Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất trung gian nhằm phân hủy thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ nấm đảm basidiomycetes (khóa luận tốt nghiệp)

1HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT TRUNG GIAN NHẰM PHÂN HỦY THUỐC BẢO
VỆ THỰC VẬT CHLORPYRIFOS BỞI ENZYME
LACCASE TỪ NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES

HÀ NỘI – 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT TRUNG GIAN NHẰM PHÂN HỦY THUỐC BẢO
VỆ THỰC VẬT CHLORPYRIFOS BỞI ENZYME
LACCASE TỪ NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES

Sinh viên thực hiện

: Hồng Thị Ngọc Anh

Khóa

: 63

Ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Chu Nhật Huy
GS.TS. Phan Hữu Tôn

HÀ NỘI – 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của bản thân. Các
số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được cơng bố
trước đó.
Sinh viên thực hiện

Hồng Thị Ngọc Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS. Chu Nhật Huy đã tạo điều
kiện và giúp đỡ em hồn thành đợt thực tập khóa luận tại phịng Cơng nghệ Sinh
học Tái tạo Mơi trường – Viện Công nghệ Sinh học và hướng dẫn cho em các kỹ
thuật, phân tích kết quả thu được.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đào Thị Ngọc Ánh và
các anh chị cán bộ nghiên cứu của phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo Mơi

trường đã tận tình chỉ dạy và giới thiệu cho em những dụng cụ, máy móc của
phịng cũng như hướng dẫn em sử dụng một số thiết bị máy móc và một số kỹ
thuật trong phịng thí nghiệm.
Em xin gửi lời cản ơn đến GS.TS. Phan Hữu Tôn và các thầy cô trong bộ
môn SHPT và CNSH ứng dụng cũng như các thầy cô trong khoa Công nghệ
Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đợt thực tập và đạt kết quả cao
nhất của lần thực tập khóa luận này.
Lời cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè, những người ln ủng hộ,
giúp đỡ em, để em có thể hồn thành khóa luận tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày tháng

năm 2022

Sinh viên

Hoàng Thị Ngọc Anh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................... vii
TÓM TẮT .......................................................................................................... viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU................................................................................................ 1

1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos .......................................... 3
2.1.1. Tính chất của chlorpyrifos .......................................................................... 3
2.1.2. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đến môi trường và con người........................ 4
2.1.3. Tình hình sử dụng chlorpyrifos tại Việt Nam ............................................. 5
2.2. Tổng quan về enzyme laccase ........................................................................ 6
2.2.1. Giới thiệu về enzyme lacccaes .................................................................... 6
2.2.2. Cấu tạo của enzyme laccase ........................................................................ 6
2.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme laccase ............................................................ 7
2.2.4. Tính chất của enzyme laccase ..................................................................... 8
2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme laccase từ vi sinh vật .............................................. 9
2.2.6. Vai trò và ứng dụng của enzyme laccase .................................................. 10
2.3. Tổng quan về nấm đảm basidiomycetes ...................................................... 10
2.4. Tổng quan về chất trung gian ....................................................................... 11
2.5. Một số nghiên cứu về sử dụng enzyme laccase phân hủy chlorpyrifos ...... 13
2.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography) ................................................................................................ 14
2.6.1. Khái niệm .................................................................................................. 14
iii


2.6.2. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................... 15
2.6.3. Pha động trong săc ký pha đảo .................................................................. 15
2.7. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ............................................................................ 16
2.8. Tổng quan về vùng ITS ................................................................................ 16
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18
3.1. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 18

3.1.1. Vật liệu và thiết bị ..................................................................................... 18
3.1.2. Hóa chất..................................................................................................... 18
3.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 18
3.2.1. Nuôi cấy và sinh tổng hợp enzyme laccase .............................................. 18
3.2.2. Định danh vi nấm ...................................................................................... 19
3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi nấm FAL1 .............................................. 19
3.2.2.2. Phương pháp PCR và định danh vi nấm ................................................ 20
3.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ của laccase sử dụng cơ chất ABTS ......... 22
3.2.4. Phương pháp chiết chlorpyrifos từ môi trường nuôi cấy .......................... 24
3.2.5. Ảnh hưởng của chất trung gian đến sự phân hủy chlorpyrifos ................. 25
3.2.6. Xác định hàm lượng chlorpyrifos bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) ................................................................................................. 27
3.2.7. Phân tích số liệu ........................................................................................ 28
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 29
4.1. Xác định hoạt tính enzyme laccase từ các chủng nấm trong bộ sưu tập giống
............................................................................................................................. 29
4.2. Định danh vi nấm ......................................................................................... 30
4.3. Xây dựng đường chuẩn chlorpyrifos ........................................................... 33
4.4. Phương pháp chiết xuất chlorpyrifos ........................................................... 35
4.5. Khả năng phân hủy và ảnh hưởng của chất trung gian đến sự phân hủy
chlorpyrifos của enzyme laccase ......................................................................... 39
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 44

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại vùng ITS ................................................... 17
Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR ...................................... 21

