Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa và kháng α glucosidase của thân rễ gừng đen (distichochlamys citrea m f newman , zingiberaceae)

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN VĂN CHỆN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG
α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG ĐEN

(DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F. NEWMAN.,
ZINGIBERACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN VĂN CHỆN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG
α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG ĐEN

(DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F. NEWMAN.,
ZINGIBERACEAE)
NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THÀNH TRIẾT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

.


.

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và
kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa được
tác giả khác cơng bố trong bất kì cơng trình nghiên cứu nào khác.
Tác giả luận văn

Trần Văn Chện

.


.

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa: 2019 – 2021
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG
ĐEN (DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F. NEWMAN., ZINGIBERACEAE)
Trần Văn Chện
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thành Triết
Đặt vấn đề: Distichochlamys citrea M.F. Newman (Zingiberaceae) là loài đặc hữu
của Việt Nam, đã được dân gian sử dụng để làm thuốc chữa các bệnh viêm nhiễm,
đái tháo đường và làm gia vị. Đã có những cơng trình nghiên cứu về tinh dầu lá và
thân rễ D. citrea nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học khác
và hoạt tính sinh học của D. citrea. Chính vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục
đích nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa và kháng
α-glucosidase của thân rễ Gừng đen.

Phương pháp nghiên cứu: Đặc điểm hình thái, vi học, thơng số lý hóa của Gừng
đen được thực hiện theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V. Mã vạch DNA
được khuếch đại bằng đoạn mồi ITS. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học theo
phương pháp Ciuley cải tiến. Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt và
phân bố lỏng-lỏng thu được cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn tương ứng.
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc tự do DDPH và
ức chế enzym α-glucosidase bằng phương pháp đo quang. Các hợp chất có cấu trúc
được xác định bằng phổ MS và NMR được phân lập bằng sắc ký cột.
Kết quả: Về mặt hình thái học, D. citrea khác với các loài Distichochlamys khác.

Đặc biệt, Gừng đen có thân rễ thon dài, lá màu xanh lục, cụm phát hoa với lá bắc
xòe rộng và hoa màu vàng (cánh mơi có rãnh sâu). Ngồi ra, các cấu trúc vi học của
D. citrea tương tự như chi Zingiber. Loài nghiên cứu tương đồng 96,54% với ITS
của D. citrea trên Genbank đã chứng minh khả năng xác định Gừng đen bằng chỉ
thị ITS. Các chỉ tiêu lý hóa của bột thân rễ đều đạt tiêu chuẩn cho phép. Phân tích

.


.

sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy sự hiện diện của tinh dầu, chất khử, acid
amin, coumarin và flavonoid trong cả thân rễ và lá. Trong khi đó, chất béo chỉ có ở
thân rễ mà khơng có ở lá.
Bột thân rễ (3,5 kg) được chiết bằng ethanol 96% (tỷ lệ 1:15) thu được 386 g
cao tổng. Qua quá trình chiết lỏng-lỏng, thu được 5 cao phân đoạn là cao n-hexan
(28,17 g), cao CHCl3 (131,32 g), cao EtOAc (13,56 g), cao n-BuOH (20,92 g) và
cao nước (126,68 g). Trong các cao thử nghiệm, cao chiết EtOAc có hoạt tính
chống oxy hóa (IC50 = 90,27 µg/mL) và ức chế enzym α-glucosidase (IC50 = 115,75
µg/mL) tốt nhất.
Các hợp chất C1 (54,8 mg; 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon), C2 (505,1mg;
β-sitosterol, stigmasterol), C3 (83,1 mg; platyphyllon) và C4 (12,3 mg; glycerol

monostearat) được phân lập từ cao CHCl 3. Các hợp chất E1 (34,1mg; kaempferol)
và E2 (14,1 mg; acid trans-5-O-caffeoylquinic) được phân lập từ cao EtOAc.
Hợp chất E1 đều cho tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzyme α-glucosidase
với giá trị IC50 lần lượt là 14,08 µM; 31,86 µM và tương tự hợp chất C1 với IC50 lần
lượt là 794,71 µM; 189,40 µM. Tuy nhiên hợp chất C4 cho tác dụng rất yếu ở cả 2
tác dụng này. Trong khi đó hợp chất C2 (IC50 > 1204,82 µM) và C3 (IC50 = 69,41
µM) đều cho tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và hợp chất E2 (IC50 = 30,20

µM) chỉ cho tác dụng chống oxy hóa.
Kết luận: Nghiên cứu này lần đầu tiên cung cấp thông tin về các đặc điểm vi học,
thơng số lý hóa, hóa thực vật và chỉ thị ITS/DNA của D. citrea. Sáu hợp chất lần
đầu tiên được phân lập và thử tác dụng sinh học từ thân rễ Gừng đen. Trong đó,
platyphyllon lần đầu tiên được báo cáo về khả năng ức chế enzym α-glucosidase.
Kết quả này được sử dụng làm tài liệu chuyên khảo trong việc định danh và tiêu
chuẩn hóa dược liệu cũng như góp phần cung cấp thơng tin cho các nghiên cứu tiếp
theo về D. citrea.

