Trương thị mỹ quyên nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ vỏ cây núc nác (oroxylum indicum (l ) vent) khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

TRƯƠNG THỊ MỸ QUYÊN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
FLAVONOID TỪ VỎ CÂY NÚC NÁC
(OROXYLUM INDICUM (L.) VENT)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ----TRƯƠNG THỊ MỸ QUYÊN
Mã sinh viên: 1801587

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
FLAVONOID TỪ VỎ CÂY NÚC NÁC
(OROXYLUM INDICUM (L.) VENT)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Bùi Thị Thúy Luyện
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất
Khoa Cơng nghệ Hóa dược

HÀ NỘI – 2023


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện và hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được
sự quan tâm, giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô cùng bạn bè và gia đình.
Để có được thành quả này, đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc
đến TS. Bùi Thị Thuý Luyện, tổ Chiết xuất - Bộ mơn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất
- Khoa Cơng nghệ Hóa dược đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và đưa ra những lời khuyên
giúp em tháo gỡ những vướng mắc trong quá trình nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi
nhất để giúp em hoàn thành đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Văn Hùng – Bộ môn Công nghiệp
Dược – Khoa Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã giúp đỡ cũng như góp ý cho em
trong suốt quá trình thí nghiệm.
Em cũng xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô Bộ
môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất - Khoa Cơng Nghệ Hóa Dược đã ln giúp đỡ,
tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn đến các bạn sinh viên khóa 73 và các em sinh viên khóa
74 cùng làm đề tài tại bộ môn đã luôn chia sẻ cùng em những kinh nghiệm quý báu và
giúp đỡ em rất nhiều trong q trình hồn thành đề tài.
Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân trong gia
đình, bạn bè đã ln giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện cho em trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu để đạt được kết quả như ngày hôm nay.
Mặc dù em đã cố gắng để khóa luận được hồn thiện nhất nhưng khơng tránh khỏi
có những sai sót trong q trình thực hiện. Vì vậy, kính mong các thầy cơ và các anh chị
chỉ bảo, góp ý để khóa luận của em được hồn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Trương Thị Mỹ Quyên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ....................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ....................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ..........................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN ........................................................................................2
1.1 Tổng quan về dược liệu núc nác .........................................................................2
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố .........................................................................2
1.1.2 Thành phần hóa học .........................................................................................2
1.1.3 Bộ phận dùng ...................................................................................................4
1.1.4 Tác dụng sinh học ............................................................................................4
1.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid và ứng dụng trên núc nác .................7
1.2.1 Phương pháp chiết xuất flavonoid ...................................................................7
1.2.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid từ núc nác ..........................................8
1.3 Tổng quan về tối ưu hóa ......................................................................................8
1.3.1 Tối ưu hóa ........................................................................................................8
1.3.2 Các phương pháp tối ưu hóa ............................................................................9
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................12
2.1 Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................12
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................12
2.1.2 Thiết bị, hóa chất, phần mềm nghiên cứu ......................................................12
2.2 Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13
2.3 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................13
2.3.1 Phương pháp định lượng xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được
từ vỏ cây núc nác ....................................................................................................13
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng .............................................................13

2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất phù hợp ............14
2.3.4 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid
từ vỏ thân núc nác ...................................................................................................15


CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................18
3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng
flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ thân cây núc nác .......................................18
3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc C0..................................................................18
3.1.2 Thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được
từ vỏ cây núc nác. ...................................................................................................18
3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid
từ vỏ thân cây núc nác sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) ......21
3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết ..........................................................................21
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ....................................................................23
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất ...............................................................24
3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và dược liệu (tỷ lệ DM/DL) .........................25
3.3 Kết quả tối ưu hóa q trình chiết xuất flavonoid từ vỏ thân cây núc nác sử
dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) ...........................................................26
3.3.1 Quy hoạch thực nghiệm .................................................................................26
3.3.2 Mối quan hệ giữa các biến đầu vào và biến đầu ra........................................27
3.3.3 Xác định không gian thiết kế .........................................................................30
3.3.4 Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu .............................................................33
3.4 Xây dựng quy trình chiết xuất và đánh giá độ ổn định của quy trình ..........34
3.5 Bàn luận ..............................................................................................................35
3.5.1 Về phương pháp định lượng flavonoid tổng..................................................35
3.5.2 Về các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ cây núc
nác ...........................................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................

PHỤ LỤC .........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Phần viết đầy đủ

STT Phần viết tắt
1

ALT

Alanin transaminase

2

ANN

Mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network)

3

ANOVA

4

AOAC

5

AST

Aspart transaminase

6

CCO

Thiết kế hỗn hợp tâm trực giao (Orthogonal Central
Composite Design)

7

DM/DL

8

DoE

9

DPPH

10

IC50

Nồng độ ức chế 50%

11

KGTK

Không gian thiết kế

12

OFAT

Phương pháp khảo sát thay đổi 1 yếu tố (One factor at a time)

13

PGE2

Prostaglandin E2

14

PLS

Hồi quy bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least
Squares regression)

15

RSD

16

RSM

17

STT

Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance)
Association of Official Analytical Chemists

Tỷ lệ dung môi - dược liệu
Thiết kế thí nghiệm (Design of Experiments)
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface
Methodology)
Số thứ tự


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Tên bảng biểu

Trang

Bảng 1.1

Cấu trúc một số hợp chất flavonoid trong vỏ cây núc nác

3

Bảng 2.1

Danh sách các hóa chất

12

Bảng 3.1

Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống của phương pháp định
lượng

18

Bảng 3.2

Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn C1 đến C5

19

Bảng 3.3

Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng

20

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng

20

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát chính xác trung gian của phương pháp định
lượng

21

Bảng 3.6

Các biến đầu vào được lựa chọn trong quy hoạch thực nghiệm

27

Bảng 3.7

Các công thức thiết kế trong quy hoạch thực nghiệm và kết quả
giá trị thực nghiệm các biến đầu ra

27

Bảng 3.8

Phân tích phương sai (ANOVA) cho hiệu suất chiết flavonoid

28

Bảng 3.9

Phân tích hệ số hồi quy của hiệu suất chiết flavonoid

29

Bảng 3.10 Kết quả kiểm định không gian thiết kế

31

Bảng 3.11 Kết quả thẩm định mơ hình bằng thực nghiệm

33

Bảng 3.12 Kết quả nâng cấp quy mô chiết xuất

34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, sơ đồ

Trang

Hình 1.1

Hình ảnh cây núc nác

2

Hình 1.2

Sơ đồ các bước tối ưu hóa quá trình chiết xuất sử dụng phương

pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

11

Hình 2.1

Hình ảnh dược liệu vỏ cây núc nác

12

Hình 2.2

Sơ đồ Ishikawa cho quy trình chiết flavonoid

15

Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ
quercetin

19

Hình 3.2

Kết quả khảo sát phương pháp chiết

22

Hình 3.3

Kết quả khảo sát nồng độ ethanol

23

Hình 3.4

Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết
flavonoid

25

Hình 3.5

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi – dược liệu đến hiệu suất chiết
flavonoid

25

Hình 3.6

Ảnh hưởng của tương tác của các cặp yếu tố đầu vào đến hiệu
suất chiết flavonoid

30

Hình 3.7

Khơng gian thiết kế được xây dựng từ mơ hình

32

Hình 3.8

Sơ đồ quy trình chiết flavonoid tổng từ vỏ thân núc nác

34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Núc nác (Oroxylum indicum (L.) Vent) là một lồi dược liệu được tìm thấy nhiều
nơi ở Việt Nam và trên thế giới, đặc biệt là Nam Á, Đông Nam Á và Trung Quốc [2].
Trong nhiều thế kỷ, núc nác đã được dùng như một loại thảo dược quan trọng ở nhiều
nước châu Á để điều trị các bệnh khác nhau, đặc biệt là bộ phận vỏ cây [37]. Từ lâu vỏ
cây núc nác đã được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền như một vị thuốc dùng để
chữa các bệnh như tiêu chảy, kiết lỵ, đau dạ dày, viêm nhiễm đường tiết niệu, tiểu buốt,
tiểu ra máu, ho, viêm họng [5]. Các nghiên cứu dược lý học hiện đại cho thấy vỏ cây
núc nác có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ
dạ dày, bảo vệ gan [13], [23], [24], [26], [27], [28]. Và hầu hết các nghiên cứu đánh giá
độc tính đều cho thấy núc nác khơng gây độc cho người và động vật thí nghiệm kể cả
khi dùng với liều cao [37]. Thành phần của vỏ thân cây núc nác bao gồm flavonoid,
tannin, alcaloid, saponin, lignin, chất béo [50]. Trong đó, nhóm chất flavonoid đã được
chứng minh là thành phần chính tạo ra tác dụng sinh học của các sản phẩm chiết từ vỏ
cây núc nác [36]. Với nhiều tác dụng dược lý quan trọng và mức độ an tồn khi sử dụng
thì flavonoid trong vỏ cây núc nác là nguồn hoạt chất tiềm năng để định hướng phát
triển các sản phẩm phục vụ cho nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe của người dân. Bởi vậy,
việc xây dựng một quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ cây núc nác để đạt được hiệu
suất tối đa là cần thiết, từ đó góp phần cung cấp cơ sở khoa học cho việc định hướng
khai thác dược liệu một cách hiệu quả.
Cho đến nay, nhiều nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về chiết tách, tinh chế,

định lượng flavonoid trong vỏ cây núc nác đã được tiến hành [21], [26], [50], [51]. Tuy
nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất lên hiệu
suất chiết flavonoid tổng từ vỏ cây núc nác.
Do đó đề tài “Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ vỏ cây núc nác (Oroxylum
indicum (L.) Vent)” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất flavonoid
tổng từ vỏ cây núc nác.
2. Đề xuất quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ cây núc nác quy mô 50g/mẻ.

1


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về dược liệu núc nác
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Vị trí phân loại [7]:
Ngành Ngọc Lan (Mangnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Mangnoliopsida)
Phân lớp Bạc Hà (Lamidae)
Bộ Hoa Mõm Chó (Scrophulariales)
Họ Chùm ớt (Bignoniaceae)
Chi Oroxylum
Tên đầy đủ: Oroxylum indicum (L.) Vent
Hình 1.1: Hình ảnh cây núc nác
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây cao 7 – 12 m, có thể cao tới 20 – 25 m, thân nhẵn, ít phân nhánh. Vỏ cây màu
xám tro, mặt trong màu vàng. Lá xẻ 2 – 3 tầng lông chim. Lá chét hình bầu dục, nguyên,
đầu nhọn, dài 7,5 – 15 cm, rộng 5 – 6,5 cm. Hoa màu nâu đỏ sẫm mọc thành chùm dài
ở đầu cành, dài khoảng 10 cm, 5 nhị trong đó có một nhị nhỏ hơn. Quả nang to, dài tới
50 – 80 cm, rộng 5 – 7 cm, bên trong chứa hạt, bao quanh có một màng mỏng, bóng và

trong, hình chữ nhật [2].
1.1.1.2. Phân bố
Cây núc nác mọc hoang và được trồng khắp nơi ở Việt Nam, ở cả miền Bắc cũng
như miền Nam. Cây còn mọc ở Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, Lào, Campuchia [2].
1.1.2 Thành phần hóa học
➢ Vỏ thân
Vỏ thân cây núc nác chứa: flavonoid, tannin, sterol với nồng độ trung bình; alcaloid,
saponin, lignin, chất béo và dầu với nồng độ thấp [50]. Trong đó flavonoid là thành phần
chính gồm chrysin 0,35%; baicalein 0,5%; oroxylin A 0,65%;… [5].
➢ Vỏ rễ
Vỏ rễ cây núc nác chứa flavonoid, alkaloid, glycosid, tannin, sterol, phenol, lignin
và saponin [50]. Trong đó có oroxylin A chiếm 0.86%, naphtalen, 3-methoxy-6,7dohydroxy flavon và acid ellagic (1 kg vỏ rễ cho 100 ng ellagic) [5].
➢ Lá cây
Lá cây núc nác chứa các flavonoid: Chrysin, oroxylin A, scutellarin và baicalein
[53], baicalein-7-O-glucosid, baicalein-7-O-diglucosid, baicalein-7-O-glucuronid,
chrysin-7-O-glucuronid và chrysin-diglucosid [55], [56].