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 21
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR....................................................... 21
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng xác định hoạt tính của enzyme ..................... 23
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng chọn phương pháp chiết ................................ 24
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng nghiên cứu ảnh hưởng của chất trung gian ... 26
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng ảnh hưởng của chất trung gian (set đối chứng)
........................................................................................................................... 27
Bảng 4.1. Hoạt tính laccase của các chủng nấm được hoạt hóa ....................... 29
Bảng 4.2. Kết quả về độ chính xác của phương pháp phân tích ....................... 34
Bảng 4.3. Tỷ lệ thu hồi CPF của các phương pháp chiết xuất .......................... 36
Bảng 4.4. Khả năng phân hủy CPF bởi laccase và ảnh hưởng của chất trung gian
ở nồng độ 6mM ................................................................................................. 41

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cơ chế xúc tác của laccase .................................................................... 8
Hình 2.2. Sơ đồ vị trí các mồi trên rDNA ........................................................... 17
Hình 4.1. Sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu nấm FAL1 ................................ 30
Hình 4.2. Sản phẩm PCR khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 .................... 31
Hình 4.3. Hình thái chủng nấm FAL1................................................................. 32
Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc của FAL1 ............................................................ 32
Hình 4.5. Sắc ký đồ Chlorpyrifos........................................................................ 34
Hình 4.6. Đồ thị đường chuẩn CPF thể hiện sự tương quan giữa nồng độ chất
phân tích và diện tích peak trung bình ................................................................ 35
Hình 4.7. Sắc ký đồ của các phương pháp chiết ................................................. 37
Hình 4.8. Mẫu sử dụng phương pháp chiết n-hexane với ACN và n-hexane với
isopropanol sau khi để tĩnh 30 phút .................................................................... 38
Hình 4.9. Biểu đồ thể hiện hoạt tính của enzyme laccase trong 5 ngày ủ .......... 40

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic axit)

ACN

Acetonitrile

BVTV

Bảo vệ thực vật

CPF

Chlorpyrifos

HBT

1-hydroxybentotriazole

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ITS

Internal Transcribed Spacer

NCBI

National Center for Biotechnology Information

SKPĐ

Sắc ký pha đảo

SKPT

Sắc ký pha thuận

TCMP

3,5,6-trichloro-2-methoxypyridine

TCP

3,5,6-trichloro-2-pyridinol

TMP

3,5,6-trichloro-2-methypyridine

vii

TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số chất trung gian giúp
tăng cường khả năng phân hủy chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ nấm đảm
Basidiomycetes. Trong bốn chủng nấm đảm Basidiomycetes được ni cấy, hoạt
hóa trên mơi trường thạch PDA và được lên men trong môi trường PDARb,
chủng Pycnoporus FAL1 đã được chọn làm nguồn enzyme để thực hiện phản
ứng phân hủy do enzyme có hoạt tính cao nhất trong các chủng đã hoạt hóa.
Phương pháp chiết chlorpyrifos được thực hiện với hai loại dung môi là nhexane và ethyl acetate. Phản ứng phân hủy chlorpyrifos được thực hiện với bốn
loại chất trung gian là violuric acid, syringaldehyde, acetosyringone, 1hydroxybentotriazole (HBT) ở nồng độ 6 mM, nồng độ chlorpyrifos là 20 ppm,
lượng enzyme được cố định là 800 µl, được ủ trong đệm citrate phosphate trong
điều kiện bóng tối ở 30℃, pH 5.0. Kết quả đã ghi nhận được HBT là chất trung
gian giúp làm tăng khả năng phân hủy của enzyme laccase, đạt 9,25 % và ba
chất trung gian còn lại, đặc biệt là acetosyringone, đã làm ức chế khả năng phân
hủy chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ chủng FAL1.

viii


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đóng vai trị rất quan trọng trong nơng
nghiệp trồng trọt, chúng cải thiện năng suất và chất lượng của cây trồng cũng
như làm hạn chế sự tác động từ sâu bệnh hại. Tuy nhiên, đi đôi với những lợi ích
này là những tác hại của thuốc BVTV đến môi trường. Sự tồn đọng của của các
chất dư lượng sau khi sử dụng thuốc BVTV trong môi trường đất và nước đã nổi
lên như một nguy cơ tiềm ẩn đối với hệ sinh thái. Vì vậy, việc loại bỏ dư lượng
thuốc bảo vệ thực vật tích lũy từ mơi trường bị ô nhiễm là điều cần thiết để làm
giảm tác động nguy hiểm của chúng.
Chlorpyrifos (CPF) là thành phần chính trong một loại thuốc trừ sâu lân
hữu cơ, được sử dụng thường xuyên trên các hệ thống cây trồng khác nhau để

