Giáo Trình Thực Hành Vi Sinh Vật Y Học - Cao Đẳng Y Tế Hà Nội.pdf

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHÓ HÀ NỘI
TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TÉ HÀ NỘI

THỰC HÀNH

VI SINH VẬT Y HỌC
GIÁO TRÌNH DẠY/ HỌC
củ’ NHÂN KỸ THUẬT Y CAO ĐẲNG

HÀ NỘI - 2009

1


CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÁN ĐOÁN VI SINH VẬT BỆNH

NHIỄM KHUẤN

Kết quả xét nghiệm vi sinh vật có giá trị trong chẩn đoán bệnh căn nguyên

bệnh nhiễm trùng. Chẩn đoán vi sinh vật là xác định nguyên nhân: vi khuẩn,
hoặc/ và virus gây nhiễm trùng. Có hai phương pháp chẩn đốn vi sinh vật bệnh

nhiễm trùng là chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán gián tiếp. Bài thực tập này giới
thiệu khái quát về những công việc cơ bản của hai phương pháp trên trong chẩn

đoán các bệnh nhiễm khuẩn. Chẩn đoán các bệnh nhiễm virus sẽ được đề cập kỳ

hơn trong một bài khác.
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Trình bày khái niệm về 2 phương pháp chẩn đoán vi sinh vật bệnh

nhiễm khuẩn.
2. Trình bày 4 bước thường được áp dụng trong phương pháp chẩn đoán
trực tiếp; nêu yêu cầu và ý nghĩa từng bước.

3. Nêu nguyên tắc và kể các bước tiến hành trong phương pháp chẩn đoán
gián tiếp.

1. Chẩn đốn trực tiếp: Là tìm vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể người bệnh.

Có thể tìm được vi khuẩn bằng hai cách khác nhau: chẩn đốn nhanh và
ni cấy xác định. Tùy theo từng loại bệnh, tính chất cấp tính hay khả năng gây
dịch và tình trạng trang thiết bị của phòng xét nghiệm mà áp dụng cả hai hay chỉ

dừng lại ở chẩn đoán nhanh (bằng nhuộm soi đơn giản).
Các bước chính trong phương pháp chẩn đốn trực tiếp là:
1.1. Lây bệnh phãm:

Bệnh phẩm là những vật phẩm có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người
bệnh. Vì vậy, tùy theo từng loại bệnh mà lấy bệnh phẩm khác nhau. Bệnh phẩm

có thể là phân (ở các nhiễm khuẩn đường ruột), nước tiểu (ở các nhiễm khuẩn

2


đường tiết niệu), mủ (ví dụ ở vết thương), máu (ở nhiễm khuẩn máu), các chất
dịch (ví dụ dịch não tủy trong viêm màng não...).
Để lấy được bệnh phẩm tốt (có chứa vi khuẩn gây bệnh), phải đảm bảo

đúng 5 nguyên tắc khi lấy bệnh phẩm, đó là:
- Đúng chồ: đúng vị trí có nhiều vi khuẩn. Muốn vậy phải nắm được đường

lan chuyền và đào thải của mầm bệnh, để quyết định lấy một hoặc một số bệnh
phẩm.
-

Đúng lúc: là đúng thời điểm có nhiều vi khuẩn trong bệnh phẩm.

-

Trước khi dùng kháng sinh, hoặc sau khi dừng sử dụng kháng sinh 24

giờ.

- Đảm bảo kỹ thuật vô trùng (không gây nhiễm trùng cho người bệnh và

không đưa vi khuẩn lạ vào bệnh phẩm).
- Bệnh phẩm cần được chuyển nhanh nhất tới phòng xét nghiệm. Nếu cần
phải bảo quản bệnh phẩm ở mơi trường và nhiệt độ thích họp.
1.2. Nhuộm, soi (chân đoản nhanh):

-

Làm tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm để tìm vi khuẩn, dựa vào: hình thể,

tính chất bắt màu, kích thước và cách sắp xếp; đánh giá các loại tế bào
và mối quan hệ giữa vi khuẩn với các tế bào này (vi khuẩn nằm trong
hay ngoài tế bào).

Thường nhuộm đơn và nhuộm Gram.
- Làm tiêu bản soi tươi bệnh phẩm để tìm vi khuẩn dựa vào tính chất di

động của nó.
Kết quả nhuộm soi thường chỉ có giá trị chẩn đốn sơ bộ và định hướng

cho ni cấy. Nhưng trong một sổ trường hợp có giá trị chẩ đoán quyết định:

Chẩn đoán bệnh giang mai, hoặc bệnh lậu bằng nhuộm soi trực tiếp bệnh phẩm
đường sinh dục. Trong một chẩn đốn một số bệnh có giá trị tương đối quyết
định như nhuộm hat nhiễm sắc chẩn đoán bệnh bạch hầu, chẩn đoán bệnh dịch

hạch bằng nhuộm bệnh phẩm hạch .... Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực

3


hiện, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp, rẻ tiền và nhanh có kết quả. Vì vậy,
có thể áp dụng được ở các tuyến y tế cơ sở.

