nghiên cứu ảnh hưởng của một sô chất phytohormone lên qua trình vi nhân giông một số dòng lúa bất dục đực (phục vụ cho công tác lúa lai)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG
CỦA MỘT SÔ CHẤT PHYTOHORMONE LÊN
QUA TRÌNH VI NHÂN GIÔNG MỘT số
DÒNG LÚA BẤT DỤC Đực
(PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC LÚA LAI)
MÃ SỐ : QT. 99-11
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI : Đỗ VĂN CÁT
Cán bỏ tham gia:
TS. Đỗ Năng Vịnh
TS. Hoàng Tuyết Minh
HÀ NỘI, THẢNG 10-2000
PTỊ m í
MIC 1,1 (
Mo (láII
ỊMián I
INlii'1 II II
iMnán III
IMnán IV
lMnán V
pỉnán VI
‘I ran
I
: I 011 quan lài IiC'11
I Tinh hình Iighiõn cứu nuôi CÁV mô-tô hào trên thô
£>iới và Irong nước.
II. Các nhân tô anh hướng lèn qua 1 rình phát sinh 4
hình thái mô-le hào Ihưc vãi invitio.
1. Môi trường
2. Điều kiện miõi cáy

a. Anh s;ínu
b. Nhiệt độ
: V ật liệu và pli 11«»11 <4 pháp nghiên CỨII
I VẠI liệu
II 1’hưưng pháp
1. Xử lý mầu
2. Môi trưởng, nuôi cây
3. Điổu kiện nuôi cấy
: Kết qua và l)àn luận 10
I. Khả nàng tạo 111Ô SCO
I Khá năng tạo mô sẹo từ phôi
2. Tạo mô sẹo lừ các lớp mỏng thế bào
3. Tạo mô sẹo lừ hao phấn Fl của tổ hợp lai
o l\ĩiai 64s X C) l 225.
II. Tái sinh chồi :
I I I. Nhân chồi
1. Ánh hưởng của kinetin lên hệ sô nhân chổi
2. ánh hưởng cùa NAA lên hệ số nhân chổi
IV. Tạo cAy hoàn chinh.
V. Tái tạo cây lúii lừ hao phấn Fl của lổ hợp lai
Ọ IVmì 64s X ()’ 1225.
: Két luận 17
: Tài liệu tham kliỉio
: IMìịi lục
H cliir viêl tát sử (lụiif» Irong llíio cáo Iiỉíy
MS: Murashi^e Skoog, l')62
LS: Linsmaiet and Skooịỉ, 1965
NAA: a - Naphthalcne íKdie ỉicid
2,4- D: 2.1- Pidiloiophenoxy acclic acid
IAA: Inclole '-Acelie Ai i(l

BAP: Ren/.yl Amino 1’urinc
IRRI: International Rice keseaeli Instiluie
I-MTH: I /íp mỏng 10' bào
T(ÌM S: T herm osen sitive ( ỉciiic Malc Slorilỉty
\v/v: Tiọng lượiiỊi/lhổ lú li
AON: Axii deroxyribonik leic
( ( 'Ang sir
MỞ ĐẦU
Lúa lai đã trở thành vấn đề thời sự trong nông nghiệp không chỉ ở
nước ta mà ở khắp các nước trổng lúa trên thê giới. Nhờ đưa lúa lai vào
sản xuất mà sản lượng lúa của Trung quốc tăng lên gấp bội, Trung quốc
đã giảm được 50% đất trổng lúa để trổng các cãy nông nghiệp khác. Lúa
lai cũng nhanh chóng được nhập nội vào nước ta vì năng xuất của lúa lai
vượt trội hơn so với lúa thường từ 20 -30% ; Do vậy việc nghiên cứu và tạo
ra các dòng lúa lai là vấn đề cấp thiết. Nhà nước ta đã chi hàng nhiều tý
đồng để nghiên cứu, tạo ra các dòng lúa lai của việt nam; Kết quá về vấn
để này chưa nhiều.
Vấn đề đặt ra là tại sao công nghệ lúa lai lại tiến bộ chậm trễ như
vậy ? Lý do vì tạo ra các dòng mẹ bất dục đực và các con lai F1 có nhiều
khó khăn, năng suất của chúng quá thấp. Tuy vậy trong những năm qua
các nhà khoa học Việt nam cũng đã thu được một số kết quả trong ITnh
vực này; Đã chọn tạo được một số dòng TGMS bất dục đực do gen nhãn
nhạy cảm với nhiệt độ gây ra; phục vụ cho công nghệ lúa lai hai dòng. Đã
chuyển các gen TGMS vào các giống lúa thường có nhiều đặc điểm tốt;
Kết hợp với nuôi cấy bao phấn đê tạo ra các dòng TGMS mới có nhiều ưu
việt hem. Nếu chọn tạo theo phương pháp thông thường phái trải qua nhiều
thế hệ chưa chắc đã nhận được các dòng theo ý muốn, hơn nữa dòng vừa
nhận được không hoàn toàn thuán chủng.
Khí hậu ở miền bắc nước ta chỉ cho phép sản xuất hạt chứa gen
TGMS vào hai thời vụ ( vụ xuân sớm và vụ thu đông ). Thời tiết lại luôn