hạn chế nhiều loại côn trùng như rệp, sáp, sâu đục thân, …. Hiện nay, ở nước ta
đang sử dụng một số thuốc bảo vệ thực vật như Monifos, Paragon 555EC,
Overagon, … có chứa thành phần chính là CPF. Do có phổ tác động rộng và tính
tồn dư lâu, CPF gây hại cho nhiều côn trùng không mục tiêu và gây ô nhiễm môi
trường trên cạn và dưới nước (Bouchard & cs., 2011). Chất này gây suy nhược
thần kinh và các bệnh về cơ ở người và động vật do khả năng ức chế hoạt động
của acetylcholine esterase (Zhang & cs., 2008). Ngoài ra, chất này cũng đã được
WHO xếp vào loại chất cấm sử dụng vào năm 2016. Vì vậy, việc loại bỏ CPF
tích lũy trong mơi trường là việc làm hết sức cần thiết.
Có nhiều cách xử lý sự tồn dư của CPF trong môi trường như bằng quy
trình hóa học hợp lý, sử dụng bãi chơn lấp (vật lý) và đốt rác thì khơng hiệu quả
nhiều. Phân hủy bằng vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm, thường được coi là một
phương pháp khử nhiễm tiết kiệm, hiệu quả cao và thân thiện với môi trường.
Nấm đảm basidiomycetes là loài nấm được biết đến với việc có khả năng sản
xuất được enzyme laccase cao, theo một số nghiên cứu đã chứng minh enzyme
này có thể phân hủy được chất ô nhiễm hữu cơ như CPF (Wang H. & cs., 2013).
1


Thời gian phân hủy CPF chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi chủng loại nấm được sử
dụng (Maqbool Z & cs., 2016; Maya K & cs., 2012). Pravin D. & cs. (2021) đã
sử dụng chủng nấm gỗ mục trắng Trametes hirsute MTCC-1171 sinh enzyme
laccase phân hủy được một số loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ chứa CPF thành
2,4-bis (1,1-dimethylethyl) phenol. Xiaoting Jin & cs. (2016) đã tối ưu hóa điều
kiện để phân hủy thuốc trừ sâu CPF bằng enzyme laccase từ Trametes
versicolorc, trong đó có sử dụng một số các chất trung gian như vallin, violuric
acid, acetosyringone.
Do đó, đề tài “nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất trung gian nhằm
phân hủy thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ nấm đảm
basidiomycetes” đã được tiến hành.

1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được một số chất trung gian giúp tăng cường khả năng phân hủy
chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ nấm đảm basidiomycetes.
1.3. Yêu cầu
- Nuôi cấy nấm và chiết xuất, kiểm tra hoạt tính ban đầu của enzyme
laccase.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất trung gian đến hoạt tính của
enzyme laccase phân hủy chlorpyrifos.

2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos
2.1.1. Tính chất của chlorpyrifos
Theo Luật bảo vệ và kiểm định thực vật Việt Nam số 41/2013/QH13 ban
hành năm 2013, đã định nghĩa thuốc BVTV như sau: “Thuốc BVTV là chất
hoặc hỗn hợp các chất chế phẩm vi sinh vật có tác dụng phịng ngừa, ngăn chặn,
xua đuổi, dẫn dụ, tiêu diệt hoặc kiểm soát sinh vật gây hại thực vật, điều hòa
sinh trưởng thực vật hoặc côn trùng, bảo quản thực vật, làm tăng độ an tồn,
hiệu quả khi sử dụng thuốc.”
Chlorpyrifos (CPF) hay cịn gọi chlorpyrifos ethyl là một hoạt chất thuốc
trừ sâu lân hữu cơ Organophosphate, được sử dụng để quản lý nhiều loại dịch
hại trên các loại cây trồng, chẳng hạn như khoai tây, rau, trái cây có múi, chuối,
cà phê, chè, ca cao, bơng, lúa mì và gạo, ... CPF là một chất trong thuốc trừ sâu
ở dạng rắn, có tinh thể màu trắng và có mùi giống như tỏi hoặc trứng thối. CPF
có cơng thức phân tử là C9H11Cl3NO3PS, tên IUPAC là O,O-diethyl O- (3,5,6trichloro-2-pyridyl phosphonothioate). Thông thường, CPF tự nhiên phân hủy
trong vòng 60 –120 ngày trong đất, tuy nhiên, nó cũng có thể tồn tại đến một
năm tùy thuộc vào các yếu tố môi trường. Theo Jaiswal & cs. (2017), chu kỳ bán hủy
của CPF là 15 ngày trong đất mùn và 58 ngày trong đất sét ở điều kiện yếm khí.

CPF tiêu diệt dịch hại bằng cách ức chế hoạt động của acetylcholine
esterase (AchE), tạo ra các triệu chứng như co giật, kích động, tăng động, ... cuối
cùng dẫn đến cái chết của dịch hại. CPF tự nhiên phân huỷ thành 3,5,6-trichloro2-pyridinol (TCP), chất này đã được tổ chức EPA Hoa Kỳ gọi là chất chuyển
hóa khó phân hủy do có thời gian bán hủy từ 65 đến 360 ngày trong đất (Li &
cs., 2010; Maya & cs., 2012). Độc tính liên quan đến CPF cao ảnh hưởng đáng
kể đến khả năng sinh sản, hệ thần kinh, nội tiết, tim mạch và hô hấp của động
vật và con người (Xu & cs., 2012). Ngoài các sinh vật mục tiêu, nó cịn ảnh
hưởng đến các sinh vật có ích không phải mục tiêu dẫn đến mất cân bằng sinh thái.

