Đoàn thị hải hạnh nghiên cứu xác định đồng thời gelsemin và koumin trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ luận văn thạc sĩ dƣợc học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ HẢI HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
GELSEMIN VÀ KOUMIN TRONG MÁU
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2023


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ HẢI HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
GELSEMIN VÀ KOUMIN TRONG MÁU
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.Phạm Quốc Chinh
PGS.TS.Phạm Thị Thanh Hà

HÀ NỘI 2023


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Quốc Chinh và PGS.TS
Phạm Thị Thanh Hà. Ngƣời thầy, cô đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và đồng hành cùng
tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Pháp y Quốc gia đã ủng
hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hồn thành luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Phịng Quản lý Đào tạo, Khoa Hóa phân tích và
Kiểm nghiệm Thuốc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi
trong q trình học tập tại Trƣờng.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất đến các anh chị em tại Khoa Độc
chất – Viện Pháp y Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi trong công
việc cũng nhƣ q trình thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã ln động viên tơi trong
q trình học tập và thực hiện luận văn.


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. Sơ lƣợc về cây lá ngón ............................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ........................................................... 3

1.1.2. Các hợp chất alcaloid ......................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng và độc tính .......................................................................... 5
1.2. Tổng quan về gelsemin .............................................................................. 7
1.2.1. Công thức và danh pháp gelsemin ...................................................... 7
1.2.2. Tính chất lý hóa của gelsemin............................................................. 7
1.2.3. Dược động học .................................................................................... 8
1.3. Tổng quan về koumin................................................................................. 8
1.3.1. Công thức và danh pháp koumin ........................................................ 8
1.3.2. Tính chất lý hóa của koumin ............................................................... 9
1.3.3. Dược động học .................................................................................... 9
1.4. Các phƣơng pháp chiết gelsemin và koumin trong máu ............................ 9
1.4.1. Phương pháp tủa protein .................................................................. 10
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ......................................................... 10
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn............................................................... 11
1.5. Một số phƣơng pháp thƣờng dùng để phân tích alcaloid cây lá ngón. .... 13
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ..................................................... 13
1.5.2. Sắc ký lỏng khối phổ ......................................................................... 14
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 18
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 18
2.2. Điều kiện nghiên cứu ............................................................................... 18


2.2.1. Chất chuẩn ........................................................................................ 18
2.2.2. Dung mơi, hóa chất ........................................................................... 19
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 21
2.3.1. Khảo sát tối ưu điều kiện phổ khối ................................................... 21
2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng .......................................................... 21
2.3.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ............................................................ 22
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 24

2.3.5. Áp dụng quy trình phân tích các mẫu thực tế ................................... 28
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 29
3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời gelsemin và koumin trong
máu bằng LC-MS/MS ................................................................................. 29
3.1.1. Khảo sát phổ khối.............................................................................. 29
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 30
3.1.3. Khảo sát phương pháp chiết mẫu ..................................................... 35
3.1.4. Tổng hợp quy trình chiết xuất, phân tích gelsemin và koumin bằng
LC-MS/MS ................................................................................................... 37
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích .......................................................... 39
3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS ............................................... 39
3.2.2. Độ đặc hiệu, chọn lọc........................................................................ 40
3.2.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .......................................... 41
3.2.4. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ...................................................... 42
3.2.5. Độ đúng và độ chính xác................................................................... 44
3.2.6. Hiệu suất chiết................................................................................... 45
3.2.7. Ảnh hưởng của nền mẫu.................................................................... 46
3.2.8. Độ ổn định ......................................................................................... 47
3.2.9. Độ nhiễm chéo................................................................................... 48


3.3. Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích gelsemin và koumin
trong máu một số trƣờng hợp nghi ngộ độc alcaloid cây lá ngón. ............. 49
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 53
4.1. Về đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 53
4.1.1. Đối tượng phân tích .......................................................................... 53
4.1.2. Các chất phân tích ............................................................................ 53
4.2. Về quy trình xử lý mẫu ............................................................................ 54
4.3. Về phƣơng pháp phân tích và thẩm định ................................................. 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 58
Kết luận ........................................................................................................... 58
Kiến nghị ......................................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 1
Phục lục 1. Kết quả khảo sát phổ khối của các chất phân tích ..................... 2
Phụ lục 2. Kết quả khảo sát các gradient pha động ...................................... 8
Phụ lục 3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ..................................................... 14
Phụ lục 4. Kết quả khảo sát các dung môi chiết mẫu ................................. 18
Phụ lục 5. Kết quả khảo sát độ chọn lọc, đặc hiệu...................................... 22
Phụ lục 6. Quy trình phân tích Gelsemin và Koumin trong máu................ 25
bằng LC/MS/MS ......................................................................................... 25
Phụ lục 7. Sắc ký đồ đƣờng chuẩn .............................................................. 26
Phụ lục 8. Sắc ký đồ một số mẫu thực tế .................................................... 44


