Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch trâu dạng cọng rạ tại bá vân

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH TRÂU DẠNG CỌNG RẠ TẠI
BÁ VÂN – THÁI NGUYÊN
Vũ Đình Ngoan,
1
Đào Đức Thà, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà, Nguyễn Đức Chuyên, Tạ Văn
Cần, Hàn Quốc Vương,
1
Nguyễn Thị Hương,
1
Nguyễn Thị Tuyết Nhung

Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi
1
Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi
Tóm tắt
Hiện nay, Việt Nam có khoảng 3 triệu con trâu. Việc nâng cao tầm vóc và chất lượng đàn giống là việc làm
cần thiết trong đó phải có ứng dụng thụ tinh nhân tạo. Vì vậy trong khuôn khổ đề tài trên với mục tiêu sản xuất tinh
đông lạnh cọng rạ trâu có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông ≥35%.
Tinh trâu có hoạt lực >70% được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu. Trong thí nghiệm chúng tôi nghiên
cứu môi trường đông lạnh, phương pháp cân bằng, chế độ cân bằng và thời gian đông lạnh trong hơi nitơ, chế độ
giải đông để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông.
Tinh trâu được cân bằng 2 bước: Tinh dịch được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½
thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50C trong thời gian
1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường đông lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h. Sau đó
cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo. Tinh dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ. Tinh dịch sau cân
bằng có mật độ tinh trùng khoảng 200 triệu/ml sau đó được nạp tinh vào cọng rạ (0.25ml/cọng) để tiến hành đông
lạnh. Đông lạnh ở 20 phút trong hơi nitơ sau đó đông lạnh sâu trong nitơ lỏng. Giải đông ở 420C trong 5 giây, sau
đó chuyển sang 370C trong 30 giây cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt nhất (A 41.04%). Hoạt lực tinh
trùng sau giải đông được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0.

1. Đặt vấn đề
Tại Việt Nam, các cơ sở chăn nuôi tập trung, cơ sở nuôi giữ giống gốc quốc gia, việc áp
dụng TTNT trên vật nuôi đại gia súc đặc biệt là TTNT cho trâu chưa được áp dụng nhiều mặc dù
nước ta có đến 3 triệu con. Việc nâng cao tầm vóc cũng như chất lượng đàn giống và tăng đàn là
một việc làm cần thiết. Vì vậy TTNT trâu nói chung và đông lạnh tinh trâu là vô cùng cần thiết.
Đông lạnh tinh trâu là một kỹ thuật có ý nghĩa kinh tế, nhằm khai thác tiềm năng di truyền của
con đực, bảo đảm an toàn về dịch bệnh, bảo tồn các giống quý hiếm, đáp ứng nhu cầu TTNT
trong chăn nuôi, giúp cho thương mại giống được dễ dàng, tránh cận huyết và dịch bệnh, tránh
được sự chênh lệch về khối lượng cơ thể, đem lại hiệu quả kinh tế cao trong chăn nuôi.
Đông lạnh tinh trâu ở Bá Vân - Thái Nguyên kỹ thuật này vẫn là một vấn đề hoàn toàn
mới. Vì vậy trong khuôn khổ đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh trâu murrah dạng cọng
rạ tại Bá Vân - Thái Nguyên với mục tiêu nhằm đạt được: Sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ trâu
có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông>35%, Bảo tồn và nhân nhanh nguồn gen quý của trâu
giống tốt vào sản xuất.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu


Sử dụng tinh dịch của giống giống trâu Murah. Trâu đực giống khỏe mạnh được chăm
sóc nuôi dưỡng theo quy trình của Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi -
thuộc Viện chăn nuôi.
Thời gian nghiên cứu: Tháng 1-12 năm 2009
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi
Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Khai thác tinh dịch và đánh giá chất lượng tinh nguyên
Tinh trâu được khai thác bằng âm đạo giả, có sử dụng trâu cái làm giá.
Một số chỉ tiêu chất lượng tinh nguyên được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision và
các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch
(V), Mầu sắc tinh dịch, Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Áp suất thẩm thấu

(ASTT), tỷ lệ kỳ hình (K), độ pH .
Những lô tinh dịch có hoạt lực ≥70% sẽ được đưa vào xử lý và đông lạnh trong thí nghiệm.
Tinh dịch sau khai thác, đánh giá hoạt lực sau đó được pha môi trường đông lạnh A, B
sao cho đạt mật độ tinh trùng có 50 triệu tinh trùng/cọng rạ sau đó tiến hành đông lạnh. Khi pha
loãng tinh dịch môi trường A và môi trường B phải bằng nhau về thể tích khi cân bằng. Trong
1 một môi trường đông lạnh chúng tôi chia làm 2 loại môi trường: Môi trường A không có
thành phần glyceryl. Môi trường B có thêm thành phần glyceryl.
Cân bằng 1 bước:
Tinh dịch thu được sau khai thác pha ngay với môi trường đông lạnh A,B hạ nhiệt độ từ
15
0
C xuống 5
0
C trong 1.5giờ và để cân bằng trong 2.5 giờ ở 5
0
C.
Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 1 lần)
Tinh dịch thu được sau khai thác được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha
loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1) được hạ nhiệt độ từ 15
0
C xuống đến
5
0
C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường B vào 1 lần. Tinh
dịch sau khi pha loãng lần thứ 2 được cân bằng ở 5
0
C trong 2.5 giờ.
Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần)
Tinh dịch thu được sau khai thác được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha
loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 15

0
C
xuống đến 5
0
C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường đông
lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h. Sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo. Tinh dịch
sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ
Phương pháp đông lạnh trong hơi nito: tinh dịch sau khi cân bằng được nạp vào các cọng
rạ và đông lạnh trong hơi nito lỏng (-80
0
C) ở 3 mức thời gian là 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau
đó tinh dịch được đông lạnh sâu ở nito lỏng (-196
0
C).
Phương pháp giải đông: cọng rạ được giải đông ở nhiệt độ là 37
0
C, 39
0
C với các thời gian
là 30 giây, 50 giây và 42
0
C trong 5 giây sau đó 37
0
C trong 30 giây.


Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông: dùng micropipet hút 0.23l tinh dịch sau giải
đông (đã được pha loãng bằng môi trường MTS) nhỏ lên phiến kính chuyên dụng (dùng riêng cho
phần mềm Sperm Vision) có nhiệt độ ổn định 37
0

C và đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0
(hãng Minitub , Đức).
Phương pháp xử lý số liệu: một số chỉ tiêu tinh dịch được đánh giá bằng phương pháp
thường quy và phần mền Sperm Vision 3.0. Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê
miêu tả (Display Descriptive Statistics) qua phương pháp kiểm tra ANOVA của phần mềm
Minitab 13. Số liệu được hiển thị dạng MeanSE, với P<0.05 có sai khác về ý nghĩa thống kê.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Chất lượng tinh nguyên
Tinh nguyên sau khi khai thác được đánh giá các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V,
ml), mầu sắc tinh dịch, hoạt lực tinh trùng (A, %), nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh
trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần), pH tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình.
Kết quả được đánh giá ở bảng 1.
Bảng 1. Một số chỉ tiêu tinh dịch trâu ở vụ thu đông
Chỉ tiêu
ĐVT
Trâu Murrah
n
X  SE
V
ml
10
3,02  0.114
A
%
10
73,667  0,59
C
triệu/ml
10
946,7  19,2

VAC
tỷ/lần
10
2,364  105
K
%
10
9,733  0,182
R

10
19533  236
pH

10
6,57  0,095
ASTT
mOsm/kg
15
320,67  5,48
Mầu tinh nguyên
Trắng, trắng ngà
(n là số mẫu tinh nguyên khai thác ở các lần trên cùng một cá thể trâu)

Qua bảng 1 cho thấy: Tinh dịch trâu có thể tích tinh dịch 3ml/lần khai thác, hoạt lực tinh
trùng 73%, nồng độ tinh trùng 946 triệu/ml. Như vậy hoạt lực tinh trùng >70% đủ điều kiện để
tiến hành nghiên cứu đông lạnh các bước tiếp theo.
Một số nghiên cứu về tinh dịch trâu của các tác giả như sau:
Tạ Văn Cần (2006), tinh trâu: 2,35-3,5ml/lần. A=72-73%. C=0.81-830 triệu/ml.
Trâu đực Murrah nuôi tại Trung tâm nghiên cứu trâu sữa và đồng cỏ Sông Bé cho kết

quả: V=3-5ml/lần, A=60-70%. (Sharma, 1990).
Koonjaenak và cs (2006), tinh trâu có A =73,4; C = 995tr/ml ở mùa hè. Tinh trâu để làm
đông lạnh thì hoạt lực tinh nguyên ngay sau khi khai thác A >70%.


Trâu đực murrah nuôi tại Trung tâm nghiên cứu trâu sữa và đồng cỏ Sông Bé cho kết
quả: V=3-5ml/lần, A=60-70%. (Sharma, Đỗ Kim Tuyên 2006).
Như vậy, kết quả nghiên một số chỉ tiêu về phẩm chất tinh dịch trên tương tự với một số
kết quả của tác giả khác đã công bố.
3.2. Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lực của tinh trùng
Môi trường đông lạnh có tác dụng điều chỉnh mật độ tinh trùng, cung cấp năng lượng và
bảo vệ tinh trùng trước sự tấn công của vi sinh vật, bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong suốt quá
trình đông lạnh.
Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lục của tinh trùng
MT đông lạnh
tinh trâu
n
Hoạt lực A (%)
Kỳ hình K (%)
Môi trường 1
10
68,61  0,94
13,21  0,25
Môi trường 2
10
70,33  0,21
12,33  0,63
Môi trường 3
10
68,25  0,78

12,96  0,52

Qua bảng 3 cho thấy: Hoạt lực tinh trùng của tinh dịch trâu ở các môi trường đông lạnh
sau cân bằng 68% đến 70%. Nhưng hoạt lực tinh trùng ở môi trường đông lạnh 2 cho kết quả cao
nhất 70,33%.
Theo Koonjaenak (2006), tinh trâu có nồng độ pha loãng trong thời gian cân bằng trước
khi nạp tinh vào cọng là ≥120 triệu/ml, 0.25ml/cọng.
3.3. Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực của tinh trùng trước và sau giải đông
Sử dụng môi trường đông lạnh 2 để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt
lực tinh trùng. Kết quả thể hiện bảng 3.
Bảng 3. Hoạt lực tinh trùng trước và sau giải đông.
Chế độ cân bằng
n
Hoạt lực tinh trùng, A (%)
Trước đông lạnh (sau CB)
Sau giải đông
Cân bằng 1 bước
10
70,05  0,20
33,88  0,16
CB 2 bước: bổ sung MT
đông lạnh B vào 1 lần
10
70,17  0,19
38,11  0,18
CB 2 bước: bổ sung MT
đông lạnh B vào 3 lần
10
70,20  0,12
41,34  0,18

Ghi chú: Hoạt lực tinh trùng giai đoạn trước đông lạnh (sau cân bằng 4h)



Kết quả cho thấy: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông sử dụng phương pháp cân bằng 2
bước có bổ sung môi trường B làm 3 lần cho kết quả cao nhất (41,34%). Có sự sai khác rõ rệt
về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở 3 phương pháp cân bằng nói trên.
Theo Dhamil (1995), tinh dịch trâu được cân bằng 2h tại 5
0
C so với 0h cải thiện đáng kể tới
hoạt lực sau giải đông 48% so với 39%. Koonjaenak (2006), tinh trâu có hoạt lực tinh trùng
sau giải đông là 42.1%.
Kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm này cho thấy hoạt lực tinh trùng sau giải đông thống
nhất với một số kết quả của một số tác giả đã nghiên cứu.
3.4. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ
hình sau giải đông
Giai đoạn đông lạnh trong hơi nito là bước đông lạnh trung gian giữa 5
0
C với đông lạnh
sâu (-196
0
C). Trong hơi nito nhiệt độ khoảng -80
0
C.
Sử dụng môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường B làm 3 lần để nghiên
cứu ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng. Kết quả nghiên
cứu được thể hiện trong bảng 4 như sau:
Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ
hình sau giải đông
Thời gian đông lạnh

n
Hoạt lực A(%)
Kỳ hình K(%)
10 phút
10
38,47  0,21
17,20  0,29
20 phút
10
41,04  0,18
17,30  0,45
30 phút
15
40,23  0,39
17,55  0,54
(Hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở cùng một chế độ giải đông)

Kết quả nghiên cứu bảng 4 cho thấy: Hoạt lực của tinh trùng sau giải đông với thời gian
đông lạnh trong hơi nito 20 phút cho kết quả cao nhất, cao hơn so với đông lạnh trong hơi nito 10
phút và 30 phút. Không có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng sau giải đông khi sử dụng thời
gian đông lạnh trong hơi nito 20 phút và 30 phút (P>0.05). Có sự sai khác rõ rệt về hoạt lực tinh
trùng sau giải đông khi đông lạnh trong hơi nito ở 20 phút, 30 phút so với đông lạnh trong hơi
nito ở 10 phút (P<0.05).
Theo Rasul (2001), trước đông lạnh hoạt lực tinh trùng trâu là 77,3 % đã giảm sau khi
giải đông còn 53,0%.
Theo Koonjaenak (2006), Tốc độ đông lanh: 4 đến -40
0
C (18
0
C/phút), từ -40

0
C đến -140
0
C
(8
0
C/phút), sau đó đông lạnh trong nito lỏng. Hoạt lực tinh trùng trâu sau giải đông 40% đến
43%.
3.5. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng
Sử dụng môi trường đông lạnh 2, cân bằng 2 bước bổ sung môi trường B làm 3 lần và
đông lạnh trong hơi nito 20 phút để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh
trùng. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5.