Hình . Kính hiển vi nền đen

Hình . Kính hiển vi huỳnh quang
4


- Ngày nay người cịn sử dụng trong chẩn đốn nhanh bằng một số kỹ thuật:
+ Kỹ thuật di truyền, như PCR (polymease chain reaction) để phát hiện

gien đặc thù của vi sinh vật.

+ Kỳ thuật miễn dịch để phát hiện kháng nguyên của vi sinh vật, như

huỳnh quang trực tiếp, ELISA, ngưng kết thụ động...
Các phưong pháp chẩn đoán nhanh đặc biệt quan trọng với các bệnh gây

dịch đặc biệt là các bệnh do virus (cúm gia cầm, SARS...)

Tìm vi khuẩn sau một q trình ni cấy và xác định các tính chất của nó
sẽ cho kết quả chính xác hơn, song yêu cầu thời gian lâu hơn và trang thiết bị
phức tạp hơn cách nhuộm soi.

Hình. Test nhanh

(a) Duong tính, (b) Âm tính
1.3. Ni cấy:

- Phân lập: Là tách biệt vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm bệnh. Tuỳ loại bệnh
phẩm và loại vi khuẩn mà người ta sử dụng loại mơi trường phân lập thích họp.

Nhưng thường môi trường thạch ( thạch máu, thạch thường...) được sử dụng để

cấy phân vùng nhằm tách biệt vi khuẩn.
Môi trường phân lập là mơi trường ni cấy, ngồi chất dinh dưỡng cịn có

thêm hóa chất đặc biệt, có tác dụng ức chế tạp khuẩn hay kích thích chọn lọc vi

khuẩn cần tìm phát triển.

5

- Dựa vào tính chất khuẩn lạc (hình dạng, màu sắc, độ lớn) hoặc/và tính chất
ni cấy khác mà nhận biết và tách biệt được vi khuẩn cần tìm thành dòng vi

khuẩn thuần nhất.
- Tăng sinh: Đối với bệnh phẩm có ít vi khuẩn (ví dụ máu), người ta phải tăng
sinh bằng cấy vào mơi trường kích thích Sự phát triển.

1.4. Xác định:

Phải dựa vào nhiều đặc điểm khác nhau để xác định vi khuẩn
- Xác định tính chất sinh học : Ngồi việc xác định hình thể, tính chất bắt

màu... người ta cịn phải xác định các tính chất hóa sinh của vi khuẩn bằng cách
ni cấy vi khuẩn thuần nhất vào các môi trường khác nhau.
Môi trường xác định tính chất hóa sinh có chứa những hóa chất đặc biệt để

xác định khả năng chuyển hóa, sinh enzym, tạo sản phẩm chuyển hóa... của vi
khuẩn.

- Xác định tính chất kháng nguyên (định typ huyết thanh - Serotype): Dùng

kháng thể đã biết (kháng huyết thanh mẫu) để xác định kháng nguyên (thân,
lông, vỏ) của vi khuẩn, dựa vào phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể đặc
hiệu. Vì vậy, xác định vi khuẩn bằng cách này có độ chính xác cao.

- Xác định tính chất ly giải bởi phage (định typ ly giải - Lysotype): Dùng
phage đã biết, xác định nó có ly giải vi khuẩn hay khơng ly giải được. Cách xác
định này có độ chính xác rất cao, song khó có chủng phaghe mẫu.

- Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm: bằng cách tiêm truyền cho súc
vật thí nghiệm (như chuột lang, thở, chuột nhắt trắng), theo dõi diễn biến bệnh

và tìm tổn thưong điển hình trên súc vật thí nghiệm.

6


Hình...Phùịng pháp chung thu thập và ni cấy
bệnh phâm vi khn hiếu khí và kị khí

2. Chẩn đốn gián tiếp: Là tìm kháng thể trong huyết thanh người bệnh.
Nguyên tắc: Dựa vào kháng nguyên (mầu) đã biết trước và bằng các phản

ứng kết họp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu để tìm kháng thể. Thơng qua sự

có mặt của kháng thể mà kết luận sự có mặt của kháng nguyên - vi khuẩn gây
bệnh.
Các bước tiến hành:

2.1. Lẩy bệnh phầm:

Lấy máu tĩnh mạch (khoảng 3 ml), cho vào ống nghiệm khô; để máu đông;
li tâm lấy huyết thanh, xử lý 56°C/30 phút.

