0154 nghiên cứu ưng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ hệ mới phát hiện đột biên precore và core promoter ở bệnh nhân viêm gan b mạn tại bv trường đại

Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

BỘ
Y TẺ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DUOC CAN THO
DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC CONG NGHE CAP TRUONG

NGHIEN CUU UNG DUNG
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẺ HỆ MỚI
PHÁT HIỆN ĐỘT BIEN PRECORE VA CORE PROMOTER
Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN

TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẢN THƠ
Chủ tịch hội đồng

Chủ nhiệm đề tài

——
“Ý
GS.TS.PHẠM VĂN LÌNH

PGS.TS.TRAN NGOC DUNG

CAN BO THAM GIA: ThS.TRINH THI HONG CUA

TS.DUONG THI LOAN
ThS.ĐINH THỊ HƯƠNG TRÚC

BSNT. HOÀNG THỊ NGỌC ANH

Cần Thơ —- năm 2015


(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

LOI CAM DOAN

Tơi xin cam đoan

đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số

liệu, kết quả nêu trong đề tài là hoản toàn trung thực và chưa được cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác. Các thơng tin, tài liệu trích dẫn trong luận
văn đêu được ghi rõ nguôn gôc.

TRẢN NGỌC DUNG


.~-⁄

—/

(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

LOI CAM ON

Đề hồn thành cơng trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
của rất nhiều đơn vị trong cũng như ngoài trường: Sự tham gia hỗ trợ nhiệt

tình của các thành viên nhóm nghiên cứu; Sự hỗ trợ kinh phí từ Ban điều phối

dự án ADB;

Sự hỗ trợ về kỹ thuật của các thành viên cơng ty Biomedic; Sự

đóng góp ý kiến của các thầy, cô các bạn đồng nghiệp trong Hội đồng xét
duyệt và nghiệm thu Cơng trình.

Sự giúp đỡ này đã góp phần rất lớn cho sự thành công của đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả
Trân trọng

Tác gia

yt

seinen

TRAN NGOC DUNG


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

{ |q

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan
Lời cám ơn
Mục lục

PHAN 1. TOM TAT DE TAI
PHAN 2. TOAN VAN CONG TRINH NGHIEN CUU
Danh mục chữ viết tắt

Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ
Danh mục các biểu đồ

PHAN MÔ HÀ ca eeiaaenaieiisiiirisiieienksseirrerdreseresei |
Chuong 1. TONG QUAN TALI LIEU .o...ccocccccccceccsscsscssecseessccsesssecseessessecsveen 3
1.1. Tình hình nhiễm virus viêm gan Boo....cccccccccececececscsssesesecsesesesesscevensesseeees 3
1.2. Đại cương về virus Vidm gan Bou.eeccceccccsecsessessecsessessvessessessuessesssessecsesesecess :

1.3. Dap tmg mién dich nhiém HBV, dién tién tu nhién nhiém HBV.............. 8
1.4. Đột bién gen HBV .......ccccceccecccsessesssesseseessesucssesssessessessesssarearessessessesseeses 11
1.9. BỆNH: VIGfH ÔNÙ VERS Biases scscsesscnsesssssesevecinssasncesnresvamevencimaapassversessnenervere 14
1.6. Các nghiên cứu về thể đột biến precore và core promoter cua virus
PCTS GORI IED sexes eacyccus wasn reaaunsep vaginas oSuAan wis eee

RNDAT RUN TARA taemreceameemernees 16

Chương 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 18
2.1. Đối tượng nghiên CU. ....eccccecsscessseessssecssesssecsssecssecsssesssecessecsstessssesseecssees 18

(re

và

ở

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

\

iV

2.2. Phuong phap nghién ctu......ccccccccssessssscssccacsececesececsceseeseesssnceasateesenses 19
2.3. Đạo đức trong nghiÊn CỨU. . . . . . . . . . .

.-- --G- G <<

E91

S111 1g 111g ke rsec 25

Chương 3. KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU........................... 2222222221952

etne 26

3.1. Đặc điểm chung bệnh nhân viêm gan B mạn nghiên cứu............................ 26

3.2. Kết quả phát hiện đột biến vùng C của HBV ở bệnh nhân nghiên cứu... 27
3.3. Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ xơ gan và ung thư gan........ 29
3.4. Liên quan giữa đột biên precore và core promoter với một sô yếu tố .... 3

Chương 4. BẢN LUẬN ....................
22s 2S EEE2E2 2221111112212
.........5
EEEEEEerree
2 33
4.1. Đặc điểm chung bệnh nhân viêm gan B mạn nghiên cứu.......................... 33

4.2. Kết quả phát hiện đột biển vùng C của HBV ở bệnh nhân nghiên cứu... 35
4.3. Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ xơ gan và ung thư gan........ 36
4.4. Liên quan giữa đột biên precore và core promoter với một sô yếu tố .... 37

KET LUAN oocseccceccsssessscecsscssssecessesesessusessusessssasestsucsusssecassucssssusesssuesssevescsse 39
ISUEN NGHI ooo ccccsssccccsecscssssscccsvescsssvessssssecsssusecsssccsssscescasssssssessssuesssssevecese 40
Tai liệu tham khảo
Phụ lục 1: Phiếu thu thập
Phụ lục 2: Danh sách đối tượng nghiên cứu


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

V

PHAN 1

TOM TAT DE TAI

V†

I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TU GEN THE HE MOI

PHAT HIEN DOT BIEN PRECORE VA CORE PROMOTER
O BENH NHAN VIEM GAN B MAN
TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DUOC CAN THO
1. Phan mé dau

Hiện nay trên thế giới có khoảng 240 triệu người bị viêm gan B man va
xấp xỉ 780.000 người chết mