Đồ án môn công nghệ thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
NGHIÊN CỨU IN VITRO HYBANTHUS ENNEASPERMUS

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ THỰC VẬT

GVHD: TS. PHẠM MINH NHỰT
LỚP: 20DSHA1
NHÓM: 07
THÀNH VIÊN NHÓM: LÊ LÂM HỒNG ANH
TRẦN VÕ TƯ TỶ

2081000010 20DSHA1
2011100711 20DSHA1

TP.HỒ CHÍ MINH, Ngày 12 Tháng 05 Năm 2023


MỤC LỤC
I.

TĨM TẮT. .............................................................................................................................................1

II.

GIỚI THIỆU Hybanthus enneaspermus ................................................................................................1

III.

KỸ THUẬT NI CẤY MÔ TẾ BÀO ............................................................................................2

IV.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................................................................3

1.

Nguồn mẫu .........................................................................................................................................3

2.

Khử trùng mẫu ...................................................................................................................................3

3.

Cấy tạo mô sẹo ...................................................................................................................................3

4.

Điều kiện ni cấy ..............................................................................................................................4

5.

Thích nghi...........................................................................................................................................4

6.

Chuyển ra vườn ươm ..........................................................................................................................4

7.

Phân tích thống kê ..............................................................................................................................4

V.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .................................................................................................................5

VI.

KẾT LUẬN ........................................................................................................................................7

VII.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................7


MỤC LỤC BẢNG
Bảng 1: Nồng độ BAP khác nhau cùng với môi trường MS ............................................... 5
Bảng 2 Kết quả …. BAP cùng với môi trường MS trong sự tăng sinh chồi ....................... 5


MỤC LỤC HÌNH
Hình 1: Hybanthus enneaspermus ....................................................................................... 1

Hình 2. Các giai đoạn nhân giống in vitro của H. enneaspermus ........................................ 6


TÓM TẮT.

I.

Nghiên cứu này được thực hiện để nghiên cứu ảnh hưởng các nồng độ khác nhau
của môi trường BAP (benylamino purine) đối với kích thích chồi in vitro của Hybanthus
enneaspermus. Các giải thích thu được từ đầu chồi và các đoạn nút của các nghiên cứu về
giống được cấy trên môi trường MS được bổ sung với các nồng độ BAP khác nhau (0,5,
1,0, 2,0 và 3,0mg/l) và các môi trường nuôi cấy được ủ ở 25±2 C với chu kỳ quang 16 giờ
(2000lux) được cung cấp bởi các ống huỳnh quang trắng mát mẻ. Độ pH của môi trường
được điều chỉnh đến 5,8 trước khi hấp. Các môi trường nuôi cấy được nuôi cấy phụ trong
khoảng thời gian 35 ngày trong cùng một môi trường để tạo ra nhiều chồi. Các cây được
tái sinh của tất cả các giống được chuyển sang các hỗn hợp phân compost khác nhau để
thích nghi. Phản ứng làm cứng tốt nhất thu được trong cát + đất + Vermicompost (1:1:1)
sau ba tuần cấy ghép trong nhà kính. Những cây cứng này sau đó đã được chuyển vào
cánh đồng.
II.

GIỚI THIỆU Hybanthus enneaspermus
Hybanthus enneaspermus (L.) F. Muell, thuộc

họ Violaceae, (ở Việt Nam có tên là cỏ tím phịng) là
một loại thảo mộc q hiếm, lâu năm được tìm thấy
ở một số vùng ấm hơn của bán đảo Deccan ở Ấn Độ.
Thường được gọi là Ratanpurus và trong tiếng Tamil
là Orithaztamarai. Bởi dân làng địa phương và các
nhà thảo dược, loại thảo dược này được biết là có đặc

Hình 1: Hybanthus enneaspermus

tính dược liệu độc đáo. Nó phát triển lên đến 15-30cm trong tự nhiên. Theo truyền
thống, cây được sử dụng như một chất kích thích tình dục, làm dịu viêm, thuốc bổ,
thuốc lợi tiểu, trong nhiễm trùng tiết niệu, tiêu chảy, bệnh khí hư, khó tiểu và vơ sinh
Các chế phẩm được làm từ lá và thân cây mềm được sử dụng trong thuốc thảo
dược cho các đặc tính kích thích tình dục, kháng viêm và thuốc bổ. Rễ là thuốc lợi tiểu
và được dùng quản lý bệnh lậu và nhiễm trùng tiết niệu. Trái cây và lá được sử dụng
làm thuốc giải độc cho vết cắn của bọ cạp và rắn hổ mang cắn bởi các bộ lạc yanadi.
Nó làm tăng ham muốn tình dục. Đó là thuốc kích thích tình dục và thuốc bổ dinh
1