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt

Giải thích

ACN

Acetonitril

EI

Va chạm điện tử (Electron impact)

(Et)2O

Diethyl ete

EtOAc

Ethyl acetat

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liqid Chromatography)

HQC

Mẫu kiểm tra hàm lƣợng cao (High Quality Control)

IS

Chuẩn nội (Internal Standard)

LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography -Mass spectrometry)

LD50

Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal Dose)

LLE

Chiết lỏng lỏng (Liquid–liquid extraction)

LLOQ

Giới hạn định lƣợng dƣới (Lower limit of quantitation)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of quantification)

LQC

Mẫu kiểm tra hàm lƣợng thấp (Low Quality Control)

MeOH

Methanol

MQC

Mẫu kiểm tra hàm lƣợng trung bình (Medium quality control)

MS

Khối phổ (Mass Spectrometry)

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)


SPE

Chiết pha rắn (solid phase extraction)

TIC

Sắc ký toàn bộ ion (Total Ion Chromatogram)

ULOQ

Giới hạn định lƣợng trên (Upper limit of quantitation)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Điều kiện khối phổ phân tích gelsemin, koumin và papaverin .......... 30
Bảng 3.2. Khảo sát hệ pha động.......................................................................... 31
Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient 10 .................................................................... 33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát dung môi chiết ........................................................ 35
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống ............................................... 39
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ......................................... 41
Bảng 3.7. Khoảng tuyến tính, đƣờng chuẩn của gelsemin, koumin trong máu .. 43
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của phƣơng pháp ............ 44
Bảng 3.9. Hiệu suất chiết gelsemin, koumin trong máu ..................................... 45
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng nền mẫu .............................................. 46
Bảng 3.11. Độ ổn định của các chất sau 4 giờ, 7 ngày, 21 ngày ........................ 47

và 3 chu kì rã – đơng. .......................................................................................... 47
Bảng 3.12. Kết quả phân tích mẫu máu thực ...................................................... 50


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây lá ngón............................................................................................ 3
Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm alcaloid có trong cây lá ngón ................................. 5
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của gelsemin [13]. ................................................... 7
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của koumin[13] ....................................................... 8
Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS tại Viện Pháp y Quốc gia................................... 20
Hình 3.1. Phổ khối scan lần 1 và phổ ion con của gelsemin, koumin và
papaverin ............................................................................................................. 29
Hình 3.2. Sắc ký đồ của chất phân tích theo 6 hệ pha động ............................... 32
Hình 3.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn gelsemin(a), koumin (b) ............................ 34
và chuẩn nội papaverin (c) ở tốc độ dịng 0,4mL/phút ....................................... 34
Hình 3.4.Kết quả khảo sát quy trình chiết........................................................... 36
Hình 3.5. Sắc đồ mẫu máu thêm chuẩn và chuẩn nội ......................................... 38
phân tích bằng LC-MS/MS ................................................................................. 38
Hình 3.6. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn ............................. 40
của các chất phân tích.......................................................................................... 41
Hình 3.7. Sắc đồ xác định LOD thông qua xác định S/N trên mẫu máu ............ 42
Hình 3.8. Đƣờng chuẩn phân tích gelsemin và koumin trong máu .................... 43
Hình 3.9. Sắc ký đồ đánh giá độ nhiễm chéo ...................................................... 49
Hình 3.10. Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của gelsemin và koumin trong mẫu
MT9 ..................................................................................................................... 51
Hình 3.11. Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của gelsemin và koumin trong mẫu
MT8 ..................................................................................................................... 51


ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth) thuộc họ Hồng đằng Gelsemiaceae cịn gọi là cây rút ruột, đoạn trƣờng thảo, câu vẫn, co ngón, hồ
mạn trƣờng, đại trà đằng… là loại cây mọc hoang, phân bố chủ yếu ở Trung
Quốc và các vùng núi phía Bắc Việt Nam nhƣ Hịa Bình, Lào Cai, Lạng Sơn,
Tun Quang, Sơn La… Ngồi ra, cây này cịn có ở Ấn Độ, Indonesia, Lào,
Malaysia, bắc Mianma, bắc Thái Lan… Cây lá ngón có độc tính rất mạnh,
độc tính của cây ngón là do alcaloid có trong tồn cây. Các nghiên cứu đã
đƣợc cơng bố xác định có đến hơn 100 alcaloid đã đƣợc phân lập từ cây lá
ngón

nhƣ

gelsenicin,

gelsamydin,

koumin,

gelsemin,

19α-

hydroxygelsamydin…[1]. Trong số các alcaloid đƣợc phân lập từ cây lá ngón,
gelsemin và koumin là hai alcaloid chính và có hàm lƣợng cao nhất [2], [3],
[4].
Các nhà khoa học của Trung Quốc đã nghiên cứu tác dụng của cây lá
ngón trong điều trị giảm đau, chống viêm, chống ung thƣ..... Tuy nhiên, do
cây lá ngón có độc tính cao, khoảng liều điều trị rất hẹp, nên thƣờng xẩy ra
các trƣờng hợp ngộ độc trong điều trị lâm sàng [3]. Theo thống kê tại Hồng
Kông về các ca ngộ độc cây độc từ năm 2003 đến năm 2017, ngộ độc cây lá

