Đồ án chuyên môn: Nghiên cứu sản xuất Protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Đồ án chuyên môn GVHD:
MỞ ĐẦU 4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 5
1.1. Tình hình nghiên cứu 5
1.2. Cấu tạo hoá học 6
1.2.1. Phân loại 7
1.4. Cơ chế tác dụng ([5]) 8
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5]) 9
1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ ([E]) 9
1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 10
1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm 11
1.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 13
1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ 13
1.5.6. Ảnh hưởng của pH 13
1.6. Nguồn thu nhận ([4]) 14
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 16
2.1. Tình hình nghiên cứu 16
2.2. Cấu tạo 16
2.3. Cơ chế tác dụng 18
2.4. Nguồn thu nhận 18
3.1. Đặc điểm cấu tạo([3]) 19
3.2. Vai trò của giống ([3]) 20
3.3. Yêu cầu của giống ([3]) 20
3.4. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9] 21
3.4.1. Nuôi cấy bề mặt 21
3.4.2. Nuôi cấy chìm 21
3.5. Nguyên liệu sản xuất 22
3.6. Phương pháp phân lập 23
3.6.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên 23
3.6.2 . Phân lập giống trong điều kiện sản xuất 23
3.6.3. Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng 24

3.7. Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae 24
SVTH: Trang 1
Đồ án chuyên môn GVHD:
3.8. Phương pháp bảo quản 25
3.8.1 .Phương pháp cấy chuyền 25
3.8.2. Phương pháp làm khô 25
3.8.3. Phương pháp đông khô 26
3.8.4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu 26
CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG 27
NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 27
4.1. Sơ đồ quy trình 27
4.2. Thuyết minh qui trình 28
4.2.1. Môi trường 28
4.2.2. Nuôi cấy 28
4.2.3. Chế phẩm thô 30
4.2.4. Trích ly 30
4.2.5. Kết tủa enzyme 31
4.2.6. Ly tâm 32
4.2.7. Hệ thống sấy phun 33
CHƯƠNG 5 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS. ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 35
5.1. Giới thiệu chung về nước mắm 35
5.2. Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm 36
5.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 36
5.3.1. Hệ enzyme Metalo-protease 36
5.3.2. Hệ enzyme serin-protease 36
5.3.3. Hệ enzyme acid-protease 36
5.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm 37
5.5. Qui trình sản nước mắm 38
5.6. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 39

5.6.1. Hải sản 39
5.6.2. Nước 39
5.6.3. Muối 39
5.6.4. Nấm mốc Asp.oryzae 39
5.7. Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa 40
SVTH: Trang 2
Đồ án chuyên môn GVHD:
5.7.1. Chượp chua 40
5.7.2. Chượp đen 41
5.7.3. Chượp thối 41
5.7.4. Nước mắm thối 42
5.8. Bảo quản 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
SVTH: Trang 3
Đồ án chuyên môn GVHD:
MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thơi gian gần đây là
nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy
chục năm qua, đó là những khám phá về cấu trúc hóa học và các cơ chế tác dụng kỳ diệu
của enzyme- xúc tác sinh học. Enzyme đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong nghành công
nghiệp hiện đại.
Trước đây enzyme enzyme được dùng trong nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất
thường được thu nhận từ động vật, thực vật. Trong những năm gần đây người ta bắt đầu
chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền. Đó là nguồn enzyme được
tách chiết từ vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh do đó có thể tạo ra một
lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme này có hoạt lực
xúc tác rất cao. Do đó, chúng được ứng dụng cho nền sản xuất enzyme.
Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease
đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá

thành chế phẩm protease còn khá cao (giá trị buôn bán 187.2 triệu USD). Do đó, cũng hạn
chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình
nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm
20 – 30%. Với để tài: “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus.
oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm” nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết
cao và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống xã hội là rất cần thiết.
SVTH: Trang 4
Đồ án chuyên môn GVHD:
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độ
đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống và
là chất xúc tác sinh học. Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme
có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. Enzyme không
những có thể xúc tác cho phản ứng trong cơ thể sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống,
ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia
trong phản ứng do enzyme xúc tác gọi là cơ chất của enzyme, ký hiệu là S.E có tính đặt
hiệu cao nghĩa là một emzyme chỉ tác dụng trên một hoặc một số cơ chất nhất định.
Từ thập kỉ trước enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến nhưng mới chỉ
có tính chất kinh nghiệm thuần tuý. Công nghệ enzyme ra đời là một bước bước phát triển
ứng dụng của enzyme. Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới,
một giai đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau như hoá học protein, sinh học
phân tử….Do đó, có được những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc,
động học….Tạo điều kiện để sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản
phẩm, hiệu quả ứng dụng ngày càng cao.
Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải
thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học cũng như
enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không
chỉ trong lĩnh vực truyền thống mà còn cả trong những vực mới tạo ra sản phẩm mới.
1.1. Tình hình nghiên cứu
Trước thế kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần tuý người

xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sản
xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang….
Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemom
người Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí
trong quá trình lên men.
SVTH: Trang 5
Đồ án chuyên môn GVHD:
Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều
là những quá trình hóc học.
Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn như công
trình nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày. Công trình này do Reaumur (người
Pháp) bắt đầu và sau đó được Sapallanzani (người Ý) mở rộng. Các tác giả đã cho thịt vào
ống kim loại và đưa vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá.
Năm 1836, Schwann đã gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin).
Từ năm 1800 người ta còn thấy rằng trong ruột còn có một enzyme phân giải protein
khác. Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin.
Nửa đầu thế kỉ XIX người ta đá tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên
liệu khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chất
tạo nên quá trình lên men.
Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính
chất cơ bản của enzyme.
Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnh
hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng
enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hoá học của
enzyme là protein….Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại để nghiên cứu
enzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme.
1.2. Cấu tạo hoá học
Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acid
kết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa
nhóm α - carboxyl của amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin của amino acid

tiếp theo, loại đi một phân tử nước. Theo cách kết hợp này các liên kết peptid nằm trên
một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu tận cùng gọi là “đầu N” (có nhóm α - amin
tự do và amino acid thứ nhất), kí hiệu bằng dấu “+”và “đầu C” (có nhóm α - carboxyl tự
do của amino acid cuối cùng, kí hiệu bằng dấu “-“. Đánh dấu thứ tự các gốc amino acid
trong phân tử bắt đầu từ “đầu N” Trong một số trường hợp đầu N và đầu C có thể kết hợp
với nhau, phân tử có cấu trúc vòng.
SVTH: Trang 6
Đồ án chuyên môn GVHD:
Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme
một thành phần hoặc protein phức tạp, gọi là protein hai thành phần hay holoenzyme.
Phân tử holoenzyme bao gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần không
phải prorein gọi là coenzyme. Coenzyme có vai trò quan trọng để thực hiện chức năng
xúc tác, loại bỏ coenzyme sẽ làm mất khả năng xúc tác. Trong một số trường hợp, chỉ
riêng coenzyme cũng là chất xúc tác nhưng không hiệu quả bằng khi kết hợp với
apoenzyme. Cùng một coenzyme khi kết hợp với apoenzyme khác nhau tạo thành các
holoenzyme khác nhau, xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá khác nhau nhưng giống
nhau về kiểu phản ứng. Coenzyme còn có vai trò làm bền enzyme.
Apoenzyme có vai trò quan trọng với tính đặc hiệu của enzyme và tăng hiệu quả xúc
tác của coenzyme.Coenzyme thường là các chất dẫn xuất của các vitamin hoà tan trong
nước. Vì vậy khi thiếu một vitamin nào đó sẽ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme tương
ứng trong tế bào, vi phạm quá trình trao đổi chất trong cơ thể, gây nên các bệnh đặt trưng.
1.2.1. Phân loại
Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế
đã trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loại
enzyme. Người ta chia enzyme ra làm 6 lớp.
1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử.
2. Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị.
3. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân.
4. Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ưng phân cắt không cần nước.
5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá.

6. Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng
liên kết giàu năng lượng của ATP…
Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp).
Tên enzyme thường được gọi: Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng
thêm tiếp vĩ ngữ ase.
SVTH: Trang 7
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.3. Tính chất
Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số
enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.
Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các
dung môi không phân cực.
Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môi
trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.
Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation,
anion hay trung hòa điện.
Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin,
amylase và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)
1.4. Cơ chế tác dụng ([5])
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian
enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm.
Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ
chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải
qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau.
E + S → ES → P + E
Hình 1.1. Cơ chế tác dụngcủa enzyme
SVTH: Trang 8
Đồ án chuyên môn GVHD:
Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là
sản phẩm (Product)

Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng
lượng hoạt hóa thấp.
Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên
kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất.
Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng trở lại trạng thái
tự do ban đầu để quay vòng xúc tác.
Hình 1.2. Một ví dụ minh họa sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5])
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc
tính và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất
vô cơ và hữu cơ khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hoá enzyme). Các yếu tố hoá lý
không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu như đối với các phản ứng hoá học
bình thường mà còn ảnh hưởng đến cấu trúc không gian, độ bền của cấu trúc không gian,
độ tích điện của phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó.
1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ ([E])
Nói chung, trong điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào
E]:v = k[E]
SVTH: Trang 9
Đồ án chuyên môn GVHD:
V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme
v
20 40 60 80
Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc của phản ứng
Nồng độ E quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc của phản ứng đã thay đổi
theo thời gian. Theo sơ đồ này nên chọn nồng độ [E]
3
sẽ có được sự phụ thuộc tuyến tính
giữa V vào thời gian trong khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định v
o

. Do đó nên tiến
hành lựa chọn nồng độ enzyme trước khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu động
học phản ứng enzyme
1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phương trình hóa học biểu diễn theo
phương trình động học Michaelis – Menten.


Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu tại điểm đó,
tất cả các phân tử enzyme đã thực hiện chức năng xúc tác của mình thì nó được gọi là tốc
độ phản ứng tối đa với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong
dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì sự
gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của Enzyme. Đó là vì tất cả
các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hoà bởi cơ chất.
SVTH: Trang 10
[E]
1
[E]
2
[E]
3
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm
Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phản
ứng do enzyme xúc tác.
Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh
Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dụng lên
trung tâm hoạt động của enzyme, chất kìm hãm choán chỗ của cơ chất ở enzyme.
Hình 1.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh
Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất

kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm
hãm hoàn toàn.
1/v = (αK
m
/V
max
) 1/S +1/V
max
α = 1+[I]/K
I
Hình 1.5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất có kiềm hãm cạnh tranh
SVTH: Trang 11
Đồ án chuyên môn GVHD:
Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xảy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có
sự tương đồng về mặt hoá học chẳng hạn như malic acid có cấu trúc gần giống với
succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác
cho sự biến đổi succinic acid thành acid fumaric acid.
Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là
1/Vmax
Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh
Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà
không liên kết với enzyme tự do.
Hình 1.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh
Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp
Hình 1.7. Kiểu kìm hãm hỗn tạp
SVTH: Trang 12
Đồ án chuyên môn GVHD:
Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với
cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P.
1.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông
thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong
nước như Mg
2+
hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như
pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP).
Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào
nồng độ.
1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ
Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trừơng,
hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên
10
0C
thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần.
Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng
chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên
trên 40-50
0C
xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do
enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh
với các phản ứng vô cơ thông thường.
Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp
enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-60
0C
, cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất
cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệt
các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao.
1.5.6. Ảnh hưởng của pH
Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay
đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử

enzyme. Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết
mỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc
phản ứng do chúng xúc tác.
SVTH: Trang 13
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.5.7. Các yếu tố khác
Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau
có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có
tác động yếu nhất
Ánh sáng vùng tử ngoại: có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung
dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng
thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ.
Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh.
Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những
gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme.
Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất
hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng.
1.6. Nguồn thu nhận ([4])
Các loại enzyme hiên nay rất phong phú và đa dạng có thể thu từ nhiều nguồn khác
nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật.
+ Động vật: có mặt trong tuyến tụy và nước bọt của động vật
+ Thực vật: có nhiều trong cây dứa, đu đủ xanh, trong dịch ép thân cây sung
+ Vi sinh vật: Bacillus, Penicillium, Pseudomonas, Rhizopus….
1.7. Ứng dụng
1.7.1. Trong thực phẩm
Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiện
tại có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào như sản
xuất sữa, bánh mì, bia, công nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa……
1.7.2. Trong nông nghiệp
Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt

là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để
chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất.
SVTH: Trang 14
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.7.3. Trong y học
Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh…
SVTH: Trang 15
Đồ án chuyên môn GVHD:
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE
2.1. Tình hình nghiên cứu
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở
nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không
chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất
quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công
nghệ gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần đây giá trị của enzyme công
nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân
(75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp
(59%)
2.2. Cấu tạo
Nhóm enzyme protease (peptitd – hidrolase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
peptitd (-CO-NH-) trong phân tử protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acid
amind. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển
acid amin.
Hình 2.1. Cấu trúc không gian của protease
SVTH: Trang 16
Đồ án chuyên môn GVHD:
Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase. ([7])
Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại:
Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly

peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.
Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly
peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti.
Dựa vào động lực hcọ của cơ chế xúc tác, endo peptidase được chia thành 4 nhóm:
Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm
các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại
enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường
hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài
proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động
ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các
asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở PH trung tính.
Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, proteinase được phân loại đơn giản hơn thành 3 nhóm Proteinase acid:
pH từ 2 – 4, Proteinase trung tính: pH từ 7 – 8, Proteinase kiềm: pH từ 9 – 10
SVTH: Trang 17
Đồ án chuyên môn GVHD:
2.3. Cơ chế tác dụng
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của
enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình
xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian.
E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian)

2.4. Nguồn thu nhận
Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn như
các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật…
Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày
niêm mạc ruột non, tuyến tụy)…. Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc
cao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi.
Thực vật: Papain từ mủ thu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin tách từ dịch ép
thân cây sung
Vi sinh vật: phân bố chủ yếu ở nấm mốc vi khuẩn và xạ khuẩn…gồm các loại thuộc
Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium…
SVTH: Trang 18
Đồ án chuyên môn GVHD:
CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE
3.1. Đặc điểm cấu tạo([3])
Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân
gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số
này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus
niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor,
Aspergillus oryzae… -
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,
protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.
Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương
theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để
sản xuất tương.
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có
nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh
lợt có ít vàng.
Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang
màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.

Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức
an gia súc
Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ
sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…
SVTH: Trang 19
Đồ án chuyên môn GVHD:
Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi
trường….
3.2. Vai trò của giống ([3])
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năng
suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu
tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh
vật.
3.3. Yêu cầu của giống ([3])
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản
phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình
trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất.
+ Giống phải cho năng suất sinh học cao
+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản
xuất công nghiệp.
+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm
tại địa phương.
+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần
khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách
chiết, tinh sạch
+ Dễ dàng bảo quản và ổn định

SVTH: Trang 20
Đồ án chuyên môn GVHD:
Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men
công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
3.4. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9]
3.4.1. Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt
chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã được
tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất phụ gia
là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm
bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể
bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất
kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này
nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi
sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế
phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần
khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có
thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá

trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường
phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích
nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
3.4.2. Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là
đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng
tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi
cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy
chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy
SVTH: Trang 21
Đồ án chuyên môn GVHD:
nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất
cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả
năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện
nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên
do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá
thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng
loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.
3.5. Nguyên liệu sản xuất
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi
trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào
hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của
chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất
cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng của
enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, H, ON. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P,

S, Fe, K và các chất vi lượng khác như.
3.5.1. Nguồn cacbon ([8])
Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit
arabinoza glactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease.
Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường
tinh bột lớn hơn 8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh
tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5%
sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.
SVTH: Trang 22
Đồ án chuyên môn GVHD:
3.5.2. Nguồn nitơ ([2]), ([8])
Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH
4,
H
2
PO
4
là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã
chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép
quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi
lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp
enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
3.6. Phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những
nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà
vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp
nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .
3.6.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên,
được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên,
khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi trường cố
định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện chúng thích
nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết.
3.6.2 . Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện
sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện.
Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc
điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
SVTH: Trang 23
Đồ án chuyên môn GVHD:
Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng hợp
cao
3.6.3. Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào vi
sinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá.
3.7. Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae
Qui trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những miếng
khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô trùng
và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khác chứa
90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10
-3

, 10
-4
.
Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA
Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng
quanh khuẩn lạc
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy.
Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h.
Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống
thạch nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường
Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm
KH
2
PO
4
1,4g MgSo
4
0,1g
NH
4
NO
3
10g FeSo
4
0,01g
KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5
Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ.
Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.

SVTH: Trang 24
Đồ án chuyên môn GVHD:
3.8. Phương pháp bảo quản
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã được
kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo
quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị
ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính
ban đầu.
3.8.1 .Phương pháp cấy chuyền
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường
thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi
cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ
lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn
lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi
bất lợi không thể lường hết được).
Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ
trong đất để khử trùng. Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm,
người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát
triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh
lý. Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn và
rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến
hư hỏng giống gốc.
3.8.2. Phương pháp làm khô
Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được
khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống
khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn,
một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm. Phương pháp
làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, giống như
phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.
SVTH: Trang 25