2


➢ Hạt
Hạt cây núc nác chứa các flavonoid như baicalein, baicalcin-6-glucosid, baicalein7-acid glucuronic, baicalein-7-O-gentiobiolosid, và một số các flavonoid khác [5].
➢ Quả
Quả cây núc nác chứa chrysin, oroxylin A, scutellarin và baicalein, phenyl
ethanoidcyclohexyl ethanoid [5], [42].
Ngoài ra một số tác giả còn tách được từ núc nác các chất: 5-hydroxy-6,7dimethoxyflavon, 5,6-dihydroxy-7-methoxy flavon; negletein; hispidulin; apigenin... và
các sterol như B-sitosterol, acid tanic và galactose [5].
Ở Việt Nam và trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của
cây núc nác. Kết quả của các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của vỏ thân
cây núc nác là các flavonoid.

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất flavonoid trong vỏ cây núc nác
STT

Hoạt chất

Công thức cấu tạo

1

Chrysin

[52]

2

Baicalein

[52]

3

Oroxylin A

[52]

4

Scutellarein

[52]

5

Scutellarein-7-Orutinosid

[52]

3

TLTK


6

Baicalein-7-Oglucuronid

[52]

7

8,8''-Bisbaicalein

[38]

8

Baicalein-7-Ocaffeat

[38]

9

6-Hydroxyluteolin

[38]

10

6-Methoxyluteolin

[38]

1.1.3 Bộ phận dùng
Bộ phận dùng là vỏ cây. Vỏ sau khi bóc thì được làm khơ ngay. Vỏ dày trên 1 mm,
mặt ngoài màu vàng nâu, mặt trong màu vàng nhạt, vị đắng.
Nếu thu hoạch hạt thì hái những quả đã già vào cuối thu, phơi khô đập lấy hạt rồi
phơi lại cho thật khơ. Hạt có vị đắng không mùi [1].
1.1.4 Tác dụng sinh học
1.1.4.1. Theo y học cổ truyền
Vỏ thân núc nác có vị đắng, tính hàn, quy vào kinh bàng quang và tỳ. Do đó, dược
liệu này có cơng dụng thanh nhiệt, sát trùng, tiêu độc, chỉ khái, chỉ thống.
Vỏ núc nác được dùng để chữa tiêu chảy, kiết lỵ, đau dạ dày, viêm nhiễm đường tiết
niệu, tiểu buốt, tiểu ra máu, ho, viêm họng. Ngoài ra, vỏ núc nác cịn có thể chữa dị ứng
và các bệnh ngoài da (mẩn ngứa, ban, sởi…).

4


Trong dân gian, người ta dùng vỏ núc nác (còn gọi là hoàng bá nam) thay cho vị
thuốc hoàng bá thực (vỏ thân phơi khơ của cây hồng bá Phellodendron amurense Rupr,

thuộc họ Cam (Rutaceae)) [5].
1.1.4.2. Theo y học hiện đại
➢ Tác dụng chống viêm
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vỏ rễ, vỏ thân và lá của cây núc nác có tác dụng
chống viêm cấp và viêm mạn trên chuột. Cao chiết chloroform, ethyl acetat và n-butanol
vỏ rễ cây núc nác liều 300 mg/kg (khối lượng cao chiết/cân nặng động vật thí nghiệm)
có tác dụng chống viêm khớp trên mơ hình gây viêm khớp chuột bằng dung dịch tá dược
Freund hồn chỉnh, trong đó cao chiết ethyl acetat cho tác dụng tốt nhất [22]. Cao chiết
n-butanol vỏ rễ cây núc nác có tác dụng chống viêm cấp trên mơ hình gây phù bàn chân
chuột bằng carrageenan và tác dụng chống viêm mạn trên mơ hình gây u hạt thực nghiệm
bằng viên bông [58]. Cao chiết nước của lá cây núc nác liều 150 mg/kg và 300 mg/kg
thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mơ hình gây phù bàn chân chuột bằng
carrageenan. Các hoạt động chống viêm được cho là do có sự hiện diện của flavonoid
và polyphenolic [16]. Tác dụng chống viêm của cao chiết ethanol vỏ thân cây núc nác
được nghiên cứu trên hai mơ hình: mơ hình gây viêm bởi xylen và mơ hình gây viêm
bởi formalin có kết quả cả hai mức liều 250 mg/kg và 300 mg/kg đều thể hiện tác dụng
chống viêm trên cả hai mơ hình [24]. Cao chiết ethanol – nước vỏ thân cây núc nác cũng
có tác dụng chống viêm trên mơ hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, kết quả
hai mức liều nghiên cứu là 250 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng chống viêm, trong
đó liều 500 mg/kg có tác dụng tốt hơn [45]. Cao chiết methanol vỏ thân cây núc nác có
tác dụng chống viêm trên mơ hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan ở cả ba
mức liều nghiên cứu 100 mg/kg, 200 mg/kg và 400 mg/kg, trong đó mức liều 400 mg/kg
thể hiện tác dụng chống viêm tốt nhất [10]. Định hướng cơ chế tác dụng chống viêm của
cây núc nác cũng đã được nghiên cứu như: cao chiết dichloromethan và cao chiết ethyl
acetat vỏ thân cây núc nác ức chế mạnh hoạt động của NF-κB, cao chiết ethyl acetat vỏ
thân cây núc nác còn ức chế sản sinh PGE2, cao chiết ethanol vỏ quả cây núc nác có tác
dụng loại bỏ các gốc tự do nội bào, giảm bài tiết NO và IL-6 [17], [29], [31].
➢ Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu trên các mơ hình in vitro đã chứng minh các bộ phận của cây núc
nác bao gồm vỏ rễ, vỏ thân, lá, quả có hoạt tính chống oxy hóa. Tiềm năng chống oxy