.


.

ABSTRACT
Master’s Thesis in Pharmacy – Course: 2019 – 2021
ANTIOXIDANT AND α-GLUCOSIDASE INHIBITORY ACTIVITIES
GUIDED ISOLATION OF PHYTOCHEMICALS FROM
DISTICHOCHLAMYS CITREA RHIZOME
Tran Van Chen
Scientific Instructor: Dr. Nguyen Thanh Triet
Objectives: Distichochlamys citrea M.F. Newman (Zingiberaceae) is an endemic
plant to Vietnam and has been used as folk medication for treatments of infectionrelated diseases, diabetes, and spice. Besides reported preceding studies on the
essential oil of D. citrea leaves and rhizomes, not any studies on other chemical
components and the biological activities of D. citrea have been publicized.
Therefore, this study was carried out to study the antioxidant and α-glucosidase
inhibitory activities from D. citrea rhizome by guided isolation of phytochemicals.
Methods:

In

this

work,

macro-and

micromorphological

features,

and

pharmacognostic parameters were performed according to the Vietnamese
Pharmacopoeia V guidelines. The DNA barcode was amplified by Internal
Transcribe Spacer (ITS) primers. The preliminary phytochemical study was
conducted by the Ciuley method with slight modification. Dried rhizomes powder
was extracted with 96% ethanol by percolation and liquid-liquid method
distribution to obtain the total crude extract and respective fractions. Antioxidant
effect was evaluated by DDPH free radical neutralization and α-glucosidase
inhibitory activity was determined by using method of optical density measurement.
Compounds whose structures were determined by MS and NMR spectroscopy were
isolated by column chromatography.
Results: Macromorphologically, D. citrea differs from other Distichochlamys
species. D. citrea, particularly, has elongated rhizomes, green leaves, spread
inflorescences, and yellow labellum (with deep slits). Additionally, D. citrea’s
micromorphological structures are similar to the genus Zingiber. The sequenced

.

.

amplicons (96.54% similar to Genbank's D. citrea ITS) demonstrated the ITS
marker’s ability to identify D. citrea. The physicochemical parameters of rhizomes
powder all meet acceptable standards. The results of phytochemical screening
revealed the presence of essential oil, reduced sugars, amino acids, coumarins, and
flavonoids in both rhizomes and leaves. Meanwhile, fats are found only in rhizomes
but not in leaves.
Dried rhizomes powder (3.5 kg) was under leaching with 96% ethanol and
liquid-liquid method distribution (the ratio is 1:15) to obtain 386 g of total crude
extract and 5 fractions were obtained: n-hexane fraction (28,17 g), CHCl3 fraction
(131,32 g), EtOAc fraction (13,56 g), n-BuOH fraction (20,92 g), and aqueous
fraction (126,68 g). In the trials, EtOAc extract possessed the best antioxidant (IC50
= 90,27 µg/mL) and α-glucosidase inhibitory activity (IC50 = 115,75 µg/mL).
Compounds C1 (54.8 mg; 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone), C2 (505.1mg;
β-sitosterol, stigmasterol), C3 (83.1 mg; platyphyllon), and C4 (12.3 mg; glycerol

monostearate) were isolated from CHCl 3 fraction, while E1 (34.1 mg; kaempferol)
and E2 (14.1 mg; trans-5-O-caffeoylquinic acid) from EtOAc fraction.
Compound E1 has both antioxidant and α-glucosidase inhibitory effects with
IC50 values of 14.08 µM, 31.86 µM, respectively, and similarly, compound C1 with
IC50 of 794.71 µM, 189.40 µM, respectively. However, compound C4 has a very
weak effect in both of these effects. Meanwhile, compound C2 (IC50 > 1204.82 µM)
and compound C3 (IC50 = 69.41 µM) both inhibite the enzyme α-glucosidase and
compound E2 (IC50 = 30.20 µM) only has antioxidant activity.
Conclusion: This study first provides information on the micromorphological
characteristics, pharmacognostic parameters, phytochemicals and ITS/DNA
markers of D. citrea. Six compounds first were isolated and tested for biological
activities from D. citrea rhizome. Among them, platyphyllon was first reported to

inhibit the enzyme α-glucosidase. These results are used as monographs in the
identification and standardization of medicinal herbs as well as contribute the
information to carrying on further studies on this D. citrea.

.


.

