Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt

NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ THÀNH THỤC IN VITRO BẰNG
PHƢƠNG PHÁP THUỶ TINH HOÁ VI GIỌT
Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Thoa,
Đỗ Văn Hƣơng, Quản Xuân Hữu
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật
Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng sống, tạo phôi sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng
bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. Trứng thu từ buồng trứng lò mổ được
lựa chọn, nuôi thành thục in vitro trong môi trường IVM từ 22-24h ở 38.50C, 5% CO2. Sau đó lựa chọn những tế
bào trứng thành thục in vitro loại A chuyển vào môi trường trước cân bằng (TCM 199 có bổ sung 1M EG và 20%
FCS) ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo tế bào trứng được chuyển vào và rửa 3 lần trong môi trường đông lạnh ( TCM 199
có bổ sung 5.5M EG + 20% FCS + 1.0M sucrose). Hút 5-8 tế bào trứng/giọt cho trực tiếp vào trong dung dịch ni tơ
lỏng. Chuyển các giọt này vào trong ống chịu lạnh, bảo quản trong ni tơ lỏng. Trứng đã thủy tinh hóa được giải đông
trong môi trường giải đông (TCM 199 + 20% FCS + 1M sucrose), sau đó được nuôi in vitro từ 1-3h ở 38.5oC 5%
CO2 để đánh giá khả năng sống, tạo phôi. Tỷ lệ tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu này là
47.86%. Tỷ lệ thụ tinh đạt 13.21%, tỷ tạo phôi dâu đạt 2.86%. Tỷ lệ này thấp hơn so với đối chứng tương ứng là
56.13% và 34.78%, P < 0.05.
1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học lạnh là nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp lên những cơ thể
sống. Trong một thời gian dài con người cho rằng nhiệt độ thấp có ảnh hưởng không tốt đến tế
bào và mô, nhưng ngày nay dựa trên những nguyên tắc cơ bản về sinh học lạnh tế bào, các nhà
nghiên cứu đã tìm ra những biện pháp đông lạnh tế bào sinh sản với mục đích bảo tồn nguồn gen
vật nuôi và những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng. Đồng thời đó cũng là nguồn
nguyên liệu cho các nghiên cứu cơ bản khác như thụ tinh ống nghiệm (IVF), Cloning, chuyển
nhân, chuyển gen… Trong chăn nuôi, quá trình sinh sản sẽ duy trì được nguồn gen từ con cái và
tế bào trứng sẽ thay thế phôi khi được lựa chọn làm con giống mang tính thương mại. Hiện nay
trên thế giới có thể đông lạnh phôi và trứng động vật có vú bằng phương pháp đông lạnh chậm
hoặc đông lạnh nhanh. Tuy nhiên so với phôi thì đông lạnh tế bào trứng của động vật có vú là
khó thành công hơn. Fuku năm 1992 và Otoi năm 1993 có báo cáo đầu tiên tạo ra bê từ trứng bò

đông lạnh. Năm 1992, Hamano và cs đã nghiên cứu phương pháp đông lạnh tế bào trứng theo
phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, bằng cách sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao và tốc độ
đông lạnh nhanh. Nhờ hai ưu điểm trên, phương pháp thủy tinh hóa vi giọt hiện nay được ứng
dụng rộng rãi trong công tác bảo tồn phôi cũng như tế bào trứng của các loài động vật có vú thay
thế phương pháp đông lạnh chậm truyền thống.
Kỹ thuật đông lạnh và lưu trữ tế bào sinh sản như tinh trùng và phôi đã ứng dụng thành
công ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, kỹ thuật đông lạnh phôi và tinh trùng bò, lợn đã
được nghiên cứu từ những năm 1990. Tuy nhiên, kỹ thuật đông lạnh tế bào trứng bò nói chung
và đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt nói riêng chưa được nghiên cứu. Vì vậy


chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in
vitro bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt”, với mục đích là góp phần bảo tồn nguồn gen
vật nuôi và làm nguyên liệu cho các nghiên cứu cơ bản khác, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu
về đông lạnh tế bào trứng của một số loài động vật nuôi có ý nghĩa kinh tế khác .
2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung
- Thu và nuôi thành thục invitro tế bào trứng bò
- Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt.
- Giải đông tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm (TTON), đánh giá tỷ lệ tạo phôi từ trứng
sau đông lạnh-giải đông.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Thu tế bào trứng bò và nuôi thành thục invitro
Buồng trứng bò được lấy ở các lò mổ, bảo quản trong dung dịch NaCl 0.9% ở nhiệt độ
25
o
C-30
O
C sau đó đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 3-5giờ.
Dịch nang trứng được hút trên bề mặt buồng trứng bằng cách chọc hút với kim 18G từ

những nang trứng có đường kính 3-8mm, sau đó để lắng rồi soi dưới kính hiển vi soi nổi để tìm
tế bào trứng.
Tế bào trứng được 2 lần trong môi trường nuôi tế bào IVM. Các tế bào trứng bò (COCs)
có từ 3 lớp màng tế bào cumulus chặt chẽ trở lên được đưa vào môi trường nuôi thành thục in
vitro trong 22-24 giờ ở 38.5
o
C, 5% CO
2

2.2.2. ĐL-GĐ tế bào trứng bò thành thục in vitro, nhuộm nhân tế bào
2.2.2.1. Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt của Kikuchi
và cs., 2006. Sau nuôi in vitro 22-24 giờ, lựa chọn những tế bào trứng thành thục in vitro loại A
rửa 3 lần trong môi trường TCM 199 rồi chuyển vào môi trường TCM 199 + 20% FCS + 1M
ethylene glycol (EG) trong 15 phút.
Tiếp sau đó chuyển tế bào trứng vào môi trường đông lạnh chứa 5.5 M EG + 20% FCS +
1.0 M Sucrose, hút 5-8 trứng /giọt (6-8μl/giọt) cho trực tiếp vào dung dịch nitơ lỏng trong vòng
30 giây. Các giọt chứa tế bào trứng đã đông lạnh được cho vào ống chịu lạnh và bảo quản trong
nitơ lỏng -196°C.
2.2.2.2. Giải đông tế bào trứng bò thành thục in vitro
Các tế bào trứng sau khi được bảo quản lạnh trong ni tơ lỏng từ 2-3 tuần sẽ được giải
đông để đánh giá tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông và TTON.
Các giọt chứa trứng được lấy ra và đưa vào môi trường giải đông TCM 199 chứa 20%
FCS và 1 M Sucrose. Sau đó tế bào trứng được nuôi invitro trong môi trường IVM sau thời gian
1-3 giờ ở 38.5
o
C, 5% CO
2
.

2.2.2.3. Nhuộm nhân tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông
Các tế bào trứng sau đông lạnh giải đông có lớp màng cumulus sáng và giãn nở trở lại sẽ
được nhuộm nhân bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342, sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh
quang. Những tế bào trứng sống là những tế bào trứng có nhiễm sắc thể không đứt gãy, phân tán.
Thụ tinh in vitro thử nghiệm các tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông.
2.2.3. Thụ tinh in vitro
Những tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông được đưa vào giọt thụ tinh (IVF) có
chứa tinh trùng đã được họat hóa. Sau 5 giờ thụ tinh các hợp tử được rửa 2-3 lần trong môi
trường nuôi phôi (IVC) và được loại bỏ lớp màng cumulus sau đó chuyển sang môi trường nuôi
phôi và nuôi ở nhiệt độ 38.5
o
C, 5% CO
2
.
Số liệu được xử lý và phân tích bằng phương pháp thống kê sinh học và χ
2
với P < 0.05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả
Kết quả thu buồng trứng bò, tế bào trứng bò và nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò
được thể hiện ở bảng 1.
Từ 100 buồng trứng bò thu ở lò mổ, chúng tôi thu được 1030 tế bào trứng bò loại A, B,
C, D. Sau đó lựa chọn được 845 tế bào trứng bò loại A, B đủ tiêu chuẩn dùng cho nuôi thành
thục in vitro, tỷ lệ thành thục in vitro đạt 85.91% (726/845). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này
chúng tôi chỉ sử dụng những tế bào trứng bò thành thục in vitro loại A để tiến hành đông lạnh
theo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, đó là những tế bào trứng có từ 3lớp màng cumulus giãn
nở trở lên. Tổng số có 585 tế bào trứng bò loại A đã được đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng
-196°C. Sau 2-3 tuần chúng tôi tiến hành giải đông và nuôi invitro từ 1-3h, quan sát hình thái và
nhuộm nhân tế bào để kiểm tra tế bào trứng bò sống sau đông lạnh-giải đông. Kết quả được thể

