Tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng saccharomyces để sản xuất chế phẩm probiotic trong chăn nuô

LỜI CẢM ƠN
Sau 3 tháng thực tập khóa luận tốt nghiệp tại Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinhHóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp
Việt Nam dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS Bùi Văn Thắng bộ môn
Công nghệ gen và ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung, tơi đã hồn thành khóa luận
tốt nghiệp của mình. Trong thời gian làm khóa luận tơi đã nhận đƣợc rất nhiều
sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo của các thầy cô giáo và sự động viên giúp đỡ từ
gia đình, bạn bè.
Lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gửi đến PGS.TS Bùi Văn Thắng bộ
môn Công nghệ gen và ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung – thầy và cơ là ngƣời trực
tiếp hƣớng dẫn chính. Thật sự vinh dự và tự hào khi tôi đƣợc thầy cô giao đề tài
và hƣớng dẫn thực hiện đề tài khóa luận. Thầy cơ đã tận tình hƣớng dẫn tơi
trong suốt thời gian thực tập làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Viện công nghệ sinh
học – Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã truyền đạt cho tôi những kiến thức,
kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trƣờng Đại học Lâm
Nghiệp.
Cảm ơn gia đình và các bạn học khóa 59-CNSH đã giúp đã giúp đỡ, động
viên tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài song do hạn chế về mặt thời gian,
kinh nghiệm bản thân và điều kiện nghiên cứu nên không thể tránh khỏi những
thiếu sót và tồn tại nhất định. Tơi kính mong nhận đƣợc những lời nhận xét,
đóng góp ý kiến của các thầy cô
Trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Mai Thị Thu

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 2
1.1. Tổng quan về probiotic ................................................................................ 2
1.1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic ................................................................ 2
1.1.2. Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp ........................................................ 3
1.1.3. Đặc điểm của chung của probiotic ............................................................ 4
1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic ........................................................ 5
1.1.5. Vai trò của probiotic đối với vật ni ....................................................... 6
1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam ...... 6
1.2. Tổng quan về Nấm men............................................................................... 7
1.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh sản .................................................... 7
1.2.2. Thành phần hóa học của tế bào nấm men ............................................... 11
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 13
2.2. Nội dung.................................................................................................... 13
2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 13
2.4. Môi trƣờng nghiên cứu .............................................................................. 14
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 15
2.5.1 Phân lập và bảo quản giống ..................................................................... 15
2.5.2. Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic ........................................... 16
2.5.3. Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi sinh vật .................. 18
2.5.4. Xác định các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thu nhận sinh
khối của nấm men ............................................................................................ 20
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 23

ii


3.1. Phân lập và bảo quản giống ....................................................................... 23
3.2. Tuyển chọn chủng có một số đặc tính nấm men .................................... 24
3.2.1. Xác định hoạt tính đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh của nấm men .. 24
3.2.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm men ....... 26
3.2.3. Khả năng đề kháng các kháng sinh của các chủng nấm men ................... 27
3.3. Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm men ............................ 28
3.3.1. Khả năng lên men các loại đƣờng ........................................................... 28
3.3.2. Kết quả sự phân giải urea và khử nitrat của nấm men. ............................ 29
3.3.3. Hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men Saccharomyces lựa chọn .............. 30
3.4. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sự tạo sinh khối tế bào của các
chủng nấm men ................................................................................................ 31
3.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian tới sự tạo sinh khối tế bào của chủng nấm men31
3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự tạo sinh khối tế bào của chủng nấm men 32
3.4.3. Ảnh hƣởng dải pH ban đầu tới sự tạo khối của chủng nấm men ............. 33
3.3.4. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sự tạo sinh khối của tế bào ...................... 33
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 35
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 1
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 5

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Chú thích

ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

CFU

Colony-Forming Unit

CMC

Carboxymethiylcellulose

ĐC

Đối chứng

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations.
Tổ chức nông nghiệp và lƣơng thực của Liên Hợp Quốc

G-

Gram âm

G+

Gram dƣơng

MT

Môi trƣờng

OD

Optical Density
Mật độ quang

STT

Số thứ tự

VK

Vi khuẩn

WHO

World Health Organization
Tổ chức y tế thế giới

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc ........................................................... 24
Bảng 3.2: Hoạt tính đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh của nấm men .......... 25
Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm men ............... 26
Bảng 3.4 : Khả năng kháng kháng sinh của các chủng nấm men ...................... 28
Bảng 3.5. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng nấm men .............. 29
Bảng 3.6: Khả năng khử nitrat và phân giải ure của nấm men. ......................... 29
Bảng 3.7. So sánh các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố của 2 chủng........... 31
Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của thời gian đến sự tạo sinh khối của các chủng nấm
men .................................................................................................................. 32
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ đến sự tạo sinh khối của nấm men ... 32
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sự tạo sinh khối của các chủng nấm
men. ................................................................................................................. 33
Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sự tạo sinh khối của chủng nấm men
......................................................................................................................... 34