Phải lấy máu 2 lần: lần I vào những ngày đầu của bệnh; lần II sau lần I

7-10 ngày.
2.2. Làm phản ứng huyết thanh:

- Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau,
thường giảm dần theo bậc 2.

- Hai mẫu huyết thanh I và II cùng được tiến hành làm phản ứng trong

cùng điều kiện.

7


- Xác định hiệu giá kháng thể (HGKT); HGKT được tính là độ huyết thanh

pha lỗng nhất mà ở đó phản ứng kết họp kháng nguyên - kháng thể còn xảy ra (+).
- Xác định động lực kháng thể (ĐLKT): So sánh HGKT của 2 mẫu huyết
thanh lần I và II để tìm ĐLKT. ĐLKT là sự gia tăng HGKT lần II so với lần I, ít
nhất là gấp 2 lần.
Khi có ĐLKT thì kết luận được: người bệnh bị nhiễm khuẩn.

Ghi chú'.
-ở một số bệnh nhất định không cần phải tìm ĐLKT mà dựa vào hiệu giá

giới hạn (là hiệu giá mà với nồng độ phản ứng dương tính bằng hoặc/ và cao

hơn được khẳng định bệnh nhân bị bệnh).
- Kỹ thuật xác định IgM trong chẩn đoán sớm cũng khơng nhất thiết phải
làm 2 lần.

Hình...Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn lâm sàng

Câu hỏi:

1. Trình bày khái niệm chẩn đốn trực tiếp và gián tiếp?

2. Trình bày 4 bước thường được áp dụng trong phương pháp chẩn đoán

phân lập vi khuẩn, nêu yêu cầu và ý nghĩa từng bước?
3. Nêu mục đích, nguyên tắc và kể các bước tiến hành trong phương pháp
chẩn đoán gián tiếp
8


CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÂN ĐỐN VIRUS HỌC
MỤC TIÊU HỌC TẬP

1.

Trình bầy được những nguyên tắc chung trong việc lấy bệnh phẩm để

phân lập virus.
2.

Vẽ và giải thích 3 sơ đồ phân lập và xác định virus.

3.

Nhận biết được hình thể tế bào bình thường và tế bào tổn thương bởi
virus.

4.

Đọc kết quả phản ứng ngưng kết hồng Cầu để xác định virus cúm.

Các bênh do virus gây ra ngày càng nhiều. Do vậy rất cần thiết chẩn đoán

xác định bệnh nhiễm virus. Hiện nay có 3 phương pháp chẩn đốn virus học:

-Chẩn đoán trực tiếp là xác định virus trực tiếp trong bênh phẩm bằng nuôi
cấy phân lập. Đây là kỳ thuật kinh điển, yêu cầu trang bị vàkỳ thuật, tốn nhiều

thời gian, nên ít được sử dụng
-Xác định virus bằng kính hiển vi điện tử hoặc kỹ thuật miền dịch hay di
truyền . Đây là những phương pháp rất hay được sử dụng hiện nay. Cho kết quả

nhanh và chính xác, nhưng tốn kém.

9


-Chẩn đốn gián tiếp hay cịn gọi là chẩn đốn huyết thanh là xác định

kháng thể đặc hiệu của virus. Nừu tìm đuợc IgM thì cho kết quả chẩn đốn sớm,
cịn IgG thì chẩn đốn muộn hơn . Đây cũng là phương phấp được sử dụng

nhiều.

1. Cách lấy và bảo quăn bệnh phẩm.

Tuỳ theo bệnh mà lấy các bệnh phẩm khác nhau ví dụ: đối với bệnh cúm
bệnh phẩm là nước xúc họng, đối với bệnh sốt xuất huyết thì bệnh phẩm là
máu... Nguyên tắc chung là phải lấy đúng lúc, đúng vị trí. Bệnh phẩm được bảo

quản lạnh, ghi rõ họ, tên, tuổi, giới tính, số bệnh phẩm, địa chỉ, ngày phát bệnh,
ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm những dấu hiệu lâm sàng chính. Gửi ngay
tới phịng xét nghiệm.

2. Các phưoìig pháp phân lập.
Hiện nay người ta thường dùng 3 phương pháp để ni cấy phân lập virus
đó là:

2.1. Phương pháp phân lập trên tế bào cảm thụ

Khi đã nhận bệnh phẩm, nếu bệnh phẩm có lẫn tạp phẩm (phân, nước xúc
họng, nước tiểu... ) cần diệt tạp khuẩn bằng kháng sinh có nồng độ thích họp

khơng ảnh hưởng tới virus. Còn những bệnh phẩm như: máu, nước não tuỷ...

thì khơng cần xử lý bằng kháng sinh.