3


Phân hủy sinh học là một q trình trong đó các chất hữu cơ phức tạp bị
phân hủy thành các phân tử đơn giản hơn và nhỏ hơn bằng cách sử dụng khả
năng phân hủy của vi sinh vật. Vi khuẩn và nấm được coi là hiệu quả nhất trong
việc phân hủy CPF vì chúng bao gồm một loạt các enzyme có khả năng phân
hủy CPF. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra sự phân hủy CPF bởi các loài vi
khuẩn như Pseudomonas, Arthrobacter sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp.,
Serratia marcescens (Silambarasan & Abraham, 2014). Ngoài ra, các loài nấm
basidiomycetes cũng có thể phân hủy CPF một cách hiệu quả.
2.1.2. Ảnh hưởng của chlorpyrifos đến môi trường và con người
CPF gây độc miễn dịch và thần kinh, có thể dẫn đến suy giảm sự phát
triển và tăng trưởng nội tiết tố. Các triệu chứng liên quan đến việc tiếp xúc với
loại thuốc trừ sâu này là buồn nôn, mắt mờ, các vấn đề về hô hấp, đổ mồ hôi,
nhức đầu, tim đập chậm, tê và chuột rút ở bụng. Chlorpyrifos oxon được tạo ra
sau khi phân hủy CPF, ức chế các enzyme AChE dẫn đến các vấn đề thần kinh
(Koshlukova & Reed, 2014). CPF và chất chuyển hóa của nó khơng chỉ nhắm
vào các lồi gây hại mà cịn ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể có ích trong đất
bao gồm xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn dẫn đến độ phì nhiêu của đất bị giảm
(Akbar & Sultan, 2016). Khi CPF xâm nhập vào đất, CPF trong đất có thể bị phá

vỡ bởi ánh sáng cực tím và hóa chất trong đất, nhiệt độ đất và độ pH cũng có thể
ảnh hưởng đến thời gian tồn tại của CPF trong đất. Khi đó, nó dính rất mạnh vào
các hạt đất, gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật ở đó. Ngồi ra, một số sản phẩm
của CPF là TCP khơng dính chặt với đất có thể xâm nhập vào mạch nước ngầm
gây ô nhiễm nguồn nước. Với những loại thuốc chứa CPF phun trên lá cây sẽ
bay hơi, một số có thể tồn tại trong 10 đến 14 ngày. CPF hoặc các sản phẩm thứ
cấp của nó có thể xâm nhập vào khí quyển và bay trong khơng khí gây ô nhiễm.
Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu máu của những phụ nữ tiếp xúc với CPF và
máu của con họ từ khi sinh ra trong ba năm (Griza & cs., 2008; Silambarasan &
Abraham, 2014). Những đứa trẻ có CPF trong máu có sự chậm phát triển và rối

4


loạn phát triển hơn những đứa trẻ khơng có CPF trong máu. Trẻ em bị phơi
nhiễm cũng bị rối loạn thiếu tập trung và rối loạn tăng động.
Hiện nay, CPF có thể được phát hiện trong các mẫu nơng nghiệp, đất,
nước trên khắp thế giới ngay cả khi nó đã bị cấm ở hầu hết các quốc gia. Theo
Hongsibsong & cs. (2020), họ đã làm thí nghiệm với 160 mẫu rau được thu thập
từ chợ địa phương tại Thái Lan và kết quả thu được là lượng CPF ở dưa chuột là
275 μg/kg, rau mùi là 145 μg/kg, cải chip là 60.6 μg/kg. Vào năm 2018,
Hasanuzzaman & cs. đã xác định thấy 37.3 μg/l CPF được phát hiện trên một
mẫu nước trong 40 mẫu từ nước ao, nước ruộng và nước giếng ống tại Ấn Độ.
Cũng trong năm 2018, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã phát
hiện 5% mẫu thực phẩm ở Hoa Kỳ vượt quá giới hạn cho phép đối với CPF.
2.1.3. Tình hình sử dụng chlorpyrifos tại Việt Nam
CPF có thể được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng ở các mơ hình
canh tác khác nhau. Có hiệu quả cao với các loại sâu cuốn lá, đục thân, rệp hay
rầy nâu, được ứng dụng trên cây lúa, cà phê, cây ăn quả, rau màu, … Theo kết
quả điều tra của Nguyễn Thị Lan Hương (2013) về tình hình sử dụng CPF trên

mơ hình màu tại một số huyện thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long cho thấy số
lượng sử dụng CPF không nhiều, chỉ khoảng 10% trên tổng diện tích khảo sát
điều tra. Tuy nhiên, liều lượng thuốc mà nông dân sử dụng thường gấp nhiều lần
so với khuyến cáo. Theo đó là khả năng phơi nhiễm với CPF tăng cao dẫn đến
nguy cơ cao ảnh hưởng đến sức khỏe. Nguyên nhân chủ yếu do dụng cụ bảo hộ
lao động nghèo nàn, còn thiếu ý thức trong việc sử dụng, bảo quản và tiêu hủy
hóa chất một cách an tồn. Theo thống kê của WHO, tại Việt Nam đã có khoảng
7170 trường hợp bị nhiễm độc thuốc trừ sâu vào năm 2002 (Nguyễn Thị Anh
Thư, 2014).
Do ảnh hưởng nghiêm trọng của CPF, ngày 12/02/2019, Thứ trưởng Bộ
Nông nghiệp và PTNT đã ký Quyết định số 501/QĐ-BNN-BVTV về việc loại
bỏ thuốc BVTV chứa hóa chất CPF ra khỏi Danh mục thuốc bảo vệ thực vật
được phép sử dụng tại Việt Nam, kèm theo đó 228 loại thuốc thương phẩm có
5