dưỡng. Một lượng nhỏ thảo dược nếu dùng với sữa, hai lần một ngày giúp cơ thể đạt
được sức mạnh. Nếu nó được dùng trong 48 ngày, cơ quan nội tạng của cơ thể phát
triển khỏe mạnh và mạnh mẽ hơn. Cụ thể, các cơ quan sinh sản được trẻ hóa, trở nên
mạnh mẽ hơn và sản xuất tinh trùng tăng lên. Cuốn của cây khi nhai có vị dẻo dính và
mịn giống ngón tay cái. Dùng hàng ngày giúp chữa loét, xảy ra do các bệnh lây truyền
qua đường tình dục và thậm chí là AIDS. Loại thảo mộc này tốt cho kinh nguyệt hàng
tháng của phụ nữ các vấn đề liên quan đến kinh nguyệt. Loại thảo mộc bổ dưỡng này
làm mát cơ thể.
III.

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Một phương pháp tái sinh thực vật cho 2.0mg/l benzylamino purine (BAP)
trong vòng 4 tuần sau khi ủ. Sự khác biệt chồi đạt được từ mô sẹo nhỏ màu lục nhạt.
Việc bổ sung casein hydrolysate (500 mg/l) và kali phosphat nhiều hơn (1,86mmol/l)
vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự biệt hóa chồi. Các cây được tái sinh có hình thái

đồng nhất và thể hiện một bộ hạt giống bình thường. Số lượng chồi/mơ cây cao nhất
thu được với giá trị pH ban đầu từ 5,5 đến 6,0. Tương tự như vậy, sự khác biệt của
chồi xảy ra khi mô sẹo nhỏ gọn màu xanh lá cây nhạt của H. enneaspermus được
chuyển sang môi trường MS được bổ sung 2,0mg/l BAP và 0,5mg/l NAA; tỷ lệ phần
trăm cao nhất của chồi hình thành mơ sẹo và số lượng chồi cao nhất đã đạt được trong
môi trường này. Các chồi của H. enneaspermus dài đến 4-5 cm trong vòng 6 tuần.
Phản ứng này có thể được cải thiện khi glucose được sử dụng làm nguồn carbon cho
một cây trồng có hoa và sử dụng nồng độ cao hơn của casein hydrolysate (500mg/l)
và kali photphat (1,86mmol/l) cho H. enneaspermus. Người ta cũng quan sát thấy
rằng sự gia tăng nồng độ NAA làm tăng chiều dài chồi lên tới 8cm H. enneaspermus
trong nuôi cấy mô. Rễ đạt được trên môi trường 1/2 MS có chứa 1,0mg/l acid indole3-butyric (IBA).
Trong ni cấy mơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) là thành phần
môi trường quan trọng trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật.
Cytokinin như benzylamino purine (BAP) và Kinetin thường được biết đến để làm
giảm ưu thế của mô phân sinh đỉnh và gây ra cả sự hình thành chồi phụ và chồi thích
2


nghi từ các mô phân sinh ở Hybanthus enneapermus. Phương pháp nuôi cấy
Hybanthus enneapermus tối ưu nhất đã đạt được bằng cách sử dụng BAP như một
chất bổ sung cho môi trường cơ bản. Hiệu quả của BAP so với Cytokinin khác trong
việc tạo ra sự nhân lên của môi trường nuôi cấy chồi ngọn đã được báo cáo trong
Hybanthus enneapermus. BAP có tác dụng rõ rệt trong việc kích thích sự phát triển,
hổ trợ tăng trưởng đầu chồi . Theo quan điểm của những điều đã nói ở trên, thí
nghiệm chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ BAP khác
nhau cùng với môi trường cơ sở MS và tối ưu hóa lượng BAP trong q trình kích
thích chồi và tăng sinh chồi của Hybanthus enneapermus được nghiên cứu.
IV.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguồn mẫu

Đối với nghiên cứu này, lĩnh vực phát triển H. enneaspermus được thu
thập từ Bộ Nông nghiệp, Đại học Annamalai, Annamalainagar, Chidambaram và
Nam Ấn Độ. Các mẫu được thu thập từ các ngọn chồi và các đoạn đốt để bắt đầu
chồi.
2. Khử trùng mẫu

