bài giảng công nghệ tế bào chương 4 công nghệ sinh học tế bào người và động vât

BÀI GIẢNG: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO
Khoa: Cơng nghệ sinh học – môi trường
Th.s Vưu Ngọc Dung


CHƯƠNG 4. CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TẾ BÀO NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT
1
2
1.
3
4
5

Cơng nghệ tế bào động vật có vú
Tế bào động vật
Môi trường nuôi cấy
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Các ứng dụng công nghệ tế bào động vật

Tài liệu tham khảo: Phạm Thành Hổ, Nhập môn công nghệ sinh học, NXBGD.


CƠNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CĨ VÚ
Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật
Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật


CÁC ƯU ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc
phịng bệnh, điều trị hoặc chẩn đốn.

 Đáp ứng được q trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản
phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical).
 Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen: các bệnh ung
thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, các
bệnh tim mạch và xơ hóa u nang.
 Sản xuất các tế bào động vật làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu
độc chất học và dược học.
 Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các
cơ quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp: Da nhân
tạo (bỏng), Mô gan (viêm gan), Đảo Langerhans (tiểu đường).



MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Kích thước lớn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật.
 Tốc độ sinh trưởng chậm và sản lượng thấp.
 Dễ bị biến dạng và vỡ (bao bọc bởi màng huyết tương).
 Môi trường nuôi cấy chưa được xác định một cách đầy đủ và
phải bổ sung huyết thanh máu.
 Mơ đã phân hóa hơn là một cơ thể đơn bào như vi sinh vật.
 Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên
một bề mặt.



TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Các tế bào dịch huyền phù
 Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết khơng điển
hình, dạng thể lỏng.
 Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền

phù (suspension cells), hoặc khơng dính bám khi chúng sinh
trưởng trong ni cấy in vitro.
 Các tế bào khơng dính bám khơng địi hỏi bề mặt để sinh trưởng.
 Ni cấy trong môi trường dịch lỏng tương tự vi khuẩn.
Các tế bào dính bám
 Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám,
vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng.
 Các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi
(fibroblast).


(c)
(a)

(b)

Hình : Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy.
(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi


MƠI TRƯỜNG NI CẤY
Động vật khơng trao đổi chất nitrogen vô cơ, bổ sung nhiều
amino acid và vitamin vào môi trường.
 Môi trường: các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân
tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose và bổ sung 2-20% huyết
tương của động vật có vú (bị con trong bụng mẹ).
 Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng cơng thức mơi
trường khơng có huyết thanh, hormone và các nhân tố sinh
trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh.


Thành phần

Nồng độ

Thành phần

(mg/L)

Thành phần môi trường Eagle (1959)

1. L-Amino acid

Nồng độ
(mg/L)

3.Vitamin

Arginine

105

Choline

1

Cystine

24

Folic acid

1

Glutamine

292

Inositiol

2

Histidine

31

Nicotinamide

1

Isoleucine

52

Pantothenate

1

Leucine

52

Pyridoxal

1

Lysine

58

Riboflavin

0,1

Methionine

15

Thiamine

1

Phenylalanine

32

4. Muối

6800

Threonine

48

NaCl

400

Tryptophan

10

KCl

200

Tyrosine

36

CaCl2

200

Valine

46

MgCl2.6H2O

150
2000

2. Carbohydrate

1000

NaH2PO4.2H2O

Glucose

5-10%

NaHCO3

Serum


KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Sản xuất các sản phẩm sinh-dược bằng nuôi cấy dịch huyền phù
trong hệ lên men.
 Cánh khuấy có dạng hình mái chèo.
 Cung cấp oxygen bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone, do
khơng tạo bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng.
 Mơi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra
hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ.
 Dịng tế bào dính bám cần một hệ thống chất mang như là
microcarrier.
 Các dòng tế bào thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4,

NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người.



1. CƠ CHẾ CHUYỂN GEN
Gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiên mã
(promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào.
 Gen chọn lọc-selector (gen chỉ thị chọn lọc- selectable marker)
cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào được biến
nạp và không biến nạp, dihydrofolate reductase (DHFR)và
glutamine synthetase (GS).
 Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc sau khi chuyển gen vài ngày đã
cho phép phân lập các tế bào tái tổ hợp sống sót.
 Sự chọn lọc xảy ra khi thiếu chất chuyển hóa thích hợp trong môi
trường (hypoxantine và thymidine: DHFR hoặc glutamine: GS),
ngăn cản sự sinh trưởng của các tế bào không biến nạp.



Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót được chuyển vào bình
ni cấy, và được phát triển để sản xuất các quần thể vơ tính
(clonal populations).
 Cuối cùng, đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp để
chọn ra dịng có khả năng sản xuất cao nhất.
 Từ những dịng này, một dịng tế bào có tốc độ sinh trưởng
thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản xuất
protein tái tổ hợp.
 Q trình ni cấy sau đó sẽ được thiết lập và tối ưu hóa cho
sản xuất.


Chuyển gen

Sàng lọc

Phát triển
q trình

Chuyển
nhiễm

Tạo thành
mạch thẳng

Chọn lọc
Các dịng tế
bào vơ tính

số lần cấy chuyển

Tối thiểu 12 tháng

Hình 6.2. Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình ni
cấy để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i.).


2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
Chuyển nhiễm (hóa biến nạp)
 Xung điện

 Lipofection
 Liposome
 Viral vector
 Vi tiêm
 Bắn gen
Mỗi phương pháp đều đòi hỏi sự tối ưu cao, bao gồm các yếu tố
như: số lượng tế bào, nồng độ DNA, các vector biểu hiện.



PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN NHIỄM (TRANSFECTION)
Dùng calcium phostphate hay dextran sulfate mở các lỗ trên màng
để DNA xâm nhập.
 DNA được chuyển nhiễm thường tái tổ hợp trước khi hợp nhất,
thể hội nhập mang nhiều bản sao DNA trong tế bào.
 Hiệu quả chuyển nạp có thể tăng khi được xử lý dimethyl
sulfoxide (DMSO) hoặc glycerol sau khi chuyển nhiễm.
 Xử lý sốc bằng chloroquindiphosphate gây độc cao.
 Mức độ độc thay đổi giữa các dòng tế bào, đặc biệt các tế bào nuôi
cấy dịch huyền phù và các tế bào phân hóa ở giai đoạn cuối.
 Khi thay đổi calcium phosphate bằng DEAE-dextran thì chuyển
nhiễm DNA có thể ít độc hơn với mọi xử lý sốc sau chuyển nhiễm
ở tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và tế bào phân hóa.



PHƯƠNG PHÁP LIPOFECTION
Sử dụng lipid trung tính hoặc mang cation tạo thành liposome.
 Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích DNA
dính bám vào trong phần bào tan (cytosol).

 Hiệu suất chuyển nạp cao hơn chuyển nhiễm bằng DEAEdextran hoặc calcium phostphate.
 Các liposome mang cation (lipofectin) thích hợp cho chuyển nạp
gen in vitro với hiệu suất trên 90% ở một số loại tế bào nuôi cấy.
 Lipofectin được sử dụng để bọc các virus, các liposome chứa
protein virus trong lớp lipid cải thiện hiệu quả gắn của vector với
các tế bào đặc biệt như tế bào ung thư gan (liver hepatocytes).
 Liposome được dùng để phân phối in vivo và ex vivo các gen
người tới tế bào đích thích hợp.



PHƯƠNG PHÁP XUNG ĐIỆN (ELECTROPORATION)
Dòng điện tạo ra các lỗ thủng trên màng huyết tương và DNA
theo gradient mật độ chui vào trong phần bào tan.
 Phương pháp này được sử dụng trong nuôi cấy dịch huyền phù
lymphocyte (lympho bào).
 Sử dụng để chuyển gen vào các tế bào mầm phôi.



PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM (MICROINJECTION)
Vi tiêm phân phối DNA trực tiếp vào trong nhân tế bào mà
không gây nguy hiểm màng tế bào.
 Đặc trưng của vi tiêm là tạo ra các động vật chuyển gen.
 Thực hiện liệu pháp sửa chữa gen in vivo.
 Gen thay thế phải được thiết kế thích hợp để thực hiện tái tổ hợp
tương đồng giữa DNA ngoại lai và DNA nội sinh.
 Ở chuột chuyển gen, hệ thống mơ hình in vivo đánh giá hiệu quả
của biện pháp thay thế gen.
 Mơ hình động vật cho hội chứng Lesch-Nyhan để đánh giá các

quy trình chuyển nạp gen in vivo, cho dù bệnh học của động vật
hiếm khi tương tự như ở người.