ngón là một trong ba loại ngộ độc thƣờng gặp nhất và cây lá ngón là một
trong bốn loài thực vật gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất dẫn đến tử vong [5].
Trong những năm gần đây, các trƣờng hợp ngộ độc alcaloid cây lá
ngón do sử dụng nhầm lẫn, đầu độc hoặc tự tử xảy ra rất nhiều, chủ yếu ở các
tỉnh miền núi, các địa bàn vùng sâu, vùng xa, những nơi có địa bàn dân trí
thấp. Theo thống kê của Trung tâm Y tế huyện Điện Biên Đông, tỉnh Điện
Biên, trong tám tháng đầu năm 2015, huyện Điện Biên Đơng, tỉnh Điện Biên
có 68 trƣờng hợp tự tử bằng lá ngón, trong đó, 14 ngƣời tử vong; trong tám

1


tháng đầu năm 2016, có 73 trƣờng hợp tự tử bằng lá ngón, trong đó có 29
ngƣời tử vong. Theo một nghiên cứu khác ở huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn, từ
năm 2011 đến năm 2015, có 52 ngƣời ngộ độc lá ngón, nguyên nhân chủ yếu
là tự tử và một số ít hái nhầm làm thức ăn [6], [7].
Việc nghiên cứu phân tích alcaloid cây lá ngón, đặc biệt là gelsemin và
koumin đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm chú ý. Đã có các nghiên cứu
xác định gelsemin và koumin đƣợc triển khai [8], [9], [10], [11].
Độc tính của gelsemin và koumin rất mạnh, chỉ với hàm lƣợng rất nhỏ
có thể gây ra ngộ độc. Việc xác định gelsemin và koumin trong mẫu máu sẽ
cung cấp bằng chứng thuyết phục để kết luận nguyên nhân ngộ độc do sử
dụng cây lá ngón.
Tại Việt Nam cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới, cho tới nay số lƣợng
các nghiên cứu phân tích, định lƣợng gelsemin, koumin nói riêng và các
alcaloid cây lá ngón nói chung trong dịch sinh học cịn tƣơng đối ít và chƣa có
hệ thống. Do vậy, để góp phần trong việc chẩn đốn và xác định ngun nhân
tử vong do sử dụng cây lá ngón, đề tài “Nghiên cứu xác định đồng thời
gelsemin và koumin trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ” đƣợc thực hiện
với các mục tiêu sau:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời gelsemin và koumin trong
máu bằng sắc ký lỏng khối phổ.
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích xác định gelsemin và
koumin trong máu một số trường hợp nghi ngờ ngộ độc alcaloid cây lá ngón.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về cây lá ngón
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Gelsemium là một chi thực vật trong họ Gelsemiaceae. Chi này bao
gồm ba loài: Gelsemium elegans ở châu Á; Gelsemium sempervirens và
Gelsemium rankinii ở Bắc Mỹ [12]. Cả ba loài đều nổi tiếng về độc tính. Tại
Việt Nam, Gelsemium elegans thƣờng đƣợc gọi là cây lá ngón, ngồi ra cịn
có một số tên gọi khác là co ngón, thuốc rút ruột, hồ mạn trƣờng, đại trà đắng,
hồ mạn đằng, cầu vẫn, đoạn trƣờng thảo, ngón vàng, khau ngn [2].

Hình 1.1. Cây lá ngón
Cây lá ngón là loại cây thân leo, thân và cành khơng có lơng, gỗ có
màu vàng, trên thân hơi có khía dọc. Lá mọc đối hình trứng, thn dài hay hơi
hình mác, mép nguyên nhẵn dài 7-12 cm, rộng 2,5 đến 5,5 cm. Hoa mọc ở

3


đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa màu vàng có thể có hoa trắng, đài 5 lá rời. Tràng
gồm 5 cánh hoa nhẵn, dính thành ống hình phễu, nhị 5 đính ở phía dƣới ống
tràng. Đầu nhuỵ 4 thuỳ hình sợi. Quả hình bầu dục hoặc hình elip dài 10–15
mm bao gồm hai quả có khớp có thể tách rời chứa nhiều hạt có cánh phẳng.