chứa hoạt chất CPF. Theo đó, thuốc BVTV chứa CPF chỉ được phép buôn bán,
sử dụng đến hết ngày 12/02/2021. Khuyến cáo nông dân hạn chế và từng bước
không sử dụng CPF trong phịng trừ cơn trùng và cỏ dại trên các loại cây trồng,
thay thế việc sử dụng CPF bằng các loại thuốc trừ cỏ và trừ sâu hại khác cùng
đối tượng dịch hại đã đăng ký trong danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng
ở Việt Nam.
2.2. Tổng quan về enzyme laccase
2.2.1. Giới thiệu về enzyme lacccaes
Laccase (benzenediol: oxy oxidoreductase, EC 1.10.3.2) thuộc nhóm
polyphenol oxy hóa có chứa nguyên tử đồng ở trung tâm xúc tác. Hầu hết các
laccase nấm là protein đơn phân. Tuy nhiên, một số laccase thể hiện cấu trúc
homodimeric, enzyme được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị giống hệt nhau với trọng
lượng phân tử điển hình cho các loại laccase đơn. Hầu hết các enzyme laccase là
enzyme ngoại bào, tham gia vào quá trình phân hủy lignin. Một số hợp chất liên

quan đến sự phân hủy tự nhiên của lignin bởi nấm gỗ mục trắng có thể có nguồn
gốc từ các đơn vị lignin bị oxy hóa hoặc trực tiếp từ sự trao đổi chất của nấm và
hoạt động như chất trung gian.
Laccase là một trong số các enzyme đã được nghiên cứu từ cuối thế kỷ
19. Lần đầu tiên nó được xác định là có trong dịch tiết của Rhus vernicifera, cây
sơn mài Nhật Bản bởi Yoshida năm 1883, sau đó được tìm thấy trên nấm bởi
Bertrand năm 1896. Mặc dù đã được biết đến từ lâu nhưng laccase chỉ được
nghiên cứu nhiều hơn khi bắt đầu có các nghiên cứu về sự phân huỷ gỗ do
enzyme của nấm gỗ mục trắng.
2.2.2. Cấu tạo của enzyme laccase
Một lồi sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau
(các isozyme) và thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động học
xúc tác. Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các
gốc carbonhydrat. Có 5 loại isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate

6


ở loài nấm đảm Trametes versicolor, thành phần carbonhydrate của chúng thay
đổi từ 10 - 45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng
phân tử dao động trong khoảng 60 - 70 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản
chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10 - 25%.
Tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên
tử đồng được chia làm 3 loại: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), khác nhau
về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có
tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, còn cặp nguyên tử đồng
T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết
với anion mạnh.
Cấu trúc không gian ba chiều của laccase bao gồm 3 vùng: vùng A, B, C
có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều đóng vai trị trong q trình

xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở giữa vùng B và C, trung tâm một
nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt
chung của vùng A và vùng C. Trung tâm đồng một chỉ chứa một nguyên tử đồng
T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cysteine. Liên kết
đồng hóa trị bền giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cysteine tạo cho
laccase có màu xanh lam đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử
đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc
histidin bảo thủ cịn các ngun tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin
bảo thủ.
2.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme laccase
Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử
đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 Cu2+ trở thành dạng Cu+ , hình thành phân tử
laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+ ). Các cơ chất bị oxy
hóa bởi nguyên tử đồng T1 và các chất điện tử được chuyển thông qua cầu
tripeptit His-Cys-His, đến nguyên tử đồng T2 và T3. Phân tử oxy oxy hóa
laccase dạng khử và tạo thành hợp chất trung gian peroxy, cuối cùng bị khử
thành nước.
7


Hình 2.1. Cơ chế xúc tác của laccase
Cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị oxy
hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Các
phân tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxy hóa khử q lớn,
vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Khi đó cần
có một hợp chất trung gian (mediator).
2.2.4. Tính chất của enzyme laccase
Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng
hằng số Michaelics (K m ), hằng số K m của laccase nhìn chung dao động xung
quanh giá trị 2.5 µM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Một loạt các

cơ chất đã được chứng minh là bị oxy hóa bởi laccase nhưng hằng số xúc tác
thì được báo cáo chủ yếu là đối với một nhóm nhỏ cơ chất (Phùng Khắc Huy
Chú, 2018).
Laccase nấm điển hình là một protein có kích thước khoảng 60 – 70 kDa
với điểm đẳng điện có tính axit xung quanh pH 4.0. Hoạt tính laccase giảm trong
điều kiện pH trung tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích
thước nhỏ nên là tác nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử
của cơ chất có bản chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với q
trình oxy hố bởi laccase. Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung
trong khoảng từ 8 - 9. Ngồi q trình oxy hóa phenol, laccase cũng đã được
chứng minh là xúc tác cho quá trình oxy hóa Mn2+ . Laccase từ nấm gỗ mục