thay đổi nên sản xuất hạt dòng mẹ gặp không ít khó khăn.
Đê rút ngắn thời gian chọn tạo dòng TGMS, chúng tôi sử dụng
phương pháp nuôi cấy mô như nuôi cấy phôi, phôi non; nuôi cấy lớp mỏng
tế bào và nuôi cấy bao phấn của con lai F1 để nhăn nhanh và tạo ra các
dong TGMS mới làm dòng mẹ phục vụ cho các tổ hợp lúa lai hai dòng.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài “ Nghiên cứu ảnh hương
của một sô phytohormone lên quá trình vỉ nhân giống một sỏ dòng
lúa bát dục đực ( phục vụ cho còng tác lúa lai)
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của các
phytohormone lên các giai đoạn nuôi cây; từ đó có thê rút ra được quy
trình nhân nhanh các dòng bất dục đực TGMS.
Bằng phương pháp này người ta đã bảo quản được nhiều loài củy
quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng do những biến đối của điều kiện sinh
thái.
Năm 1964 Guha và Mahesvvari đã tạo thành công cây đơn bội từ
nuôi cấy bao phấn cà độc dược; đã mở ra một hướng nghiên cứu mới. Kỳ
thuật nuôi cấy bao phấn đã được nhiều nước sử dụng, đặc biệt là Trung
quốc, Pháp ứng dụng trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa. Người ta đã
nhận được các dòng đom bội hay các dòng đồng hợp tử trong một thời gian
ngắn. Đến nay đã có hàng trăm giống cãy trổng trong đó có cây lúa đựoc
tạo ra và đã được đưa vào sản xuất.
Kỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa đặc biệt trong việc cứu phôi; Đối
với những con lai khác loài do tính bất hoà hợp vể tổ chức nên thường bất
thụ, và phôi sẽ bị chết non; Băng phương pháp nuôi cấy phôi người ta đã
nhận được những cây từ các hợp tử lai này.
Phương pháp này rất có ý nghĩa khi tiến hành lai xa khác loài giữa
các loài cây trồng với các loai hoang dại, những con lai thường có sức
sống cao, chống chịu với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Ngoài
ra bằng công nghệ nuôi cấy mô các nhà khoa học có thể phá ngủ của một
số cây khó nẩy mầm.

Từ năm 1965 - Nickell đã thành công trong việc nuôi cấy các tế bào
đơn trong dịch huyền phù của cây đậu trong thời gian dài. Năm 1960
Bergman dùng phương pháp lọc dịch huyền phù, được những tế bào đơn
độc lập, những tế bào này tiếp tục phân chia, tạo ra mô sẹo. úng dụng kỹ
thuật này Váil và haberlandt (1965) đã nhận được cây thuốc lá hoàn chỉnh
từ các tế bào đơn nuôi cấy.
Vào đầu những năm 70 các nhà khoa học Nhật bản Nagata và
Tanaka đã tách và nuôi cấy thành công tế bào trần (protoplast) của cây
thuốc lá. Từ đó mở ra một lĩnh vực cực kỳ quan trọng trong công nghệ
sinh học là lai xa giữa các tế bào soma. Bằng phương pháp dung hợp tế
bào trần của các loài rất xa nhau. Nhờ phương pháp dung hợp tế bào trần
người ta có thê chuyển các gen, đoạn gen mong nuốn từ tế bào này sang tê
bào khác. Tê bào trần đã trở thành một công cụ không thể thay thế để
nghiên cứu vai trò của ADN trong các cơ quan tử và quan hệ giữa chúng
với ADN trong nhân.
Trong những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào
trần gắn chặt với các nghiên cứu về công nghệ di truyền thực vật. Đê
chuyển các gen từ tế bào này sang tế bào khác, người ta thường dùng các
plasmid của vi khuẩn làm vật chuyển vận; Người ta lắp ghép các gen định
chuyển vào plasmid của vi khuẩn và nuôi các ci khuẩn này với mô của cây
cần nhận gen. Bằng phương pháp này các nhà khoa học đã thành công
trong việc chuyển các gen mong muốn vào nhiều cây quan trọng như
bông, thuốc lá, dưa chuột
3
lượng không đầy đủ (Bhojwani và Razdan 1983). Vì vậy người ta thường
phải bổ sung vào môi trường một sô vitamin như Thiamin, piridoxin,
nicotinic axit, pantotenic axit (vitamin bs); Tuỳ theo giai đoạn, và đôi
tượng nuôi cấy.
Vitamin c đôi khi được bổ sung vào môi trường với hàm lượng cao
( 1-lOOmg/l) không có nghĩa là cãy đòi hỏi nhu cầu lớn như vậy, mà nó