Mùa ra hoa và đậu quả là từ tháng 5 đến tháng 12 [12].
Cây lá ngón phân bố chủ yếu ở Nam và Đơng Nam châu Á nhƣ: Ấn
Độ, Thái Lan, Indonesia, Lào, Srilanca, Malaysia, Trung Quốc và Việt Nam.
Ở Việt Nam cây mọc hoang khá phổ biến ở các vùng núi cao nhƣ: Hà Giang,
Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hồ Bình, Quảng Ninh,
Quảng Nam, các tỉnh Tây Ngun...[2].
1.1.2. Các hợp chất alcaloid
Những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên
cứu về cây lá ngón. Nhiều alcaloid có nhân indol đã đƣợc phân lập và xác
định cấu trúc, chủ yếu là các alcaloid thuộc phân nhóm oxindol và indolenin
[13], [14].
Hiện tại, tổng số 121 alcaloid đã đƣợc phân lập và xác định và có nhân
indole hoặc oxindole. Dựa trên cấu trúc hóa học của chúng, các alcaloid đa
dạng và phức tạp đã đƣợc phân thành 6 loại sau: loại gelsedin, loại gelsemin,
loại humantenin, loại koumin, loại sarpagin và loại yohimban. Ngoài ra, thành
phần cây lá ngón cịn chứa nhiều loại iridoid glycoside, iridoid, steroid và các
hợp chất không phải là alcaloid khác [15].
Các khung cấu trúc alcaloid có trong cây lá ngón gồm [15]:
- Nhóm 1: Các alcaloid loại sarpagin gồm 14 hợp chất.
- Nhóm 2: Các alcaloid loại koumin gồm 10 hợp chất.
- Nhóm 3: Các alcaloid loại humantenin gồm 28 hợp chất.
- Nhóm 4: Các alcaloid loại gelsemin gồm 15 hợp chất.
- Nhóm 5: Các alcaloid loại gelsedin gồm 47 hợp chất
- Nhóm 6: Các alcaloid loại yohimban gồm 3 hợp chất
4


Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm alcaloid có trong cây lá ngón
Trong số các alcaloid có mặt trong cây lá ngón, gelsemin và koumin là
hai alcaloid có hàm lƣợng cao nhất. Vì thế, hai alcaloid này đƣợc lựa chọn

nhằm xác định ngộ độc cây lá ngón [3] .
1.1.3. Tác dụng và độc tính
1.1.3.1. Tác dụng dược lý
Cây lá ngón là một loại cây có độc tính cao, phân bố rộng rãi ở Đông
Nam Á và đƣợc các nhà nghiên cứu Trung Quốc sử dụng làm thuốc cổ truyền
để điều trị đau thấp khớp, đau thần kinh, co cứng, loét da và ung thƣ [15].
- Tác dụng chống khối u: Các alcaloid cây lá ngón có tác dụng chống
khối u thơng qua việc ngăn chặn tăng sinh tế bào và thúc đẩy q trình tiêu
hủy. Trong số đó, koumin có tác dụng chống khối u mạnh nhất. Các alcaloid
cây lá ngón đƣợc nghiên cứu trong điều trị ung thƣ
Các nghiên cứu cho thấy các alcaloid cây lá ngón có tác dụng ức chế sự
phát triển của ung thƣ gan, ung thƣ ruột kết, ung thƣ dạ dày, ung thƣ trực
tràng, ung thƣ biểu mô tuyến phổi và tế bào ung thƣ biểu bì. Những phát hiện
trên định hƣớng cho các nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ sau này.
5


- Tác dụng chống viêm và giảm đau: Các alcaloid cây lá ngón có vai trị
nhất định trong điều trị chống viêm và giảm đau, chủ yếu là giảm đau do bệnh
thần kinh, viêm khớp dạng thấp, loét da và khối u.
- Tác dụng giảm lo âu: Koumin liều thấp có tác dụng đáng kể trong
việc chống lo âu và không ảnh hƣởng đến các chức năng sinh lý và thần kinh
tự chủ khác.
- Tác dụng kích thích miễn dịch và ức chế miễn dịch: Koumin không
chỉ ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho T CD4+ mà còn cả hoạt động miễn
dịch của tế bào lympho T. Cây lá ngón cũng đƣợc sử dụng để điều trị các loại
bệnh ngoài da bao gồm bệnh lupus ban đỏ, bệnh vẩy nến và viêm da thần
kinh.
- Điều hòa nhịp tim: Các alcaloid cây lá ngón làm chậm nhịp tim do
liên quan đến tác dụng ức chế hoặc ngăn chặn đối với các thụ thể .