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt i
Danh mục các bảng iii
Danh mục các hình iv
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC..........................................................................3
1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC..............................................................6
1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ.........................................................................................11
1.4 Stress oxy hóa và MƠ HÌNH THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA..........................12
1.5 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ MƠ HÌNH ỨC CHẾ ENZYM Α-GLUCOSIDASE............14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..................................................................................18
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................................19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ

25

3.1 Khảo sát thực vật học.......................................................................................25
3.2 Thử tinh khiết...................................................................................................38
3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật..........................................................38
3.4 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn................................................39
3.5 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa và kháng α-glucosidase...............................40
3.6 Phân lập, tinh chế và đánh giá hoạt tính của các chất tinh khiết.......................43
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

73

4.1 Đặc điểm hình thái và định danh thực vật bằng DNA......................................73
4.2 Các thơng số lý hóa, sơ bộ thành phần hóa thực vật và sàng lọc tác dụng chống
oxy hóa và kháng α-glucosidase của các cao phân đoạn..................................78
4.3 Nghiên cứu hóa học và tác dụng sinh học của các chất phân lập......................81
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................................90
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN.............93

.


.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.

.

i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Anh

ABTS

2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonic acid)

Ace

Acetone

Aceton

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Cơng cụ tìm kiếm các trình tự
tương đồng

CH2Cl2

Dichloromethane

Dicloromethan

CHCl3 (Cf)

Chloroform

Cloroform

COPD

Chronic Obstructive Pulmonary
Disease

Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính

COSY

Collerated Spectroscopy

Phổ tương quan 1H-1H

COVID-19

Coronavirus Disease 19

Bệnh corona vi rút

CTPT

Ý nghĩa

Công thức phân tử

d

doublet

dd

doublet of doublet

DĐVN

Đỉnh đôi
Dược điển Việt Nam

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

GC-MS

Gas Chromatography-Mass
Spectrometry

Sắc ký khí-quang phổ khối

GLUT

Glucose Transporters

Chất vận chuyển glucose

HL-60

Human Leukemia Cell line

Dòng tế bào ung thư bạch cầu

Heteronuclear Multiple Bond
Correlation
High Performance Liquid
Chromatography

Phổ biểu diễn tương tác xa trong
không gian phân tử

HMBC
HPLC

Dimethyl sulfoxid

Ethyl acetat

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC

Heteronuclear Single Bond Correlation

Phổ biểu diễn tương quan một nối
giữa proton và carbon

HT29

Human colon cancer cell line

Dòng tế bào ung thư ruột kết

HTCO

Hoạt tính chống oxy hóa

.


.

ii

IC50

Half maximal Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử
nghiệm

IR

Infrared

Phổ hồng ngoại

ITS

Internal Transcribe Spacer

Chỉ thị ITS

LC-MS

Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry

Sắc ký lỏng-khối phổ

m

multiplet

Nhiều đỉnh

MeOH

Methanol

Motl-4B

Human T lymphoblast

MS

Mass Spectrometry

Phổ khối

MW

Molecular Weight

Khối lượng phân tử

n-BuOH

n-Butanol

NBCI

National Center for Biotechnology
Information

Trung tâm thông tin Công nghệ
sinh học Quốc gia

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

p-NPG

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

PCR

Polymerase Chain Reaction

PE

Petroleum Ether

RCC

Renal-Cell Carcinoma

ROS

Reactive Oxygen Species

s

singlet

Đỉnh đơn

t

triplet

Đỉnh ba

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TMS

Tetramethylsilane

Tetramethylsilan

Ung thư biểu mơ thận

TT

Thuốc thử

tt/kl

Thể tích/ khối lượng

UC

Ức chế

UV

Ultraviolet

Tia Tử ngoại

VQG

Vườn Quốc Gia

VS

Vanilin-Sulfuric

DANH MỤC CÁC BẢNG

.


.

iii

Bảng 1.1.

Thành phần hóa học của tinh dầu D. citrea............................................7

Bảng 1.2.

Thành phần chính của tinh dầu D. citrea ở các vùng khác nhau..........11

Bảng 2.1.

Bố trí thử nghiệm chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH..................22

Bảng 3.1.

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của D. citrea............39

Bảng 3.2.

Khối lượng, hiệu suất chiết, độ ẩm của cao tổng và các cao phân đoạn
40

Bảng 3.3.

Kết quả tác dụng ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn D. citrea
41

Bảng 3.4.

Giá trị IC50 của các cao phân đoạn từ thân rễ D. citrea và acarbose trên
mơ hình ức chế α-glucosidase..............................................................42

Bảng 3.5.

Kết quả phân tách các phân đoạn từ cao CHCl3 bằng sắc ký cột..........44

Bảng 3.6.

Kết quả phân tách các phân đoạn từ cao Cf9 bằng sắc ký cột..............47

Bảng 3.7.

Kết quả phân tách các phân đoạn từ cao Cf7 bằng sắc ký cột..............50

Bảng 3.8.

Kết quả phân tách các phân đoạn từ cao EtOAc bằng sắc ký cột.........52

Bảng 3.9.

Dữ liệu phổ NMR của C1 và 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon.......57

Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 13C-NMR của C2 và hỗn hợp β-Sitosterol, Stigmasterol...59
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ NMR của C3 và Platyphyllon...........................................61
Bảng 3.12. Dữ liệu phổ NMR của C4 và Glycerol monostearat.............................63
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của E1 và Kaempferol............................................65
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ NMR của E2 và Acid 5-O-caffeoylquinic........................67
Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm chống oxy hóa và giá trị IC 50 của các mẫu thử trên
mơ hình DPPH.....................................................................................69
Bảng 3.16. Kết quả thử nghiệm và giá trị IC50 của các mẫu thử trên mơ hình ức chế
enzym α-glucosidase............................................................................70
Bảng 4.1.