có vai trò như một anti-oxitdant có tác dụng bảo vệ các axit amin vitamin
và các thành phán khác trong môi trường cần thiết cho cây khỏi bị huỷ
hoại do tác dụng của điểu kiện nuôi cấy (Pierik. 1987).
Các axit amin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy như một
nguồn nitơ hữu cơ, thường bổ sung vào môi trường khi tỷ lệ NO? /NH4+
mất cân bằng. Nguồn nitơ hữu cơ được dùng phổ biến nhất là L-glutamin,
mặc dù asparagin cũng có thê được sử dụng (Pierik 1987). Các chất điều
hoà sinh trưởng là thành phần quan trọng nhâ't trong môi trường nuôi cấy
mô- tế bào, được dùng phổ biến là các nhóm chất auxin và xitokinin. Nhờ
có các chất này, các nhà khoa học có thê chủ động điều khiển các quá
trình phát sinh, phát triển trong mô nuôi cấy invitro.
Người ta thấy răng auxin thường có tác dụng kéo dài tế bào làm
tăng khả năng phân chia tế bào ( tạo mô sẹo) và tạo các rễ phụ, auxin còn
có tác dụng kích thích sự phát sinh phôi vô tính trong dịch huyền phù tế
bào nuôi cấy (Pierik 1987). Tuy nhiên trong một số trường hợp các tê bào
trong mô nuôi cây tự nó có thể sản sinh ra auxin đủ để kích thích sự sinh
trưởng của tế bào trong mô mà không cần auxin ngoại sinh. Theo
Kohlenback (1977) một sô mẫu sau khi nuôi trong trong auxin rồi cấy
chuyển sang môi trường không có auxin, thấy chúng vẫn có khả năng tạo
rễ như ở lúa mỳ, cà độc dược (Street^ỌTỌ).
Nhưng trong đại đa số trường hợp quá trình tạo rễ của mẫu nuôi
cấy đòi hỏi phải có sự kích hoạt của các auxin có sẵn trong môi trường
như ở mô cẩm chướng ( Bhojwani và Razdan 1983), lúa mỳ ( Street 1979).
Môi trường có hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự tạo rễ bất định trong
mô nuôi cấy, trái lại với nồng độ auxin cao, các mô nuôi cấy sẽ không có
khả năng tạo rễ, mà chủ yếu tạo ra các mô sẹo ( Street 1979). Nếu trong
môi trường không có auxin hoặc với hàm lượng thấp sẽ kích thích mô phát
sinh phôi hoặc cơ quan ( Ammirato 1983). Trong một số trường hợp auxin
lại là kích thích tạo chồi như ở cây anh thảo ( Heide 1972), hoa loa kèn,
cây lan dạ hương (Pierik( 1979).

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu thường sử dụng môi trường có các
tổ hợp các chất auxin/ xitokinin cao sẽ kích thích mô phát triển rễ, trái lại
tý lệ này thấp sẽ gây phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức trung gian mô sẽ
phát triển thành mô sẹo. Hiện tượng này thường gặp trong nuôi cấy mô
thuốc lá (Street,, 1979), đậu hà lan (Harvinder,l990)(8).
Người ta thấy xitokinin tham gia điều hoà sinh trưởng ở tất cả các
pha phát triển của cây từ khi hạt bắt đầu nảy mám đến khi cây hoá già
(Heiđe,! 972). Nó kích thích sứ tạo chồi nách bằng việc làm giảm tính trội
5
chồi cao nhất. Đặc biệt trong môi trường nuôi cấy rễ củ sâm ks sự có mặt
của nước dừa đã làm cho tác dụng của các hoimone sinh trưởng tăng lên
rõ rệt. Tác dụng của nước dừa có lẽ là do ảnh hưởng của hỗn hợp các chất
tham gia điều hoà sinh trướng lên mõ nuôi cấy.
2. Điều kiện nuôi cấy ;'
a. Ảnh sáng
Ánh sáng có tác dụng mạnh mẽ lên sự phát sinh hình thái trong quá trình
phát triển của mô nuôi cấy invitro. Sự phát sinh hình thái của các mô nuôi
cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tô như: chu kỳ, cường độ và thành phần
quang phổ của ánh sáng.
Một chu kỳ xác định (16 giờ sáng/ 8giờ tối) tương phán với sự
nuôi cấy liên tục trong ánh sáng hoặc trong tối hoàn toàn là cần thiết cho
sự tái sinh chổi ở các mẫu mô phong lữ (Ammirato 1986). Chu kỳ chiếu
sáng cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tạo hoa và tạo củ trong
nuôi cây invitro. Sự có mặt của ánh sáng hay khồng cũng ánh hưởng mạnh
mẽ lên sự phát sinh và phát triển của phôi sôma. Nuôi cấy hoàn toàn trong
tối đả làm giám thấp tần sô biến dị của phôi cây cà rốt. 0 cà rốt và cây
cần nước nuôi trong tối sẽ làm phôi bị vàng úa, trái lại trong ánh sáng,
phôi sôma của chúng sẽ tái sinh cây hoàn chỉnh( Ammirato 1986).
Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự phát sinh hình thái cũng
được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu; người ta thấy rằng ánh sáng đỏ

