Nguyễn thị huyền xây dựng phương pháp định lượng ɣ oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ɣ-ORYZANOL TRONG VIÊN
LÀM TRẮNG DA BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
MÃ SINH VIÊN: 1801316

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ɣ-ORYZANOL TRONG VIÊN
LÀM TRẮNG DA BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đỗ Thị Thanh Thủy
2. ThS. Cao Cơng Khánh
Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa dược

2. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ
sinh thực phẩm quốc gia

HÀ NỘI-2023


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới những người
thầy đã hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận này:
TS. Đỗ Thị Thanh Thủy - giảng viên bộ mơn Hóa dược- Khoa Cơng nghệ Hóa
học- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình chỉ dẫn, theo dõi và đưa ra những lời
khun bổ ích giúp tơi giải quyết được các vấn đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu
và hồn thành đề tài một cách tốt nhất.
ThS. Cao Cơng Khánh công tác tại khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, người đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q
trình tìm kiếm và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ bộ mơn Hóa Dược- khoa Cơng nghệ Hóa
học - Trường Đại học Dược Hà Nội; ThS. Mạc Thị Thanh Hoa, chị Vũ Thị Thanh An,
anh Nguyễn Duy Linh cùng tập thể cán bộ, nhân viên khoa Nghiên cứu phát triển – Viện
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt q trình thực hiện khóa luận này.
Tơi cũng xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu và toàn thể các phịng ban, các khoa,
các bộ mơn, các thầy cô giáo và kỹ thuật viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo
và tạo cơ hội cho tôi được học tập, rèn luyện, tích lũy kiến thức, kỹ năng trong suốt quá
trình 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng xin dành sự biết ơn sâu sắc tới bố mẹ tơi, tất cả những người thân trong
gia đình và bạn bè đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tơi có thêm nghị lực hồn thành
tốt khóa luận.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023

Sinh viên
Nguyễn Thị Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Thông tin chung về ɣ- oryzanol ............................................................................. 2
1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc .......................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất hóa lý .................................................................................................... 2
1.1.3. Tác dụng dược lý .................................................................................................. 3
1.2. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có ở Việt Nam và trên thế giới .. 3
1.2.1. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có ở Việt Nam............................... 3
1.2.2. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có trên thế giới .............................. 5
1.3. Thông tin về mẫu chứa ɣ- oryzanol....................................................................... 9
1.3.1. Một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol hiện đang có trên thị trường
trong nước và ngồi nước ................................................................................................ 9
1.3.2. Thông tin về sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân dùng trong nghiên cứu ... 10
1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao..................................... 11
1.4.1. Nguyên tắc........................................................................................................... 11
1.4.2. Phân loại .............................................................................................................. 11
1.4.3. Các đại lượng đặc trưng ...................................................................................... 12
1.4.4. Ứng dụng ............................................................................................................ 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................................... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 14
2.1.2. Thiết bị, hóa chất, dung mơi ................................................................................ 14

2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 15
2.2.1. Khảo sát các điều kiện phù hợp để xây dựng phương pháp định lượng ɣoryzanol ......................................................................................................................... 15
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................................. 15
2.2.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản phẩm
viên làm trắng da Kiều Xuân......................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 15
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol ................................................. 15
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol ................................................ 16


2.3.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm
trắng da Kiều Xuân ....................................................................................................... 18
2.4. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 18
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 20
3.1. Thực nghiệm và kết quả ...................................................................................... 20
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol .................................................. 20
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol................................................. 28
3.1.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản phẩm
viên làm trắng da Kiều Xuân......................................................................................... 36
3.2. Bàn luận ................................................................................................................. 38
3.2.1. Về phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng HPLC .. 38
3.2.2. Về thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng
HPLC 39
3.2.3. Về ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong viên
làm trắng da Kiều xuân ................................................................................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 41
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 41
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

ACN

Acetonitril

AOAC (Association of Official
Agricultural Chemists)

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính
thống

CH3COOH

Acid acetic

DHEA

Dehydroepiandrosterone

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

GC-MS (Gas chromatography–mass
Sắc ký khí khối phổ
spectrometry)
H2

Hydrogen

H2 O

Nước

HPLC (High performance
chromatography)
ICH (International
Harmonization)
IPA

liquid

Conference

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

on Hội nghị quốc tế về hài hịa hóa các thủ
tục đăng ký dược phẩm
Isopropanol

LC-MS (Liquid chromatography–mass
Sắc ký lỏng khối phổ
spectrometry)
LD50 (Lethal dose 50)

Liều gây chết trung bình

MeCl2

Diclometan

MeOH

Methanol

MTBE

Methyl tert- butyl ete

NXB

Nhà xuất bản

PA (Pure analysis)

Tinh khiết phân tích

PA (Purity angle)

Độ tinh khiết góc

PDA (Photodiode array)

Đầu dị mảng đi-ốt

Rs (Resolution)

Độ phân giải

RSD (Relative standard deviation)

Độ lệch chuẩn tương đối

TH (Purity threshold)

Độ tinh khiết ngưỡng

tR (Rentention time)

Thời gian lưu

TT

Thứ tự

UV (Ultraviolet)