hóa của cao chiết methanol từ các bộ phận khác nhau của cây núc nác bao gồm vỏ rễ,
vỏ thân, lá và quả được xác định bằng khả năng dọn sạch gốc tự do DPPH, nitric oxyd,
anion superoxyd, hydroxyl, trong đó cao chiết methanol từ lá thể hiện hoạt động dọn
gốc tự do cao hơn so với cao chiết methanol từ vỏ và quả [25]. Cao chiết ethyl acetat,
methanol và nước của lá cây núc nác cho thấy hoạt tính chống oxy hóa đáng kể, thể hiện
5


khả năng dọn gốc tự do DPPH với các giá trị IC50 của các cao chiết lần lượt là 49,0
mcg/mL; 55,0 mcg/mL; 42,5 mcg/mL [41]. Cao chiết methanol vỏ thân cây núc nác
được nghiên cứu có khả năng dọn sạch các tự do DPPH với hiệu suất là 79,29% so với
acid ascorbic [23]. Cao chiết chloroform, ethanol và cao chiết nước của vỏ thân núc nác
có khả năng ức chế sự hình thành các gốc tự do DPPH, superoxid, hydroxyl, nitric oxid
và ức chế q trình peroxyd hóa lipid ở gan chuột [28], [30].
➢ Tác dụng kháng khuẩn
Vỏ thân cây núc nác đã được nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn. Các cao chiết
methanol, ethyl acetat và ethanol vỏ thân cây núc nác có hoạt tính kháng khuẩn với ba
chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương: Bacillus subtilis, E.coli, Pseudomonas
eruginosa [13]. Cao chiết hexan và choloroform vỏ thân cây núc nác đã được thử nghiệm
về hoạt tính kháng khuẩn trên một số vi khuẩn Gram âm, Gram dương như Bacillus
megaterium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea. E. coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella parathyphii, Salmonella typhi, Shigella boydii,
Shigella dysenteriae, Vibrio mimicus... Tất cả các cao chiết đều có hiệu quả chống lại
các vi khuẩn Gram dương, Gram âm với hiệu quả tương đương khi so sánh với kháng
sinh ampicillin [20].
➢ Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vỏ thân cây núc nác có tác dụng chống ung thư.
Bốn cao chiết: cao chiết nóng chloroform, cao chiết lạnh chloroform, cao chiết nóng
ether dầu hỏa, cao chiết lạnh ether dầu hỏa của vỏ thân cây núc nác có khả năng gây độc
tế bào, cảm ứng gây chết tế bào theo chu trình và tiềm năng chống di căn ung thư khi

đánh giá tác dụng trên các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm ung thư bạch cầu,
ung thư vú, cổ tử cung và tuyến tiền liệt [26]. Cao chiết ethanol từ vỏ thân cây núc nác
đã được chứng minh là có độc tính cao đối với khối u ác tính ở chuột, ung thư biểu mơ
đại tràng và tế bào ung thư bạch cầu [12]. Cao chiết từ lá và quả núc nác cũng có hoạt
tính chống lại các tế bào ung thư vú MCF-7, cả hai cao chiết đều gây chết tế bào ung
thư vú và ức chế sự di chuyển của tế bào bằng cách giảm mức protein MMP 9 [11]. Cao
chiết ether dầu hỏa vỏ thân cây núc nác ức chế sự di chuyển của các tế bào, do đó có
tiềm năng ngăn cản quá trình di căn [21], [26].
➢ Bảo vệ dạ dày, chống loét
Cao chiết hexan và aceton vỏ thân cây núc nác có tác dụng chống lại các tổn thương
niêm mạc dạ dày do ethanol trên chuột cống trắng ở nồng độ 100 mg/kg và 250 mg/kg
[9]. Cao chiết n-butanol vỏ rễ cây núc nác liều 100 mg/kg và 300 mg/kg làm giảm đáng
kể tình trạng loét dạ dày do ethanol gây ra ở chuột với cơ chế được biết đến có thể là
thơng qua hoạt động chống oxy hóa, giãn mạch và bảo vệ tế bào dạ dày [57].

6


➢ Hoạt động bảo vệ gan
Hoạt động bảo vệ gan của lá cây và vỏ thân cây núc nác đã được nghiên cứu. Cao
chiết ethanol, nước và chloroform lá cây núc nác với liều 300 mg/kg cho thấy hoạt động
bảo vệ gan chống lại tác nhân gây độc gan CCl4, làm thay đổi đáng kể nồng độ ALP,
ALAT, ASAT và tổng lượng bilirubin so với nhóm chứng; trong đó cao chiết ethanol
thể hiện hiệu quả tốt hơn các cao chiết khác [8]. Cao chiết ether dầu hỏa, chloroform,
methanol và nước của vỏ thân cây núc nác có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương
gây ra bởi CCl4, làm giảm nồng độ AST (aspart transaminase), ALT (alanin
transaminase), phosphatase kiềm ALP so với nhóm đối chứng dùng silymarin [27]. Cao
chiết ethanol – nước của vỏ thân cây núc nác liều 900 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan
chống lại nhiễm độc gan gây ra bởi CCl4 gây ra ở chuột Wistar so với nhóm đối chứng
dùng silymarin [47].

