoa đỏ có hình elip hoặc hình mũi mác, thường mọc thành
vịng gồm 3 đến 5 lá chét sát nhau, lá có màu xanh đậm, sáng bóng và dài 7 - 10
cm, rộng 3,5 - 5,0 cm (Lobay, 2015).
Rễ
Rễ của Ba gạc hoa đỏ có dạng rễ củ xuất hiện các nốt sần có hình dạng
khơng đều và vỏ màu nâu nhạt bao bọc lấy nó. Rễ cái mềm đạt chiều dài từ 30
đến 50 cm và đường kính từ 1,2 đến 2,5 cm (Brijesh, 2014).
Hoa
Cụm hoa ở dạng xim hình tán với các hoa lưỡng tính và lưỡng tính có
màu trắng hoặc hơi hồng. Cụm hoa bao gồm một cuống màu đỏ đậm dài khoảng
1,5 cm, lá bắc có màu đỏ tươi với các đoạn dài 2 mm xuất hiện thành cụm.
Tràng hoa có màu hồng nhạt với hình dạng màu bạc có một ống mảnh giãn ra ở
trung tâm dài 1 - 1,5 cm, bao gồm 5 thùy, đặc biệt biểu thị hình dạng elip và
thn dài với chiều dài 3 - 4 mm. Hoa của Ba gạc hoa đỏ bao gồm 5 nhị hoa, có
màng, chia thùy khơng rõ ràng và thường cắm vào phần phình ra của ống tràng
hoa có tràng hoa khơng đều. Nó cũng được đính kèm với 2 lá noãn chủ yếu bao
gồm 2 noãn trong mỗi lá nỗn với kiểu hình sợi và đầu nhụy rộng, đài hoa có
hình tam giác ở gốc và 2 lá noãn ở đỉnh. Ở Ấn Độ, hoa bắt đầu nở từ đầu tháng 3
đến cuối tháng 5.
Quả

5


Quả của Ba gạc hoa đỏ là dạng quả hạch đơn hoặc quả mọng, hình cầu có
đường kính lên đến 0,5 cm có màu sắc thay đổi từ xanh sang đỏ và đen bóng.
Hạt thường có cánh hay có chùm lông ở 1 hoặc ở cả 2 đầu.
2.1.5. Yêu cầu ngoại cảnh
Đất

Ba gạc hoa đỏ phát triển trên nhiều loại đất từ đất thịt phù sa đến đất mùn
đá ong đỏ hoặc đất thịt sẫm màu cứng. Trong môi trường sống tự nhiên, nó ưa
đất sét hoặc đất thịt pha sét có tỷ lệ mùn lớn và khơng phát triển tốt trên đất có
độ pH từ 8 trở lên. Độ pH lý tưởng cho loại cây trồng này là từ 4,6 - 6,2. Đất
chứa nhiều cát, làm cây chậm phát triển và dễ bị các bệnh về rễ và lá.
Khí hậu
Ba gạc hoa đỏ có thể phát triển trong nhiều điều kiện khí hậu khác nhau.
Nó phát triển mạnh trong điều kiện nóng ẩm và có thể được trồng cả dưới ánh
nắng mặt trời và một phần bóng râm. Thích hợp với điều kiện nhiệt đới hoặc cận
nhiệt đới, được hưởng lợi từ những cơn mưa gió mùa. Khí hậu với phạm vi nhiệt
độ từ 10-30°C dường như rất phù hợp với loại cây này. Khu vực tốt nhất để nó
phát triển là những khu vực có lượng mưa lớn với đất thốt nước hợp lý. Nó
nhạy cảm với tình trạng ngập úng và mùa đông khắc nghiệt. Cây sẽ chuyển qua
trạng thái ngủ đông và rụng hết lá, hoa và quả khi nhiệt độ xuống dưới 10°C, nó
thậm chí có thể chịu được nhiệt độ xuống dưới 4°C. Lượng mưa hàng năm ưa
thích nằm trong khoảng 1500 đến 3500 mm, nhưng có thể chịu được mức 580
đến 4500 mm (Varadarajan, 1963).
Sâu bệnh hại
Ba gạc Ấn Độ nhìn chung ít bị sâu bệnh hại. Thời kỳ cây con mới nẩy
mầm thường bị sâu xám ăn mất mầm non. Khi cây trưởng thành vào mùa hè có
thể xuất hiện rệp mềm, sâu xanh và sâu cuốn lá hại ngọn cây, thân và lá.
• Sâu xám (Agrotis ipsilon)