Bệnh phẩm được gây nhiễm cho tế bào cảm thụ ở nhiệt độ và khí trường
thích họp (tỷ lệ oxy và co2 tuỳ thuộc từng virus). Trong bệnh phẩm nếu có
virus, virus sẽ làm cho tế bào bị huỷ hoại. Thời gian đọc kết quả phụ thuộc vào

chu kỳ nhân lên của từng loại virus.

Dấu hiệu huỷ hoại tế bào là: Nguyên sinh chất bị tiêu huỷ, tế bào co trịn
lại khơng bám vào được thành trai và có thể tạo ổ phá huỷ (Plaque), mơi trường

ni cấy trở nên tím đỏ.

Có hai loại tế bào thường dùng để nuôi cấy phân lập virus là tế bào tiên
phát và tế bào thường trực.

10


Mơi trường ni cấy tế bào phải có đầy đủ các axitamin, muối khống, pH
= 7,0 và có từ 5-20% huyết thanh bê đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho tế bào
phát triển và sinh sản.

Cell lysis

11


2.2. Phương pháp phân lập trên bào thai gà.

Tuỳ theo loại virus mà ta tiêm bệnh phẩm vào các vị trí khác nhau của bào
thai gà ví dụ: đối với virus đậu mùa ta tiêm vào màng niệu đệm, đối với virus
cúm ta tiêm vào khoang niệu đệm, còn virus dại ta tiêm vào bào thai...

Thông thường: dùng những quả trứng gà ấp được 8-11 ngày, soi lên đèn
trong buồng tối để xác định buồng hơi, vị trí bào thai. Dùng đinh đục một lồ ở
buồng hơi, chọc kim tiêm qua bơm khoảng 0,2mml bệnh phẩm vào vị trí để xác

định. Dùng parafin nóng chảy hàn kín lồ thùng ở buồng hơi lại, tiếp tục cho ấp ở
35-36°C, thời gian ủ tuỳ thuộc từng loại virus.
Sau thời gian nuôi cấy chúng ta gặt dịch trong quả trứng, dịch thu được sẽ

xác định sự có mặt của virus.

Amniotic cavity

Allantoic cavity
Extra-1

coelom

Chorioallanfnic
membrane
Vitelline
membrane

2.3. Phân lập virus trên động vật.
2.3.1. Chọn động vật thỉ nghiêm.

Mối loại động vật có mức độ cảm nhiễm khác nhau với từng loại virus do
đó tuỳ từng loại virus mà ta chọn động vật thí nghiệm cho thích hợp. Những

động vật được chọn phải thuần chủng, khoẻ mạnh, chưa bị nhiễm virus. Một số

12


virus cóthể nhân lên được trong các tổ chức cơn trùng như muồi, do đó người ta

cũng có thể dùng muồi để phân lập virus.
2.3.2. Cách phân lập.

Tuỳ từng loại virus mà bệnh phẩm được đưa vào những bộ phận klhác
nhau của động vật. Sau khi tiêm bệnh phẩm, động vật được nuôi dường chu
đáo. Khi thấy động vật bị bệnh, mổ lấy những bộ phận thích hợp được mang đi

xác định virus. Ví dụ: đối với virus viêm não Nhật Bản, bệnh phẩm được tiêm

vào não chuột bạch 1 -3 ngày tuổi. Khi chuột bị liệt, ta mổ lấy não để xác định
virus.

3. Xác định sự có mặt của virus.
Người ta thường dùng phản ứng ngưng kết hồng cầu để xác định sự có mặt

của virus, với những virus có kháng nguyên ngưng kết hồng cầu.
- Nguyên lý của phản ứng là: ở một số virus (cúm dengue) khi gặp hồng
cầu (ngồng, gà) ở pH nhất định thì sẽ làm hồng cầu ngưng kết.

- Phản ứng được tiến hành trên phiến nhựa. Dung dịch chứa virus được
pha loãng bậc hai, Hồng cầu có đậm độ như nhau ở mọi giếng.

- Cách đọc: Giếng nào có hiện tượng ngưng kết hồng cầulà dưong tính:
(+).

Giếng nào hồng cầu lắng là âm tính (-).

Hiệu giá virus được tính ở giếng nào có lượng virus được pha lỗng nhất
mà vẫn cịn dưong tính.

4. Định týp virus.
Người ta thường dùng các phản ứng: ngăn ngưng kết hồng cầu, kết hợp bổ

thể, trung hoà và miễn dịch huỳnh quang để định týp virus dựa vào kháng thể

đặc hiệu đã biết.