- Bảo vệ chức năng tạo máu: Các alcaloid cây lá ngón thúc đẩy sản xuất
tế bào hồng cầu và có tác dụng bảo vệ chức năng tạo máu [17] [16] .
1.1.3.2. Độc tính
Cây lá ngón có độc tính rất cao, chất độc chính là các alcaloid có trong
tồn cây [2], [17]. Độc nhất là rễ và lá non, rồi đến lá thƣờng và hoa, thân và
quả; thân già độc hơn thân non. Tác dụng chính là trên các đầu mút dây thần
kinh vận động dẫn tới liệt các cơ vân. Tác dụng gây co giật cịn chƣa đƣợc
thống nhất, trong y văn hiện có hai cách giải thích: tác dụng trên tuỷ sống
giống nhƣ strychnin hoặc tác dụng trung ƣơng đối kháng với tác dụng của
gamma aminobutyric acid (GABA) [15], [18], [20]. Nƣớc sắc các bộ phận của
cây lá ngón đƣợc xác định LD50 trên chuột nhắt trắng với kết quả nhƣ sau:
LD50 của rễ là 0,079 g/kg, lá 0,225 g/kg, hoa 0,458 g/kg, thân già 1,309 g/kg,
thân non 1,830g/kg và quả 1,275 g/kg [2]. Liều gây chết đối với ngƣời trƣởng
thành là 2-3 g rễ cây hoặc 7 lá non [19].

6


Triệu chứng ngộ độc cây lá ngón là khát nƣớc, sốt, đau rát họng, đau
bụng, nôn mửa, giãn đồng tử, sụp mi (do liệt cơ), song thị, giảm hoặc mất thị
lực, khơ miệng, khó nói, khó nuốt, nhịp tim chậm, khó thở, suy hơ hấp do liệt
cơ hơ hấp, chóng mặt, co giật (khi ngộ độc nặng), khít hàm, cứng các cơ, yếu
cơ, liệt cơ, răng cắn chặt, sùi bọt mép, thân nhiệt hạ, huyết áp hạ, cuối cùng là
tử vong do ngừng hô hấp [13], [15], [18], [20], [21].
1.2. Tổng quan về gelsemin
1.2.1. Công thức và danh pháp gelsemin
Gelsemin đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1870 và cấu trúc của nó
đƣợc xác định vào năm 1959.
Gelsemin là một trong những alcaloid chính nhân indol của cây lá
ngón. Cơng thức phân tử của gelsemin là C20H22N2O2 và có khối lƣợng phân

tử 322,4 g/mol [22]. Tên khoa học là 2'-ethenyl-4'-methylspiro[1H-indole3,7'-9-oxa-4-azatetracyclo[6.3.1.02,6.0 5,11]dodecane]-2-one [13].
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của gelsemin [13].
1.2.2. Tính chất lý hóa của gelsemin
Gelsemin dạng tinh thể màu vàng nhạt, ít tan trong nƣớc, tan trong ethanol, chloroform, benzen, aceton, diethyl ether… , điểm chảy 1780C [13].

7


1.2.3. Dược động học
Từ những năm 1970, gelsemin đƣợc nghiên cứu làm thuốc điều hòa
miễn dịch, giảm đau trong ung thƣ hoặc do chấn thƣơng [23]. Gelsemin có độ
độc cao nên các nghiên cứu về dƣợc động học và chuyển hóa của gelsemin là
rất hạn chế. Đến nay, con đƣờng chuyển hóa của gelsemin vẫn chƣa hồn tồn
đƣợc biết đến [23].
Giá trị LD50 của gelsemin đƣợc xác định trên chuột nhắt là 56 mg/kg
thể trọng [19].
Khi nghiên cứu dƣợc động học của cây lá ngón Gelsemium elegans
trên dê với liều 2 g/kg thể trọng, một số thông số dƣợc động học của gelsemin
đƣợc xác định nhƣ sau: giá trị T1/2 là 13,97± 3,74 giờ, Tmax 3,25 ± 3,05 giờ,
Cmax 156,73 ± 127,36 µg/L [24].
1.3. Tổng quan về koumin
1.3.1. Cơng thức và danh pháp koumin
Koumin lần đầu tiên đƣợc phân lập từ Gelsemium elegans vào năm
1931, và cấu trúc của nó đƣợc xác định vào năm 1981.
Koumin có cơng thức phân tử là C20H22N2O và có khối lƣơng phân tử
306,4 g/mol. Tên khoa học của Koumin là (1S,10S,12S,15S,16R,17S)-15ethenyl-13-methyl-19-oxa-3,13diazahexacyclo[14.3.1.02,10.04,9.010,15.012,17]icosa-2,4,6,8-tetraene [13].
Công thức cấu tạo:

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của koumin[13]

8


1.3.2. Tính chất lý hóa của koumin
Koumin dạng bột kết tinh màu trắng, ít tan trong nƣớc, tan trong
ethanol, methanol, ethyl acetat, chloroform, diethyl ether…, điểm chảy 168
0

C [13].