Tử ngoại

VIS (Visible)

Ánh sáng nhìn thấy


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol ................................................4
Bảng 1. 2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol ở Việt Nam ..4
Bảng 1. 3. Phương pháp đo quang để định lượng ɣ- oryzanol trên thế giới ...................5
Bảng 1. 4. Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol có trên
thế giới .............................................................................................................................6
Bảng 1. 5. Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol ..................7
Bảng 1. 6. Một số phương pháp xác định ɣ- oryzanol bằng sắc ký khí khối phổ ...........8
Bảng 1. 7. Thông tin về một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol có trên thị
trường ............................................................................................................................10
Bảng 1. 8. Các thành phần của viên làm trắng da Kiều Xuân .......................................11
Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ...................................................22
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu ..........................................................23
Bảng 3. 3. Thông số pic sắc ký khi khảo sát dung môi chiết ........................................26
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu ...........................................................27
Bảng 3. 5. Kết quả thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký về diện tích pic, thời gian
lưu và độ phân giải ........................................................................................................28
Bảng 3. 6. Số liệu số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối theo từng pic sắc ký .....................29
Bảng 3. 7. Thời gian lưu của các pic sắc ký mẫu thử, mẫu chuẩn ................................31
Bảng 3. 8. Độ tinh khiết pic sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn ...................................32
Bảng 3. 9. Cách pha chế dung dịch thẩm định độ tuyến tính ........................................33
Bảng 3. 10. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính ...........................................................33
Bảng 3. 11. Kết quả thẩm định độ lặp lại ......................................................................34
Bảng 3. 12. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ...............................................35
Bảng 3. 13. Kết quả thẩm định độ đúng ........................................................................36

Bảng 3. 14. Kết quả định lượng ɣ-oryzanol trên mẫu viên Kiều Xuân .........................38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của một số chất trong ɣ-oryzanol .......................................2
Hình 1. 2. Sắc ký đồ phân tích ɣ- oryzanol bằng HPLC trong tài liệu tham khảo [5] ....5
Hình 1. 3. Hình ảnh một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol trên thị trường .9
Hình 1. 4. Hình ảnh sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân........................................11
Hình 3. 1. Kết quả quét phổ dung dịch chuẩn ...............................................................20
Hình 3. 2. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung mơi pha động MeOH: ACN = 50: 50 ...........21
Hình 3. 3. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 35: 65 ...........21
Hình 3. 4. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 70: 30 ...........21
Hình 3. 5. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là isopropanol ...............................24
Hình 3. 6. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết mẫu là n-hexan-ethanol= 5:2 ................24
Hình 3. 7. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết mẫu là methanol ...................................24
Hình 3. 8. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là ethanol ......................................25
Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết mẫu là n-hexan .....................................25
Hình 3. 10. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là n-hexan- isopropanol = 1: 3 ....25
Hình 3. 11. Sắc ký đồ mẫu trắng ...................................................................................30
Hình 3. 12. Sắc ký đồ mẫu placebo ...............................................................................30
Hình 3. 13. Sắc ký đồ mẫu thử ......................................................................................30
Hình 3. 14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ..................................................................................31
Hình 3. 15. Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết pic của mẫu thử ............................................32
Hình 3. 16. Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết pic của mẫu chuẩn .......................................32
Hình 3. 17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích của pic ɣ-oryzanol
.......................................................................................................................................34
Hình 3. 18. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn ...........................................................................37
Hình 3. 19. Sắc ký đồ của mẫu thử đại diện ..................................................................38