So sánh các đặc điểm hình thái của D. citrea và các loài khác trong chi
Distichochlamys...................................................................................74

.


.

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Mơ tả thực vật lồi D. citrea..................................................................5

Hình 1.2.

Thân rễ D. citrea....................................................................................6

Hình 1.3.

Một số cấu tử nhóm monoterpen hydrocarbon trong tinh dầu D. citrea.8

Hình 1.4.

Một số dẫn xuất chứa oxy của monoterpen trong tinh dầu D. citrea......9

Hình 1.5.

Một số cấu tử nhóm sesquiterpen hydrocarbon trong tinh dầu D. citrea 9

Hình 1.6.

Một số dẫn xuất chứa oxy của sesquiterpen trong tinh dầu D. citrea...10

Hình 1.7.

Một số cấu tử khác trong tinh dầu D. citrea.........................................10

Hình 2.1.

Quy trình chiết xuất và phân lập thân rễ D. citrea................................21

Hình 3.1.

Đặc điểm hình thái của D. citrea..........................................................26

Hình 3.2.

Mảnh biểu bì mang lỗ khí của lá D. citrea...........................................27

Hình 3.3.

Vi phẫu tổng quát và cấu tạo chi tiết lá D. citrea.................................28

Hình 3.4.

Sơ đồ cấu tạo lá D. citrea.....................................................................28

Hình 3.5.

Vi phẫu tổng quát, chi tiết và sơ đồ cấu tạo cuống lá D. citrea............29

Hình 3.6.

Vi phẫu tổng quát và cấu tạo chi tiết rễ D. citrea.................................30

Hình 3.7.

Sơ đồ cấu tạo rễ D. citrea.....................................................................30

Hình 3.8.

Vi phẫu tổng quát và cấu tạo chi tiết thân rễ D. citrea.........................32

Hình 3.9.

Sơ đồ cấu tạo thân rễ D. citrea.............................................................32

Hình 3.10. Bột rễ và thân rễ D. citrea....................................................................33
Hình 3.11. Một số cấu tử ở bột rễ và thân rễ D. citrea...........................................34
Hình 3.12. Một số cấu tử ở bột lá D. citrea............................................................35
Hình 3.13. Kết quả sản phẩm PCR được tạo ra bởi mồi ITS1 và ITS4..................36
Hình 3.14. Biểu đồ hình cây phát sinh lồi (Maximum likelihood).......................37
Hình 3.15. Sơ đồ kết quả chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn thân rễ D. citrea..40
Hình 3.16. Tác dụng ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn D. citrea.........42
Hình 3.17. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao CHCl3.............................44
Hình 3.18. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất C1................................45
Hình 3.19. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất C2................................46

.


.

v

Hình 3.20. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao Cf9..................................47
Hình 3.21. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao Cf9-5..............................48
Hình 3.22. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất C3................................49
Hình 3.23. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao Cf7..................................51
Hình 3.24. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất C4................................51
Hình 3.25. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao EtOAc.............................53
Hình 3.26. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của E1...............................................54
Hình 3.27. Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn từ cao EA7................................55

Hình 3.28. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất E2................................55
Hình 3.29. Các tương quan trong phổ HMBC và COSY của hợp chất C1.............58
Hình 3.30. Cấu trúc của hợp chất C2.....................................................................59
Hình 3.31. Các tương quan trong phổ HMBC và COSY của hợp chất C3.............62
Hình 3.32. Các tương quan trong phổ HMBC và COSY của hợp chất C4.............63
Hình 3.33. Các tương quan trong phổ HMBC và COSY của hợp chất E1.............66
Hình 3.34. Các tương quan trong phổ HMBC và COSY của hợp chất E2.............68
Hình 3.35. Sơ đồ tổng kết phân lập và giá trị IC50 của các chất tinh khiết.............71
Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập.........................................72
Hình 4.1.

Liên quan cấu trúc-tác dụng chống oxy hóa và ức chế α-glucosidase
của hợp chất C1 và E1..........................................................................84

.


.

1

MỞ ĐẦU
Chi Gừng đen (Distichochlamys) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là chi thực
vật đặc hữu của Việt Nam, được miêu tả lần đầu tiên bởi M.F. Newman vào năm
1995 1.. Trong bốn loài thuộc chi Distichochlamys được các nhà khoa học phát hiện
thì lồi Gừng đen (D. citrea) được phát hiện sớm nhất ở Vườn Quốc gia Bạch Mã
thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế. Sau này, lồi D. citrea cịn được phát hiện ở một số
tỉnh miền Trung như Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam và Nghệ An

2.,3.,4.,5.

. D.

citrea cho tinh dầu có mùi thơm đặc trưng, được người dân PaKơ dùng làm thuốc
và gia vị để cải thiện các rối loạn bên trong cơ thể như đau bụng, các bệnh liên quan
đến viêm nhiễm, tiêu mủ, đông máu, làm lành vết thương và dùng làm trà trong hỗ
trợ bệnh nhân đái tháo đường

3.,4.,5.

. Ở Việt Nam đã có cơng trình nghiên cứu về

thành phần hóa học của tinh dầu từ thân rễ và lá Gừng đen cho thấy thành phần
chính gồm các cấu tử đặc trưng như 1,8-cineol, α-citral, β-citral, geraniol, geranyl
acetat, terpinen-4-ol, linalool, borneol, α-terpinol

4.,5.

. Các chất này giữ vai trị quan

trọng có lợi cho sức khỏe, bao gồm các tác dụng chống ung thư, chống viêm, chống
oxy hóa, kháng khuẩn và nhiều tác dụng sinh học khác 6.,7.. Trong những năm gần
đây việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết, kháng
khuẩn tự nhiên khơng độc hại được ly trích từ các dược liệu thuộc họ Gừng rất được
quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên các dược liệu từ họ Gừng như
Zingiber officinale (L.) Roscoe., Zingiber ottensii Valeton., các dược liệu này đều
có vai trị chống oxy hóa và hạ đường huyết 8.,9.,10.. Các kết quả này mang đến sự
phát triển cho các chất chống oxy hóa tự nhiên để sử dụng trong thực phẩm, mỹ
phẩm cũng như thuốc điều trị và các ứng dụng khác.
Mặc dù chi Gừng đen (Distichochlamys) được rất nhiều nhà nghiên cứu quan

tâm, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố về các thành phần
hóa học khác ngồi tinh dầu, cũng như chưa có các cơng bố về tác dụng sinh học
của D. citrea ở Việt Nam và trên thế giới. Nếu được quan tâm đầu tư nghiên cứu
chắc chắn Gừng đen trở thành một chủ đề thú vị và hữu ích trong việc tìm kiếm các
tác nhân chống oxy hóa, hạ đường huyết và các tác dụng sinh học khác từ nguồn

.


.

2

nguyên liệu thiên nhiên, từ đó Gừng đen trở thành dược liệu có ích trong cơng cuộc
phịng và chữa bệnh cho người dân.
Để làm sáng tỏ những tác dụng điều trị bệnh của một cây thuốc quý, đề tài này
đã tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy
hóa và kháng α-glucosidase của thân rễ Gừng đen (Distichochlamys citrea M.F.
Newman., Zingiberaceae)” với các mục đích:
- Khảo sát đặc điểm hình thái và vi học của lồi D. citrea.
- Phân lập thành phần hóa học từ thân rễ loài D. citrea theo định hướng tác
dụng chống oxy hóa và kháng α-glucosidase.
- Xác định cấu trúc và đánh giá tác dụng sinh học của các chất phân lập được
trên mơ hình thử nghiệm cho sàng lọc tác dụng của các cao ban đầu.
Từ đó, cung cấp thơng tin khách quan bước đầu làm tiền đề khoa học cho các
thử nghiệm, nghiên cứu, kiểm nghiệm, tìm kiếm các tác dụng chữa bệnh và định
hướng khai thác, sử dụng, bảo tồn của loài D. citrea sau này.

.

.

3

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thực vật học
1.1.1 Chi Distichochlamys
Họ Gừng (Zingiberaceae) phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu
ở Đông Nam Á. Ở Việt Nam có khoảng 21 chi với 141 lồi, phần lớn mọc hoang,
một số được trồng làm thuốc, hương liệu và gia vị 2.,11..
Chi Gừng đen (Distichochlamys) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), là cây thân
thảo, sống lâu năm. Cụm hoa mọc trên một phát hoa, các lá bắc nguyên phát, lá bắc
con hình ống. Hoa đi bị cạp mở ra đầu tiên. Cánh mơi có 2 thùy và phẳng. Bao
phấn khơng có gai ở đáy 1.. Cho đến nay, chỉ có bốn loài đặc hữu được ghi nhận ở
Việt Nam.
D. citrea M.F. Newman được M.F. Newman phát hiện ở Vườn quốc gia Bạch
Mã (Thừa Thiên Huế) và mô tả khoa học đầu tiên năm 1995. Đây là lồi điển hình
của chi này, lá màu xanh và hoa màu vàng, có điểm vệt đỏ giữa gốc 1..
D. orlowii K. Larsen & M.F. Newman hay cịn gọi là Gừng đen Orlow
hay Gừng đen lá tím, được K. Larsen và M.F. Newman tìm thấy và mơ tả khoa học
năm 2001. Phân bố trong một khu vực hẹp tại một làng thuộc huyện An Khê, tỉnh
Gia Lai 12..
D. rubrostriata W.J. Kress & Rehse hay còn gọi Gừng đen khía đỏ, được John
Kress (Viện Smithsonian) và Tania Rehse (Đại học Duke) mô tả khoa học năm
2003. Phân bố chủ yếu tại khu vực Cúc Phương, Việt Nam 13..
D. benenica Q.B. Nguyen & Škorničk được các nhà khoa học Nguyễn Quốc

Bình (Việt Nam) và Jana Leong-Škorničková (Singapore) tìm thấy ở Vườn quốc gia
Bến En, Thanh Hóa vào tháng 4 năm 2011 14..
1.1.2 Loài D. citrea M.F. Newman.
Tên khoa học: D. citrea M.F. Newman 1..
Tên Việt Nam: Gừng đen 1.,2..