Bảng 5. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng
Chế độ giải dông
n
Hoạt lực A(%)
37
0
C trong 30 giây
10
35,37  0,20
37
0
C trong 50 giây
10
38,21  0,33
39
0

C trong 30 giây
10
37,25  0,27
39
0
C trong 50 giây
10
37,50  0,30
42
0
C ở 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30 giây
10
41,54  0,68

Với cọng rạ 0.25ml/cong. Phương pháp giải đông 42
0
C trong 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30
giây cho kết quả cao nhất. Không có sự sai khác về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở nhiệt độ
37
0
C trong 50 giây, 39
0
C trong 30 giây và 50 giây. Ngược lại có sự sai khác về hoạt lực của tinh
trùng ở chế độ giải đông 37
0
C trong 30 giây so với các phương pháp khác trên.

Bhavsa và cs (1989), hoạt lực tinh trùng trâu trước và sau khi tan băng trung bình 69,9%
và 54,2%.
Zahid
và cộng sự (2001) cho kết quả tưng ứng là 77,3% và 53,0%.
Theo Kuisma và cs (2006), nên giải đông cọng rạ 0.5ml/cọng nhiệt độ giải đông 37
0
C ít nhất
30 giây, cọng rạ 2,5ml/cọng ứng với 50
0
C cho 30 giây. Tốc độ giải đông phải đạt ≥35
0
C/giây.
4. Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận
- Sử dụng môi trường đông lạnh 2. Cân bằng 2 bước bổ sung MT B có Glyceryl làm 3 lần
ở 3 thời điểm cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao nhất.
- Đông lạnh trong hơi nitơ 20 phút và giải đông ở 42
0
C ở 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30 giây
cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông là 41,04%
4.2. Đề nghị
Đề nghị công nhận kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh trâu dạng cọng rạ.
Đề nghị tiến hành TTNT bằng tinh đông lạnh trâu để đánh giá tỷ lệ thụ thai.
Tài liệu tham khảo
1. Tạ Văn Cần, Nguyễn Hữu Trà, Vũ Văn Tý, Nguyễn Đức Chuyên, Mai Văn Sánh, 2006. Nghiên cứu lai tạo
giữa trâu đực Murrah với trâu cái địa phương và đánh giá khả năng sinh trưởng của con lai F1 nuôi trong
nông hộ. Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi 2006.
2. Bhavsa, D.K., Dhamin, A.J., Kadagali, S.B, 1989. Monthly variation in freezability and fertility of

Mehsana buffalo semen. Indian J Dairy Scri 42.
3. Dhami1, A.J., Sahni, K.L., Mohan, G., Jani, V.R, 1995. Effects of different variables on the freezability,
post-thaw longevity and fertility of buffalo spermatozoa in the tropics. Received 24 March 1994; Accepted
10 October 1995.
4. Koonjaenak, S., Kunawongkrit, A., Chanatinart, V., Sirivaidyapong, S., Pinyopuminintr & Rodriguez, H.,
Martinez, 2006. Semen quality of Thai Swamp buffalo artificial insemination bulls: Comparison of
production date from 1988-1993, 2001-2004 and 2004-2005. Swedish University of Agricultural Science,
Box 7054, SE 75 007, Uppsala, Swedish 2006.


5. Kuisma, P., Andersson, M., Koskinen, E and Katila, T, 2006. Fertility of frozen-thawed stallion semen
cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Veterinaria Scandinavica.
6.
Rasul, Z.,
Ahmad, N., and Anzar, M, 2001.

Changes in Motion Characteristics, Plasma Membrane
Integrity, and Acrosome Morphology During Cryopreservation of Buffalo Spermatozoa.
Journal of
Andrology.

Animal Sciences Institute, National Agricultural Research Centre, Islamabad, Pakistan

7. Sharma, P.A., Đỗ Kim Tuyên, 2006. Khả năng sinh sản của trâu đực giống Murrah nuôi tại Sông Bé. Tạp
chí Khoa học nông nghiệp số 292. Hà Nội tháng 10 năm 2006.

Phụ lục. Các loại môi trường đông lạnh tinh trâu trong thí nghiệm
Bảng 1. Thành phần các loại môi trường thí nghiệm
TT
Tên hóa chất

ĐVT
Môi trường đông lạnh
MT 1
MT 2
MT 3
1
Tris
g
2.42
1.82
0.60
2
Citric acid
g
1.34
1.00
0.34
3
Sodium Citrate
g
0.52
1.04
2.08
4
Fructos
g
0.25
0.25
0.25
5

Glucose
g
0.25
0.25
0.25
6
Lactose
g
1.00
1.00
1.00
7
Streptomycin
mg/ml
1
1
1
8
Penicillin
UI/ml
1000
1000
1000
9
Glycerol
ml
7
7
7
10

Distilled Water upto
ml
100
100
100
11
Egg Yolk
ml
20
20
20