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo tế bào nấm men ...................................................................... 8
Hình 1.2. Hình thái nấm men ............................................................................. 8
Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm men phân lập đƣợc .................... 23
Hình 3.2: Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định của nấm men ......... 25
Hình 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng nấm men .................. 27
Hình 3.4. Khả năng sinh enzyme protease của chủng D3, M1 .......................... 27
Hình 3.5. Khả năng sinh enzyme cellulase của chủng D3, M1 ......................... 27
Hình 3.6: Khả năng đối kháng kháng sinh ở nồng độ 30 (50) µg/ml của các
chủng nấm men ................................................................................................ 28

Hình 3.7: Khả năng phân giải urea của nấm men.............................................. 30
Hình 3.8: Khả năng phân giải nitrat của nấm men ............................................ 30
Hình 3.9 : Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men ..................... 30

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong dinh dƣỡng động vật, việc tăng cƣờng sức khoẻ hệ thống tiêu hố
của vật ni thơng qua những tác động tới hệ vi sinh vật đƣờng ruột đƣợc coi là
một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột của vật nuôi rất phong phú
về chủng loại và số lƣợng, những biến động về cơ cấu, số lƣợng các loài vi sinh
vật đƣờng ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn
trong tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông
qua thức ăn và nuôi dƣỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ƣu giữa các loài
vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ đã và đang là hƣớng nghiên
cứu đƣợc các nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc quan tâm. Có nhiều biện pháp
để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong
đƣờng tiêu hố của gia súc, gia cầm. Biện pháp cổ điển đƣợc ứng dụng rộng rãi
từ những năm 1950 của thế kỷ trƣớc là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên,
việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế, nên nhu
cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách. Một
trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic.
Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn ni có mặt trên thị
trƣờng Việt Nam nhiều nhƣng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chƣa đƣợc rõ
ràng. Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với
hệ vi sinh vật đƣờng ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất
các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nƣớc ta cịn rất hạn chế.
Tơi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học
của chủng Saccharomyces để sản xuất chế phẩm probiotic trong chăn nuôi”, lấy

nguồn vật liệu trong nƣớc để ứng dụng tạo ra chế phẩm sinh probiotic có hiệu
quả trong việc chăn nuôi.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic

1.1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic
a. Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry
Tisser (1900), một bác sỹ ngƣời Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những
đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn
những đứa trẻ khỏe mạnh.
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - ngƣời Nga, đạt giải Nobel – đã
chứng minh đƣợc rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của
hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Ơng giải thích đƣợc điều bí ẩn về sức khỏe của những
ngƣời Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115
tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên
men, điều này đƣợc ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The
Prolongation of life (1908).
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là ngƣời đầu tiên đƣa ra những đề xuất
mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về
probiotic [25, 34, 35].
Năm 1930, nhà khoa học ngƣời Nhật, Minoru Shirota phân lập các vi
khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [26].
Nghiên cứu của Luc Shiming (1980) cho thấy chế phẩm Lactobacillus
đƣợc phân lập từ gà con khoẻ mạnh có tác dụng phịng và trị bệnh tiêu chảy cấp
tính và ác tính hàng loạt ở gà.

Reverdin (1996) cho rằng Saccharomyces cerevisiae có tác dụng làm
nâng cao chất béo trong sửa dê. Nghiên cứu khác cho thấy sử dụng chế phẩm
probiotic trên gà đẻ làm tăng sản lƣợng 5% (mohal et al., 1995).
Cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển biến thức ăn, trọng lƣợng trứng
và chất lƣợng lòng đỏ (Tortuero và Fernandez, 1995).

2


Nghiên cứu của Tortuero (1989) cho thấy bổ sung hỗ hợp L. acidophilus
và S. faecium cho gà thịt giai đoạn 5-8 tuần đã cải thiện 2% tăng trọng và hiệu
quả sử dụng thức ăn chăn nuôi.
Ngày nay, các nghiên cứu về chế phẩm probiotic ngày càng đƣợc ứng
dụng rộng rãi trong và ngồi nƣớc.
b. Định nghĩa probiotic
Theo ngơn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ
probiotic đƣợc Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những
vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó
đến nay thuật ngữ probiotic đã đƣợc cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm
vi sinh vật sống hữu ích khi đƣợc đƣa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn
hoặc nƣớc uống tạo nên những ảnh hƣởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất
hiện, khái niệm probiotic vẫn chƣa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên,
hiện có hai định nghĩa đƣợc cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic
và đƣợc sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học [35, 36].
Theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức
ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa theo hƣớng có lợi
cho vật chủ”.
Theo định nghĩa của FAO/WHO năm 2002, “Probiotic đó là những vi
sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho
vật chủ”. Đây là định nghĩa đƣợc chấp nhận nhiều hơn cả.

1.1.2. Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp
Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng vi sinh vật có ích. Đó là các
tế bào sống của các chủng vi sinh vật, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp
chất sinh học có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện môi trƣờng,
đồng thời cũng có tác dụng dƣơng tính đối với sức khỏe con ngƣời khi đƣa chế
phẩm này vào đƣờng ruột. Chế phẩm probiotic thƣờng gồm các nhóm vi sinh
vật sau:
 Nhóm vi khuẩn Lactic

3


Các vi khuẩn Lactic có lợi giữ vai trị chính đƣợc sử dụng nhƣ L.
Acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subs, Lactobacillus casei, L. plantarum,
L. bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium , S. faecalis,... [24].
 Nhóm vi khuẩn Bacillus
Trong chế phẩm probiotic, ngƣời ta thƣờng sử dụng các chủng thuộc giống
Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B.
clausii [27]. Các chủng này rất có ích, khơng gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi.
 Nấm men Saccharomyces
Để sản xuất probiotic, ngƣời ta thƣờng dùng các chủng sau: S. cerevisiae,
S. carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe, đặc biệt là S. Boulardii, S. boulardii có
tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy và trị
liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [25].
 Nấm mốc
Điển hình là Aspergillusp oryzae, Aspergillusp niger. Trong chế phẩm
probiotic, chúng có vai trị sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase, … Nhằm
tăng cƣờng khả năng tiêu hóa thức ăn của con ngƣời và vật ni, đồng thời cũng có
thể đƣợc bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do

thức ăn thừa hay phân do vật nuôi bài tiết ra [24].

1.1.3. Đặc điểm của chung của probiotic
 An tồn cho ngƣời và động vật, khơng gây bệnh và khơng tạo độc tố.
 Có khả năng sống sót trong đƣờng ruột của vật chủ, chịu đƣợc pH thấp
ở dạ dày và muối mật trong đƣờng ruột, …
 Có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột để làm giảm số lƣợng vi
sinh vật gây bệnh.
 Có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh nhờ khả năng sinh chất có
hoạt tính kháng khuẩn giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
 Có lợi cho q trình tiêu hóa của vật chủ nhờ khả năng sinh một số loại
enzyme ngoại bào, …
 Có khả năng tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch và sức đề kháng của vật chủ.

4


 Có khả năng sống sót cao và giữ đƣợc đặc tính ổn định trong thời gian
dài ở điều kiện thƣờng.
 Chế phẩm có chất lƣợng cảm quan tốt.
 Đủ số lƣợng yêu cầu, đạt 108 -109 CFU/g chế phẩm.
 Phù hợp với yêu cầu sản xuất công nghiệp, quy trình ni cấy và sản
xuất đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản

1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic
Vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động
lên đƣờng tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế nhƣ cạnh tranh và đối kháng
với các vi khuẩn gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích
thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ,…
Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh: Các vi sinh vật

probiotic sẽ phát triển, chiếm ƣu thế trong đƣờng ruột bằng cách cạnh tranh về
mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dƣỡng và khối lƣợng các chất đƣợc sản sinh.
Từ đó, ức chế và tiêu diệt đƣợc vi sinh vật gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ vi
sinh vật đƣờng ruột.
Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn: Probiotic tác
động nhờ vào khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn nhƣ kháng
sinh, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo, …),
diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt, nhiều chủng vi sinh vật còn
sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn. Những chất này
có tác dụng ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh ở đƣờng ruột. Tăng cƣờng
hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đƣờng ruột.
Điều hịa phản ứng miễn dịch: Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng
điều hịa phản ứng miễn dịch thơng qua ảnh hƣởng lên lympho bào B. Ngồi ra,
vi sinh vật probiotic cịn tác động lên hệ tiêu hóa của ngƣời cũng nhƣ vật ni
bằng những cơ chế khác, nhƣ đồng hóa lactose trong sữa,...

5


1.1.5. Vai trị của probiotic đối với vật ni
Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi nhƣ gia súc, gia cầm, thủy cầm,
thủy sản. Cụ thể nhƣ sau [10]
+ Probiotic giúp phát triển hệ vi khuẩn đƣờng ruột bình thƣờng, tăng
cƣờng khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dƣỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia
súc dạ cỏ, probiotic còn giúp hệ vi khuẩn dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
+ Ức chế và có thể tiêu diệt đƣợc các vi sinh vật có hại. Làm tăng sức đề
kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật ni, phịng
chống các dịch bệnh thƣờng gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.
+ Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lƣợng thịt và tăng
năng suất chăn ni.

+ Góp phần cải thiện chất lƣợng nƣớc, chống ô nhiễm môi trƣờng nƣớc,
tăng cƣờng khả năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ nito và photpho,
kích thích sinh trƣởng của tảo, giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm,
cá…[10, 20].
+ Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nƣớc uống cho
vật nuôi sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hơi thối gây ơ nhiễm chuồng trại chăn
ni.

1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam
 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic
trên thế giới
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật
trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic
trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản
xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và
phổ biến hơn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về
sử dụng các sản phẩm probiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái
ngƣợc nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho
thấy có đáp ứng tích cực: tăng cƣờng khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ
tiêu hóa các chất dinh dƣỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn...). Bên cạnh đó
6


cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung
các chế phẩm probiotic trên lợn (Breton. J and Munoz. A): không quan sát thấy
ảnh hƣởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho
lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo; Navas Sanschez và cộng sự
(1995) : khuyến cáo rằng đối với lợn con sau cai sữa không nên sử dụng các chế
phẩm probiotic; Galassi. G và cộng sự : khơng thấy có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu
hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lƣợng ở các nhóm lợn thí nghiệm và đối