có tác dụng kích thích sự tạo chồi phụ ở mô cây hướng dương, cây tùng
núi cao, rau cải(Pierik 1987). Ánh sáng xanh da trời có ảnh hưởng tốt lên
sự sinh trưởng của mô sẹo cây Pelargonium; ánh sáng tím kích thích sự
tạo chồi phụ ở mô sẹo thuốc lá; trái lại ánh sáng đỏ gây tạo rễ phụ. Ánh
sáng đỏ cũng kích thích sự tạo rễ phụ ở mô cây đỗ quyên. Ánh sáng trắng
(đa sắc) thường ức chế tạo rễ phụ và kích thích tạo chồi phụ, ánh sáng đỏ
và hồng ngoại có vai trò quan trọng trong sự tạo chồi và rễ phụ( Pierik
1987).
Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ lên sự phát triển của
mô nuôi cấy; cường độ chiếu sáng cao thì sẽ kích thích sự tạo mô sẹo,
cương độ ánh sáng thấp sẽ kích thích sự tạo chồi (Ammirato 1986).
b. Nhiệt độ
Tuỳ thuộc vào xuất sứ của loài cây mà người ta điều chỉnh nhiệt
độ phòng nuôi sao cho thích hợp; Các cây vùng ôn đới thường cần nhiệt
độ thấp hơn các cây xuất sứ từ vùng nhiêt đới. Trong nuôi cấy mô tế bào
thì việc sử lý nhiệt độ vào các mẫu trước khi nuôi cấy cũng rất quan trọng.
Nếu sơ bộ sử lý bao phấn trước khi nuôi cấy ở nhiệt độ lạnh hoặc là nóng
cũng tăng tần số hạt phấn tạo mô sẹo hoặc phát triển thành cây( Ammirato
1986). Nhiệt độ lạnh cũng được sử dụng trong quá trình đặc biệt như tạo
chổi, hoa, phá ngủ và nảy mầm của hạt( Pierik 1987) hoặc cho nhu cầu
lạnh của phôi sôma được tạo ra trong môi trường invitro( Ammirato 1986).
7
Phần II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
L VÂT LI HU í
Trong các thí nghiệm chúng tôi sử dụng các dòng lúa có chứa các
gen nhân TGMS ( gây bất dục đực do do gen gây ra) là VN.01 ; 8S ; 9S ;
40s và dòng Zs.97A chứa gen CMS (Bất dục đực do gen ngoài tế bào chất
gây ra) để nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone lên quá trình
nhân giống của các dòng này.

Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng bao phấn con lai F1 của tổ hợp lúa
lai o Peiai 64S X 0*1225 để thu nhận các dòng TGMS thuần chủng mới.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu (í
1. Xử lý mẫu vật í '
Các mẫu vật được đưa vào nuôi cấy đều được rửa sạch bằng nước
cất, khử trùng sơ bộ bằng cồn 75% trong vòng một phút, tiếp theo khử
trùng bằng H20 2 iO% trong 15-20 phút hay bằng HgC12 0,1% trong vòng
3-5 phút. Sau đó mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và đưa vào
môi trường nuôi cấy thích hợp.
2. Môi trường nuôi cấy ó
Môi trường gốc dùng cho các thí nghiệm là môi trường thạch rắn
(0,8% thạch) được chuẩn bị theo công thức của Murashige-Skoog (1962)
viét tắt là MS và môi trường LS (Linsmaier-Skôg 1965).
Trong đó thành phần nồng độ các chất phytohormone thuộc nhóm
auxin và xitokinin và các chất phụ gia được thay đôỉ tuỳ vào mục đích của
từng bước thí nghiệm.
3. Điều kiện nuôi cấy é
Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy luôn được duy trì khoảng từ 22-
25°c, chiếu sáng 10 giờ/ngày đêm bằng hệ thống giàn đèn neon. Riêng
việc nuôi cấy tạo mô sẹo được nuôi trong buồng tối.
9
Phần III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. KHẢ NĂNG TẠO MỎ SẸO c
1. Tạo mỏ sẹo từ phôi chín và phói non^
Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên khả năng tạo mô sẹo ở
phôi chínỊHạt gạo) và phôi non (hạt đang còn sữa) của các dòng VN.01 ;
40s có chứa gen TGMS gây bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ. Các hạt
gạo và phôi non đã vô trùng của hai dòng lúa trên được cấy lên môi trường
MS có liểu lượng 2,4D thay đổi từ : 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0mg/l. Mẫu vật được