8


trắng trắng T. versicolor đã oxy hóa Mn2+ đến Mn3+ với sự có mặt của
pyrophosphate (Hưfer & Schlosser, 1999).
Nhiệt độ bền của laccase thường ở 30 - 50°C và nhanh chóng bị bất hoạt ở
nhiệt độ trên 60°C. Tuy nhiên, nhiệt độ này có sự dao động đáng kể, tùy thuộc
vào nguồn gốc của vi sinh vật. Một số enzyme có nhiệt độ tối ưu dưới 35°C, ví
dụ: laccase từ G. lucidum với hoạt tính cao nhất ở 25°C. Thời gian bán hủy ở
50°C dao động từ vài phút ở B. cinnerea đến hơn 2 - 3 giờ ở L. edodes và A.
bisporus, đến 50 –70 giờ ở Trametes sp. Trong khi enzyme từ G. lucidum bị bất
hoạt ngay lập tức ở 60°C. Ngoài ra, một số laccase thể hiện sự nhạy cảm với kim
loại nặng, nhưng một số khác thì lại khơng.
2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme laccase từ vi sinh vật
Ngồi mơi trường đất, laccase thường được tìm thấy trong thực vật và
nấm. Laccase thực vật tham gia vào các cơ chế dựa trên cơ sở hình thành
polyme lignin, trong khi ở nấm, laccase có thể có nhiều vai trị hơn bao gồm cả
hình thái, gây bệnh thực vật, chống căng thẳng và phân hủy lignin. Hoạt tính của

laccase đã được chứng minh ở nhiều loài nấm và enzyme đã được tinh chế từ
hàng chục loài. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ
sinh học, việc sử dụng các vi sinh vật và enzyme từ vi sinh vật để giảm mức độ
sử dụng clo trong xử lý màu thuốc nhuộm hay xử lý các chất gây ơ nhiễm đã
được nhiều nhóm tác giả nghiên cứu và chứng minh là giải pháp công nghệ có
tính khả thi và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Phùng Khắc Huy Chú, 2018).
Trong số các chủng nấm sợi, nấm đảm và nấm men có thể sinh tổng hợp laccase,
các chủng nấm đảm được coi là nhà sản xuất lignin và laccase. Các loài nấm
đảm được biết đến là có khả năng sinh tổng hợp laccase như Agaricus bisporus,
Cerrena unicolor, Coprinopsis cinerea, Coriolopsis gallica, Cryptococcus
neoformans, Cyathus bulleri, Fomes fomentarius, Ganoderma lucidum, Panus
rudis, Phlebia radiata, Polyporus brumalis, Pycnoporus cinnabarinus,
Pycnoporus sanguineus, Rigidoporus microporus, Schizophyllum commune.

9


2.2.6. Vai trò và ứng dụng của enzyme laccase
Laccase là một oxidase oxy hóa polyphenol, phenol được thay thế bằng
metoxy, diamines thơm và một loạt các hợp chất khác nhưng khơng oxy hóa
tyrosine như tyrosinase. Hầu hết các enzyme laccase là enzyme ngoại bào, tham
gia vào quá trình phân hủy lignin. Một số hợp chất liên quan đến sự phân hủy tự
nhiên của lignin bởi nấm gỗ mục trắng có thể có nguồn gốc từ các đơn vị lignin
bị oxy hóa hoặc trực tiếp từ sự trao đổi chất của nấm và hoạt động như chất
trung gian. Ngồi q trình oxy hóa phenol, laccase cũng đã được chứng minh là
xúc tác cho q trình oxy hóa Mn2+ với sự có mặt của chất chelat. Laccase liên
quan đến sự phân hủy lignin và sự chuyển hóa của axit humic, sự tương tác của
nấm với các vi sinh vật khác nhau như là tham gia vào quá trình bảo vệ thụ động
bằng cách hình thành melanins hoặc các hợp chất tương tự, hay góp phần vào
việc phân hủy các kháng sinh phenolic ức chế sự phát triển của nấm.

Hiện nay, laccase đã được nghiên cứu ứng dụng vào việc oxy hóa một
loạt các hợp chất như các phenol được clo hóa, thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc trừ
sâu và hydrocacbon thơm đa vòng. Chúng cịn có thể được ứng dụng vào việc
tẩy trắng bột giấy Kraft hoặc khử độc các phụ phẩm nông nghiệp như là chất
thải của nhà máy ô liu hoặc bã cà phê.
2.3. Tổng quan về nấm đảm Basidiomycetes
Nấm đảm Basidiomycetes là loài nấm thường sống trong đất, hoại sinh
hay ký sinh. Nhóm hoại sinh gây ra triệu chứng làm mục cây, ..., nhóm ký sinh
gây bệnh rữa, cháy lá, mục gỗ, ... Các chủng nấm được sử dụng trong phân hủy
sinh học thường là các chủng nấm đảm thuộc ngành nấm Basidiomycetes. Các
chủng nấm này có khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme ngoại bào khơng đặc
hiệu. Lồi Basidiomycetes chủng gỗ mục trắng đã được báo cáo là có thể sinh
tổng hợp enzyme laccase có khả năng oxy hóa cao, hệ enzyme này phân hủy
lignin và các hợp chất tương tự lignin. Hầu hết tất cả các loài nấm gỗ mục trắng
được công bố là tạo ra laccase ở các mức độ khác nhau. Trong trường hợp