hiện ở bảng 2.


Bảng 1. Kết quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò
Đợt
TN
Số buồng
trứng (n)
Số tế bào trứng thu
được (A, B, C, D) (n)
Số tế bào trứng nuôi
thành thục in vitro
(A, B) (n)
Số tế bào trứng
thành thục in vitro (n)
A
B
C
D
1
6
62
51
35
5
1
1
2
8
82

67
47
5
2
1
3
8
80
63
48
6
2
2
4
10
103
84
58
10
3
1
5
8
88
68
46
10
2
2
6

12
124
100
72
12
2
1
7
10
106
87
55
12
2
1
8
8
78
62
44
7
3
1
9
10
102
85
58
12
2

2
10
10
104
88
62
10
4
2
11
10
101
90
60
13
1
1
TS
100
1030
845
585
102
24
15

Bảng 2. Khả năng sống sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được đông lạnh
bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt
Đợt thí nghiệm
Tế bào trứng giải đông (n)

Tế bào trứng sống (%)
1
105
42 (40)
2
92
47 (51.08)
3
90
42 (46.67)
4
84
41 (48.81)
5
108
50 (46.3)
6
106
58 (54.71)
Tổng
585
280 (47.86)

Kết quả cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống là 47.86% (280/585). Các
tế bào trứng sống là những tế bào có lớp màng cumulus sáng và giãn nở trở lại, nhiễm sắc thể
còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, phân tán.
Những tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải đông được thử nghiệm
thụ tinh in vitro. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.
Bảng 3. Khả năng thụ tinh, tạo phôi sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được
đông lạnh bằng PP thủy tinh hóa vi giọt

Đợt
TN
Thụ tinh
Tạo phôi
Đối chứng
Trứng sau ĐL-GĐ
Đối chứng
Trứng sau ĐL-GĐ
1
34/50 (68)
a
4/42 (9.52)
b
17/50 (34)
c
0/42 (0)
d


2
36/62 (58.06)
a
7/47 (14.89)
b
24/62 (38.71)
c
2/47 (4.25)
d
3
46/95 (48.42)

a
5/42 (11.9)
b
38/95 (40)
c
1/42 (2.38)
d
4
51/98 (52.04)
a
4/41 (9.76)
b
29/98 (29.6)
c
1/41 (2.44)
d
5
62/103 (60.2)
a
7/50 (14)
b
36/103 ( 34.95)
c
1/50 (2.0)
d
6
55/ 98 (56.12)
a
10/58 (17.24)
b