chứng đƣợc ăn thức ăn có và khơng có bổ sung probiotic... [32, 34]
Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả
nghiên cứu, nhƣng ý kiến đƣợc nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm
probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ
các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể
là ngun nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính.
 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt Nam
Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn đƣợc chủng nấm men
Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trƣờng rỉ mật, bƣớc đầu đã
đƣa ra quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này [5].
Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất
hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi
khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các
enzym α - amylase và protease dùng trong xử lý môi trƣờng nƣớc nuôi tôm, cá
và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã đƣợc
ứng dụng rộng rãi nhƣng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chƣa cao [6].
Một nghiên cứu khác vào năm 2004 của Lê Khắc Quảng (2004) cho thấy:
Công nghệ EM là một giải pháp phịng bệnh cho gia cầm có hiệu quả. Từ chế
phẩm EM1 có thể chế tạo ra các chế phẩm khác để sử dụng trong q trình chăn
ni và xử lý môi trƣờng chuồng trại [12].
1.2. Tổng quan về Nấm men

1.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh sản
Theo tài lieu của Nguyễn Thị Khả [7].
7


a. Hình thái
Nấm men có cấu tạo đơn bào, hình thái thay đổi tùy thuộc từng loại, điều
kiện nuôi cấy và giai đoạn phát triển của tế bào. Do đó nấm men có hình thái rất

đa dạng: hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình bầu dục, hình trịn, …
Một số nấm men có tế bào hình thái dài nối tiếp nhau thành những sợi nấm
gọi là khuẩn ty thể hoặc khuẩn ty thể giả. Sợi nấm chia thành hai loại khác nhau:
Sợi cơ chất giúp nấm bám chặt vào cơ chất, hấp thụ các chất dinh dƣỡng chứa
trong cơ chất và sợi khí sinh phát triển trong khơng khí, trên bề mặt của cơ chất.
Kích thƣớc tế bào nấm men thay đổi nhiều tùy thuộc vào từng giống, từng
loài, trung bình khoảng 3,5 x 5-10 μm.
b. Cấu tạo tế bào nấm men

Hình 1.1. Cấu tạo tế bào nấm men

Hình 1.2. Hình thái nấm men

Các tế bào nấm men có cấu tạo tƣơng đối phức tạp, các tế bào nấm men
khác nhau thì có cấu tạo và thành phần hóa học khác nhau. Nhƣng nhìn chung
chúng đều đƣợc cấu tạo từ các thành phần sau: [3]
 Vỏ tế bào
Vỏ tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền chắc cao, có chiều dầy là
1500-2500 nm. Khi cịn non, vỏ tế bào nấm men tƣơng đối mỏng, tuỳ theo thời
gian nuôi dƣỡng mà vỏ tế bào dày lên. Thành phần hoá học chủ yếu của vỏ tế
bào là glucan và mannan. Thành phần cịn lại là protein, một ít lipid,
poliphosphat, enzyme, sắc tố và một ít ion vơ cơ, đặc biệt vỏ tế bào còn chứa
chất kitin. Nhiệm vụ của vỏ tế bào là bảo vệ tế bào trƣớc các tác động bên ngồi,
khống chế các q trình trao đổi chất và áp suất thẩm thấu ở trong tế bào. Vỏ
cịn tạo nên hình dáng tế bào. Vỏ thƣờng chiếm 20 - 30% trọng lƣợng tế bào.
8


 Màng nguyên sinh chất
Màng nguyên sinh chất có chiều dày khoảng 7 - 8 µm cấu tạo chủ yếu là protein,

chiếm 50% khối lƣợng khơ của tế bào, cịn lại là lipid 40% và một ít polysacarit. Chức
năng của màng cũng giống nhƣ màng nguyên sinh chất của vi khuẩn.
 Nguyên sinh chất
Nguyên sinh chất đƣợc phân bố đều khắp trong tế bào, đƣợc cấu tạo chủ
yếu từ protein với một lƣợng nƣớc lớn, ở dạng dung dịch keo. Tất cả các hoạt
động sống của tế bào đều xảy ra trong nguyên sinh chất. Nguyên sinh chất là
môi trƣờng cần thiết để tế bào hoà tan các chất dinh dƣỡng, là nơi thực hiện các
phản ứng sinh hoá và liên kết chặt chẽ các thành phần trong tế bào.
 Ti thể
Là những thể hình cầu, hình que, hình sợi, kích thƣớc khoảng 0,2 - 0,5 x
0,4 - 1µm. Ty thể gồm hai lớp màng: màng trong và màng ngoài. Màng trong
có hình lƣợn sóng hay hình răng lƣợc để tăng diện tích tiếp xúc, giữa hai màng
có các hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản, bên trong ti thể là chất dịch hữu cơ.
Chức năng của ti thể
Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lƣợng khỏi
cơ chất, làm cho năng lƣợng đƣợc tích luỹ dƣới dạng ATP.
Giải phóng năng lƣợng khỏi ATP và chuyển dạng năng lƣợng đó thành
dạng năng lƣợng có ích cho hoạt động sống của tế bào. Tham gia vào việc tổng
hợp lên một số hợp chất protein, lipid, hydrat cacbon, những hợp chất này tham
gia vào cấu tạo màng tế bào. Ngồi ra ti thể cịn chứa nhiều loại men khác nhau:
oxidase, peoxidase, photphatase…
 Riboxom
Số lƣợng Riboxom thay đổi tuỳ thuộc từng loài, từng giai đoạn phát triển
và từng điều kiện ni cấy. Có hai loại riboxom: loại riboxom 70S và riboxom
80S.
 Không bào
Không bào chứa các enzyme thuỷ phân, poliphotphat, lipoit, ion kim loại,
các sản phẩm trao đổi chất, ngồi tác dụng làm kho dự trữ, khơng bào còn tham
9

gia q trình trao đổi chất và điều hồ q trình sinh trƣởng và phát triển của tế
bào nấm men. Ngồi ra cịn chứa các hạt dự trữ khác: Hạt lipid dƣới dạng các
hạt nhỏ, hạt glucogen, một ít hạt tinh bột.
 Nhân
Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có nhân thật. Nhân tế bào có
hình dạng cầu hoặc ovan và đƣợc bao bọc bởi một lớp màng, bên trong có dịch
nhân. Trong đó có một thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con. Kích thƣớc của
nhân tế bào thƣờng bằng 1-3µm. Trên bề mặt của màng nhân có các hạt
Riboxom. Trong nhân có chứa DNA, RNA, nucleprotein và các gen, do đó nhân
đóng vai trị quan trọng trong sinh sản di truyền các tính trạng cho thế hệ sau.
c. Sinh sản của nấm men
Sinh sản vơ tính: Gồm hai hình thức chính là tự phân và gián phân
Tự phân: Nhân bắt đầu chia làm hai và sau đó chia tế bào men làm hai
phần.
Gián phân: Hình thức sinh sản mọc chồi. Tế bào men tạo thành chồi, chồi
lớn dần lên và tách khỏi tế bào mẹ trở thành tế bào độc lập.
Nảy chồi là cách sinh sản vơ tính điển hình của nấm men. Khi đó thành tế
bào mở ra để tạo ra một chồi. Chồi phát triển thành tế bào con và có thể tách
khỏi tế bào mẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thể vẫn khơng tách ra ngay cả
khi lớn lên bằng tế bào mẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thể vẫn khơng tách
ra ngay cả khi lớn bằng tế bào mẹ. Nhiều khi nhiều thế hệ vẫn dính vào một tế
bào đầu tiên nảy chồi và tạo thành một cành nhiều nhánh tế bào trong giống nhƣ
cây xƣơng rồng. Chồi có thể mọc ra theo bất kỳ hƣớng nào hoặc chỉ nảy chồi ở
hai cực hoặc chỉ nảy chồi ở một cực nhất định.
Nấm men cịn có hình thức sinh sản phân cắt nhƣ vi khuẩn. Có thể hình
thành một hay vài cách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt.
Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi đƣợc sinh ra từ
các túi. Có thể xảy ra tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào
mẹ và chồi. Nếu hai tế bào nấm men có hình thái kích thƣớc giống nhau tiếp hợp

với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu hai tế bào nấm men khác nhau
10


thì đƣợc gọi là tiếp hợp dị giao. Cịn có cả sự biến nạp trực tiếp trong một tế bào
sinh dƣỡng, tế bào này biến thành túi không qua tiếp hợp. Thƣờng trong mỗi túi
có bốn hay đơi khi tám bào tử túi. Trong một số trƣờng hợp lại chỉ có 1- 2 bào tử
túi. Bào tử túi ở chi Saccharomyces có dạng hình cầu, hình bầu dục; ở chi
Hanseniaspora và lồi Hansenula anomala có dạng hình mũ, … Bề mặt bào tử
túi có thể nhẵn nhụi, có thể xù xì hoặc có gai… Bào tử màng dày là dạng bào tử
giúp nấm men vƣợt qua đƣợc điều kiện khó khăn của ngoại cảnh, chứ khơng
phải là hình thức sinh sản. Một số nấm men cịn có thể sinh vỏ nhày.
Trong chu kỳ sống của nhiều lồi nấm men, có sự kết hợp các hình thức
sinh sản khác nhau. Đối với loài nấm men Saccharomyces là loài nấm men phân
bố rộng rãi trong thiên nhiên. Chu kỳ sống của nấm men này có hai giai đoạn
đơn bội và lƣỡng bội. Đầu tiên tế bào sinh dƣỡng đơn bội (n) sinh sơi nảy nở
theo lối nảy chồi. Sau đó hai tế bào đơn bộ kết hợp với nhau có sự trao đổi của
tế bào chất và nhân hình thành tế bào lƣỡng bội (2n). Tế bào lƣỡng bội lại nảy
chồi thành nhiều tế bào lƣỡng bội khác, cuối cùng hình thành hợp tử. Nhân của
hợp tử phân chia giảm nhiễm thành bốn nhân đơn bội. Mỗi nhân đơn bội đƣợc
bao bọc nguyên sinh chất, hình thành nang, tạo thành bốn bào tử nằm trong một
túi gọi là bào tử túi. Khi túi vỡ, bào tử ra ngoài phát triển thành tế bào dinh
dƣỡng và lại phân chia theo lối này rồi tiếp tục chu trình sống.