.


.

4

1.1.3 Vị trí phân loại trong bảng hệ thống thực vật
Vị trí của lồi D. citrea M.F. Newman được sắp xếp theo hệ thống phân loại
của Takhtajan A như sau 15.:
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophita)
Lớp Hành (Liliopsida)
Bộ Gừng (Zingiberales)
Họ Gừng (Zingiberaeae)
Chi Distichochlamys
Lồi D. citrea M.F. Newman
1.1.4 Mơ tả thực vật lồi D. citrea
Cây thảo nhỏ cao đến 35 cm, thân rễ dài 5 cm. Lá dài tới 42 cm, cuống lá dài
20 cm, cứng, rãnh sâu trên bề mặt sợi đồng trục, mặt dưới của lá song song với thân
rễ. Phiến lá dài 17–22 cm, rộng 8,3–10,7 cm, hình elip rộng, gân giữa rõ rệt, hình
chóp buồm hoặc trịn, đầu bằng hoặc khơng, đỉnh ngắn, nhẵn bóng ở trên, có lơng
mượt bóng bên dưới. Các chồi lá gần nhau tạo ra một cụm dày gồm 1–3 lá, các bẹ
phía dưới có kích thước 10 x 2,5 cm và khi đến mùa hoa sẽ khô lại thành lớp mỏng.
Lưỡi nhỏ, dài 5 mm, khô và tiêu biến theo mùa hoa. Các lá bắc sắp xếp thành hai

hàng dọc ở hai bên đối diện của cuống, kích thước 23–25 x 12 mm, được bao phủ
bởi những sợi lơng mềm mượt bên ngồi, bên trong nhẵn bóng, màu đỏ hồng. Lá
bắc con hình ống, màu hồng, dài 21–23 mm, có đường nứt bằng một nửa chiều dài
của chúng. Lá bắc con đầu tiên có 2 gân nổi dọc và 3 thùy, phủ đầy lông mịn mượt;
lá bắc con khác hầu như khơng có gân nổi dọc, một thùy và có lơng chủ yếu ở đầu.
Cụm hoa mọc ở ngọn trên một cuống hoa dài 1,5–2,5 cm, tổng chiều cao tới 9,5
cm, thường mọc ba hoa đến khi trưởng thành và một hoặc hai hoa nữa khơng phát
triển. Đài hoa hình ống, dài 9,0 mm, có lơng thưa, hai đầu hoặc có thùy, tách ra đối
diện thùy, màu trắng trong. Tràng hoa hình ống dài 30 mm, màu trắng ở gốc đến
màu vàng nhạt; tràng hoa thùy hình elip, kích thước 14–16 x 4–5 mm, các mặt bên
lớn hơn một chút so với mặt lưng, cuộn lại khi ra hoa. Mặt bên hình elip, 19–20 x
5,0 mm, có lơng ở phía bên trong, màu vàng sáng. Cánh mơi hình tam giác, 22 x 22

.


.

5

mm, có khe hở. Chỉ nhị dài 2,5–3,0 mm, màu vàng nhạt. Bao phấn dài 5 mm, 2 ô.
Bầu nhụy dài 2 mm, lông dày, bầu 3 ô với kiểu đính nỗn trung trụ. Đầu nhụy hình
cốc dẹt, màu trắng. Nhiễm sắc thể 2n = 26 1..

Hình 1.1.

Mơ tả thực vật loài D. citrea 1.,16.. Cây trưởng thành ra hoa; A. Chồi

hoa; B. Đỉnh lá; C. Lá bắc; D. Lá bắc con; E. Đài hoa; G. Phần hoa cắt dọc mặt
bên (Tràng hoa thùy bên, Bao phấn); F. Phần hoa cắt dọc (Cánh môi, Tràng hoa

thùy trước); H. Bao phấn; I. Đính nỗn trung trụ
1.1.5 Khóa phân loại các lồi thuộc chi Distichochlamys 13.,14.
1A. Cụm hoa có lá bắc xịe rộng, xếp thành xim; cánh mơi có khe hở sâu đến
một nửa chiều dài của nó………………………..……..................…...D. citrea
1B. Cụm hoa có lá bắc mọc đối với trục hoa, dày đặc; cánh mơi bị chia cắt với
khe hở kéo dài ít hơn một nửa chiều dài của nó.………....................………....2
2A. Các nhị bên màu vàng với hai mảng dài tuyến tính màu đỏ ở
gốc.......................................................................................D. rubrostriata
2B. Các nhị bên màu vàng.………….........………......…………….…...3
3A. Cánh môi với mảng đỏ ở gốc và hai thùy tròn ở
đỉnh……………………………………….........……….D. benenica

.