1.3.3. Dược động học
Koumin đã đƣợc nghiên cứu làm thuốc giảm đau chống viêm. Koumin
có tác dụng điều trị giảm đau hiệu quả đối với các các cơn đau sau phẫu thuật
do tổn thƣơng thần kinh và các phản ứng viêm khó điều trị [17], [25]. Bên
cạnh đó, Koumin cịn đƣợc nghiên cứu với tác dụng ức chế tế bào ung thƣ
biểu mơ [12].
So với gelsemin, độc tính của koumin thấp hơn, giá trị LD50 trên chuột
nhắt là 100 mg/kg thể trọng. Liều gây chết của koumin trên ngƣời trƣởng
thành là 0,15-0,3 g [19].
Khi nghiên cứu dƣợc động học của cây lá ngón Gelsemium elegans
trên dê với liều 2 g/kg thể trọng, một số thông số dƣợc động học của koumin
đƣợc xác định nhƣ sau: giá trị T1/2 là 10,98 ± 3,33giờ, Tmax 0,88 ± 0,35 giờ,
Cmax 36,69 ± 34,93 µg/l [24].
1.4. Các phƣơng pháp chiết gelsemin và koumin trong máu
Trong quá trình phân tích, chuẩn bị mẫu là bƣớc quan trọng và mất khá
nhiều thời gian. Việc chuẩn bị mẫu chiếm tới 60 % thời gian thực hiện của cả
quá trình phân tích. Do vậy, việc lựa chọn kĩ thuật chuẩn bị mẫu đóng vai trị
vơ cùng quan trọng. Để có thể lựa chọn đƣợc một quy trình chiết mẫu tối ƣu,

việc hiểu cơ chế phân tách là vô cùng cần thiết.
Mẫu máu thƣờng có nhiều các tạp chất nên nền mẫu khá phức tạp. Để
loại bỏ bớt sự ảnh hƣởng của nền mẫu, tăng độ nhạy, tăng hiệu phân tích và
kéo dài tuổi thọ của thiết bị cần phải thực hiện các phƣơng pháp xử lý, chiết
xuất mẫu trƣớc khi tiến hành phân tích gelsemin và koumin trên hệ thống sắc

9


ký. Các phƣơng pháp, kĩ thuật thƣờng đƣợc đƣợc sử dụng để chuẩn bị mẫu
trƣớc khi phân tích là tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn.
1.4.1. Phương pháp tủa protein
Phƣơng pháp tủa protein đƣợc sử dụng rộng rãi để chuẩn bị các mẫu
dịch sinh học trong phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng. Phƣơng pháp loại
protein thƣờng đƣợc sử dụng là dùng các hóa chất gây kết tủa protien kết hợp
siêu âm và ly tâm. Các mẫu dịch sinh học thƣờng đƣợc thêm 3-5 lần thể tích
dung mơi hữu cơ nhƣ acetonitril, methanol hoặc các dung dịch acid lỗng nhƣ
acid perchloric hoặc trichloroacetic. Ngồi ra, các tác nhân gây tủa protein có
thể sử dụng nữa đó là các muối nhƣ amoni sulfat hay kim loại.
Kết tủa xảy ra do sự thay đổi pH hoặc tính kỵ nƣớc làm thay đổi tƣơng
tác giữa protein và môi trƣờng nƣớc hoặc thông qua liên kết của muối hoặc
kim loại với các nhóm chức năng của protein.
Ƣu điểm của phƣơng pháp tủa protein là rẻ, đơn giản, dễ thực hiện, tỉ lệ
mất mẫu thấp và có thể áp dụng cho nhiều chất phân tích. Tuy nhiên, q
trình thổi khơ, làm giàu mẫu khá mất thời gian.
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Chiết lỏng-lỏng là phƣơng pháp chiết dựa trên sự phân bố khác nhau
của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau thƣờng một pha là nƣớc và
pha cịn lại là dung mơi hữu cơ khơng tan hoặc rất ít hịa tan trong nƣớc. Q
trình chiết là q trình chuyển chất tan từ pha nƣớc vào pha hữu cơ đƣợc thực

hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tƣơng tác hóa học giữa tác nhân
chiết và chất cần chiết.
Để có đƣợc kết quả chiết tốt, q trình chiết phải có các điều kiện chiết
cần thiết. Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ:
+ Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không đƣợc trộn lẫn, trong đó
dung mơi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo khơng làm nhiễm bẩn chất phân
tích.
10


+ Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt.
+ Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ
ràng để giải chiết đƣợc tốt.
+ Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm pH của dung dịch,
nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…
Phƣơng pháp LLE có thể áp dụng cho các chất chất lỏng và rắn với
những ƣu điểm nhƣ các thiết bị đơn giản, hiện có rất nhiều dung mơi tinh
khiết với độ hịa tan và chọn lọc tốt, hòa tan mẫu thuận lợi và phù hợp với
thiết bị sắc ký [26] [27] [28].
Gelsemin và koumin là các chất tan tốt trong dung môi hữu nên việc
chiết trực tiếp gelsemin, koumin bằng LLE đƣợc nhiều tác giả sử dụng.
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha
không tan vào nhau.
Cơ chế của sự chiết pha rắn có thể có các bản chất theo các kiểu nhƣ
sau:
-

Theo cơ chế tƣơng tác hấp phụ pha rắn.