10


của Pycnoporus cinnabarinus (một loài nấm gỗ mục trắng), laccase được mơ tả
là enzyme duy nhất do lồi này tạo ra có khả năng phân giải lignin. Một trình tự
DNA có độ tương đồng tương đối cao với trình tự DNA của nấm gỗ mục trắng
đã được phát hiện trong Gloeophyllum trabeum. Q trình oxy hóa ABTS (2,2′azinobis (3-ethylbenzathiazoline-6-sulfonic acid)) như một dấu hiệu gián tiếp
của hoạt động oxy hóa cũng được tìm thấy ở lồi nấm này. Với đặc tính ưu việt
thú vị như vậy nên các hệ enzyme đại diện cho nấm đảm này được sử dụng để
phân hủy các hợp chất hữu cơ trong đất.
2.4. Tổng quan về chất trung gian
Chất trung gian (mediator) là khi các phân tử cơ chất có cấu tạo phức tạp
khơng thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của một enzyme mà phải cần đến sự
xúc tác của chất trung gian. Tùy từng loại chất trung gian mà có thể làm tăng

hoặc ức chế hoạt tính của laccase.
Một cơ chế xúc tác khác của laccase là sử dụng chất trung gian. Hợp chất
hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase
oxy hóa thành dạng gốc tự do. Sau đó chất trung gian ở dạng oxy hóa nhận một
điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Sự có
mặt của chất trung gian đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không
đặc hiệu cơ chất của laccase.
Các chất trung gian thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic
acid (HAA), 2,2’ - azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS),
N-hydroxybenzotrialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid
(ViO), …
 ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)):
Là một hợp chất hóa học được sử dụng để quan sát động học phản ứng của
các enzyme cụ thể. Một ứng dụng phổ biến cho nó là trong xét nghiệm hấp thụ
miễn dịch liên kết với enzyme để phát hiện sự liên kết của các phân tử với nhau.
Thường

được sử

dụng

làm chất

nền với hydrogen

11

peroxide cho enzyme

peroxidase hoặc một mình với enzyme oxydase đa nhân màu xanh lam (như
laccase). Hợp chất này tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng với hydrogen
peroxide, biến nó thành một sản phẩm cuối cùng có màu xanh lam và hịa
tan. Có thể dễ dàng theo dõi độ hấp thụ ánh sáng mới tối đa 420 nm của nó đối
với ánh sáng (ε = 3,6 × 10 4 M –1cm –1) bằng máy đo quang phổ.
 Violuric acid:
Violuric acid có cơng thức phân tử là C4H3N3O4, tên IUPAC là 6hydroxy-5-nitroso-1 H -pyrimidine-2,4-dione. Violuric acid có thể được sử dụng
để tổng hợp một số pyrimidine mới được dung hợp với dị vòng aza, có phổ hoạt
tính dược lý rộng. Sự có mặt của violuric acid góp phần làm tăng phổ cơ chất
xúc tác và tính khơng đặc hiệu cơ chất của laccase.
 1-hydroxybenzotriazole (HBT):
1-hydroxybenzotriazole (HBT) có cơng thức phân tử là C6 H5 N3 O, là
một hợp chất hữu cơ, là một dẫn xuất của benzotriazole. Nó là một loại bột kết
tinh màu trắng, chủ yếu được sử dụng để ngăn chặn sự phân chia của các phân
tử bất đối đồng phân đơn và để cải thiện hiệu quả của quá trình tổng hợp
peptide.
 Syringaldehyde:
Syringaldehyde có cơng thức phân tử là C9 H10 O4 , tên IUPAC là 4hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde. Đây là một hợp chất hữu cơ xuất hiện ở
dạng vi lượng rộng rãi trong tự nhiên. Một số lồi cơn trùng sử dụng
syringaldehyde trong hệ thống liên lạc hóa học. Syringaldehyde chưa nhiều
nhóm chức, là chất rắn khơng màu. Syringaldehyde có thể được tìm thấy tự
nhiên trong gỗ của cây vân sam và cây phong. Acetosyringone:
Acetosyringone có cơng thức phân tử là C10 H12 O4 , tên IUPAC là 1- (4hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)

etan.