6


Đặc điểm gây hại: Thường gây hại ở thời kỳ cây con. Loài sâu này thường
gây hại vào ban đêm, ăn lá non hoặc cắn đứt ngang các thân và cành non. Sâu non
màu xám đen hoặc màu nâu xám dọc theo hai bên thân có những chấm đen mờ.

• Rệp mềm (Aphis gossipii)
Đặc điểm gây hại: Ban đầu, rệp chỉ tập trung gây hại ở những búp non, lá
non. Về sau do tích lũy nhiều, mật độ tăng nhanh, chúng xuất hiện trên cả những
lá già và thường tập trung ở mặt dưới của lá. Rệp chích hút nhựa cây làm búp
non, lá non bị quăn queo, biến dạng, lá chuyển dần sang màu vàng, cây còi cọc,
sinh trưởng kém. Rệp mềm có kích thước nhỏ, có hình quả lê và thân mềm.
Chúng thường tập trung lại thành từng đám, đặc biệt ở dọc các gân lá.
2.2. Giá trị của cây Ba gạc hoa đỏ
Theo y học cổ truyền
Chất chiết xuất từ rễ của Ba gạc hoa đỏ có lợi trong điều trị các bệnh rối
loạn đường ruột chẳng hạn như dịch tả, đau bụng và tiêu chảy, kiết lỵ, nó cũng
được sử dụng để điều trị tăng huyết áp và ung thư vú (Lohani và cộng sự, 2011;
Stanford và cộng sự, 1986). Ba gạc hoa đỏ đã được sử dụng trong y học dân
gian ở Ấn Độ trong nhiều thế kỷ để chữa nhiều loại bệnh nhiễm trùng bao gồm
cả vết cắn do rắn và côn trùng gây ra. Dịch chiết xuất từ lá được sử dụng để hỗ
trợ điều trị các bệnh về mắt và thuốc sắc chế từ lá dùng để chữa đau răng. Thuốc
chế biến từ rễ rất hữu ích trong điều trị đau dạ dày và rắn cắn (Khare, 2007;
Caamal và cộng sự, 2011; Quattrocchi, 2012; Choudhury và cộng sự, 2013).
Trong y học dân gian, rễ của Ba gạc hoa đỏ được sử dụng trong khi sinh để kích
thích co bóp tử cung và đẩy thai nhi ra ngoài.
Tác dụng dược lý
Ba gạc hoa đỏ giữ vị trí quan trọng trong hệ thống dược phẩm do sự hiện
diện của các alkaloid khác nhau trong phần oleoresin của rễ. Alkaloid của cây
này có tầm quan trọng y học lớn để điều trị bệnh tim mạch, bệnh huyết áp cao,
7


tăng huyết áp, rối loạn nhịp tim, các bệnh tâm thần khác nhau, rối loạn tâm thần,
ung thư vú, bệnh bạch cầu promyelocytic của con người. Reserpin là alkaloid
chính có mơ hình hoạt động rất phức tạp chủ yếu tạo nên sự thay đổi nồng độ