32/98 (32.65)
c
3/58 (5.17)
d
Tổng
284/506 (56.13)
a
37/280 (13.21)
b
176/506 (34.78)
c
8/280 (2.86)
d
a, b
Các giá trị khác nhau có ý nghĩa; P < 0.05
c, d
Các giá trị khác nhau có ý nghĩa; P < 0.05
Kết quả cho thấy, tỷ lệ thụ tinh và tạo phôi in vitro của tế bào trứng sau đông lạnh-giải
đông là thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với đối chứng (13.21% so với 56.13%, 34.78% so với
2.86%, tương ứng)
3.2. Thảo luận
Đông lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt là một quá trình làm
đông đặc chất bảo quản lạnh ở nồng độ cao trong suốt quá trình đông lạnh mà không có sự hình
thành tinh thể đá gây tổn thương cho tế bào trứng trong quá trình đông lạnh (Niemann và cs.,
1993). Mỗi một tế bào sẽ có một tốc độ làm lạnh tối ưu khác nhau và khả năng thấm màng của
chất bảo quản lạnh cũng thay đổi theo sự thay đổi của nhiệt độ (Leibo và cs., 1971; Mazur, P.
1970; Mazur, P. 1977). Khi tốc độ làm lạnh nhanh phù hợp sẽ làm giảm thời gian tiếp xúc của tế
bào trứng với nhiệt độ và làm giảm độc tố của chất bảo quản lạnh, do đó sẽ làm giảm bớt các tổn
thương của tế bào trứng trong quá trình thủy tinh hóa. Trong phương pháp đông lạnh thủy tinh
hóa vi giọt việc sử dụng một lượng rất nhỏ dung dịch bảo quản (5 μl mỗi giọt) đã làm tăng tốc

độ đông lạnh và giảm bớt nguy cơ hình thành tinh thể đá làm tổn thương tế bào trong quá trình
hạ nhiệt cũng như nâng nhiệt. Với các ưu điểm trên chúng tôi lựa chọn phương pháp thủy tinh
hóa vi giọt cho thí nghiệm của mình.
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải
đông, tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm và tỷ lệ tạo phôi của trứng bò thành thục in vitro sống sau
đông lạnh-giải đông tương ứng là 47.86%, 13.21% , 2.86% thấp hơn so với một số báo cáo
khác. Trong báo cáo của Dinnyes và cộng sự (2000), tỷ lệ sống của tế bào trứng bò sau đông
lạnh-giải đông là 79-85%. Còn theo Andreas Mavrides và cộng sự (2002), tỷ lệ sống của trứng
bò sau đông lạnh-giải đông là 90.5%. Tuy nhiên tỷ lệ trứng bò sống sau đông lạnh-giải đông của
nghiên cứu này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của J.M.Lim, Y. Fukui and H. Ono năm
1991, trứng sống sau đông lạnh giải đông đạt 31.6%, tỷ lệ phôi phát triển đến 8 tế bào là 2.2 %.
Hiện nay, kết quả đông lạnh và bảo quản tế bào trứng của các giống vật nuôi như bò
(Doong-Hoon kim và cs., 2007), lợn (Tamas Somfai và cs., 1998), trâu (R.C.S YADAV và cs.,
2008), cừu (N. Grag, N.G. Purhit., 2007) đã được công bố, nhưng tỷ lệ tạo phôi từ trứng sau
đông lạnh-giải đông phát triển đến phôi nang còn rất thấp. Nguyên nhân chính là do sự tổn
thương của trứng trong suốt quá trình đông lạnh-giải đông như sự hóa rắn của màng
zonapellucida, sự đứt gãy nhiễm sắc thể…. Đa số các nghiên cứu về đông lạnh tế bào trứng bò
đều cho rằng khả năng sống và phát triển của trứng bò thành thục sau đông lạnh-giải đông cao


hơn so với trứng chưa thành thục, các tác giả cho rằng nguyên nhân là do trứng bò thành thục có
khả năng thấm màng cao hơn trứng chưa thành thục. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng
tôi dùng trứng bò thành thục in vitro loại A để đông lạnh. Kết quả của nghiên cứu này còn thấp
có rất nhiều lý do, có thể là do màng nguyên sinh chất bị tổn thương, sự tăng lên của tế bào chất
không bình thường trong trứng, sự tổn thương của thoi vô sắc hoặc sự thay đổi cấu trúc của vành
trong suốt trong quá trình đông lạnh, đây là vấn đề mà chúng tôi còn phải tiếp tục nghiên cứu.
Mặc dù kết quả đạt được của chúng tôi trong nghiên cứu này chưa cao nhưng cũng khẳng
định rằng khả năng đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh
hóa vi giọt của Viện Chăn nuôi bước đầu đã thành công.
4. Kết luận