nuôi trong phòng tối cho các tế bào phân biệt tạo mô sẹo.
Sau 3 tuần theo dõi, kết quả thu được trình bày ở bảng 1. Qua bảng
này ta thấy 2,4D có ánh hướng rõ rệt lê khá năng tạo mô sẹo của cả 2
dòng lúa nuôi cấy. Khi liều lượng 2,4D tăng lên từ 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0mg/l
tương ứng : 83,33% và 87,67%. Riêng đối với phôi non chúng tôi chi thử
nghiệm được đối với dòng VN.01 và thấy rằng tỷ lệ tạo mô sẹo rất cao :
91.33%.
2. Tạo mò sẹo từ các lớp mỏng tế b‘ảOff
Sau khi xác định ở nồng độ 2mg/l 2,4D cho hiệu quá tạo mô sẹo
cao nhất, chúng tôi sử dụng kết quả này vào các thí nghiệm tiếp theo.
Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy lớp mỏng tế bào của các dòng lúa TGMS :
VN.01 ; 8S; 9svà dòng Zs.67A chứa gen CMS (bất dục đực do tế bào chất
gây nên). Các cây mạ vô trùng của các dòng này có tuổi từ 3-51á thật được
cắt thành những lát mỏng (0,5-0,7mm) cấy lên môi trường MS có bổ sung
2mg/l 2,4D. Các mẫu vât được nuôi trong phòng tối đế cho chúng tạo mô
sẹo.
Trong thí nghiêm này chúng tôi muốn tìm hiểu ảnh hưởng của 2,4D
lên khả năng tạo mô sẹo ở các tuổi mạ khác nhau, thấy rằng ở tất cả các
dòng đã nghiên cứu thì ở tuổi mạ 3 lá thật cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất
tương ứng 37,5 ; 34,6 ; 28,2 ; 30%. Ở tuổi mạ 5 lá thật là thấp nhất (31,1 ;
30,0 ; 26,3 ; 30,3%). Điều đó nói lên rằng các cơ thê càng trẻ càng nhạy
cảm với các yếu tố môi trường. (Xem kết quả ở bảng 2).
3. Tạo mò sẹo từ bao phán F1 của tổ hợp lai o Peiai 64s X ( ý 1225/5»
Chúng tôi còn tiến hành nuôi cấy bao phấn của con lai F! của tổ hợp
lúa lai Ọ Peiai 60s X o 1225 nhằm mục đích thu nhận các dòng đổng hợp
tử chứa gen TGMS mới. Các bao phấn cũng được nuôi trên môi trường MS
có bố sung 2mg/l 2,4D ; sau 3 tuần nuôi trong tối, có 36,6% bao phấn tạo
mô sẹo.
Mô sẹo của tất cả các thí nghiệm trên đểu có đặc điểm là chííng
gồm 2 loại mô: Mô sẹo cứng và mô sẹo xốp (Embryogenic callus và Non-

Embryogenic callus). Mô sẹo cứng có màu trắng, sữa, khô, khi cấv
chuyển lên môi trường tái sinh, nó dính chặt trên mặt thạch. Còn mô xốp
10
Chúng tôi nghiên cứu anh hường của các tỷ lệ Xitokinin/auxin lên
khá năng tái sinh chổi. Các khối mô sẹo có kích thước bằng nhau được
cấy lên các môi trường MS2, MS3, MS4 (xem phụ lục) có bổ sung nồng
độ xitokinin/auxin tương ứng với các tỷ lệ sau : 2/1 ; 2,5/1 ; 12/1. Sau đó
các mẫu được nuôi trong phòng nuôi.
Sau 3 tuần nuôi cấy, kết quá thu được trình bày ở báng 3:
Hảng 3 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khá năng tái sinh cây từ
mô sẹo.
_____
__________________
_________________ _________________ ________
_
_____
_
Tên
dòng
VN-01
8S
9S Zs.97A
Môi
trường
Sô mô
sẹo
đem
cấy
Tỷ lệ
tái

sinh
(%)
Sô mô
sẹo
đem
cấy
Tỷ lệ
tái
sinh
(%)
Sô mô
sẹo
đem
cấy
Tỷ lệ
tái
sinh
(%)
Số mô
sẹo
đem
cấy
Tỷ lệ
tái sinh
(%)
MS2
35 94,2
30 93,3
28
89,2

29 75,8
MS3 38
100
28 100 28 96,4
30
83,3
MS4
32 96,8 31 93,5 26 88,4
27
74,0
Qua bảng này ta thấy trong môi trường MS.3 (Tỷ lệ xitokinin/auxin
2,5/1) là môi trường tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất ở tất cả các dòng
nghiên cứu. Trên môi trường này các dòng VN.01 ; 8S tỷ ỉệ tái sinh chồi
đạt 100% còn dòng 9S đạt 96,4% ; dòng Zs.??chỉ đạt 83,3%, nhưng cũng
đểu cao hơn trong môi trường MS.2 và MS.4 (75,8%, 74%).
Các dòng VN.01, 8S tỷ lệ tái sinh ở tất cả các môi trường chúng đều
xấp xỉ bằng nhau, đều cao hơn tỷ lê tái sinh chổi của 2 dòng kia 9S và
Zs.97A trong các môi trường tương ứng.
Theo tiến sĩ Hoàng Tuyết Minh cho biết 2 dòng VN.01 và 9S bản
thân chúng có khả năng đẻ nhánh cao. Điều đó lý giải về khả năng tái sinh
chồi cao trong nuôi cấy chúng.
Trong môi trường MS.2 ; MS.3 ; MS.4 có bổ sung nồng độ
xitokinin/auxin khác nhau là 2/1 ; 2,25/1 ; 12/1, các tỷ lệ này có ảnh
hưởng rõ rệt lên khả năng tái sinh chổi của các dòng.
Môi trường MS.3 (2,25 xitokinin/lauxin) cho tỷ lệ tái sinh chổi tốt
nhất đối với tất cả các dòng lúa nghiên cứu. Còn môi trường MS.2 ; MS.4
cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp hơn nhiều. Có lẽ trong các môi trường này
nồng độ xitokinin quá cao ở môi trường MS.4 và quá thấp ở môi trường
MS.2 không thích hợp cho việc tái sinh chồi. Vì vậy việc tìm ra tỷ lệ
xitokinin trên auxin thích hợp cho việc tái sinh, nhân chồi là hết sức cần