amin trong não. Nó chịu trách nhiệm tác động đến nồng độ glycogen, acetyl
choline, axit g - amino butyric, axit nucleic và hormone chống bài niệu. Tác
dụng của reserpin bao gồm ức chế hô hấp, kích thích nhu động, co cơ, giãn
màng nicting và cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ của trung tâm điều tiết. Nó làm
tăng khối lượng và độ axit tự do của dịch vị. Viên nang Pitkriya (công thức
Unani) chứa arsol (Ba gạc hoa đỏ) hoạt động như Musakkin - wo - Munawwim
(an thần và thôi miên), Mudir (lợi tiểu), Musakkin - e - Asab (thuốc an thần thần
kinh) và Mukhaddir (thuốc mê). Các hoạt động dược lý khác nhau của nó bao
gồm kháng cholinergic, hạ huyết áp, chống co thắt, an thần, thư giãn, tăng thân
nhiệt, chống bài niệu, giao cảm, hoạt động thôi miên, giãn mạch, chống nôn,
thuốc an thần, chống loạn nhịp tim, kháng nấm và diệt tuyến trùng. Ba gạc hoa
đỏ được cho là có thuộc tính dược lý sau: (1) Có tác dụng vận mạch trung tâm,
vì nó dẫn đến giãn mạch bằng cách hạ thấp huyết áp. (2) Hoạt động ức chế trên
não trung tâm vì nó làm dịu hệ thống thần kinh nói chung. (3) Có tác dụng an
thần trên niêm mạc dạ dày và kích thích hoạt động trên cơ trơn của đường ruột.
(4) Kích thích cơ phế quản (Mittal và cộng sự, 2012; Agrawal và Mishra, 2013).
Một số hoạt chất có lợi
Alkaloid
Alkaloid là một nhóm lớn các phân tử hữu cơ có chứa một vòng nitơ dị
vòng. Chúng được tạo ra bởi các sinh vật khác nhau như động vật và vi khuẩn,
nhưng một loạt các alkaloid đặc biệt được tạo ra bởi thực vật. Khoảng 10 % các
loài thực vật được cho là sản xuất alkaloid dưới dạng chất chuyển hóa thứ cấp,
chúng hoạt động chủ yếu trong việc bảo vệ động vật ăn cỏ và chống lại mầm
bệnh. Các alkaloid cô lập tinh khiết và các dẫn xuất tổng hợp của chúng được sử
dụng làm thuốc giảm đau, chống co thắt và diệt khuẩn. Các alkaloid thu được từ
dịch chiết rễ tác động trực tiếp lên hệ thần kinh trung ương và do đó làm giảm
8


huyết áp so với các chất hạ huyết áp khác. Ba gạc hoa đỏ được báo cáo là có chứa

0,7 – 3,0 % tổng số alkaloid và khoảng 0,1 % hoạt chất reserpine là một loại
alkaloid indole, có trong rễ. Do đó, sản xuất sinh khối rễ của cây này có thể có tầm
quan trọng kinh tế. Dựa trên cấu trúc, có ba loại alkaloid là alkaloid indole có tính
bazơ yếu, alkaloid có tính bazơ trung bình và alkaloid có tính bazơ mạnh. Các
alkaloid khác nhau được xác định trong Ba gạc hoa đỏ bao gồm ajmaline,
ajmalimine, ajmalicine, deserpidine, indobine, indobinine, reserpine, reserpiline,
rescinnamine, rescinnamidine, serpentine, serpentinine và yohimbine, v.v. (Kumari
và cộng sự, 2013).
Reserpine
Là một alkaloid đơn tinh thể tinh khiết, có nguồn gốc từ rễ của Ba gạc hoa
đỏ và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1952. Nó là một bazơ bậc III tương
đối yếu xuất hiện trong phần oleoresin của rễ và rất hữu ích trong điều trị bệnh
cao huyết áp, bệnh tim mạch và bệnh thần kinh. Đặc tính hạ huyết áp của rễ cây
Ba gạc hoa đỏ là do reserpin (este axit 3,4,5-trimethyl benzoic của axit reserpic,
một dẫn xuất indole của loại 18-hydroxy yohimbine). Nó là chất nổi bật nhất
trong tất cả các alkaloid và được sử dụng chủ yếu như một loại thuốc an thần tự
nhiên. Reserpine hiện đang được sử dụng như một công cụ trong các nghiên cứu
sinh lý về các chức năng của cơ thể và trong các nghiên cứu dược lý. Tác dụng
hạ huyết áp của reserpine là do tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương (CNS)
và hệ thần kinh ngoại biên bằng cách liên kết với các túi dự trữ catecholamine
có trong tế bào thần kinh. Điều này ngăn chặn việc lưu trữ bình thường
catecholamine và serotonin làm suy giảm catecholamine. Nó can thiệp vào chức
năng của hệ thống thần kinh tự chủ bằng cách làm cạn kiệt chất dẫn truyền từ
các tế bào thần kinh adrenergic và kích hoạt hệ thống đối giao cảm trung ương.
Những chất này chủ yếu liên quan đến việc kiểm soát nhịp tim, sự co bóp của
tim và sức cản ngoại biên. Nó cũng giúp an thần và hạ huyết áp, đặc biệt trong
trường hợp tăng huyết áp trầm trọng hơn do căng thẳng và hoạt động của hệ
thần kinh giao cảm. Reserpine gây giải phóng 5-hydroxytryptamine (5-HT) từ
9