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, khi xã hội đang ngày càng phát triển, nhu cầu làm đẹp cũng vì thế mà
tăng lên. Khái niệm “làm đẹp” giờ đây đã mở rộng ra nhiều khía cạnh, khơng chỉ là
chăm sóc “sắc đẹp bên ngồi” mà cịn là các vấn đề sức khỏe bên trong để bổ trợ cho
việc làm đẹp. “Nhất dáng, nhì da” là câu cửa miệng của nhiều phụ nữ, cho thấy tầm
quan trọng của làn da với nhan sắc phái đẹp. Một làn da đẹp không chỉ tạo nên ngoại
hình ưa nhìn, mà cịn mang đến sự tự tin cho bản thân.
Các nước Châu Á đặc biệt là Việt Nam, đa số các cô gái đều muốn sở hữu cho
mình làn da trắng sáng, mịn màng. Chính vì vậy, ngày càng có nhiều phương pháp làm
trắng da ra đời: sử dụng dược liệu thiên nhiên, dùng mỹ phẩm, dược- mỹ phẩm, hay áp
dụng máy móc cơng nghệ cao...Trong đó, các sản phẩm của dược- mỹ phẩm có xu hướng
phát triển mạnh và rất được ưa chuộng ở Việt Nam. Hiện nay, thị trường dược- mỹ phẩm
trong nước rất phong phú và hấp dẫn với các nhãn hàng uy tín, có thương hiệu, đến từ
các quốc gia nổi tiếng và Việt Nam.
Bên cạnh những thành phần nổi bật như collagen, vitamin E, glutathion, vitamin
C… thì ɣ-oryzanol là thành phần quan trọng trong công thức của các sản phẩm dượcmỹ phẩm đang rất được ưa thích với khả năng chống oxy hóa mạnh, đem lại hiệu quả
ngạc nhiên. Tuy nhiên, lợi dụng vào nhu cầu làm đẹp của mọi người, nhiều hàng giả,
hàng nhái, hàng kém chất lượng được bán trên thị trường mang lại nhiều hệ lụy cho sức
khỏe và đời sống của người sử dụng. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng các sản phẩm là
vấn đề cần thiết để đảm bảo an toàn cho người dùng.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng
phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao”.
Đề tài được thực hiện với những mục tiêu sau:
- Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao.
- Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao.
- Ứng dụng phương pháp vào định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Thông tin chung về ɣ- oryzanol
1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc
ɣ-oryzanol là thành phần được tìm thấy với số lượng nhiều nhất trong dầu cám gạo,
hàm lượng ɣ- oryzanol có trong dầu cám gạo khoảng từ 1 % đến 2 % hay 10-20 mg/g.
Ngoài ra, hoạt chất này cũng được tìm thấy trong ngơ, lúa mạch, các loại dầu thực vật,
lúa mạch đen và cám lúa mì.
ɣ-oryzanol được xác định là một hỗn hợp của phytosteryl ferulat, của acid ferulic
được este hóa với sterol (campesterol, sitosterol, stigmasterol) và triterpenoid
(cycloartenol và 24-methylenecycloartenol). Ít nhất 10 phytosteryl ferulat của γoryzanol đã được tìm thấy, chẳng hạn như campesteryl, campestanyl, cycloartenyl, 24methylenecycloartanyl, sitostanyl, sitosteryl, stigmasteryl, Δ-campestenyl, Δ-sitostenyl
và Δ-stigmastenyl ferulat. Trong số này, chiếm ưu thế là campesteryl, cycloartenyl, 24methylenecycloartanyl và sitosteryl ferulat chiếm từ 80% đến 95% γ-oryzanol tùy vào
các giống lúa [10], [17], [24].

1.1.a) Cycloartenyl ferulat

1.1.b) 24- Methylenecycloartenyl ferulat

1.1.c) Sitosteryl ferulat
1.1.d) Campesteryl ferulat
Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của một số chất trong ɣ-oryzanol
1.1.2. Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh không vị, màu trắng hoặc hơi vàng, khơng có mùi [26].
- Nhiệt độ nóng chảy từ 137,5–138,5 °C [26].
- Khơng tan trong nước, tan ít trong diethyl ether, ethanol và n-heptan, tan trong
cloroform và aceton [26].
- Bị thủy phân trong môi trường kiềm ở 80 oC tạo muối của acid ferulic [31].
2

- Tạo kết tủa với ion canxi sau khi thủy phân trong mơi trường kiềm và pha lỗng
với nước [12].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Nhiều cơng trình nghiên cứu đã xác định thuộc tính sinh học của ɣ-oryzanol như
sau:
- Tác dụng giảm cholesterol trong máu: ɣ-oryzanol ức chế sự hấp thu cholesterol
trong chế độ ăn uống và đồng thời cũng ức chế sự tái hấp thu của cholesterol nội sinh từ
đường tiêu hóa [8], [11], [15], [29].
- ɣ- oryzanol có lợi cho bệnh nhân tiểu đường giúp cải thiện lượng đường bằng
cách cải thiện chức năng và sự tồn tại của tế bào β tuyến tụy. Nhiều bằng chứng cho
rằng đặc tính hạ đường huyết liên quan chặt chẽ đến hoạt tính chống oxy hóa của ɣoryzanol [16], [30].
- Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm của γ-oryzanol liên quan với các
đặc tính chống oxy hóa, đã được báo cáo trong các mơ hình in vitro và in vivo. Ví dụ,
các đại thực bào RAW 264,7 của chuột đã được tiêm γ-oryzanol ức chế đáng kể quá
trình sản xuất các gốc tự do do lipopolysaccharid gây ra và biểu hiện viêm qua trung
gian NF-κB, dẫn đến cản trở các phản ứng viêm [30].
- Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào trước phản ứng oxy hóa: Đối với đặc
tính chống oxy hóa, ở cấp độ phân tử và tế bào, γ-oryzanol là chất chống oxy hóa dùng
để vơ hiệu hóa một số phần tử gọi là gốc tự do. Một nghiên cứu in vitro cho thấy rằng
γ-oryzanol có hiệu quả ngăn chặn q trình oxy hóa mơ cao hơn gấp bốn lần so với
vitamin E [26], [29], [30].
- Tác dụng lên hệ thần kinh và triệu chứng tiền mãn kinh: ɣ - oryzanol có tác dụng
làm giảm các triệu chứng bốc hỏa, đổ mồ hôi về đêm, mất ngủ ở người tiền mãn kinh.
Hơn nữa, sự kết hợp của ɣ- oryzanol và các sterol thực vật đã được sử dụng trong điều
trị chứng mất trí nhớ do tuổi già, xơ cứng động mạch và tiểu não [26], [32].
1.1.4. Độc tính của ɣ- oryzanol
Thử nghiệm trên chuột cho thấy độc tính cấp tính của ɣ- oryzanol với LD50 theo
các đường dùng như sau:

- Đường uống: 2500 mg/kg
- Đường qua da: 100 mg/kg
- Đường tiêm tĩnh mạch: 382 mg/kg [25].
1.2. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có ở Việt Nam và trên thế giới
1.2.1. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có ở Việt Nam
1.2.1.1. Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol
Phương pháp đo quang đã được sử dụng để định lượng ɣ- oryzanol ở Việt Nam với
các điều kiện phân tích như Bảng 1.1.
3


Bảng 1. 1. Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol
Mẫu

Xử lý mẫu

Cám gạo (Hưng Hịa tan với
n)
dung mơi

Dung mơi chiết
mẫu
n-heptan

Bước sóng

Tài liệu
tham khảo

315 nm

[6]

Nhận xét: Phương pháp có ưu điểm dễ vận hành, cách tiến hành nhanh chóng và
tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên, phương pháp có độ chính xác không cao và dễ mắc sai số.
1.2.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol
Ngoài phương pháp đo quang, HPLC cũng được ứng dụng để định lượng ɣ- oryzanol
với các điều kiện như Bảng 1.2.
Bảng 1. 2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol ở Việt Nam
Đối
tượng
mẫu

Xử lý
mẫu

Dung
mơi
chiết
mẫu

Cám
gạo
(Tiền
Giang)

Lắc ở
nhiệt
độ
phịng

Aceton

Cám
gạo
(Nàng
Hương)

Dùng
hỗ trợ
của vi
sóng

MeOH

Điều kiện sắc ký
Cột
phân
tích

Pha
động

Bước
sóng

Nhiệt độ
cột

C18 (4,6

x 250
mm, 5
µm)

Aceton:
ACN =
60: 40

330 nm

35 oC

C18 (4,6
mm x
150, 5
µm)

MeOH:
ACN =
30 :70

280 nm

Tài
liệu
tham
khảo

[2]

Nhiệt độ
phịng

[5]

Nhận xét: Phương pháp HPLC xác định ɣ- oryzanol trên nền mẫu cám gạo, dung
môi chiết và cách xử lý mẫu đa dạng, pha tĩnh là cột C18, pha động đẳng dòng, bước
sóng phát hiện là 280nm và 330 nm, nhiệt độ cột từ 20 oC đến 35 oC. Tuy nhiên, sắc ký
đồ phân tích trong tài liệu tham khảo [5] cho thấy các pic của ɣ- oryzanol không tách
khỏi nhau như Hình 1.2.

4


Hình 1. 2. Sắc ký đồ phân tích ɣ- oryzanol bằng HPLC trong tài liệu tham khảo [5]
Như vậy, hiện tại ở Việt Nam các nghiên cứu xác định ɣ- oryzanol sử dụng 2 phương
pháp là đo quang và HPLC với các điều kiện phân tích đơn giản, tuy nhiên số lượng
nghiên cứu còn rất hạn chế.
1.2.2. Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có trên thế giới
1.2.2.1. Phương pháp đo quang định lượng ɣ- oryzanol
Phương pháp đo quang đã được sử dụng để định lượng ɣ- oryzanol trên thế giới với
các điều kiện phân tích như Bảng 1.3.
Bảng 1. 3. Phương pháp đo quang để định lượng ɣ- oryzanol trên thế giới

Mẫu

Xử lý mẫu

Cám
gạo

(Brazil)

-Hòa tan bằng nước
và acid ascorbic
-Vortex và ủ trong
60 phút
-Sau đó chiết lặp lại
bằng dung mơi
chiết mẫu

Dung mơi
chiết mẫu

Thời gian
chiết

Bước sóng

n-hexan:
IPA=1:3

40 phút

326 nm

Tài liệu
tham
khảo

[22]

Nhận xét: Phương pháp có ưu điểm dễ vận hành và tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên,
phương pháp có độ chính xác khơng cao, dễ mắc sai số, quy trình chiết phức tạp và thời
gian xử lý mẫu lâu.
1.2.2.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được áp dụng nhiều trên thế giới để xác
định ɣ- oryzanol với độ chính xác cao và tiết kiệm chi phí nghiên cứu. Một số phương
pháp HPLC xác định ɣ- oryzanol đã có trong tài liệu tham khảo như Bảng 1.4.

5


Bảng 1. 4. Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol có
trên thế giới

TT

1

2

Đối
tượng
mẫu

Xử lý
mẫu

Dung
mơi

chiết
mẫu

4

Cột
phân

Pha động

tích

Bước

Nhiệt

sóng

độ cột

Gạo lứt Siêu âm
Ibaraki ở 0oC
(Nhật
Bản)

n-hexan: C8
EtOH = (4,6 x
4:3
150
mm, 5

µm)

ACN:
325
MeOH: IPA nm
=50: 45: 5

Gạo
Chiết
nếp tím Soxhlet
(Thái

n-hexan: C18
EtOAc = (4,6 x
7:3
250

MeOH:
ACN:
MeCl2:

Lan)

3

Điều kiện sắc ký

mm, 5
µm)