13


Reciprocal serum dilution
*


# c?

<$>

♦

Well number

Agglutinated
mat

Nonagglutinated
pellet

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. Trình bầy được những nguyên tắc chung trong việc lấy bệnh phẩm để

phân lập virus.
2. Vẽ và giải thích 3 sơ đồ phân lập và xác định ơirus

3. Nhận biết được hình thể tế bào bình thường và tế bào tổn thương bởi

virus.

4. Đọc kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu để xác định virus cúm

14


sử DỤNG VÀ BẲO QUẲN KÍNH HIẾN VI CĨ VẬT KÍNH
DẦU ĐÈ SOI TIÊU BẲN NHUỘM VI KHUẨN
MỤC TIÊU HỌC TẬP

1- Thực hiện đúng các thao tác tìm vi trường; tìm được hình ảnh rõ nét của vi
khuẩn trong thời gian khơng q 5 phút.
2- Chỉ đúng vị trí, mơ tả đúng hình thể và ước lượng được kích thước gần đúng

của vi khuẩn; chỉ ra được các loại tế bào (nếu có) và nói rõ mối quan hệ giữa vi khuẩn
và tế bào.
3- Vẽ đúng hình thể, tính chất sắp xếp của 6 loài vi khuẩn đại diện cho 3 loại

hình thể vi khuẩn, trên 6 tiêu bản đã được soi.
4- Thực hiện đúng việc lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận của kính hiển

vi về tư thế họp lý sau khi sử dụng.

Để quan sát hình thể vi khuẩn bằng kính hiển vi có vật kính dầu, trước hết phải

có tiêu bản đã được nhuộm, ở bài thực tập tiếp theo, sinh viên sẽ được làm tiêu bản

nhuộm vi khuẩn, ở bài thực tập này, chỉ sử dụng kính hiển vi có vật kính dầu để quan
sát hình thể vi khuẩn trên tiêu bản đã được nhuộm sẵn.

Trước khi đến thực tập bài này, mồi sinh viên cần làm nhũng việc sau đây:
1- Ôn lại nhũng kiến thức về sử dụng và bảo quản kính hiển vi có vật kính dầu.
2- Ơn lại bài lý thuyết về hình thể vi khuẩn.

3- Đọc bài thực tập này.
1. Cách tìm vi trường

Quy ước "tìm thấy vi trường" là khi điều chỉnh nhìn thấy được hình ảnh của vật

soi (vi khuẩn, tế bào...).

1.1. Nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản, đặt lên mâm kính, tiêu bản phải nằm sát mặt
mâm kính và được giữ chắc.
1.2. Xoay vật kính dầu về đúng hãm.

1.3. Nhẹ nhàng hạ vật kính (hoặc nâng mâm kính, tùy loại kính hiển vi) để vật

kính và tiêu bản sát nhau. Trong lúc làm công việc này, mắt khơng nhìn vào thị kính

15


mà nhìn vào khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản để tránh vỡ tiêu bản. Tuy nhiên, để

biết vật kính đã chạm vào tiêu bản hay chưa, chủ yếu dựa vào cảm giác của tay.
1.4. Điều chỉnh để có ánh sáng thích họp. Trong đa số các trường họp soi tiêu
bản đã nhuộm vi khuẩn, chúng ta cần có ánh sáng tối đa. Cách điều chỉnh để có ánh

sáng tối đa như sau:

- Nâng tụ quang lên hết mức.
- Mở hết chắn sáng.
- Bỏ lọc sáng.
- Dùng gương lõm và điều chỉnh gương để ánh sáng tập trung vào tụ quang.

1.5. Mắt nhìn vào thị kính, tay xoay vít đại cấp (vít lớn - nâng vật kính hoặc hạ
mâm kính, tùy loại kính hiển vi). Động tác này làm thật chậm và đều (khơng giật cục).

Khi thấy hình ảnh thì dừng ngay rồi điều chỉnh vít vi cấp (vít nhỏ) cho rõ nét.

Lưu ý:

+ Trường họp xoay vít đại cấp nhiều (vật kính đã tách khỏi giọt dầu trên mặt tiêu
bản) mà vần khơng thấy xuất hiện hình ảnh gì, thì phải làm lại từ động tác 1.3.

+ Trường họp đã thống thấy hình ảnh, dùng lại điều chỉnh vít vi cấp khoảng
một vịng mà vẫn khơng thấy vi trưịng thì khơng cố tình xoay vít vi cấp đến hết cỡ

mà cũng phải làm lại từ động tác 1.3.
Ocular
(eyepiece) -

Body —

Nosepiece —
Objective lens (3) —
Mechanical Stage­
Coarse
adjustment knob

stage —

Stage adjustment —

Fine
adjustment knob

iser ins adjustment —

Illuminator lens —
Subslage condenser
adjustment knob

Light switch­
on base

16


Hình . Kính hiên vi quang học

Hình . Vật kính dầu

2. Cách soi tiêu bản

Mắt nhìn vào thị kính, một tay cầm vít vi cấp để điều chỉnh cho hình ảnh luôn

luôn rõ nét, tay kia vặn xe tiêu bản để chuyển dịch vị trí quan sát. Phải soi một cách

tuần tự theo đường "dích dắc".