PHƯƠNG PHÁP DÙNG SÚNG BẮN GEN (GENE GUN)
Sử dụng các hạt kim loại như tungsten (volfram) hoặc vàng làm
vi đạn.
 Vi đạn được bọc bằng DNA và đi với một vận tốc thích hợp để
xâm nhập vào tế bào đích.
 Hiệu quả tương đương với phương pháp chuyển nhiễm.
 Súng bắn gen và vi tiêm trực tiếp DNA trần của plasmid bị hạn
chế đối với tim và các tế bào cơ xương của động vật.
 Các phương thức hầu hết đều thích hợp cho liệu pháp DNA
vaccine, một lượng nhỏ protein là đủ để tạo ra một phản ứng
miễn dịch



PHƯƠNG PHÁP DÙNG CÁC VIRAL VECTOR
Đây là các cấu trúc tái tổ hợp trong đó một hoặc nhiều gen của
virus được thay thế bởi DNA tạo dòng.
 Virus mang DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào đích đặc trưng
và phân phối tải trọng di truyền vào trong chúng.
 Viral vector điều hịa biểu hiện gen khi có mặt promoter và
enhancer của virus.
 Các viral vector có nguồn gốc từ hầu hết các virus DNA.
 DNA của provirus được sản xuất nhờ phiên mã ngược RNA của
retrovirus như là một bản sao đơn trong nhiễm sắc thể vật chủ.
 Các viral vector đặc biệt được thiết kể để phân phối DNA ngoại

lai vào trong các tế bào phân hóa, các tế bào mầm phôi, các
lymphocyte.



Chọn lựa một phương pháp chuyển gen thích hợp phụ thuộc vào
mục đích thí nghiệm và loại tế bào đích (dính bám hay dịch huyền
phù).
 Nồng độ DNA dùng trong thí nghiệm chuyển gen thay đổi từ 1 ng
đến 10 µg cho 105-106 tế bào nhận.
 Số lượng bản sao đưa vào trong các tế bào nhận (tế bào vật chủ)
tỷ lệ với kích thước của vector, đoạn chèn và nồng độ DNA.
 Các cấu trúc mạch thẳng hợp nhất thông qua tái tổ hợp cao hơn
khoảng 10 lần các cấu trúc mạch vòng.



CÁC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Sản xuất vaccine virus: bệnh bại liệt, viêm gan B, quai bị,
sởi, dại (người); lở mồm, long móng (gia súc)…
 Sản xuất các protein (bao gồm protein trị liệu và tái tổ
hợp): interferon, kháng thể và các hocmone trị liệu…
 Các chế phẩm miễn dịch: các kháng thể đơn dịng
 Cơng nghệ tế bào gốc dùng trong liệu pháp tế bào, nhằm
đưa tế bào bình thường thay thế tế bào bệnh.
 Sinh sản vơ tính



CÁC KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

Các tế bào bạch huyết (lymphocytes) cần cho các phản ứng miễn
dịch.
 Các B-lymphocyte (lá lách, u bạch huyết và máu): sản xuất kháng
thể (antibody) gọi là immunoglobulin khi một chất ngoại lai đi
vào cơ thể.
 Các kháng thể nhận ra hình dạng của yếu tố quyết định đặc hiệu
trên bề mặt của chất ngoại lai gọi là kháng nguyên (antigent).
 Các kháng thể liên kết với kháng nguyên đặc hiệu, trung hòa và
đào thải các chất ngoại lai.
 Là công cụ phát hiện sự hiện diện thuốc, virus, vi khuẩn, hormone
và các kháng thể khác trong máu.
 Có 5 loại kháng thể là immunoglobulin G, A, M, D và E.



Có nhiều dịng B-lymphocyte và mỗi dịng sản xuất ra các kháng
thể khác nhau.
 Khi một động vật được tiêm một tác nhân miễn dịch, thì nó phản
ứng bằng cách sản xuất ra một hỗn hợp kháng thể đa dạng hầu
như không thể phân chia được.
 Để sản xuất một lượng lớn kháng thể đồng nhất (kháng thể đơn
dòng) chỉ nhận ra một cấu trúc hóa học, phải cho sinh trưởng
được một dòng tế bào đặc biệt của B-lymphocyte.



Vùng liên kết
kháng nguyên

Kháng nguyên

Yếu tố quyết định
kháng nguyên

Chuỗi nặng
Vị trí liên kết
kháng ngun

Chuỗi nhẹ

Vùng có thể thay đổi

Vùng khơng thể
thay đổi
a. Cấu trúc cơ bản của kháng thể

b. Vị trí liên kết kháng ngun có
kháng thể liên kết