Sau khi cắt bỏ, khử trùng bề mặt, các bộ phận cấy ghép chủ yếu được rửa
sạch trong nước máy trong 30 phút sau đó rửa nhẹ bằng ethanol 70% trong 60
giây và với dung dịch natri hypoclorua 5% trong 10 phút. Sau mỗi bước khử
trùng, dụng cụ cấy được rửa bằng nước cất vô trùng ba lần. Các quy trình khử
trùng tiếp theo được thực hiện trong buồng cấy, tiệt trùng khơng khí laminar bằng
cách sử dụng 0,1% HgCl2 trong 5 phút.Các dụng cụ cấy sau đó được rửa sạch năm
lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng, đặc trong buồng cấy lưu lượng khơng khí
laminar, mẫu được cắt thành từng mảnh nhỏ.
3. Cấy tạo mô sẹo

Môi trường MS, được bổ sung cytokinin và auxin được sử dụng đơn lẻ
hoặc kết hợp. Độ pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,8 và trước khi hấp,
0,6% agar (Himedia, Mumbai) đã được thêm vào mơi trường. Sau đó, quá trình
hấp được thực hiện ở 121ºC và 15psi trong 20 phút. Tiếp theo, khử trùng và cắt
lát hoàn toàn, mẫu cấy được cấy vào môi trường sau hấp để tạo mô sẹo.
3


4. Điều kiện nuôi cấy

Sau khi cấy, các môi trường ni cấy được duy trì ở nhiệt độ 25±2ºC với

chu kỳ quang 16 giờ mỗi ngày. Ánh sáng 80µEm-2s-1 được cung cấp bằng cách sử
dụng các ống huỳnh quang trắng và nguội (Philips India Ltd.). Các loại chất điều
hòa sinh trưởng thực vật BAP khác nhau được bổ sung với mơi trường MS để
kích thích chồi tốt hơn (Bảng 1). Mơi trường MS mà khơng cần thêm chất điều
hịa sinh trưởng thực vật được dùng làm đối chứng. Sau 35-45 ngày nuôi cấy,
nhiều chồi được tách thành từng mảnh nhỏ chuyển vào chai nuôi cấy 500ml chứa
50ml cùng loại trung bình để tăng số lượng chồi. Để bắt đầu tạo rễ, chồi được
chuyển sang môi trường MS 1/2 được bổ sung IAA, IBA và NAA.
5. Thích nghi

Cây con khỏe mạnh với rễ dài 5 đến 7cm đã được loại bỏ riêng lẻ khỏi các
bình ni cấy. Sau khi rửa rễ cẩn thận bằng nước máy, cây con được trổng vào
các chậu nhựa có đường kính 10cm chứa hỗn hợp cát, đất và phân hữu cơ (1:1:1)
và chúng được đặt trong nhà kính để làm cứng. Các cây được tưới bằng dung dịch
muối MS ½ mỗi tuần và được phủ một túi polythene trong 2 tuần. Sau đó, các cây
cứng dần được chuyển đến các chậu 20cm chứa đất vườn nguyên chất và giữ trên
cánh đồng để phát triển thành cây trưởng thành.
6. Chuyển ra vườn ươm

Sau khi rễ, cây con được chuyển vào các chậu nhỏ chứa các tổ hợp cát, đất
và phân hữu cơ khác nhau trong điều kiện nhà kính trong 1-2 tháng. Các cây con
sao khi thích nghi trở nên cứng hơn được cấy vào khu vực thử nghiệm để tăng
trưởng và phát triển.
7. Phân tích thống kê

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Ảnh hưởng của các phương pháp
nghiên cứu khác nhau đã được định lượng và dữ liệu được phân tích thống kê bằng
cách sử dụng lỗi tiêu chuẩn của giá trị trung bình bằng cách sử dụng phần mềm
SPSS.

4


V.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Bảng 1: Nồng độ BAP khác nhau cùng với môi trường MS
Phương pháp điều trị

Nồng độ (mg/l)

MS+BAP

0,5mg/l

MS+BAP

1,0mg/l

MS+BAP

2,0mg/l

MS+BAP

3,0mg/l

MS+BAP

4,0mg/l

Bảng 2 Kết quả của các phương pháp điều trị khác nhau của BAP cùng với môi
trường MS trong sự tăng sinh chồi
Phương pháp
điều trị

Số chồi (Trung bình
± SE)

Chiều dài chồi (cm)
(Trung bình ± SE)

Đối chứng

0,83±0,19

1.33±0.18

MS+0.5mg/l BAP

3.17±0.22

1.98±0.19

MS+1.0mg/l BAP

8,50±0,24

3.83±0.22

MS+2.0mg/l BAP

11.28±0.37

6.68±0.37

MS+3.0mg/l BAP

10,34±0,32

6,12±31

MS+4.0mg/l BAP

4.52±0.31

5,36±0,24

5


Hình 2. Các giai đoạn nhân giống in vitro của H. enneaspermus
(a) Tái sinh chồi từ các mô sẹo
(b) Bắt đầu hình thành nhiều chồi
(c) Tăng số lượng nhiều hơn
(d) Hình thành rễ từ chồi tái sinh
(e) Thích nghi và phục hồi cây tái sinh

6

KẾT LUẬN

VI.