1.2.2. Thành phần hóa học của tế bào nấm men
Về mặt thành phần hóa học của nấm men tƣơng đối ổn định, song về mặt
định lƣợng thì tùy theo điều kiện dinh dƣỡng và giai đoạn phát triển mà có sự
biến đổi cơ bản. Thành phần nấm men bao gồm; nƣớc (68-75%), protein (1314%), carbohydrat (6-8%), xenlulose (1,8%), lipid (0,9%), khoáng (1,77%).
Điều quan trọng và đáng lƣu ý nhất là thành phần nấm men chứa khá đầy
đủ axit amin không thay thế và hàm lƣợng vitamin khá cao. Tùy thuộc vào điều

kiện nuôi cấy, nấm men có thành phần hóa học khác nhau nhƣng nói chung các
chế phẩm men gia súc (độ ẩm 8%) thƣờng chứa khoảng 48 - 52% (protein), 1316% (carbohydrat), 2- 3% (lipid), 22- 40% (chất chiết không nito) và một tập
hợp vitamin thuộc nhóm B.
11


Trong tế bào nấm men có chứa khoảng 6,5-12% các chất khống. Ngồi
ra trong tế bào nấm men cịn chứa phong phú các loại nguyên tố vi lƣợng.
Lƣợng chứa axit nucleic trong tế bào nấm men thay đổi tùy theo giai đoạn phát
triển của chúng, nhìn chung lƣợng DNA khá ổn định, lƣợng chứa RNA thƣờng
đạt đến mức cao nhất (11,1 - 11,7% trọng lƣợng khô) ở giai đoạn logarit của quá
trình phát triển.

12


CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
 Phân lập đƣợc một số chủng nấm men Saccharomyces có đặc tính
probiotic và nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng phân lập đƣợc.
2.2. Nội dung
 Phân lập các chủng nấm men Saccharomyces từ nguồn mẫu nƣớc quả:
mía, dƣa hấu, nho, …
 Tuyển chọn các chủng có một số đặc tính probiotic
o Có khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh kiểm định
o Có khả năng sinh enzyme ngoại bào: amylase, protease, cellulase.
o Có khả năng đề kháng các kháng sinh
 Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển chọn
đƣợc

o Xác định khả năng phân giải urea
o Xác định khả năng khử nguồn nitrat
o Xác định khả năng lên men các loại đƣờng
o Xác định hình thái tế bào khuẩn lạc của các chủng nấm men
 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣớng đến khả năng thu nhận sinh khối của
chủng nấm men
o Ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ đến sự tạo sinh khối nấm men
o Ảnh hƣởng của yếu tố pH đến sự tạo sinh khối nấm men
o Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sự tao sinh khối nấm men
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu nƣớc lên men hoa quả nhƣ nƣớc mía, nho, dƣa hấu, …đƣợc thu
thập, thu mua tại khu vực Xuân Mai- Chƣơng Mỹ - Hà Nội.
Các chủng vi khuẩn kiểm định: Ecoli sp, Samonella sp, Shigella sp nằm
trong bộ sƣu tập giống vi sinh vật của Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh,
Viện Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp.

13


Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm 216, Viện Công nghệ
Sinh học , trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
 Thời gian thực hiện: 15 01 2017 đến 20 04/ 2018.
 Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy
lắc (vortex), lị vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím,…
- Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn,
giấy đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống
đong, que trang,… Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh
vật đều đƣợc xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
 Hóa chất:

- Hóa chất cơ bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, acid acetic,…
- Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh họá: NaOH 40%, α naphtol 10%, acid sulfanilic,… Thuốc thử lugol, phenol- Red,… Thuốc
dùng cho phƣơng pháp nhuộm Gram.
2.4. Môi trường nghiên cứu
MT Hansen: Đƣờng glucose: 50g, KH2PO4: 3g, MgSO4.7H2O: 3g,
Peptone: 10g, Thạch agar: 20g, H2O: 1000ml.
MT Agar-casein: Agar: 17g, Casein: 1g, H2O: 1000ml
MT Agar- tinh bột: Agar: 17g, Tinh bột: 1g, H2O: 1000ml
MT Agar-CMC: Agar: 17g, CMC: 1g, H2O: 1000ml
MT urea Christensen lỏng: Peptone: 1g, K2HPO4: 2g, NaCl: 5g, đƣờng
Glucose: 1g, Urea: 5g, Phenol đỏ: 0,01g; Nƣớc cất: 1000ml
MT khử nitrat: Peptone: 10g, KNO3: 1g, Nƣớc cất: 1000ml
MT MPA: Cao nấm men: 5g, Peptone: 5g, Agar: 15g, Nƣớc cất: 1000ml
MT nuôi vi sinh vật kiểm định: Cao thịt: 3g, Pepton: 5g, NaCl: 1g, Agar:
15g, Nƣớc cất: 1000ml