thiết.
r:íc Hỏng <1Ọ ii N A A In I ; 1,5 ; 2m g/ỉ để nhộn được các mỏi trường
MSX, MS() ; MSIO. Snu (16 cúc mỗti dược nuôi trong cííc phòng miỏi.
S;m 3 tuÁn theo (lõi, kớỉ (Ịiin lim được trình bày ở bảng 5.
Iỉ;mg 5 Ảnli Imởng cún (/ NAA Irong mỏi I rường lên họ sổ nhAn chồi.
1 ru
VN 01
8
s
9
s
7.S.97A
dòng
Mòi
Sỏ
1 lệ số
SÁ
1 ỉẹ số Số 1 lệ số SỐ
1 lệ số
111 1YV| 1V
chổi
nliíìiì
cliổi
tihAn chồi nliAn
chồi nhan
đưa chồi đưa
chổi
đira chổi dưa
chổi
vào

vào vào
vào
MS.S
}\
4,4 Mì
. A ? __
34
4,2
25
3,8
MS.9
31
4,8 _
30 4,5
35 4,6
25 4,3
MS.K) 31
4,2
30
4,1
37
3,9
25
3,0
<a)u;i hãng 11,hy ta thÃy trên mối trườngMS.R (có lmg/1 (X-NAA) hộ
sò itliAii rliổi của e.íc dòng VN-OI, 8S, 9S và (lòng Zs.97A tirơiig ứng chỉ
<l;tt '1.1 : 4.2 : 4,1 ; 3,8 IÀH. Trong khi đó ở môi trường MvS.9 có nồng độ (X-
NAA l,ì 1,5mg/l thì hệ số nhAn cliổi của tAt cả các (lòng tương ứng (1ỔII
VH'<Í| (lòi so với 2 niAi tnrờng kin là 4,8 ; 4,5 ; 4,6 ; 4,3 lẩn.
I lìílp Iihíìt là mỏi Inrờnp MS. 10 khi uổng độ a-NAA tăng lên

’iiiị;/I. hệ sA Iiliíln ( hổi củn Cílr (lòng tương líng chỉ đạt : 4,2 ; 4,1 ; 3,() ;
'y(i liin Như víly nổnp (tộ (1 NA/\ 1,5mg/l là thích hợp lum CíV
i\ I A< ) ( ÂY l!( >ẢN CIIỈNII :
S;m khi nliAit được một sA khối lượng lárn cílc cụm chổi củn c:íc
« I"I|U noliiíMi cứu. ( 'húng lõi lìm CỈÍC mỏi (rường thích hợp dế cho cóc cụm
( Itổi I:i lỗ tối nliííl
hong thí nghiệm này. cỉìútìg tAi sử dụng 2 loai 111 Ai Inròrng In MS
VI ! s (xem phụ !ục). c nc rum chổi (lược cấy vào 2 mỏi trường nói liên,
,;III (!(< mÃii (lược miAi ttong pliòng mtAi Kết íỊiin theo (lõi trong 10 ngày
I ItiMC II mh bày ờ h:’)iiiĩ <v
Ọm b;ing nhy chúng In thây inng liên môi trường LS (lồi với (fl( c;í
< .!<• (lòng nghiOn cứu 100% srt chổi đều ra lễ, còn trên mỏi trường MS của
í;ìI e;t c;ic (lòng đổn lliấp hơn so với mỏi litrờng LS. Nhưng trên mỏi lnrờiig
lùụ l\ lọ m lễ cún líít cả các dòng tương dối đồng đều nhau.
Háng 6. Tỷ lệ ra rễ của các dòng lúa nghiên cứu.
Tên
dòng
VN.01
8S 9S
Zs.97A
Môi
trường
Sô
chồi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
SỐ

chổi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
Số
chồi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
Số chồi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
MS
50 98 50
98
50
96
50
96
LS 50 100
50 100 50 100 50 100
V. TẢI TAO CÂY LÚA TỪ MỔ SEO CỦA DAO PHẤN F1 CỦA T ổ HƠP LAI
y PHIAI 6 4 S X O 1 2 2 5.