CH3COOH
=50: 44: 3: 3

C18
(4,6 x

MeOH:
ACN:

Gạo
(Hàn

Chiết
nóng ở

n-

Quốc)

70oC

EtOH = 250

Dầu
cám
gạo

Pha
lỗng
với pha

động

hexan:
9:1

mm, 5
µm)

Pha
động

C18
(4,6 x
250
mm, 5
µm)

330
nm

330
nm

MeCl2:
CH3COOH
= 55: 44: 3: 3
MeOH:
ACN:
MTBE
= 65:30:5

40 oC
[28]

Nhiệt
độ
phòng

[24]

Nhiệt
độ
phòng

325
nm

Tài
liệu
tham
khảo

[9]

50 oC
[23]

Nhận xét: Phương pháp HPLC được sử dụng trong các tài liệu tham khảo có các
đặc điểm sau:
- Dung môi và cách xử lý mẫu đa dạng

- Pha tĩnh: chủ yếu sử dụng cột C8 và C18
- Pha động: đẳng dịng
- Bước sóng phát hiện từ 325 đến 330 nm
- Nhiệt độ cột: từ 20 oC đến 50 oC.
1.2.2.3. Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Một số tài liệu tham khảo đưa ra phương pháp xác định ɣ- oryzanol bằng sắc ký
lỏng khối phổ với các điều kiện sắc ký khác nhau được trình bày ở Bảng 1.5.
6


Bảng 1. 5. Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Điều kiện sắc ký

Dung
TT

1

2

3

Đối tượng
mẫu

Xử lý
mẫu

mơi
chiết

mẫu

Gạo (Viện
Nghiên
cứu
lúa
gạo Quốc
tế)

Siêu
MeCl2:
âm ở MeOH=
30oC
2:1
trong
30
phút

MeOH
Gạo (Bắc Siêu
Mỹ)
âm ở
50oC
trong 1

Cột
phân
tích

Pha động

Bước
sóng

Nhiệt liệu
tham
độ
cột khảo

C18
(4,6 x
250
mm, 5
µm)

MeOH:
325
ACN:
nm
MeCl2:
CH3COOH
= 50: 44: 3:
3

30oC

C18 (3
x 150
mm 2.6
µm)

ACN, H2O, 325
IPA
nm
(chương
trình

25oC

giờ

gradient)

Cám gạo Chiết
MeOH
(Arkansas) và để 80%
lắng ở

C8 (4.6 ACN, H2O 320
x 150
(chương
nm
mm, 5 trình

5o C
trong
24 giờ

Tài

µm)

gradient)

[14]

[7]

Nhiệt
độ
phịng

[13]

Nhận xét: Phương pháp LC- MS trong các tài liệu tham khảo sử dụng điều kiện sắc
ký có đặc điểm sau:
- Dung mơi và phương pháp xử lý mẫu đa dạng
- Pha tĩnh là cột C8 hoặc C18
- Pha động theo chương trình gradient hoặc đẳng dịng
- Bước sóng phát hiện từ 320 nm đến 325 nm
- Nhiệt độ cột từ 20 oC đến 30 oC.
1.2.2.4. Một số phương pháp sắc ký khí khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Ngoài việc sử dụng phương pháp HPLC và LC-MS, một số phương pháp xác định
ɣ- oryzanol bằng sắc ký khí khối phổ trong tài liệu tham khảo được trình bày ở Bảng
1.6.

7


Bảng 1. 6. Một số phương pháp xác định ɣ- oryzanol bằng sắc ký khí khối phổ

Điều kiện sắc ký
TT

Đối
tượng
mẫu

1

Cám
gạo
(Ấn
Độ)

Xử lý
mẫu

Chiết
bằng
dung
mơi ở
38°C

Dung
mơi chiết
mẫu
Ete dầu
mỏ - nhexanMeOH =
1:3 (w/v)

Cột
phân
tích
Rtx-5
MS
(60 m
x 0,25
mm;

Khí
mang

Chế
độ
tiêm
mẫu

Heli với Chia
µ = 1,21 dịng
ml/phút 10:1

0,25
µm)
Gạo
(Đức
và
Trung
Quốc)
2

Gạo
(Indon
esia)
3

Chiết
bằng
dung
mơi ở
50°C,
khuấy
45
phút

MeCl2:
MeOH =
2:1

Chiết
bằng
dung
mơi ở
nhiệt
độ
phịng

EtOAc

Nhiệt độ
cột

300°C, tốc
độ
10°C/phút
trong 10
phút.

Tài
liệu
tham
khảo

[17]

Duy trì ở
260°C

Rtx H2 với
200MS µ = 1,9
(27 m ml/phút
x 0,25
mm;
0,1
µm)

Rxi
SH5Sil
(30 m
x 0,25
mm;
0,25

µm)

Chia
dịng
1 :10

Heli
Chia
µ = 14,0 dịng
ml/phút 1 :10

140°C/ 5
phút.
310°C, tốc
độ
15°C/phút,
trong 5
phút.
340°C, tốc
độ
2,5°C/phút,
trong 3
phút.
Duy trì ở
320 °C.
110°C/ 2
phút.
200°C, tốc
độ
10°C/phút.

Duy trì ở
200°C.