- Theo cơ chế trao đổi ion (cation và anion).
- Theo kiểu trao đổi tạo cặp ion.
- Theo kiểu hợp chất liên hợp phân tử.
- Kiểu chiết rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn.
Chiết pha rắn (SPE) là một quy trình chiết mẫu với nguyên tắc tƣơng tự
nhƣ sắc ký cột. Hiện nay, có rất nhiều loại cột chiết với các chất hấp phụ khác
nhau đƣợc sản xuất theo công nghệ hiện đại, nên SPE có thể áp dụng để phân
tích rất nhiều chất trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Pha rắn hay chất hấp phụ trong SPE đƣợc chia thành 4 loại chính: cột
chiết khơng phân cực, cột chiết phân cực, cột chiết trao đổi ion (cation và
anion), và cột chiết hỗn hợp (mixed mode).
11


- Cột SPE không phân cực: Pha rắn chứa các chất không phân cực nhƣ
C18, C8, C6, C4, C2, phenyl, cyclohexyl và cyanopropyl. Sự tƣơng tác giữa
chất phân tích và bề mặt chất hấp phụ đƣợc thực hiện thông qua lực Van der
Waals. Các loại chất hấp phụ này đƣợc sử dụng để chiết các phân tử có chứa
các nhóm chức không phân cực từ nền mẫu chủ yếu là các chất phân cực [26]
[29] [30].
- Cột SPE phân cực: Pha rắn có bề mặt hấp phụ là các nhóm chức phân
cực nhƣ diol, aminopropyl, cyanopropyl, silica không liên kết, alumina và
Florisil (US Silica). Các chất phân tích chứa các nhóm chức phân cực có thể
tƣơng tác và đƣợc giữ lại ở bề mặt chất hấp phụ thông qua tƣơng tác liên kết
lƣỡng cực hoặc liên kết hydro [26] [29] [30].
- Cột chiết trao đổi ion: Môi trƣờng trao đổi ion có cả dạng anion và
cation để chiết các chất phân tích có nhóm chức bazo( cation) hoặc acid
(anion). Bề mặt chất hấp phụ trao đổi cation chứa các nhóm mang điện tích
âm và ngƣợc lại, bề mặt chất hấp phụ trao đổi anion chứa các nhóm mang
điện tích dƣơng. Cả hai loại bề mặt đều tƣơng tác với chất phân tích thơng

qua tƣơng tác tĩnh điện (ion) [26] [29] [30].
- Cột chiết hỗn hợp: Chất hấp phụ ở cột chiết hỗn hợp có hai hay nhiều
cơ chế lƣu giữ nhƣng cơ chế lƣu giữ phổ biến nhất đó là có các nhóm trao đổi
ion và kị nƣớc gắn trên bề mặt. Các nhóm kị nƣớc có thể thay đổi từ các
nguyên tố C2 đến các nhóm C18. Các nhóm trao đổi ion có thể là trao đổi
cation, trao đổi anion hoặc kết hợp cả hai [26] [29] [30].
Hiện nay chiết pha rắn đang đƣợc sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân
tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi
kim do những ƣu điểm sau:
+ Hiệu suất thu hồi cao
+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch
+ Thích hợp cho mẫu lƣợng nhỏ và phân tích lƣợng vết các chất
12


+ Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt
+ Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn
Nhiều nghiên cứu phân tích gelsemin và koumin trong phủ tạng và dịch
sinh học có sử dụng phƣơng pháp SPE để chiết xuất và làm giàu gelsemin và
koumin. Cột SPE thƣờng đƣợc sử dụng là cột C8, C18, cột chiết hỗn hợp.
1.5. Một số phƣơng pháp thƣờng dùng để phân tích alcaloid cây lá ngón.
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí (GC) là phƣơng pháp đƣợc dùng để tách các chất ở thể khí
bay hơi, với pha động là chất khí. Mẫu phân tích đƣợc đƣa vào đầu cột và q
trình rửa giải đƣợc thực hiện nhờ dịng khí trơ qua cột sắc ký. Do các chất
phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng đƣợc tách ra khỏi nhau. Sắc ký
khí áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền ở nhiệt độ cao [26],
[31], [33], [34].
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lƣợng và
điện tích của ion (m/z) để cung cấp thơng tin định tính xác định cấu trúc và

định lƣợng các chất. Đây là một detector có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Do
đó, nó rất phù hợp để ứng dụng trong phân tích hàm lƣợng vết [26], [31],
[33], [34].
Sự kết hợp giữa GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký khí khối phổ
GC-MS. Sắc ký khí kết nối khối phổ ngồi việc cung cấp thơng tin sắc ký đồ,
cịn có thể cung cấp các thông tin về phổ khối lƣợng của từng chất. GC-MS là
cơng cụ phân tích phổ biến khi phân tích các chất độc nhiều thành phần.
Năm 2008, Huang Wei-xion và cộng sự [10] đã xây dựng phƣơng pháp
sắc ký khí khối phổ để xác định gelsemin trong dƣợc liệu. Các mẫu đƣợc
ngâm bằng cồn kiềm, sau đó đƣợc chiết với chloroform. Giới hạn phát hiện là
0,12 mg/kg. Độ thu hồi từ 84,12 % đến 92,16 % . Phƣơng pháp đƣợc sử dụng
để phân tích định tính và định lƣợng các mẫu ngộ độc thực phẩm.