Acetosyringone

là

thuộc

nhóm

acetophenone được thay thế 1-phenylethanone bởi một nhóm hydroxy ở vị trí 4
và nhóm methoxy ở vị trí 3 và 5. Nó có vai trị như một loại thuốc chống viêm
khơng steroid, hay một loại thuốc chống hen, giảm đau không gây nghiện, một
12


loại thuốc hệ thần kinh ngoại vi và một chất chuyển hóa từ thực
vật. Acetosyringone là một sản phẩm tự nhiên được tìm thấy ở Justicia
adhatoda, Polyporus umbellatus và một số sinh vật khác. Acetosyringone khơng
hịa tan trong nước, có nhiệt độ nóng chảy khoảng 125℃.
2.5. Một số nghiên cứu về sử dụng enzyme laccase phân hủy chlorpyrifos
Enzyme laccase được biết đến là có khả năng phân hủy các hợp chất
phenolic cũng như được coi là một hệ thống sinh học có khả năng phân hủy các
chất hữu cơ có độc. Enzyme này cũng đã được các nhà nghiên cứu ứng dụng để
nghiên cứu phân hủy Chlorpyrifos. Pravin D. & cs. (2021) đã sử dụng chủng
nấm gỗ mục trắng Trametes hirsute MTCC-1171 sinh enzyme laccase phân hủy
sinh học thuốc trừ sâu lân hữu cơ chlorpyrifos thành 2,4-bis (1,1-dimethylethyl)
phenol. Họ chỉ ra rằng chủng nấm này có thể phân hủy CPF một cách hiệu quả
và nhanh chóng trong khi sử dụng nó như một nguồn carbon và năng lượng duy
nhất khi được ni cấy trong mơi trường muối khống (MSM). Các điều kiện thí
nghiệm tối ưu để phân huỷ CPF trong môi trường lỏng như pH ban đầu 6.0,
lượng nấm 0.18 – 0.01 g/l (trọng lượng khô), nồng độ CPF 150 mg/l, pH 6.0,
nhiệt độ 30℃, tốc độ lắc là 150 vòng/phút và tỷ lệ phân hủy chlorpyrifos trong
16 giờ ủ đạt được 95%. Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng chloroform làm
dung môi chiết kết hợp với bộ lọc Whatman và máy cô quay. Phân hủy CPF
trong đất bị ô nhiễm sử dụng laccase cố định với natri alginat 3%,

glutaraldehyde 1% đã được thực hiện bởi Xin Wang & cs. (2016). Xiaoting Jin
& cs. (2016) cũng đã tối ưu hóa các điều kiện để phân hủy CPF bằng enzyme
laccase từ Trametes versicolorc, trong đó có sử dụng một số các chất trung gian
như vallin, violuric acid, acetosyringone, … Đưa ra kết quả rằng điều kiện tối ưu
cho việc phân hủy tốt nhất là pH ở 5.0 và nhiệt độ từ 20 - 30℃, đạt 90% phân
hủy sau 8 ngày ủ và 100% sau 10 ngày. Chen & cs. (2012) đã phân lập được
Cladosporium cladosporioides, thơng qua phân tích gen 5,8 S rDNA từ mẫu bùn
hoạt tính của bộ phận xử lý nước thải của đơn vị sản xuất CPF, có thể phân hủy

13


hoàn toàn 50 mg/l trong khoảng thời gian 5 ngày ở điều kiên pH 6.5 và nhiệt độ
26.8℃.
Nhiều loại dung môi chiết cũng đã được sử dụng để chiết xuất CPF, phục
vụ cho việc định lượng nồng độ CPF trong mẫu bằng phương pháp sắc ký.
Richard E. & cs. (2006) đã sử dụng 90% acetonitrile (ACN)/10% đệm PO4 1
mM để chiết CPF có trong hạt hướng dương đầu đen. Hệ dung môi 1% acid
acetic/ 99% methanol cũng đã được sử dụng bởi Moghadam & cs. (2018) để
chiết CPF từ nước và các mẫu đất. Ngoài ra, n-hexane và ethyl acetate cũng
được sử dụng khá nhiều. Xinhua Dai & cs. (2017) đã sử dụng n-hexane kết hợp
với ACN để chiết CPF trong mẫu máu.
2.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
2.6.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) là một dạng sắc ký lỏng cột được cải tiến, dung môi chảy với áp suất
cao lên tới 400 atm, làm tăng tốc độ chảy của dung môi pha động. HPLC hoạt
động với nguyên tắc cơ bản là tách một mẫu gồm hỗn hợp thành phần thành các
bộ phận cấu thành của nó dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các phân tử khác

nhau với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách.
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến do có độ
nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc
dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC cũng rất rộng,
như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia
thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường, …
Trong sắc ký HPLC phân loại dựa trên cơ chế tách của pha tĩnh có các
loại sau: HPLC thuận, HPLC pha đảo, HPLC rây phân tử, HPLC trao đổi ion.

14


2.6.2. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang
rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: Pha tĩnh được giữ lại trên chất
mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý, được gọi là sắc ký lỏng - lỏng (liquidliquid chromatography). Và kiểu thứ hai là pha tĩnh liên kết hóa học với chất
nền, gọi là sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). Trong quá trình
sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha
lỏng - lỏng do pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng –lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động
nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp
chất phân tích. Hơn nữa, pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động
nên rất khó có thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. Vậy nên
người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn
các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
2.6.3. Pha động trong săc ký pha đảo
Trong sắc ký pha đảo, dung mơi pha động có độ phân cực cao. Trên lý
thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế
cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt
yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm
khả năng rửa giải. Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số

khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ
phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength), … Trong đó độ phân cực
và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động cần được
tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thành phần pha động có thể cố
định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo
một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung mơi) để có hiệu quả
tách tốt hơn.

15