[20]

[19]

Nhận xét: Trong phương pháp GC-MS, phương pháp xử lý mẫu đơn giản, dung
mơi chiết mẫu, cột phân tích, chương trình nhiệt độ đa dạng và khí mang được sử dụng
là Heli và H2.
Như vậy, ɣ- oryzanol được xác định bằng nhiều phương pháp phân tích như đo
quang, HPLC, LC- MS và GC- MS. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn
8


sử dụng HPLC để xây dựng phương pháp định lượng ɣ- oryzanol với ưu điểm độ chính
xác cao, thao tác đơn giản và phù hợp với thiết bị có sẵn tại phịng thí nghiệm. Các
nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC ở Việt Nam và trên thế giới đều dùng pha tĩnh
là cột C8 hoặc C18, pha động đẳng dòng, bước sóng phát hiện từ 280 nm đến 330 nm,
nhiệt độ cột từ 20oC đến 50oC, tốc độ dòng từ 1,0-1,7 ml/phút, dung môi chiết mẫu đa
dạng như methanol, diclometan: methanol (2:1), n-hexan: ethanol (tỷ lệ 4:3 và 9:1), nhexan: ethyl acetat, …
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột C18, tốc độ dòng 1,2 ml/phút,
nhiệt độ cột 40oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, sử dụng pha động là MeOH và ACN theo tài
liệu tham khảo [5]. Nghiên cứu tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi pha động, dung môi
chiết mẫu, thời gian chiết mẫu và bước sóng phát hiện để lựa chọn điều kiện tối ưu.
1.3. Thông tin về mẫu chứa ɣ- oryzanol
1.3.1. Một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol hiện đang có trên thị trường
trong nước và ngồi nước
Hình ảnh của một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol hiện đang có trên thị
trường trong nước và ngồi nước được thể hiện ở Hình 1.3.

Hình 1. 3. Hình ảnh một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol trên thị trường
Các sản phẩm có chứa ɣ- oryzanol trên thị trường trong và ngoài nước hiện nay rất
đa dạng cả về dạng bào chế (viên nén, viên nang mềm, nang cứng) và hàm lượng ɣoryzanol. Thông tin về một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol được thể hiện
trong Bảng 1.7 như sau:

9


Bảng 1. 7. Thông tin về một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol có trên thị
trường
TT

Tên sản phẩm

Dạng bào chế

Nhà sản xuất

Hàm lượng
ɣ- oryzanol
trên nhãn (mg)

1

Source Naturals
Gamma Oryzanol

Viên nén

Threshold
Enterprises

60

2

Swanson Gamma
Oryzanol

Viên nang cứng

Swanson
Premium

60

Vistra Ceramide
Gamma Oryzanol &
CoQ10 Plus
Nano Megumi Oic

Viên nén

Công ty Vistra
(Thái Lan)

150

3

Viên nang mềm

4
Skin Vitamin E đỏ

Viên nang mềm

5
Viên nang cứng

6

Ricela Gamma
Oryzanol

Viên nén

7

KAL Gamma
Oryzanol
Health Guard
Gamma Oryzanol
Capsule

Viên nang cứng

8

Công ty cổ phần
công nghệ mới
Nhật Hải
Công ty cổ phần
dược phẩm
Oshii
Công ty A.P
Organics ( Ấn
độ)
KAL
Chiropractors
Buy Group

30

0,1

150

100

RCM ( Ấn độ)
150

1.3.2. Thông tin về sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân dùng trong nghiên cứu
Trong các sản phẩm đang có trên thị trường, viên làm trắng da Kiều Xuân được lựa
chọn làm mẫu thử để khảo sát các điều kiện thích hợp, từ đó xây dựng và thẩm định
phương pháp định lượng ɣ- oryzanol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Thông tin về mẫu viên làm trắng da Kiều Xuân:
- Hình ảnh sản phẩm (Hình 1.4)

- Dạng bào chế: viên nén
- Nhà sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim- khu công nghiệp Quang
Minh- Mê Linh- Hà Nội.
- Bảng thành phần và hàm lượng các thành phần được trình bày ở Bảng 1.8.

10


Bảng 1. 8. Các thành phần của viên làm trắng da Kiều Xuân
Thành phần

Hàm lượng nhãn (mg)

EstroG-100 (estrogen thảo dược)

257

ɣ-oryzanol

20

Glutathion

20

DHEA

5

Pregnenolon acetat

5

Collagen

100

Cao củ sắn dây

50

Curcumin

20

Tá dược vừa đủ

700

Hình 1. 4. Hình ảnh sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân
1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1. Nguyên tắc
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật sắc ký được sử
dụng để tách các hợp chất trong hỗn hợp với mục đích định tính, định lượng và tinh chế
các thành phần của hỗn hợp. Trong đó, các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các
hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng. Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau
trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác nhau, do đó ái lực của
nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau. Với các chất cùng nhóm có cấu
trúc khá tương đồng hoặc đồng phân đối quang cần tác động vào hệ tách gồm pha tĩnh
và pha động để có thể thu được kết quả tách đáp ứng yêu cầu [1], [3].