Hình 1. Chuyển dịch vị trí quan sát
theo đường "dích dắc"

2.1. Quan sát tiêu bản nhuộm từ vi khuẩn đã được nuôi cấy phân lập

Đối với các tiêu bản nhuộm từ vi khuẩn đã được phân lập: chọn nơi vi khuẩn

không quá dày, quan sát xác định hình thể, tính chất bắt màu, tính chất sắp xếp và ước

lượng kích thước.
2.2. Quan sát tiêu bản nhuộm từ bệnh nhân

Trong tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm, ngồi vi khuẩn cịn có tế bào. Nói chung

tìm vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm khó hon trên tiêu bản nhuộm từ vi
khuẩn đã phân lập. Nhiều trường họp, nếu không soi một cách hệ thống và đủ thời

gian thì sẽ bỏ sót, kết luận là khơng tìm thấy vi khuẩn. Nếu thấy vi khuẩn cũng xác

định hình thể, tính chất bắt màu, tính chất sắp xếp và kích thước.
Việc tìm tế bào vừa có ý nghĩa trong chẩn đốn, vừa để có định hưóng cho ni

cấy phân lập, nhất là trong trường họp không quan sát thấy vi khuẩn. Trong bệnh
phẩm lấy từ ổ viêm mủ có thể thấy nhiều bạch cầu đa nhân; trong các viêm đặc hiệu

17


(ví dụ lao hay virut) lại thấy nhiều bạch cầu đon nhân. Bệnh phẩm từ đường hô hấp,

đường tiết niệu, thì ngồi bạch cầu đa nhân cịn có thể thấy thêm tế bào biểu mơ. Bệnh

phẩm hồn tồn khơng thấy tế bào bạch cầu đa nhân, thường không cần tiến hành ni

cấy phân lập.
Bệnh phẩm có bạch cầu đa nhân thì nên điều trị kháng sinh ngay, nếu chỉ thấy
bạch cầu đơn nhân thì khơng nên dùng kháng sinh.

Khi quan sát các tiêu bản làm từ bệnh phẩm, cần quan tâm đến mối quan hệ giữa
vi khuẩn và tế bào: vi khuẩn nằm trong hay ngoài tế bào? tế bào cịn ngun vẹn hay
bị phá vỡ? Nhũng vi khuẩn có hình thể đặc trung như lậu cầu, não mơ cầu, phế cầu,

dịch hạch,... nếu thấy nằm trong tế bào bạch cầu đa nhân, ngồi giá trị định hưóng cho
ni cấy phân lập cịn có giá trị chẩn đốn cao.
2.3. Cách xác định kích thước vi khuẩn

Trước hết xác định kích thước hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên vi trường.
Nếu kính hiển vi có gắn thước đo, ta điều chỉnh để chiều cần đo cảu vi khuẩn nằm dọc

theo thước, ta sẽ biết kích thước chính xác của hình ảnh.
Nếu kính hiển vi khơng gắn thước đo, ta phải ước lượng kích thước gần đúng

của hình ảnh vi khuẩn hoặc vật thể trên vi trường.

Khi đã biết kích thước hình ảnh vi khuẩn, ta tính kích thước thật của vi khuẩn
như sau:

Kích thước thật =

Kích thước hình ảnh vi khuẩn trên vi trường

_____________________________________________
Độ phóng đại của thị kính X Độ phóng đại của vật kính

Đon vị đo độ lớn của vi khuẩn thường được dùng là micromet (p).
3. Lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận về tư thế họp lý

Cuối buổi thực tập, phải lau ngay vật kính dầu.
- Nâng vật kính (hoặc hạ mâm kính) để tiêu bản cách xa khỏi vật kính.
Chú ý: Khơng nâng vật kính lên quá cao hay hạ mâm kính xuống quá thấp.

- Nhấc tiêu bản ra khỏi mâm kính.
- Xoay vật kính tới vị trí dễ lau nhất, dùng khăn sạch, tẩm xylen vừa ẩm (nếu quá
đẫm thì chờ một lát cho xylen bay hơi bớt), lau khẩu kính đến khi có cảm giác tron là

được.
- Điều chỉnh các bộ phận của kính hiển vi về tư thế họp lý (tư thế nghỉ).