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy :
- Việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh hóa
vi giọt bước đầu đã thành công trong điều kiện tại Việt Nam. Tỷ lệ tế bào trứng sống sau đông
lạnh-giải đông đạt 47.86%, tỷ lệ thụ tinh và phát triển đến phôi dâu đạt 13.21% và 2.86%.
- Có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu này trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò bằng
phương pháp thủy tinh hóa vi giọt, từ đó có thể mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng công nghệ
sinh học lạnh trong việc bảo quản tế bào trứng của một số loài động vật quý hiếm, động vật chăn
nuôi có ý nghĩa kinh tế khác.
Tài liệu tham khảo
1. Andreas Mavrides, David Morroll , 2002. Cryopresrevation of bovine oocytes : is cryoloop vitrification
the future to preserving the female gamete?. Reprod. Nutr. Dev. 42 73-80.
2. Dong-Hoon Kim, Hyo-Suk Park, Se-Woong Kim, In-Sun HWANG, Byoung-Chul YANG, Gi-Sun IM , 2007.
J.Reprod. Dev. 53 : 843-851.
3. Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X , 2000. Hight development rates of vitrified bovine oocytes following
parthennogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod;63:513-8.
4. Fuku E, Kojima A, Shioya Y, Marcus GJ, Downey BR ,.1992. In vitro fertilization and development of
frozen-thawed bovine oocytes. Cryobiology); 29 : 485-49.
5. Lim J.M, Fukui. Y and Ono. H June 1991. The post-thaw developmental capacity of frozen bovine oocytes
following in vitro maturation and fertilization. Theriogenology. VOL.35No.6
6. Landa V, Tepla O. Cryopreservation of mouse 8-cell embryos in microdrops. Folia Biologica (Praha)
1990; 36 : 153-158
7. Le Gal F., Massip A., Cryopreservation of cattle oocytes : effects of meiotic stage, cycloheximide
treatment, and vitrification proceduce, Cryobiology 38 , 290-300, 1999
8. Leibo S.P. and Mazur P. 1971. The role of cooling rates in low-temperature preservation.Cryobiology
8:447-452.
9. Mazur P. 1970. Cryobiology: The freezing of biological systems. Science 168:939-949.
10. Mazur P. 1977. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates.
Cryobiology 14:251-272.
11. Niemann H, Lucas-hahn A, Stoffregen C. 1993. Cryopreservation of bovine oocytes and embryos
following microsurgical operation. Mol reprod dev1993; 36 : 232-235.

12. Grag N, Purohit N.G 2007. Effect of different cryoprotectant concentrations for ultrarapid freezing of


immature goat follicular oocytes on their subsequent maturation and fertilization invtrro.
Anim.Reprod.,V.4, n.3/4, p. 113-11813.
13. Hamano S, Koikeda A, Kuwayama M & Nagai T 1992. Full-term development of in vitro-matured,
vitrified and fertilized bovine oocytes. Theriogenology 38 1085–1090.
14. Otoi T, Tachikawa S, Kondo S, Suzuki T 1993. Developmental capacity of bovine oocytes frozen in
different cryoprotectants. Theriogenology; 40:801–807.
15. Tamas Somfai, Andras Dinnyes, Dagma Sage, Miklos Marosan, Joseph W, Carnwath, Manbu Ozawa,
Kazuhiro Kikuchi, Heiner Niemann 2006. Theriogenology; 66 : 415-422.
16. Vajta G, Kuwayama M, Booth PJ, Holm P, Greve T, Callesen H 1998. Open pulled straw (OPS)
vitrification of cattle oocytes. Theriogenology; 49:176.
17. Yadav R. C. S, Sharma A and Purohit G. N (2008). Survival of vitrified water buffalo cumulus oocytes
complexes and their subsequent development in vitro. Bulgarian Jounal of Veterinary Medicine, 11, No 1,
55-64.