1.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid và ứng dụng trên núc nác
1.2.1 Phương pháp chiết xuất flavonoid
Khơng có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác
nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid glycosid thường
dễ tan trong các dung môi phân cực như cồn, methanol, hay hỗn hợp cồn nước. Các
aglycon dễ tan trong dung mơi ít phân cực hơn [1].
Hiện nay các kỹ thuật chiết xuất flavonoid thường sử dụng được chia làm 2 nhóm,
đó là cơng nghệ thông thường và công nghệ xanh. Công nghệ thông thường bao gồm:
chiết ngâm, chiết soxhlet, chiết hồi lưu; công nghệ xanh bao gồm: chiết siêu âm, chiết
vi sóng, chiết bằng dung môi dưới áp lực cao, chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn
[39]. Các phương pháp chiết xuất thông thường dựa vào độ tan của dược chất từ dược
liệu vào trong dung mơi. Do đó, thường sử dụng một lượng lớn dung môi, hiệu suất
chiết thấp và thời gian chiết kéo dài. Ngoài ra, khi nhiệt được sử dụng trong quy trình
chiết xuất, cấu trúc hóa học của flavonoid có thể bị phân hủy, dẫn đến giảm hoạt tính
sinh học của hoạt chất [34]. Trong khi đó, các phương pháp chiết xuất xanh sử dụng hóa
chất an tồn, tiết kiệm năng lượng, sử dụng nguyên liệu tái tạo và ngăn ngừa ô nhiễm
môi trường. Tuy nhiên các phương pháp chiết xuất này cũng tồn tại một số nhược điểm
như vốn đầu tư cao, một số phương pháp khó triển khai khi nâng cấp lên quy mô công
nghiệp.
Nhiều dung môi được sử dụng để chiết xuất flavonoid bao gồm ethanol, methanol,
ethyl acetat, acetone,… [39]. Nồng độ ethanol cao (90 - 95%) được sử dụng để chiết
xuất flavonoid tự do, trong khi ethanol thấp độ (khoảng 60%) được sử dụng để chiết
xuất flavonoid glycosid và ethyl acetat được ưu tiên sử dụng để chiết xuất các aglycon
[15], [40]. Đặc tính của dung mơi chiết xuất ảnh hưởng đến tính chất và hoạt tính sinh
học của các flavonoid được chiết xuất. Do hiệu suất thu hồi flavonoid lớn hơn nên
7


methanol và ethanol là những dung môi được sử dụng thường xuyên nhất để chiết xuất
flavonoid [14], [54].

1.2.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid từ núc nác
Hiện nay, trên thế giới chưa có nghiên cứu nào được thực hiện nhằm khảo sát ảnh
hưởng của điều kiện chiết xuất và tối ưu hóa chiết xuất nhóm hợp chất flavonoid từ vỏ
cây núc nác. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về tác dụng sinh học của của núc nác,
nhiều quy trình chiết xuất khác nhau đã được thực hiện để chuẩn bị các mẫu thử.
Các quy trình chiết xuất được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới về núc nác
rất đa dạng về phương pháp, dung môi, điều kiện chiết xuất… Có thể nhận thấy điểm
chung của các quy trình được sử dụng là đều khá đơn giản, chỉ bao gồm hai bước chính
là chiết xuất thu dịch chiết và loại dung mơi thu sản phẩm, khơng có các bước loại tạp
chất. Các phương pháp chiết xuất được sử dụng có thể kể đến như ngâm ở nhiệt độ
phịng [21], [26], [32], [46], [51] ; ngâm nóng [21], [26]; chiết soxhlet [32]; chiết xuất
liên tục [25]; chiết siêu âm [32]. Dung môi sử dụng trong các nghiên cứu cũng rất đa
dạng như nước cất [16]; hỗn hợp ethanol - nước ở các nồng độ khác nhau [13], [24],
[46], [51]; methanol [10], [13], [25]; các dung môi hữu cơ khác như ethyl acetat, aceton,
n-butanol, chloroform… [20] , [22], [58]. Các nghiên cứu đó đã cho thấy rằng với các
phương pháp chiết, dung mơi chiết, điều kiện chiết xuất khác nhau thì sản phẩm chiết
sẽ có đặc điểm và hoạt tính sinh học khác nhau. Tuy nhiên phương pháp chiết chủ yếu
thường dùng là chiết ngâm ở nhiệt độ phòng do cách tiến hành đơn giản và dung môi
được sử dụng chủ yếu là hỗn hợp ethanol - nước ở các nồng độ khác nhau do hiệu suất
chiết cao và tiết kiệm chi phí.
Yếu tố được đánh giá trong các nghiên cứu trên là tác dụng sinh học của dịch chiết
núc nác khi thử nghiệm trên các mơ hình khác nhau, một số nghiên cứu có quan sát về
hiệu suất chiết flavonoid. Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào đánh giá
ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất lên hiệu suất chiết flavonoid từ vỏ cây núc nác.
1.3 Tổng quan về tối ưu hóa
1.3.1 Tối ưu hóa
− Định nghĩa tối ưu hóa
Tối ưu hóa một cơng thức hay quy trình là việc tìm cơng thức, thơng số (hay điều
kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất trong giới hạn
mong muốn của người làm thí nghiệm [4].

− Các khái niệm:
o Biến đầu vào còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: Là những biến mà người làm thí
nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí nghiệm và sự thay đổi này
sẽ kéo theo sự thay đổi giá trị của biến đầu ra [4].

8


o Biến đầu ra còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: Là kết quả của thí nghiệm mà
người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá [4].
− Phương pháp tối ưu hóa
Theo lý thuyết hệ thống, một hệ thống có thể xem như một quá trình chuyển đổi từ
đầu vào (input) thành đầu ra (output).
Việc xem xét hệ thống từ phương diện bằng thực nghiệm được coi như là việc tiếp
cận một hộp đen. Hộp đen là một hệ thống với cấu trúc bên trong chưa biết nhưng biết
được giá trị của đầu vào và đầu ra. Trên thực tế, chất lượng của đầu ra khơng những bị
ảnh hưởng bởi đầu vào mà cịn có nhiều yếu tố khác có thể khơng được biết. Do đó, có
thể sử dụng các yếu tố được biết, điều khiển được và có ảnh hưởng đến q trình tối ưu
hóa. Như vậy, để tối ưu hóa cần phải thể hiện được mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến
đầu vào.
Có 2 cách để mơ tả mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào:
+ Cách 1: Dùng mơ hình (phương trình) tốn học. Đây là cách mơ tả đơn giản và dễ
hiểu nhất. Phương trình thường có dạng đa thức có bậc ≤ 2 và được gọi là phương trình
hồi quy.
+ Cách 2: Dùng mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network – ANN). Sự vận
hành của mạng neuron nhân tạo (ANN) dựa trên sự mô phỏng quá trình thần kinh sinh
học diễn ra trong bộ não con người. Sự vận hành này có thể xác định mối tương quan
giữa những cặp biến đầu vào – biến đầu ra. ANN rất hữu ích đối với những mơ hình hệ
thống mà ở đó mối quan hệ giữa các biến đầu vào và biến đầu ra phức tạp (phương trình
hồi quy dạng đa thức bậc 2 khơng thể mơ tả đầy đủ mối quan hệ này) [4].