14


2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phân lập và bảo quản giống
 Phân lập
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên môi
trƣờng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau.
Lấy 1 ml các loại nƣớc từ sản phẩm lên men hịa tan với 9 ml nƣớc muối
sinh lí 0,9% đƣợc nồng độ 10-1. Lấy 1 ml ở nồng độ 10-1 đƣa vào ống nghiệm
chứa 9 ml nƣớc muối trộn đều đƣợc nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho
đến ống nghiệm cuối cùng có nồng độ 10-5.
Chọn các ống nghiệm có nồng độ pha lỗng 10-3, 10-4, 10-5 dùng micropipete

hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trƣờng Hansen (mỗi nồng độ
lặp lại 2 lần) và gạt đều bằng que gạt vô trùng, sau đó bao gói và bỏ vào tủ ấm ủ ở
370C trong 24 giờ, quan sát sự hình thành khuẩn lạc trên đĩa petri.
Yêu cầu: Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và phải có kí hiệu riêng
biệt để nhận biết. Tiến hành phân lập và thử nghiệm trên nhiều mơi trƣờng, bƣớc
đầu tìm ra chủng vi khuẩn mong muốn.
Phƣơng pháp bảo quản giống
Nguyên tắc: Bảo quản giống để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu
của giống và phục vụ cho nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
- Bảo quản giống trên ống thạch nghiêng
+ Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phù hợp với từng loại vi khuẩn tƣơng
ứng và ống nghiệm đã hấp khử trùng
+ Đổ môi trƣờng vào mỗi ống, để nghiêng cho khô và dùng que ria chấm
một khuẩn lạc cấy vào ống thạch theo đƣờng zic zac. Làm tƣơng tự với các
chủng khác, lặp lại mỗi chủng 2 ống.
+ Bao gói và ủ ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể cho vào tủ lạnh để bảo
quản giống. Phƣơng pháp này có thể bảo quản giống từ 1-2 tháng.
- Bảo quản ở - 800C trong glycerol
+ Chuẩn bị glycerol và ống eppendorf đã hấp khử trùng.
+ Chuẩn bị dịch canh trƣờng vi khuẩn cần bảo quản đã nuôi trong 24 giờ.
15


+ Bảo quản theo tỉ lệ 20 - 25% dịch glycerol trộn với 75 – 80% dịch canh
trƣờng vi khuẩn ni từ 16 - 18 giờ. Bao gói và cho vào tủ - 800C để bảo quản.
Phƣơng pháp này có thể bảo quản giống trong thời gian rất lâu.

2.5.2. Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic
2.5.2.1. Xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định bằng phương
pháp khoan lỗ thạch

Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Nguyễn Lân
Dũng [2, 3].
Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy vi
khuẩn vào mơi trƣờng thạch, những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì nơi đó
vi sinh vật kiểm định khơng sinh trƣởng đƣợc và tạo thành vịng vô khuẩn xung
quanh lỗ khoan.
 Nuôi lắc các chủng nấm men trên môi trƣờng dịch thể Hansen nuôi ở
300C trong 24 giờ.
 Ly tâm 5000 vòng phút (10 phút) để loại bỏ sinh khối, thu nhận dịch
nổi bên trên.
 Cấy trải các chủng vi sinh vật kiểm định Ecoli sp, Samonella sp,
Shigella sp lên môi trƣờng MPA .
 Dùng đầu cơn vơ trùng (đƣờng kính d = 9 mm) khoan lỗ ở giữa đĩa
chứa vi sinh vật kiểm định.
 Bổ sung 0,1ml dịch canh trƣờng của chủng vi sinh vật nghiên cứu vào
lỗ khoan.
 Đặt mẫu ở 40C từ 4 – 8 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ, sau đó xác định
hoạt tính đối kháng bằng cách đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn (D-d), mm.
Kết quả: Hoạt tính ức chế đƣợc đánh giá bằng hiệu số: (D – d), mm.
Trong đó
D: đƣờng kính vịng phân giải, d: đƣờng kính lỗ thạch
(D – d) ≥ 25 mm : rất mạnh; (D – d) ≥ 20 mm : mạnh; (D – d) ≥ 10 - 19,5
mm : trung bình ; (D – d) ≤ 10 mm : yếu; (D – d) = 0 : khơng kháng, kí hiệu (-).

16


Hiệu số (D - d, mm) càng lớn, hoạt tính ức chế của chủng vi sinh vật
nghiên cứu càng mạnh.
Dựa vào vòng ức chế vi khuẩn kiểm định, chọn lọc các chủng vi sinh vật

có khả năng kháng khuẩn mạnh.
2.5.2.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm men
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Nguyễn Lân
Dũng [2, 3].
Nguyên tắc: Enzyme tác động với cơ chất trong môi trƣờng thạch, cơ
chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ thạch. Độ lớn vịng
trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme.
Thử nghiệm khả năng sinh một số enzyme: amylase, protease và cellulase
thông qua các cơ chất tƣơng ứng: tinh bột, casein, CMC.
Chuẩn bị mơi trƣờng thạch có bổ sung chất cảm ứng thích hợp (1% tinh
bột, 1% casein, 1% CMC) đƣợc đổ lên đĩa peptri, sau khi môi trƣờng đông cứng
lại, tiến hành đục lỗ thạch bằng thanh kim loại vô trùng đƣờng kính 9 mm. Hoạt
hóa các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Nuôi vi khuẩn nấm men trên môi
trƣờng Hansen trong khoảng 48 - 72 giờ, ly tâm 5000 vịng/phút thu dịch
enzyme thơ. Nhỏ 0,1 ml dịch enzyme vào các lỗ đã đục, để ở 40C trong vòng 30
phút, sau đó ủ ở 370C trong 24 giờ. Nhuộm bằng thuốc thử Lugol, Coomassie
Brilliant Blue, Congo - Red để phát hiện vòng phân giải cơ chất tƣơng ứng: tinh
bột, casein, CMC.
Đo vịng phân giải D-d (mm), D là đƣờng kính vịng ngồi, d là đƣờng
kính lỗ nhỏ dịch.
Đánh giá khả năng sinh enzyme
D-d ≥ 25 mm: rất mạnh: D-d ≥ 20 mm: mạnh, D-d ≥ 15 mm: trung bình,
D-d < 10 mm: yếu.
2.5.2.3. Xác định khả năng đề kháng chất kháng sinh bằng đĩa giấy kháng sinh
chuẩn
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Nguyễn Lân
Dũng [2, 3].
17