13


Năm 2012, Đặng Đức Khanh và cs [8] đã tiến hành nghiên cứu chiết
koumin và gelsemin từ lá của cây lá ngón và mẫu phủ tạng. Tác giả sử dụng
LLE để chiết alcaloid từ lá ngón và SPE để chiết từ phủ tạng và đã áp dụng
phân tích 2 mẫu thực tế.
Năm 2016, Luo Da-long [1] phân tích gelsemin và koumin trong cây lá
ngón bằng phƣơng pháp chiết pha rắn kết hợp sắc ký khí-khối phổ. Mẫu
đƣợc ngâm bằng acid clohydric 1% và chiết bằng SPE. Phƣơng pháp đã áp
dụng cho 2 trƣờng hợp nghi ngộ độc alcaloid cây lá ngón với 10 mẫu bệnh
phẩm.
Năm 2015, Mai Peiming [ 35] và cộng sự đã sử dụng vi chiết lỏng-lỏng
phân tán kết hợp sắc ký khí khối phổ để phân tích 3 thuốc diệt chuột (tetramin, bromadiolon, brodifacoum) và 5 alcaloid độc ( hyoscyamin, scopolamin,
gelsemin, strychnin, brucin) trong nƣớc, nƣớc tiểu và rƣợu. Giới hạn phát
hiện từ 0,003 đến 1 μg/L trong các mẫu.
1.5.2. Sắc ký lỏng khối phổ

Sự kết hợp giữa hệ thống sắc ký lỏng (LC) và hệ thống khối phổ (MS)
để phân tích một hợp chất đơn lẻ hoặc một mẫu phức hợp chứa nhiều thành
phần đƣợc gọi là hệ thống sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS). Ký hiệu LC/MS chỉ
ra sự kết hợp của hai kỹ thuật khác nhau. Đầu tiên là sự phân tách bằng hệ
thống sắc ký lỏng,và sau đó là xác định dựa trên khối lƣợng, hay chính xác
hơn là tỷ lệ khối lƣợng trên điện tích (m/z) của các chất [36].
 Sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành
phần riêng biệt dựa trên sự tƣơng tác giữa chất phân tích với pha động (chất
lỏng) và pha tĩnh trong cột (chất rắn). Pha động mang theo chất phân tích di
chuyển qua pha tĩnh đứng yên. Chất rắn nhồi cột thƣờng là silicagel hoặc polymer [36].

14


 Khối phổ
Khối phổ dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của
chúng, khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dị có
dịng điện ion hóa. Khi đó, chất hóa học bị các luồng bắn phá và bị vỡ thành
các mảnh lớn hoặc nhỏ. Những mảnh vụn này thực tế là các vật mang điện
hay còn gọi là ion (z). Việc đo tỷ số khối lƣợng và điện tích các ion (m/z) để
cung cấp thơng tin định tính, xác định cấu trúc và định lƣợng các chất.
Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật trên, các nhà khoa học có thể đánh giá,
phân tích định tính và định lƣợng với một số chất. Ngày nay, ngƣời ta ứng
dụng kĩ thuật LC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành nhƣ y
học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm, pháp y, v.v… [36]
 Đầu dò khối phổ ba tứ cực
Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực là thiết bị đƣợc sử dụng rộng rãi nhất.
Thiết bị này hoạt động theo nguyên tắc: cô lập tiền chất, phân mảnh ion và
phân tích mảnh ion. Thiết bị này cung cấp kết quả với độ nhạy cao nhất, có

khả năng tái tạo cao và mang lại độ chọn lọc cao.
 Một số kĩ thuật MS [36]
- Kĩ thuật phân tích tồn thang (FULL SCAN)
Với một hỗn hợp nhiều chất sau khi đƣợc tách ra qua cột sắc ký lỏng và
đƣa vào detector khối phổ, detector sẽ ghi nhận tổng cƣờng độ các ion sinh ra
từ mỗi chất. Ta có một sắc ký đồ toàn bộ ion (TIC) và phổ khối đƣợc lấy toàn
bộ các ion (FULL SCAN). FULL SCAN cho đầy đủ thơng tin về chất phân
tích hơn, tuy nhiên độ nhạy khơng cao, nhiễu đƣờng nền có thể lớn.
- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Mornitoring)
Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc ký đồ
theo thời gian. Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đƣờng nền và do
đó tăng độ nhạy, tức tăng tỉ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đƣờng nền (N).

15