tất cả các mơ mà nó thường được dự trữ và dẫn đến tăng các chất chuyển hóa
trong nước tiểu (Pandey và cộng sự, 2010; Prusoff, 1961).
Ajmaline
Lần đầu tiên được phân lập bởi Salimuzzaman Siddiqui vào năm 1931 từ
rễ của Ba gạc hoa đỏ. Ơng đặt tên cho nó là ajmaline, theo tên của Hakim Ajmal
Khan, một trong những người thực hành y học Unani lừng lẫy nhất ở Nam Á.
Được chiết xuất từ rễ cây Ba gạc hoa đỏ như một chất chống loạn nhịp loại I, nó
rất hữu ích trong việc chẩn đoán hội chứng Brugada (rối loạn tim di truyền) và
phân biệt giữa các phân nhóm bệnh nhân mắc bệnh này. Các tác nhân này chủ
yếu được phân thành bốn nhóm chính trên cơ sở cơ chế hoạt động của chúng, ví
dụ như phong tỏa kênh natri, phong tỏa beta adrenergic, kéo dài quá trình tái cực
và phong tỏa kênh canxi. Ajmaline là thuốc chặn kênh natri cho thấy tác dụng
tức thì khi được tiêm vào tĩnh mạch, điều này khiến nó trở nên lý tưởng cho mục
đích chẩn đốn. Việc sử dụng rauvolfia alkaloid cho những bệnh nhân mắc
chứng rối loạn nhịp tim này được gọi là “thử nghiệm Ajmaline”. Nó đã được
báo cáo để kích thích hơ hấp và nhu động ruột. Tác dụng của ajmaline đối với
huyết áp hệ thống và phổi tương tự như của serpentine (Prusoff, 1961).
Serpentine
Serpentine, một chất ức chế topoisomerase loại II, có đặc tính chống loạn
thần. Enzyme peroxidase (PER) chịu trách nhiệm cho q trình oxy hóa
ajmalicine thành serpentine bằng cách xúc tác bisindole alkaloid khu trú trong
không bào (Prusoff, 1961).
Phenol
Phenol là chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật được phân bố rộng rãi
trong giới thực vật, chủ yếu là thảo mộc, cây bụi, rau và cây cối. Sự hiện diện
của phenol được coi là chất độc đối với sự tăng trưởng và phát triển của nhiều
loại sâu bệnh và mầm bệnh. Sự hiện diện của một lượng lớn các hợp chất
polyphenolic tổng số trong R. serpentina cho thấy các đặc tính hạ đường huyết
và trị đái tháo đường đáng kể. Trong y học, nó được dùng làm thuốc long đờm

10


và nhũ hóa. Sự hiện diện của các hợp chất phenolic cho thấy chất này có thể
được sử dụng làm chất chống vi khuẩn (Rolf và cộng sự, 2003; O’ Connor và
cộng sự, 2006).