18


- Lau bụi hoặc hơi nước rồi chụp khăn phủ kính hoặc đặt kính vào hộp có chất

hút ẩm.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1- Thực hiện đúng các thao tác tìm vi trường với vật kính dầu?
2- Cho biết những gì cấn đặc biệt lưu ý đẻ tìm được hình ảnh rõ nét của vi khuẩn.

3- Chỉ đúng vị trí, mơ tả đúng hình thể và ước lượng được kích thước gần đúng của

vi khuẩn; chỉ ra được các loại tế bào (nếu có) và nói rõ mối quan hệ giữa vi khuẩn và

tế bào.
4- Vẽ đúng hình thể, tính chất sắp xếp của 6 loài vi khuẩn đại diện cho 3 loại hình

thể vi khuẩn, trên 6 tiêu bản đã được soi.
5- Thực hiện đúng việc lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận của kính hiến vi

về tư thế họp lý sau khi sử dụng

19


PHA CHẾ MỘT SÓ THƯỚC NHUỘM VÀ CÁC PHƯƠNG
PHÁP NHUỘM VI KHUẲN
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1- Chuẩn bị đủ các phương tiện cần thiết để pha chế và nhuộm vi khuẩn.
2- Thực hiện pha chế các loại thuốc nhuộm của 3 phương pháp nhuộm thông

thường (gram, xanh methyl en, Zieh-neelsen).
3- Tiến hành nhuộm và nhận định kết quả 3 phương pháp nhuộm trên.

1. Pha chế thuốc nhuộm

1.1. Pha chế thuốc nhuộm gram

Nội dung

TT

1

Chuẩn bị dụng cụ: lọ sạch loại 200 ml có nút kín, ống đong

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

2,0

pipet, giấy lọc, cân, cối sứ
2

3

4

Pha thuốc nhuộm tím gentian:

- Tím gentian nồng độ 1/10 trong cồn etylic 95° 10 ml

1,0

- Acid phenic 1 ml

0,5

- Nước cất 100 ml

0,5

Lắc đều, lọc qua giấy lọc

0,5

Pha dung dịch lugol
- lod 1 g

0,5

- Kali iodua 2 g

0,5

- Nước cất 5 ml

0,5

Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200 ml

1,0

Pha thuốc nhuộm fucsin kiềm
- Fucsin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn etylic 95° 10 ml

1,0

- Acid phenic 1 ml

0,5

- Nước cất 100 ml

0,5

Lắc đều, lọc qua giấy lọc

1,0

20


1.2. Pha chế thuốc nhuộm Ziehl - Neelsen

Nội dung

TT
1

Chuẩn bị dụng cụ: các lọ sạch có nút, ống đong, pipet, cân

2

Pha dung dịch fucsin của Ziehl

- Dung dịch A:

- Dung dịch B:

3

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

1,0

fucsin kiềm 0,3 g

1,0

cồn etylic 10 ml

0,5

acid phenic 5 g

1,0

nước cất 95 ml

0,5

Trộn dung dịch A với dung dịch B

1,0

- Pha dung dịch con acid: cồn etylic 95° 100 ml

0,5

Dung dịch HC1 30% 100 ml

1,0

- Dung dịch xanh methylen kiềm:
- Dung dịch A:

- Dung dịch B:

xanh methylen 0,3 g

1,0

cồn etylic 95° 30 ml

0,5

dung dịch KOH 0,01% 100 ml

1,0

Trộn dung dịch A với dung dịch B

1,0

1.3. Pha chế thuốc nhuộm Albert

TT

Nội dung

1

Chuẩn bị dụng cụ: các lọ sạch có nút, ống đong, pipet, cân, giấy

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

2,0

lọc, cối chày sứ
2

Pha dung dịch I:

Xanh toludin

0,15 g

1,0

Lục malachit

0,2 g

1,0

Acid axetic

1 ml

0,5

Cồn 95°c

2 ml

0,5

Nước cất

100 ml

0,5

Nghiền xanh toluidin và lục malachit trong cối sứ

1,0

Cho cồn vào khuấy tan, cho acid axetic rồi cho nước. Đổ vào lọ

1,0

Để tủ ấm 37°c/24h, lọc qua giấy lọc

1,0

21


3

Pha dung dịch II:

Kali clorua

2g

0,5

lod

3g

0,5

Nước cất

300 ml

0,5

1.4. Pha chế dung dịch xanh methylen để nhuộm đơn xanh methylen (xem trong phần thuốc
nhuộm Ziehl - Neelsen)

2. Một số phương pháp nhuộm vi khuẩn
2.1. Nhuộm gram

TT
1

Nội dung

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

Chuẩn bị phương tiện:

- Dụng cụ: lam kính sạch, que cấy, đèn cồn, pipet nhỏ giọt, giá

1,0

nhuộm, giá cắn, bocan, đồng hồ...