Đê nhận được cãy từ mô sẹo của bao phấn tổ hợp lai ọ Peiai 64s X
o 1225 cũng phải tiến hành qua các giai đoạn ; Tái sinh chổi, nhân chồi,
tạo rễ thành cây hoàn chỉnh như đã trình bày ở phần trên. Trong số 69 cây
lúa nhận được chúng phân lý ra các kiểu hình khác nhau.
Trong đó 60 cây có chiều cao trung bình, lá cây màu xanh lục, khi
trỗ bông bao phấn bình thường, hạt phấn khi nhuộm màu KI 1 % bắt màu
tím đen, cây kết hạt bình thường chứng tỏ chúng là cây lưỡng bội 2n.
6 cây thân thấp, rễ ngắn, lá nhỏ màu xanh nhạt. Khi trỗ bông, các
hoa xếp xít nhau, bao phấn phát triển kém, hạt phấn nhỏ và không nhuộm
màu không nhuộm KI 1%. Cây không kết hạt. Những cây này chúng tôi
nghi chúng là đơn bội n.
3 cây thân to, đẻ nhánh khoẻ, lá to dài có màu xanh đậm, đòng lớn.
Khi trỗ bông, bông dài bao phấn và hạt phấn to; Khi nhuộm màu dung
dịch KI 1% thì hạt phấn bắt màu nâu vàng, cây không kết hạt. Những cây
này chúng tôi nghi chúng là đa bội.
Trong điều kiện nhiệt độ tự nhiên dưới 24°c tất cả 60 cây 2n đều
hữu thụ và kết hạt bình thường. Trong số này có 27 cây khi điều kiện thời
tiết trung bình lên trên 26wc thì hạt phấn bất thụ hoàn toàn. Điều đó chứng
tỏ nó có chứa gen TGMS đổng hợp tử lặn.
Trong 27 cá thê này chúng tôi chọn được 5 dòng TGMS mới có các
đặc điểm nông sinh học cần thiết trình bày ở bảng 7. Nếu nhiệt độ thấp
hơn 24°c chúng đều có khả năng kết hạt. Nếu nhiệt độ tăng lên từ 24°c
trở lên thì hạt phấn đều bất thụ. Nếu được nghiên cứu thêm các dòng này
có thể sử dụng làm các dòng mẹ cho công tác lúa lai.
15
Banụ 7 . Đặc lính nông sinh học cú;i các dòng TCÌMS ớ thời ky l'.ìl iliu
Dòng
TGMS
sỏ
Chiổu cao

(cm)
Chiêu dài
cổ hông
(cm)
Chiều dài
bông (cm)
Đoạn bông
nghẹn so với
chiểu dài bông
Sô hoa trôn
hỏng chính
1 71,9+1,8
-S,x
23.3 + 2,2 24,0
148
1 1
79,2 + 2,1
-5.Í1
20,4 + 2,5
27,5
143
17 68,7 + 3,5
-5.S
l‘),7 + 1,8
2‘),4
135
22 80,2 + 2,4
-5.4
20.1 + 1,6 26,‘)
141

25
72,8 + 2.6 -6.7
21,4 + 2,5
31,3
137
1».
TÀI LIỆU TIIAM KIỈẢC)
1. Nguyễn Thới Nhâm 1988, nước.
“Nước dứa trong công nghệ sinh học”
Đề tài cấp nhà nước 02C-0701 UBKHKT nhà nước.
2. Nguyễn Vãn Uyên, 1993.
Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trổng
Nhà xuất bản Nông nghiệp , trang 31 -39.
3. Trần Văn Minh; 1994
Nuôi cấy mô tê bào thực vật, Phân viện công nghệ sinh học thành
phố Hồ Chí Minh. %
Q
4. Amirato, p.v.
Control and expression of morphogenesis in culture in Plant tissue
culture and agricultural application, London.
5 Bhojwani/S.S and Razdan,,M.K.
Plant tissue culture, Theory and practice, Elsevier Science
publisherẩ, Amsterdam.K,25-41
6. Murshige,T. and Skoog,F. 1962
A revised medium for rapid growth and biomass with tobaco tissue
culture. Plant physiol, 1~5rp.••473-479.
7. Pierik R. I, 1987.
Invitro culture of higher plant. Mactinus nijkoff publishei^Dordech
the Netherland
8. Street H. E., 1975.

Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific publication, p 39-
51.
ọ
9. Sxvaminathan, 1984.
Tissue culture and Third World agriculture. Problems and potential,
in tissue culture technology and development centre for Science and
technology for development. Unite nation.
10.Heide Ola M.,1972.
The role of Cytokinin in regenerations processes. In Hoimonal
Regulation in plant growth and development. Proc. Adv. study inst. ỉzmir.
p. 207-219.
1?
PHỤ LỤC
I hììnli pliíỉn dinh (lưỡng mAi trường cơ bòn MS (Murashige and Skooịĩ, 1962)
riiònli phỉìn
Ilàm lượng (itig/1)
K hoátiỊi đa lương
KNO,
NĨI.NO,
CaCI2. 2II2C)
MjỉS( ),. 7H2()
K HịK ),,
FcS( )„. 7HjO
Na2EDTA
khoáng, vi lương
MiiS()4. 4H2()
/ iiSO,. 7Hj()
lí,no,
KI
CtiSO, 5Mj()