11


Tannin
Hoạt động ức chế q trình oxy hóa của tannin là do sự hiện diện của axit
gallic và axit diagalic. Tannin có đặc tính làm se, chúng đẩy nhanh q trình
chữa lành vết thương và niêm mạc bị viêm. Vì vậy, giải thích việc sử dụng Ba
gạc hoa đỏ trong điều trị nhiều chứng bệnh của các thầy lang ở Đông Nam Ấn
Độ (Prusoff, 1961; O’ Connor và cộng sự, 2006)
Saponin
Saponin là glycoside của cả triterpen và sterol và đã được phát hiện trong
hơn 70 họ thực vật. Một số đặc điểm của saponin bao gồm sự hình thành bọt
trong dung dịch nước, hoạt động tán huyết, đặc tính liên kết cholesterol và vị
đắng. Saponin có đặc tính làm đơng hồng cầu. Ung thư tuyến tiền liệt ung thư
tuyến tiền liệt được coi là nguyên nhân chính gây tử vong liên quan đến ung thư
ở nam giới. Các kỹ thuật hiện đại như hóa trị và xạ trị đã khơng mang lại lợi ích
sống sót đáng kể cho bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt. Các sản phẩm tự nhiên
đã được chứng minh là nguồn chính để xác định các hợp chất hoạt tính sinh học
được sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh tật, bao gồm cả ung thư khi so sánh
đến hóa trị và xạ trị. Các bộ phận khác nhau của loại cây này đã được sử dụng
như một loại thuốc truyền thống trong nhiều thế kỷ để điều trị nhiều loại bệnh
bao gồm sốt, suy nhược chung, bệnh đường ruột, các vấn đề về gan và hàm
lượng saponin cao của Ba gạc hoa đỏ chứng minh việc sử dụng chiết xuất này để

cầm máu và điều trị vết thương (Bonnila và cộng sự, 2003; Harisaranraj và cộng
sự, 2009; Li và cộng sự, 2004).
2.3. Các phương pháp nhân giống truyền thống cây Ba gạc hoa đỏ
Ngồi mơi trường tự nhiên, cây Ba gạc hoa đỏ được nhân giống chủ yếu
bằng phương pháp gieo hạt hoặc giâm rễ, giâm cành.
Hạt của Ba gạc hoa đỏ khá đặc biệt, khi gieo trực tiếp trên ruộng không
cho thấy bất kỳ tỷ lệ nảy mầm thành cơng nào, do đó cần nhân giống trong vườn
ươm tạo cây con để trồng ra ruộng (Sharma và cộng sự, 2022). Do ảnh hưởng
bất lợi cũng như sự hiện diện của nội nhũ đá, tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm 25 12