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ BAP khác nhau đối với
sự phát triển và nhân chồi đã được nghiên cứu. Những kết quả của kích
thích chồi và hình thành chồi nhiều hơn với việc thực hiện các nồng độ khác
nhau của BAP cùng với môi trường nền MS được trình bày trong (Bảng 2).
Ngồi ảnh hưởng của kiểu gen, tốc độ tăng sinh chồi và kéo dài bị ảnh
hưởng bởi các loại cytokinin và nồng độ của chúng. Các cytokinin dựa trên
adenine được sử dụng trong một số H. enneaspermus. Đối với nhân giống in
vitro N6- benzylamino purine (BAP) là cytokinin được ưa thích nhất.
Nồng độ cytokinin ngoại sinh dường như là yếu tố chính ảnh hưởng
đến sự nhân lên. Ví dụ, Wong (1986) tuyên bố rằng khi 2,0mg/l BAP là bổ
sung trong môi trường, mỗi người trong số các mơ tạo ra trung bình 2,4
chồi, trong khi tăng nồng độ BAP lên 2,0mg/l và 3,0mg/l dẫn đến 2,6, 4,3
chồi trên mỗi bình tương ứng. Tuy nhiên, nồng độ BAP được khuyến nghị
tối ưu là 2,0mg/l đối với vi sinh vật H. enneaspermus. Trong nghiên cứu này
cũng phù hợp như 2.0mg/l BAP cho thấy kết quả tốt khi so sánh với nồng độ
thấp và cao của nó trong việc tạo chồi và nhân chồi. Do đó, nồng độ BAP
này có thể được khuyến nghị là mức tối ưu để cảm ứng và tăng sinh trong
ống nghiệm của H. enneaspermus.
VII.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

3.

4.

5.

K. R. Kirtikar và B. D. Basu, Indian Medicinal Plants, Vol IV, B/S Bishen Singh
Mahendra Pal Singh, Dehra-dun, 1981.
SN Yoganarasimhan, Cây thuốc của Ấn Độ, Tamil Nadu, Vol. 2, Cyber Media,
2000. G. Sudarsanam và G. Sivaprasad, 1995. Medical Ethnobotany of Plants
used as Antidotes by Yanadi Tribes in South India, Journal of Herbs, Spices and
Medicinal Plants, Tập 3, số 1, 1995,
pp. 57-65. doi:10.1300/ J044v0 3n0 1_07.
E. Prakash, et al., 1999. Regeneration of Plants from Seed Derived Callus of
Hybanthus enneaspermus L. Muell., a Rare Ethnobotanical Herb, Plant Cell
Report, Vol.18, pp. 873-878.
Prakash E, Sha PS, Vallikhan P, và cộng sự. 1999.  Tái sinh thực vật từ
callus có nguồn gốc từ hạt của Hybanthus enneaspermus (L.) Muell., một thứ
hiếm có thảo mộc ethnbotanical [J]. J Plant Cell Reps, 18(10): 873-878.
Priya DA, Ranganayaki S, Devi PS. Tuyển tập báo cáo các nghiên cứu khoa học
quốc tế ngành y học dành cho các bạn tham khảo đề tài: Phytochemical screening
7


6.

7.
8.

9.

and antioxidant potential of Hybanthus enneaspermus: A rare ethanobotanical

herb J Pharm Res, 2011, 4(5): 1497-1502.
Patel DK, Kumar R, Prasad SK, va ̀ cô ̣ ng sư .̣ Khả năng chống oxy hóa chống
đái tháo đường và in vitro của Hybanthus enneaspermus (Linn) F. Muell trong
chuột tiểu đường do streptozotocin gây ra [J]. Asian Pac J. Trop Bio Med, 2011,
1(4): 316-322.
The Wealth of India: A Dictionary of Indian Raw Materials and Industrial
Products-Raw Materials Series (ấn bản 2). New Delhi: Tổng cục Xuất bản và
Thông tin, CSIR, 1959.
Murashige, T. và F. Skoog. 1962. Tuyển tập báo cáo các nghiên cứu khoa học
quốc tế ngành y học dành cho các bạn tham khảo đề tài: A revised medium for
rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures Physiol. Nhà máy 15:
473-497.
SPSS, 1999. Gói thống kê cho Khoa học Xã hội (SPSS) V.11.5 cho Windows
Illinos, Hoa Kỳ: SPSS Inc.

8