1.3.2 Các phương pháp tối ưu hóa
Hiện nay, để giải quyết bài tốn tối ưu hóa, có hai phương pháp được ứng dụng trong
quy hoạch thực nghiệm cho nghiên cứu là phương pháp thay đổi một yếu tố - One factor
at a time (OFAT) và phương pháp thiết kế thí nghiệm - Design of Experiments (DoE)
[35], [48].
1.4.2.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) là thay đổi giá trị
của một thông số trong khi giữ cố định tất cả các yếu tố khác để đánh giá ảnh hưởng của
từng thông số lên đáp ứng của một quá trình. Trong các thí nghiệm thiết kế theo phương
pháp OFAT, yếu tố cần khảo sát cần được cô lập, tất cả các yếu tố cịn lại phải được giữ
cố định và kiểm sốt chặt chẽ để khơng gây ra nhiễu giữa các thí nghiệm [43].
Với những ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi xử lý thống kê phức
tạp, phương pháp OFAT là một phương pháp rất hữu hiệu và thường được ứng dụng
nhiều trong khảo sát các yếu tố đến một quá trình, đặc biệt trong trường hợp số lượng
yếu tố cần khảo sát ít và các yếu tố này hoàn toàn độc lập với nhau [35].
9


Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp OFAT để xác định điều kiện tối ưu cho một
quá trình gặp phải những nhược điểm sau:
- Số lượng thí nghiệm cần phải tiến hành lớn, đặc biệt khi khảo sát sự ảnh hưởng
của nhiều yếu tố đến quá trình. Điều này càng đáng cân nhắc khi các thí nghiệm cần tiến
hành địi hỏi chi phí cao và thời gian kéo dài.
- Khơng đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các yếu tố khi coi các yếu
tố cần khảo sát là độc lập với nhau.
- Khả năng xác định chính xác điều kiện tối ưu bị hạn chế do số lượng quan sát ít và
chỉ có thể lựa chọn điều kiện tối ưu trong một tập hữu hạn các giá trị khảo sát. Do đó,
đối với các yếu tố có thể thay đổi trong một khoảng rộng các giá trị thì việc khảo sát
trên tồn bộ khoảng giá trị đó sẽ rất tốn kém cả về chi phí lẫn thời gian, công sức.
Để khắc phục các nhược điểm trên, nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên

các nguyên tắc về thống kê (Design of Experiments) đã được phát triển. Trong đó,
phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) là một trong những công
cụ được sử dụng phổ biến nhất để xác định điều kiện tối ưu [35].
1.4.2.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng hay còn được biết đến với một số tên gọi khác như
phương pháp mặt đáp, phương pháp mặt mục tiêu được công bố đầu tiên vào năm 1951
bởi nhà thống kê học người Anh - George E.P.Box . Theo đó, phương pháp bề mặt đáp
ứng là một tập hợp các kỹ thuật thống kê và toán học được ứng dụng trong việc phát
triển, cải thiện và tối ưu hóa một quá trình hoặc ứng dụng trong thiết kế, phát triển và
xây dựng công thức bào chế cho một thuốc mới, cũng như cải thiện một cơng thức thuốc
đã có [48].
• Quy trình tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng
Phương pháp bề mặt đáp ứng là một chuỗi các thao tác được tiến hành tuần tự để xác
định điều kiện tối ưu cho quá trình. Các bước chính khi ứng dụng RSM trong tối ưu hóa
quá trình được thể hiện ở sơ đồ hình 1.1 [44].
Mục tiêu của phương pháp là tối ưu hóa một đáp ứng (biến đầu ra) bị ảnh hưởng bởi
một số biến độc lập (các biến đầu vào). Nếu điểm tối ưu hoá (điểm cực đại hoặc cực
tiểu) có tồn tại trong khu vực các mức của các biến đầu vào thì mơ hình bề mặt đáp ứng
trong thí nghiệm RSM có thể xác định được chính xác điểm tối ưu đó. Ưu điểm của
phương pháp bề mặt đáp ứng là phản ánh được sự tương tác lẫn nhau giữa các biến đầu
vào mà phương pháp tối ưu hóa đơn yếu tố không làm được, hiển thị ảnh hưởng thực
của các biến lên đáp ứng đầu ra, với hiệu quả cao và chi phí thấp.

10


Hình 1.2: Sơ đồ các bước tối ưu hóa quá trình chiết xuất sử dụng phương pháp bề mặt
đáp ứng (RSM) [44]

11

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu
Dược liệu được nghiên cứu là vỏ thân cây núc nác được thu hái vào tháng 10/2019
tại tỉnh Hịa Bình.
Vỏ thân được loại bỏ các chất bẩn bề mặt, sấy khô ở nhiệt độ 50oC trong tủ sấy ở
điều kiện vệ sinh sạch sẽ đến độ ẩm dưới 10%, sau đó bảo quản trong túi PE kín ở điều
kiện phịng thí nghiệm.