1.4.2. Phân loại
11


Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc
vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích. Các kỹ thuật sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến
trong thực tế như:
- Sắc ký phân bố
- Sắc ký hấp phụ
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký loại cỡ
- Sắc ký ái lực
- Sắc ký các đồng phân quang học
Trong đó, sắc ký phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, có thể
phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:
- Sắc ký lỏng- lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang rắn, gọi
là chất nhồi cột.
- Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh có liên kết với bề mặt chất mang rắn, gồm sắc ký
pha thuận và pha đảo [3].
1.4.3. Các đại lượng đặc trưng
1.4.2.1. Số đĩa lý thuyết (N):
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột). Ở mỗi
đĩa sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động.
Cơng thức tính:
!

#

𝑁 = "hoặc N = 16x($! )%
Trong đó: L là chiều dài của cột

H là chiều cao của đĩa lý thuyết
W là chiều rộng đo ở đáy pic
tR là thời gian lưu của pic tương ứng chất phân tích (phút) [3], [4].
1.4.2.2. Thời gian lưu (tR):
Thời gian lưu là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.
Công thức tính:
𝐿
𝑡& =
𝑣̅
Trong đó: L là chiều dài cột,
𝑣̅ là tốc độ trung bình của chất phân tích [3], [4].
1.4.2.3. Độ phân giải (Rs):
Độ phân giải là khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký.
Cơng thức tính:

12


∆𝑍

𝑅' =

1
(𝑊 + 𝑊) )
2 (
Trong đó: ∆𝑍 là khoảng cách giữa hai pic,
W* , W+ lần lượt là độ rộng pic của chất A, B [1], [3].
1.4.2.4. Hệ số bất đối (AF): dùng để đánh giá tính bất đối xứng của pic
Cơng thức tính:
𝐴𝐹 =

𝑏
𝑎

Trong đó: a là nửa chiều rộng phía trước pic,
b là nửa chiều rộng phía sau pic,
a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic [1], [3].
1.4.4. Ứng dụng
Các ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm bao gồm:
- Định tính: định tính chất thử dựa vào thời gian lưu, hình dạng pic của thử và chuẩn,
hoặc chồng pic của thử và chuẩn.
- Định lượng: định lượng các chất dựa vào diện tích pic và nồng độ của chất thử, chất
chuẩn. Có nhiều phương pháp định lượng bằng HPLC như: phương pháp chuẩn ngoại,
phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Xác định tạp chất: dựa vào thời gian lưu, diện tích pic để xác định tạp chất.
- Định lượng tạp chất: định lượng các chất dựa vào diện tích pic và nồng độ của chất
thử, chất chuẩn tạp [3].

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu thử: viên làm trắng da Kiều Xuân.
- Nơi sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim- khu công nghiệp Quang MinhMê Linh- Hà Nội
- Hàm lượng: ɣ-oryzanol 20 mg
- Lô sản xuất: 220621 và 150622
- Quy định hàm lượng: hàm lượng ɣ-oryzanol trong mỗi viên không nhỏ hơn 80,0 % và
không lớn hơn 120,0 % so với hàm lượng ghi trên nhãn (tiêu chuẩn nhà sản xuất).

2.1.2. Thiết bị, hóa chất, dung mơi
2.1.1.1. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy Binder (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E53 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện
kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Tủ lạnh Sharp (Thái Lan), mã thiết bị: NIFC.05E049 của Khoa Nghiên cứu phát triểnViện kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Cân phân tích Mettler toledo (Thụy Sĩ), d= 0,0001 g, mã thiết bị: NIFC.04E60 của
Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Cân phân tích Sartorius (Đức), d=0,00001 g, mã thiết bị: NIFC.04E059 của Khoa
Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Máy ly tâm HERMLE-Z 326 K (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E0119 của Khoa Nghiên
cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Máy lắc ngang IKA-HS 260 basic (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E079 của Khoa Nghiên
cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters e2695 (Mỹ), mã thiết bị: NIFC 05M.063 của
Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Cột sắc ký XBridge Waters (Mỹ) C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) của Khoa Nghiên cứu
phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết.
2.1.1.2. Chất chuẩn
- Chất đối chiếu: ɣ-oryzanol
- Nhà sản xuất: Toronto Research Chemicals Inc.-2 Brisbane Road, Toronto, Canada.
- Số lơ: 3-OBI-37-1
- Hàm lượng: 95,0 %
2.1.1.3. Hóa chất, dung môi
- Nước cất
14


- Isopropanol (tinh khiết PA)
- n-hexan (tinh khiết PA)