30%. Một lý do khác có thể khiến tỷ lệ nảy mầm thấp là do khơng có phơi trong
quả dẫn đến hiện tượng tạo quả không hạt (parthenocarpy) hoặc do tính vơ sinh
somatoplastic bị trì hỗn. Các kết quả nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng tỷ lệ
nảy mầm cao nhất (58 - 74%) thu được từ hạt tươi của quả chín thu hái ngay
trước khi gieo. Việc thu hái muộn và gieo hạt trong vòng 24 - 36 giờ cũng như
phơi hạt và bảo quản dưới ánh nắng mặt trời sẽ làm giảm tỷ lệ nảy mầm. Hạt
được lưu trữ trong hơn 7 - 8 tháng hoàn toàn khơng nảy mầm do mất khả năng
sống. Để duy trì khả năng sống của hạt trong ít nhất sáu tháng, hạt chín được thu
hái vào tháng 6 và tiếp tục cho đến cuối tháng 10 đến tháng 11 và được bảo quản
trong các thùng kín (Sharma và cộng sự, 2022).
Để nhân giống bằng cách giâm rễ, người ta sử dụng rễ cái với một số rễ
bên thứ cấp có sợi nhỏ. Kết quả nhân giống bằng hom rễ ở một số nơi như
Dehradun cho thấy hom rễ có đường kính khoảng 0,25 cm trồng trong điều kiện
có tưới nước trong khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 cho tỷ lệ thành công
là 52 - 79%. Rễ khỏe, các chồi bắt đầu xuất hiện ngay sau 10 đến 15 ngày nhân
giống. Nhân giống bằng phương pháp giâm rễ cho tỷ lệ cây phát triển cao hơn
phương pháp gieo hạt, tuy nhiên hàm lượng alkaloid của cây phát triển từ giâm
rễ lại thấp hơn cây từ gieo hạt (Mitra, 1976).
Sử dụng các đoạn thân dài 15 - 23 cm gồm 2 - 3 lóng để tiến hành giâm

cành được cho là phù hợp nhất. Dựa trên điều tra các báo cáo, thấy rằng các
cành giâm được xử lý bằng dung dịch axit axetic indole (IAA) 30 ppm đã cho tỷ
lệ ra rễ đạt từ 60 - 100% trong thời gian 15 ngày. Tuy nhiên, giâm cành được
cho là kém khả quan hơn so với giâm rễ vì hầu hết các cây thu được từ giâm
cành có bộ rễ phát triển kém (Sharma và cộng sự, 2022).
2.4. Nhân giống cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ cở lý luận của phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật là tính tồn
năng của tế bào và sự phân hóa, phản phân hóa của tế bào.

13


Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra quan điểm mỗi tế bào bất kì của một cơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thế hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại cho rằng mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
hóa đều mang đủ thơng tin di truyền cần thiết của cá thể sinh vật đó. Mỗi tế bào
có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thích hợp. Đó chính là
tính tồn năng của tế bào. Hiện nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả
năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Cơ thể thực vật trưởng thành gồm có nhiều cơ quan khác nhau tập hợp
thành một chỉnh thể thống nhất, được cấu tạo từ nhiều loại tế bảo khác nhau.
Các tế bào khác nhau đó đều được cấu tạo từ 1 tế bào sơ khai (tế bào hợp tử). Ở
giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh
chưa mang chức năng riêng biệt (chun hóa). Sau đó từ các tế chưa chuyên hóa
chúng biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có
chức năng khác nhau, đó chính là sự phân hóa của tế bào.
Tuy nhiên, khi đã biến đổi thành tế bào chuyên hóa, chúng vẫn có khả
năng biến đổi. Trong điều kiện cần thiết, khi gặp điều kiện thích hợp, các tế bào
chun hóa có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và tiến hành phân chia mạnh mẽ,

đó chính là q trình phản phân hóa.
2.4.2. Quy trình nhân giống bằng kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật
Quy trình gồm 4 bước:
Bước 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn quyết định đến kết quả của nhân giống in vitro. Để có
được vật liệu nuôi cấy sạch cần chú ý đến cách thu mẫu và xử lý khử trùng mẫu.
Mỗi cây đều có cách lấy mẫu, xử lý khử trùng mẫu và môi trường khởi động
phù hợp. Các mẫu nuôi cấy cần đảm bảo các yếu tố: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ tái
sinh cao, sinh trưởng và phát triển tốt.
Khi thu mẫu cần chọn đúng mô, cơ quan nuôi cấy và đúng giai đoạn phát
triển phù hợp của cây. Chọn các mô non, ít chun hóa như chồi ngọn, chồi
bánh tẻ, mắt ngủ, lá non, v.v.
14