Hình 2.1: Hình ảnh dược liệu vỏ cây núc nác
2.1.2 Thiết bị, hóa chất, phần mềm nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm
• Tủ sấy Memmert
• Cân phân tích Sartorius TE214S
• Máy đo quang phổ hấp thụ UV- VIS Hitachi 5100
• Máy cơ quay chân khơng BUCHI R-210
• Bếp cách thủy Memmert
• Cồn kế
• Các dụng cụ khác: Ống đong 100 mL, 250 mL, 1000 mL; cốc có mỏ; bình nón
500 mL, 1000 mL; bình định mức 10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL; ống nghiệm;
pipet chính xác các loại; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh;…
2.1.2.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Danh sách các hóa chất
STT Tên hóa chất

Tiêu chuẩn, nguồn gốc

1

2
3
4
5

Việt Nam
E0319322.03 (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương)
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc

Ethanol 96%
Chất chuẩn quercertin
NaOH
AlCl3
NaNO2

12


2.1.2.3. Phần mềm
Phần mềm MODDE Pro 12
2.2 Nội dung nghiên cứu
Để giải quyết các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết flavonoid tổng từ vỏ cây
núc nác
2. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ cây núc nác
3. Xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ cây núc nác
4. Bước đầu đánh giá độ ổn định của quy trình chiết xuất
2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được
từ vỏ cây núc nác
Xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được bằng phương pháp quang phổ
hấp thụ tử ngoại - khả kiến, sử dụng phản ứng tạo màu với dung dịch nhôm triclorua,
định lượng đối chiếu theo quercetin [59]. Lấy chính xác 1 mL dịch chiết (hoặc dịch chiết
được pha lỗng trong ethanol) cho vào bình định mức 10 mL; sau đó thêm khoảng 4 mL
nước cất và 0,3 mL dung dịch natri nitrit 5% (NaNO2 5%) lắc đều, để yên 5 phút. Tiếp
theo cho thêm 0,3 mL dung dịch nhôm triclorua 10% (AlCl3 10%) lắc đều và để yên 6
phút. Sau đó thêm 2 mL dung dịch natrihydroxyd 1M (NaOH 1M) và định mức tới 10,0
mL bằng nước cất. Lắc đều và tiến hành đo quang ở bước sóng 510 nm. Mẫu trắng được
chuẩn bị bằng cách thay 1 mL dịch chiết bằng nước cất. Tổng lượng flavonoid tồn phần
chiết được tính theo quercetin từ nồng độ thu được thông qua đường chuẩn [51]. Phương
pháp được thẩm định về độ phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại theo
AOAC.
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng
Thẩm định phương pháp định lượng xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết
được từ vỏ cây núc nác theo hướng dẫn của AOAC [6].
2.3.2.1. Độ phù hợp hệ thống
Độ phù hợp hệ thống là phép thử để đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống như máy
móc, thiết bị.
• Cách tiến hành: tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn có nồng độ 0,3 mg/mL, ghi lại độ hấp
thụ quang
• Yêu cầu: độ hấp thụ của các mẫu đo biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD
(%) phải ≤ 2,0 % nếu khơng có quy định khác [6].

13


2.3.2.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của đại lượng đo được và
nồng độ các chất phân tích.
• Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6
mg/mL. tiến hành định lượng theo quy trình ở mục 2.3.1. Xây dựng phương trình hồi
quy tuyến tính độ hấp thụ và nồng độ các chất phân tích và xác định hệ số tương quan
R.
• Yêu cầu: 0,99 < R2 < 1 [6].
2.3.2.3. Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình
của kết quả thực nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
• Cách tiến hành: Tạo các mẫu thử thêm chuẩn với nồng độ chuẩn quercetin tương
ứng khoảng 50%, 100% và 120% nồng độ flavonoid có trong mẫu thử. Mỗi mức nồng
độ tiến hành 3 mẫu độc lập, tiến hành định lượng. Tính độ thu hồi của chất chuẩn.
• Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 97,0-103,0% (hàm lượng chất phân tích trên 1%) ở mỗi
mức nồng độ [6].
2.3.2.4. Độ chính xác - Độ lặp lại:
Độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được
biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%).
Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt của một mẫu cao dược liệu, tính kết quả dựa
vào mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại dựa vào giá trị RSD
(%) giữa các lần định lượng.
• Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử được biểu diễn bằng RSD (%) không
quá 2,7% [6]
Độ chính xác trung gian: Tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng thực hiện trong một
ngày khác và người phân tích khác nhau, thực hiện trong cùng điều kiện phịng thí
nghiệm và thiết bị. Xác định độ chính xác trung gian dựa vào giá trị RSD (%) giữa các
lần định lượng trong các ngày, giữa các ngày khác nhau.
• Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử được biểu diễn bằng RSD (%) không
quá 4,0% [6].

2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất phù hợp
2.3.3.1. Lựa chọn dung môi chiết
Flavonoid chủ yếu ở trong vỏ cây núc nác thuộc nhóm flavon (oroxylin A, baicalein,
chrysin,…). Các dung môi chiết xuất hữu cơ như methanol, ethanol và aceton thường
được sử dụng để chiết xuất flavon.
14


Ngồi ra ethanol cịn rẻ tiền, dễ kiếm và khơng độc nên có thể sử dụng trong quy
mơ cơng nghiệp và phù hợp với phạm vi nghiên cứu nên chúng tôi đã lựa chọn hỗn hợp
ethanol – nước ở các nồng độ khác nhau để thực hiện trong nghiên cứu này.
2.3.3.2. Lựa chọn phương pháp chiết
Có khá nhiều phương pháp để chiết xuất flavonoid từ trước đến nay, từ các phương
pháp cổ điển như chiết ngâm, ngấm kiệt, chiết hồi lưu, soxhlet cho đến gần đây là các
phương pháp hiện đại ứng dụng cơng nghệ siêu âm, vi sóng, … Tùy thuộc vào mục đích
nghiên cứu, đặc điểm của dược liệu và điều kiện trang thiết bị sẵn có mà sẽ lựa chọn các
phương pháp chiết phù hợp. Nhóm nghiên cứu đã làm một thí nghiệm để so sánh về
hiệu suất chiết flavonoid thu được giữa các phương pháp: chiết ngâm ở nhiệt độ phịng,
chiết ngâm nóng, chiết siêu âm và chiết hồi lưu.
Quy trình được thiết kế như sau: Cân chính xác khoảng 5,0 g vỏ cây núc nác sấy khơ
đã được làm nhỏ đến kích thước thích hợp, thêm 75 mL dung môi ethanol 70% và chiết
theo điều kiện của từng phương pháp trong thời gian 1 giờ. Lọc thu dịch chiết, để nguội
ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 100 mL và định mức tới vạch bằng dung
mơi chiết xuất. Lấy chính xác 1 mL dịch chiết để xác định Tổng lượng flavonoid toàn
phần chiết được theo phương pháp ở mục 2.3.1 từ đó tính được hiệu suất chiết flavonoid
của từng phương pháp.
2.3.4 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid
từ vỏ thân núc nác
2.3.2.1. Các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
➢ Các yếu tố khảo sát

Sơ đồ phân tích Ishikawa đã được thực hiện để tìm ra các thơng số ảnh hưởng đến
q trình chiết flavonoid từ vỏ cây núc nác, như trong hình 2.2. Có thể thấy rằng năm
ngun nhân chính, bao gồm mơi trường, dược liệu, dung mơi, thiết bị, quy trình và các
nguyên nhân liên quan đã được xem xét.