.

6

3B. Cánh mơi màu vàng với các sọc tím, dải giữa màu vàng đậm và
hai thùy hình lơng chim…………………….….................D. orlowii
1.1.6 Sinh học, sinh thái và phân bố
Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 7–8; thường gặp trong rừng thứ sinh,
rừng nguyên sinh, trảng cây bụi 1.,2..
Phân bố: Gừng đen là lồi đặc hữu có tại ở các tỉnh miền Trung của Việt Nam
như Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Nghệ An (Vườn quốc gia Pù Mát), Thừa
Thiên – Huế (Vườn Quốc gia Bạch Mã) 2.,3.,4..
1.1.7 Bộ phận dùng
Bộ phần dùng của Gừng đen chủ yếu là thân rễ 2.. Thân rễ nhỏ hình trụ, màu
vàng nhạt, có mùi thơm độc đáo và vị cay nhẹ.

Hình 1.2. Thân rễ D. citrea
1.2 Tổng quan về thành phần hóa học
Thành phần hóa học của loài D. citrea mới chỉ được nghiên cứu và báo cáo về
tinh dầu và các hợp chất bay hơi. Tinh dầu thu được dưới dạng lỏng, không màu,
nhẹ hơn nước và có mùi thơm đặc trưng 4.. Hàm lượng tinh dầu từ 0,25–0,60%
(tt/kl). Cho đến nay đã có khoảng 43 cấu tử có trong tinh dầu Gừng đen được xác
định, số lượng và hàm lượng các cấu tử trong tinh dầu khác nhau tùy theo vùng
phân bố.

.


.

7

Các cấu tử này được phân loại thành các nhóm: Các hợp chất béo, monoterpen
hydrocarbon, dẫn xuất chứa oxy của monoterpen (nhóm chất chính có trong mẫu
tinh dầu), sesquiterpen hydrocarbon và dẫn xuất chứa oxy của sesquiterpen. Trong
đó, 1,8-cineol (43,67%, Quảng Bình), β-citral, α-citral, neryl acetat là các cấu tử đặc
trưng của tinh dầu thân rễ Gừng đen, ngoài ra cịn có các cấu tử có hàm lượng khá
cao như: α-pinen, β-pinen, β-linalool, D-limonen, α-terpineol, cis-geraniol 2.,3.,4.,5..
Ngoài ra, trong năm 2022, bằng phân tích GC-MS, các hợp chất từ cao chiết nhexan của thân rễ Gừng đen (VQG Bạch mã) đã được Van Hue và cộng sự báo cáo
gồm có 21 hợp chất (geranyl acetat, 6-methyl-4,6-bis(4-methylpent-3-en-1yl)cyclohexa-1,3-diencarbaldehyd, geraniol, ethyl palmitat, neryl palmitat, endoborneol, ethyl linoleat, β-selinen, ethyl oleat, acid hexadecanoic, ethyl stearat, acid
α-linoleic, (L)-α-terpineol, aristolochen, α-himachalen, ambrial, acid geranic,

maaliol, m-camphoren, neointermdedeol và capryophyllen oxid) 17..
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của tinh dầu D. citrea
Nhóm

chất

hợp

Cấu tử trong tinh dầu

α-thujen; α-phellandren; α-pinen; camphen; sabinen; β-pinen; β-myrcen;
1,3,5-trimethylenecycloheptan; 2-caren; terpinolen; p-cymen; m-cymen; Dlimonen; β-trans-ocimen; β-cis-ocimen; β-terpinen; γ-terpinen.
1,8-cineol; β-linalool; 1,3,3-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-ol; 5-isopropylDẫn xuất chứa
2-methylbicyclo[3.1.0]hexan-2-ol; trans-pinocarveol; isopulegol; (S)-cisoxy
của
verbenol; borneol; terpinen-4-ol; α-terpineol; (1R)-myrtenal; fenchyl acetat;
monoterpen
verbenon; β-citral; cis-geraniol; α-citral; bornyl acetat; neryl acetat,…
β-elemen; trans-α-bergamoten; β-caryophyllen; α-caryophyllen; thujopsenSesquiterpen
(I2); β-chamigren; eremophilen; alloaromadendren; β-bisabolen; βhydrocarbon
sesquiphellandren; β-eudesmen; patchoulen,…
Dẫn xuất chứa
oxy
của caryophyllen oxid; viridiflorol; guaiol; α-cedrol; lepidozen.
sesquiterpen
3-butenylhexyl ether; 3-ethyl-3-methylhexan; 2,2-dimethyl hexanol;
Hợp chất khác
butyloxiran; 1,5-dimethyl-7-oxabicyclo [4.1.0] heptan; 6-methyl-5-hepten-2(Aliphatic
on; 1-methylheptyl acetat; 6-(2-furyl)-6-methyl-2-heptanon; 3-methylen-1compound)
cyclohepten; 6-methyl-5-hepten-1-yn.