Nguyên tắc: Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên môi trƣờng thạch,
ức chế các vi sinh vật mẫn cảm với chúng và tạo ra vịng vơ khuẩn. Những vi
sinh vật nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trƣởng và
phát triển.
Các kháng sinh đƣợc sử dụng bao gồm: Gentamycin, Streptomycin,
Tetracylin. Pha loãng kháng sinh với nƣớc cất tiệt trùng để đạt nồng độ 50
µg/ml, 30 µg/ml. Đây là các kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn ni.
Hoạt hóa các chủng đã đƣợc tuyển chọn ở các bƣớc trên. Dùng pipet vô
trùng hút 30 μl dịch huyền phù dịch vi sinh vật nhỏ vào giữa đĩa petri có chứa
mơi trƣờng thích hợp. Dùng que gạt vô trùng dàn đều khắp mặt thạch. Sau khi
mặt thạch khô, dùng cặp vô trùng cẩn thận đặt các khoanh giấy (giấy Whatman
đƣờng kính 0,9 mm) đã đƣợc tẩm kháng sinh đặt lên trên bề mặt hộp petri đã
cấy vi sinh vật sao cho các khoanh giấy cách đều nhau và cách tâm 2,5 cm. Mỗi
đĩa đặt 3 khoanh giấy kháng sinh. Đặt các đĩa vào tủ ấm 37 0C, sau 24 giờ kiểm
tra vịng vơ khuẩn xung quanh các khoanh giấy kháng sinh.
Nếu vịng vơ khuẩn từ 15 - 25 mm, VK khơng có khả năng kháng
kháng sinh; nếu vịng vơ khuẩn từ 11 - 14 mm, VK đƣợc coi là có khả năng đề
kháng rất yếu với kháng sinh; nếu vịng vơ khuẩn < 10 mm vi khuẩn đƣợc coi là
có khả năng đề kháng với kháng sinh; cịn nếu khơng có vịng vơ khuẩn thì vi
khuẩn đó đƣợc coi là có khả năng đề kháng mạnh với chất kháng sinh.

2.5.3. Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi sinh vật
2.5.3.1. Xác định khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men
Dùng 1% các loại đƣờng sử dụng thay cho glucose trong môi trƣờng
đƣờng nhƣ : D-fructose, D-mantose, lactose, saccarose.
Môi trƣờng đƣợc chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày. Đối
chứng dƣơng đƣợc cấy trên môi trƣờng chứa glucose, đối chứng âm đƣợc cấy
trên các môi trƣờng không chứa nguồn đƣờng nào. Quan sát sự thay đổi màu
của thuốc thử Phenol Red.

18


2.5.3.2. Xác định sự phân giải urea
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Nguyễn Lân
Dũng [2, 3].
Urea là diamide của acid carbonic. Những loài vi khuẩn, nấm men có
enzyme urease có khả năng chuyển hóa urea thành sản phẩm kiềm ammoniac,
làm tăng pH của môi trƣờng, dẫn đến làm thay đổi màu của chỉ thị màu. [14]
Cơ sở sinh hóa
(NH2)2CO + H2O => 2NH3 + CO2
Pha chế mơi trƣờng urea Christensen lỏng có pH là 6,8; chỉ thị màu là
phenol Red.
Cấy chủng nấm men vào môi trƣờng, ủ 370C, ni lắc 48 giờ ở 370C, 200
vịng/phút.
 Mơi trƣờng chuyển từ màu vàng sang màu đỏ hồng là thử nghiệm
dƣơng tính.
 Mơi trƣờng khơng chuyển màu là âm tính
2.5.3.3. Xác định khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nito duy nhất
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Nguyễn Lân
Dũng [2, 3].
+ Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm 4-5 ml/ống, hấp khử trùng.
+ Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dịch nuôi lỏng mẫu nấm men vào mỗi
ống nghiệm nuôi lắc trong 48 giờ ở 300C, 200 vịng/phút.
+ Chọn ống khơng cấy nấm men để làm ống đối chứng.
Kết quả
 Sau 48 giờ nuôi, cho thuốc thử Griees vào môi trƣờng trong mỗi ống
nghiệm, nếu môi trƣờng chuyển sang màu đỏ, hồng, da cam hoặc nâu thì chứng
tỏ dƣơng tính, chủng nấm men trong ống nghiệm đổi màu đó có khả năng sử
dụng nitrat.

 Đối với những ống môi trƣờng chứa chủng nấm men không chuyển
màu (màu vàng), tiếp tục thêm thuốc thử Diphenylamine vào, nếu dịch nuôi
19