Hình 2.2: Sơ đồ Ishikawa cho quy trình chiết flavonoid
15


Đối với yếu tố kích thước dược liệu: dược liệu càng được chia nhỏ thì càng làm tăng
diện tích tiếp xúc pha, tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ, làm giảm thời gian chiết xuất. Tuy
nhiên dược liệu quá mịn trong q trình chiết tạo ra nhiều tạp, khó lọc và tinh chế dịch
chiết, dễ làm thất thoát dược liệu. Do vậy trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tơi cố
định kích thước dược liệu là khoảng 2 – 4 mm.
Các yếu tố còn lại được lược chọn để tiến hành khảo sát:
− Nồng độ ethanol: 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 96%
− Tỷ lệ dung môi – dược liệu: 5/1 mL/g; 10/1 mL/g; 15/1 mL/g; 20/1 mL/g
− Thời gian chiết: 5 phút; 10 phút; 20 phút; 30 phút; 60 phút; 120 phút
− Số lần chiết: 1 lần; 2 lần; 3 lần
➢ Thơng số đánh giá
• Hiệu suất chiết flavonoid tổng
Khối lượng flavốnốid chiết được
Y=
×100%
Khối lượng flavốnốid trống dược liếu
Trong đó: Khối lượng flavonoid trong dược liệu được xác định bằng cách: cân chính
xác khoảng 5 g dược liệu đem chiết hồi lưu nhiều lần bằng ethanol 70% đến khi dịch
chiết không tạo tủa vàng với dung dịch NaOH 10%. Lọc và gộp các dịch chiết. Lấy
chính xác 1 mL dịch chiết để xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được theo
phương pháp ở mục 2.3.1 từ đó tính được khối lượng flavonoid trong dược liệu.

2.3.2.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
a) Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time- OFAT) [11]
Các yếu tố: nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi – dược liệu, thời gian chiết xuất và số
lần chiết sẽ lần lượt được khảo sát bằng cách tiến hành các thí nghiệm có thay đổi các
mức khảo sát của một yếu tố trong khi điều kiện của tất cả các yếu tố còn lại được giữ
nguyên. Từ kết quả khảo sát, các điều kiện tốt nhất được lựa chọn và cố định để thực
hiện các bước khảo sát tiếp theo. Riêng yếu tố số lần chiết sẽ khảo sát sau khi có kết quả
tối ưu hóa.
b) Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
➢ Xác định hàm mục tiêu, biến và phạm vi nghiên cứu
− Biến đầu vào:
Ba biến đầu vào được lựa chọn là thời gian chiết xuất (X1), nồng độ ethanol (X2) và
tỷ lệ dung môi – dược liệu (X3). Các khoảng khảo sát của biến đầu vào để xây dựng mơ
hình sẽ được lựa chọn theo kết quả khảo sát từng biến bằng phương pháp OFAT
− Biến đầu ra:
Hiệu suất chiết flavonoid toàn phần trong dịch chiết vỏ vây núc nác (Y)

16


− Mục tiêu:
Hàm mục tiêu được đặt ra là lựa chọn các các biến đầu vào X1, X2, X3 sao cho biến
đầu ra Y đạt giá trị lớn nhất.
➢ Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm MODDE Pro 12 để thiết thế các thí nghiệm theo mơ hình CCO
(Thiết kế hỗn hợp tâm trực giao - Orthogonal Central Composite Design) thu được 15
thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được tiến hành 1 lần, thí nghiệm tại tâm được tiến hành 3
lần. Các thí nghiệm được tiến hành lần lượt nhằm xác định hiệu suất chiết flavonoid
toàn phần trong dịch chiết vỏ vây núc nác.
➢ Thiết lập phương trình hồi quy

Từ kết quả thực nghiệm, thiết lập phương trình hồi quy đặc trưng cho sự phụ thuộc
của hàm đáp ứng Y vào các biến X1, X2, X3. Phương trình có dạng:
𝑌 = 𝐴0 + 𝐴1 𝑋1 + 𝐴2 𝑋2 + 𝐴3 𝑋3 + 𝐴12 𝑋1 𝑋2 + 𝐴13 𝑋1 𝑋3 + 𝐴23 𝑋2 𝑋3 + 𝐴11 𝑋12 + 𝐴22 𝑋22
+ 𝐴33 𝑋32
Trong đó 𝐴1 , 𝐴2 , 𝐴3 là các hệ số bậc 1; 𝐴11 , 𝐴22 , 𝐴33 là hệ số bậc 2; 𝐴12 , 𝐴13 , 𝐴23 là
hệ số tương tác của từng cặp yếu tố.
➢ Xác địch điều kiện tối ưu và thẩm định mơ hình
Cài đặt các u cầu riêng cho từng biến (tối thiểu, tối đa, trong khoảng giới hạn) sau
đó phân tích các phương án tương ứng với các điều kiện chiết xuất thỏa mãn yêu cầu
vừa cài đặt và mức kì vọng của phương án. Từ đó, lựa chọn phương án tối ưu là phương
án thỏa mãn đồng thời 2 điều kiện: hiệu suất chiết flavonoid cao nhất và mức kì vọng
cao. Sau khi đã chọn được phương án tối ưu, lặp lại điều kiện kiện tối ưu 3 lần nhằm
kiểm tra sự tương thích giữa lý thuyết với thực nghiệm

17