- Hóa chất:

1,0

+ Thuốc nhuộm tím gentian
+ Dung dịch lugol
+ Cồn 90°
+ Dung dịch fucsin kiềm
+ Nước muối sinh lý

- Vi khuẩn hoặc bệnh phẩm

2

0,5

Tiến hành nhuộm

- Đánh dấu lam kính

0,5

- Dùng que cấy dàn vi khuẩn hoặc bệnh phẩm lên lam kính, để

1,0

khơ

- Cố định tiêu bản bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3-4 lần

0,5

- Phủ kín dung dịch gentian 45 giây, rửanước

0,5

- Nhỏ dung dịch lugol 1 phút, đổ đi

0,5

- Tẩy màu bằng cồn 90° đến khi bạc màu, rửa nước (30" - T)

0,5

- Phủ thuốc nhuộm fucsin kiềm 30 giây, rửa nước, để khô

0,5

- Soi dưới lánh hiển vi

0,5

22


3

Nhận định kết quả

- Vi khuẩn gram (+): vi khuẩn bắt màu tím

1,5

- Vi khuẩn gram (-): vi khuẩn bắt màu đỏ

1,5

Gram stain

Hình. Nhuộm Gram

Hình . Vi khuẩn Gram (+) và Vi khuẩn Gram (-)

23


2.2. Nhuộm Ziehl - Neelsen

Nội dung

TT
1

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

Chuẩn bị phương tiện:

- Dụng cụ: lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắn, bơcan,

1,0

que bơng cán kim loại

- Hóa chất: các thuốc nhuộm Ziehl - Neelsen

1,0

- Bệnh phẩm: đờm hoặc các dịch khác như dịch màng não,

0,5

nước tiểu...
2

Tiến hành nhuộm

- Đánh dấu tiêu bản

0,5

- Dùng que cấy lấy bệnh phẩm dàn tiêu bản, dàn rộng và mỏng,

1,0

để khô

- Cố định tiêu bản bằng cách nhỏ 1 giọt cồn 90° lên tiêu bản rồi

1,0

đốt cháy cồn hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3-4 lần
- Phủ thuốc nhuộm fucsin Ziehl kín hết bệnh phẩm, dùng que

1,0

bơng cồn đốt cháy nhẹ dưới lam kính đến khi trên mặt đồ phiến

bốc hơi thì thơi, đốt như vậy 3 lần. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ
- Tẩy màu với hồn hợp cồn acid bằng cách nhúng tiêu bản vào

0,5

bình chứa con acid, khi nào đưa lên chỉ còn vết đỏ nhạt là được.

Rửa nước.
- Nhuộm xanh methylen 30 giây, rửa nước, để khơ soi kính

0,5

hiển vi
3

Nhận định kết quả
- Vi khuẩn lao kháng con acid: bắt màu đỏ

2,0

- Các vi khuẩn khác: bắt màu xanh

1,0

24


2.3. Nhuộm Albert

Nội dung

TT
1

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

Chuẩn bị phương tiện:

- Dụng cụ: lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắn, bơcan,

1,0

đồng hồ

2

3

- Hóa chất: dung dịch I, dung dịch II

1,0

- Bệnh phẩm: là chất ngoáy họng hoặc vi khuẩn bạch hầu

0,5

Tiến hành nhuộm

- Đánh dấu tiêu bản

0,5

- Dùng que cấy lấy bệnh phẩm dàn tiêu bản, để khô

1,0

- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, hơ 3-4 lần

0,5

- Nhỏ dung dịch 1 lên bệnh phẩm đã dàn 15 phút, rửa nước

1,0

- Nhỏ tiếp dung dịch 11 để 1 phút, rửa nước, để khơ

1,0

- Soi kính hiển vi

0,5

Nhận định kết quả
- Trực khuẩn bạch hầu bắt màu xanh, trên thân có những hạt

2,0

nhiễm sắc bắt mầu đậm hơn, hai đầu hạt nhiễm sắc to đậm

- Các vi khuẩn khác: bắt màu xanh

1,0

2.4. Nhuộm xanh methylen

Nội dung

TT
1

Điểm

Điểm

chuẩn

đạt

Chuẩn bị phương tiện:

- Dụng cụ: lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắn, bơcan,

1,0

đồng hồ

2

- Hóa chất: thuốc nhuộm xanh methylen

0,5

- Bệnh phẩm: mủ, dịch, đờm...

1,0

Tiến hành nhuộm

- Đánh dấu tiêu bản

0,5

- Dùng que cấy lấy bệnh phẩm dàn tiêu bản, để khô

1,0

25