( o( 'lj. fiH2()
Na2Mo.|. 2H70
' 'iiưnũn ỵà cức chất liữu cơ
(' I ve i 11
I hÌMiìiin-í 1CI (Vilamin BI)
l \ I idoxin-l I('I (Vilamin B6)
Nieotinie acid (Vitnmin B)
Sticrose
Mói Iiirờng LS (Linsmaier and Skoog, 19f>5) cố thành phồn lí\
Kín MS Ví\ hổ sung 100(mg/l) Myo- inositol
1900
1650
440
370
170
25,8
37.2
22.3
8,6
6,2
0,83
0,025
0,025
0,025
2,00
0,10
0,50
0,50
10000
lìiAi trirờiiP cơ

PHỤ LỤC
NHŨNG MÔI TRUỒNG SỬDỤNG TRONG BÁO CÁO NÀY
Ký hiệu
môi
trường
Môi
trường cơ
bản
Phytohormone
2,4D (mg/1)
Kinetin
(mg/1)
(X NAA
(mg/1)
PAP
(mg/1)
MSI
MS
2 1
1
MS2 MS
1
1
1
MS3
MS
2 1
0,25
MS4
MS

4 0,5
2
MS5 MS
1,0
1,0
0,5
MS6 MS
2,0
1,0
0,5
MS7
MS
3,0
1,0
0,5
MS8 MS
2
1,0
0,5
MS9
MS
2
1,5
0,5
MS10 MS
2
2,0
0,5
!. Tạo mô sẹo từ bao phấn của F1 ( ọ Peiai 64s X (1 1225)
2. Tái sinh chổi từ mổ sẹo

4. Hạt phấn hữu thụ
AM1
ấẮ®*;
.í. «
5. Hạt phấn bất thụ
6. Hạt pliấn của cAy nghi là Tam bội
PHIẾU ĐẢNG KÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu KH-CN
Téĩm đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của một sỏ chất phytohormon lên quá
trhmh vi nhân giống một sô dòng lúa bất dục đực.
M lãisố: QT-99-11
Cơ t (quan chù trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Điaa chỉ:
334 Nguyễn Trãi, Quận Thanh xuân - Hà nội.
Điệệm thoại:
8.585277
Cơ i tquan quản lý đề tài:
Đại học Quốc gia Hà Nội
Km8 đường Xuân Thuỷ, Cầu giấy Hà Nội.
ĐitệỆm thoại:
8.340564
Tô>nn<ig kinh phí thực hiện:
7.000.000đ
Trooing đó: - Từ ngân sách nhà nước:
7,0 triệu đổng, hoặc
USD.
- Kinh phí của Trường:
tr.đ
USD
- Vay tín dụng:

ir.đ
USD
- Vốn tư có:
tr.đ
USD
- Thu hổi:
tr.đ
USD
Thtờờii gian nghiên cứu: 1 năm
- Thời gian bắt đẩu: 1- 1999
- Thời gian kết thúc: 12- 1999
Tẽin n < các cán bộ phối hợp nghiên cứu:
1- TS. ĐỖ Năng Vinh
2- TS. Hoàng Tuyết Minh
Số <đ đáãng ký đề tài: Số chứng nhận đăng ký
<QQ)T-99-11 Kết quả nghiên cứu
Ngààyìvy:
Bảo mật
A.Phổ biến rộng rãi
B.Phổ biến hạn chẽ
C.Bảo mật.
T>ni tắt kết quả nghiên cứu:
- Đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên quá trình tạo mỏ sẹo ở một sô dòng lúa bất
dục đực.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các xỉtokỉnin và auxin lên quá trình biệt hoá chồi và
nhản chồi của các dòng lúa nói trên.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của ãuin lén quá trình tạo rễ ở lúa.
- Hoàn thành 2 bài báo in trên tạp chí chuyên ngành.
- Đào tạo được 7 cử nhân theo hướng nghiên cứu của đề tài.
Kiến nghị về qui mỏ và đối tượng áp dụng nghiên cứu:

Các dòng bất dục đực nhận được cần được tiếp tục nghiên cứu có khả nâng ứng
dụng được vào thực tiễn chọn giông.
Chủ nhiệm để tài
Thủ trưởng cơ quan
Chủ trì để tài
Chủ tịch Hội đồng
đánh giá chính thức
Thủ trưởng cơ quan
Quản lý đề tài
Họ và tèn:
Đỗ Văn Cát
Nguyền Ngọc Long
1
ỈA ilo rỵ ỹ $JưQOữ(fac.
'k u V r^ G L u a n c Ị ỊÌq c
Học vị: GVC
PGS.TS
Pér
1S H K
p & n u e
Ký tên:
* t ì v Ẵ
Đóng dấu
.



ị
KMOA-HpTT Ị
Vy TỤ NHtf;N , ý'

V ^ \
J Ệ - -
>