- Ethanol (tinh khiết PA)
- Methanol (dùng cho HPLC) sản xuất bởi Merck KGaA, Đức.
- Acetonitril (dùng cho HPLC) sản xuất bởi Merck KGaA, Đức.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát các điều kiện phù hợp để xây dựng phương pháp định lượng ɣoryzanol
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
- Khảo sát bước sóng phát hiện
- Khảo sát tỷ lệ dung mơi pha động
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
- Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi chiết mẫu
- Khảo sát thời gian chiết mẫu
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Tính thích hợp hệ thống sắc ký
- Độ đặc hiệu
- Độ tuyến tính
- Độ lặp lại
- Độ chính xác trung gian
- Độ đúng [35].
2.2.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản
phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
2.3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
a) Khảo sát bước sóng phát hiện: quét phổ dung dịch chuẩn với bước sóng từ 210
nm đến 400 nm để chọn bước sóng phân tích.
b) Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động: khảo sát pha động MeOH: ACN ở các tỷ lệ
35:65; 50:50 và 70: 30.
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
a) Dựa vào độ tan của ɣ-oryzanol và điều kiện của phịng thí nghiệm, chúng tôi khảo

sát 6 dung môi xử lý mẫu là:
- Isopropanol
- n-hexan: ethanol= 5:2 (v/v)
- Methanol
15


- Ethanol
- n-hexan
- n-hexan: isopropanol= 1:3 (v/v)
b) Khảo sát thời gian chiết mẫu với thời gian là 15 phút, 30 phút và 45 phút.
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
2.3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn ɣ-oryzanol dùng trong định lượng, ghi lại
sắc ký đồ. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký về thời gian lưu tR, diện tích pic
S, số đĩa lý thuyết N, độ phân giải Rs và hệ số bất đối AF [4].
Yêu cầu:
- Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0 %
- Giá trị RSD của tổng diện tích pic ≤ 2,0 %
-

Độ phân giải các pic Rs > 1,5
Số đĩa lý thuyết N ≥ 2000

- Hệ số bất đối AF < 2,00.
2.3.2.2. Độ đặc hiệu
So sánh đáp ứng của mẫu trắng (dung mơi pha mẫu), mẫu placebo (có các thành
phần tá dược như Bảng 2.1), mẫu thử, mẫu chuẩn được phân tích trong cùng điều kiện.
Bảng 2. 1. Các thành phần của mẫu placebo
Thành phần

Hàm lượng (g)

EstroG-100 (estrogen thảo dược)

5,14

Glutathion

0,4

Pregnenolon acetat

0,1

Collagen

2

Cao củ sắn dây

1

Curcumin

0,4

Yêu cầu:
- Mẫu trắng và mẫu placebo không xuất hiện pic tại thời gian lưu của ɣ-oryzanol
trong mẫu chuẩn. Mẫu thử, mẫu chuẩn có thời gian lưu của pic ɣ-oryzanol tương đồng

nhau.
- Các pic sắc ký của ɣ-oryzanol trong mẫu thử và mẫu chuẩn đạt độ tinh khiết pic
với độ tinh khiết góc (PA) < độ tinh khiết ngưỡng (TH) [33].
2.3.2.3. Độ tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 400 µg/ml, pha lỗng với dung môi pha
mẫu để được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ ɣ-oryzanol đạt 50% - 75% 16


100% - 125% - 150% so với nồng độ dung dịch thử (40 µg/ml), tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện và xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan R
và % hệ số chắn Y [35].
Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng tuyến tính với hệ số tương quan R
≥ 0,998 và % hệ số chắn (tại nồng độ 100 %) Y% ≤ 2,0 %.
Y% =

|Hệsốchắn(b)|
x100%
S!"#$$%

2.3.2.4. Độ lặp lại
Tiến hành phân tích độc lập 6 dung dịch thử nồng độ 100 %, tính kết quả dựa vào
đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính RSD
của các giá trị hàm lượng ɣ-oryzanol trong mẫu thử giữa các lần phân tích [4].
Yêu cầu: RSD ≤ 2,0 %.
2.3.2.5. Độ chính xác trung gian
Hai kiểm nghiệm viên tiến hành phân tích độc lập 12 dung dịch thử nồng độ 100%
tại hai ngày khác nhau, mỗi kiểm nghiệm viên 6 mẫu, tính kết quả dựa vào mẫu chuẩn
tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ chính xác trung gian bằng cách tính RSD
của các giá trị hàm lượng ɣ-oryzanol trong mẫu thử giữa các lần phân tích [35].
Yêu cầu: Độ chính xác trung gian của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày khác

nhau có RSD ≤ 2,0 %.
2.3.2.6. Độ đúng
Thêm một lượng chính xác chất chuẩn ɣ-oryzanol tương ứng 60 %, 100%, 140%
so với nồng độ dung dịch thử (40 µg/ml) vào mẫu placebo, chuẩn bị 3 mẫu độc lập với
mỗi nồng độ, tiến hành tương tự mẫu thử, phân tích mẫu, ghi lại sắc ký đồ và tính độ
thu hồi của chuẩn ɣ-oryzanol.
Yêu cầu: Độ thu hồi của ɣ-oryzanol từ 97,0 %-103,0 % ở mỗi mức nồng độ.
m,-.ẩ0ɣ345678049#ì;9ạ=
%Tìmlại =
𝑥100
m,-.ẩ0ɣ3456780499ý#-.6ế#
Theo AOAC, độ thu hồi chấp nhận được theo nồng độ chất phân tích được trình bày
trong Bảng 2.2. Hàm lượng ghi trên nhãn của ɣ-oryzanol là 20 mg trong viên 700 mg,
vì vậy độ thu hồi chấp nhận được của ɣ-oryzanol là 97,0-103,0 % [34].

17