Monoterpen
hydrocarbon

.


.

8

1.2.1 Monoterpen hydrocarbon

α-phellandren

-terpinen

Sabinen

α-pinen

Camphen

2-caren

α-thujen

1,3,5-trimethylencycloheptan

Hình 1.3. Một số cấu tử nhóm monoterpen hydrocarbon trong tinh dầu D. citrea
1.2.2 Dẫn xuất chứa oxy của monoterpen

Isopulegol

α-terpineol

.

β-linalool

1,8-cineol


.

9

5-isopropyl-2-

1,3,3trans-pinocarveol

trimethylbicyclo-

(1R)-myrtenal

[2.2.1]heptan-2-ol

methylbicyclo[3.1.0]hexan2-ol

Hình 1.4. Một số cấu tử chứa oxy của monoterpen trong tinh dầu D. citrea
1.2.3 Sesquiterpen hydrocarbon

β-elemen

Thujopsen-(I2)

trans-α-bergamoten

β-caryophyllen

β-chamigren

Alloaromadendren

Hình 1.5. Một số cấu tử nhóm sesquiterpen hydrocarbon trong tinh dầu D. citrea

.


.

10

1.2.4 Dẫn xuất chứa oxy của sesquiterpen

Caryophyllen oxid

Viridiflorol

Guaiol

Hình 1.6. Một số cấu tử chứa oxy của sesquiterpen trong tinh dầu D. citrea
1.2.5 Các hợp chất khác

3-butenylhexyl ether

1,5-dimethyl-7-oxabicyclo
[4.1.0] heptan

6-methyl-5-hepten-1-yn

3-ethyl-3-methylhexan

Butyloxiran

6-(2-furyl)-6-methyl-2heptanon

Hình 1.7. Một số cấu tử khác trong tinh dầu D. citrea
Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy có sự khác nhau về thành phần và hàm
lượng tinh dầu của thân rễ và lá Gừng đen tùy vào từng vùng phân bố (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Thành phần chính của tinh dầu D. citrea ở các vùng khác nhau
Hàm lượng (%) của tinh dầu

.


.

11

Thành phần chính
trong tinh dầu
1,8-Cineol
α-Pinen

β-Pinen
Camphen
β-Linalool
α-Terpineol
Terpinen-4-ol
D-Limonen
Cis-Geraniol (Nerol)
β-Citral (Geranial)
α-Citral (Neral)
Neryl acetat

Quảng
Bình (QB)
43,67
4,47
2,79
2,79
14,79
2,27
1,00
3,28
0,58
1,63
2,47
10,81

Nhóm chất chính
Monoterpen
17,14
hydrocarbon

Hợp chất chứa oxy của
80,29
monoterpen
Sesquiterpen
2,06
hydrocarbon
Hợp chất chứa oxy của
sesquiterpen
Hợp chất khác
0,27
Tổng lượng tinh dầu

99,76

Quảng
Trị (QT)
31,78
1,81
2,69
0,97
1,78
2,12
2,01
1,18
8,89
13,98
18,38
11,11

Quảng

Nam (QN)
30,71
3,82
7,03
1,70
1,51
1,53
1,82
2,36
4,01
13,49
19,13
4,14

Thừa Thiên
Huế (TTH)
30,34
2,02
3,21
1,57
1,50
1,36
2,22
1,48
7,61
11,05
20,88
9,90

Nghệ An

(NA)
23
1,4
1,9
1,10
1,20
4,60
4,10
0,30
15,00
18,90
-

8,35

18,91

11,60

4,4

90,73

79,47

86,59

79,40

0,00

1,03

1,61

2,3

-

-

-

5,8

0,92

0,56

0,20

1,90

100,00

99,97

100,00

93,80

1.3 Tác dụng dược lý
Trong các nghiên cứu trước đây về Chi Distichochlamys, các nhà khoa học chỉ
có báo cáo về tác dụng ức chế acetylcholinesterase của tinh dầu thân rễ D. benenica
18.
19.

và hoạt động chống viêm, kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ D. benenica
, và tác dụng kháng khuẩn từ cao chiết của thân rễ D. citrea

17.

nhưng chưa có

thêm các nghiên cứu nào về tác dụng cũng như các thành phần hóa học khác của D.
citrea ở Việt Nam và trên thế giới. Tuy nhiên, các cấu tử chính: 1,8-Cineol (23–
43,67%), β-citral (1,6–13,98%), α-citral (2,47–20,88%) và neryl acetat (4,14–
11,11%) được xác định trong tinh dầu thể hiện một số tác dụng dược lý tiềm năng
đã được nghiên cứu và báo cáo trước đây, chẳng hạn như 1,8-cineol có hoạt tính

.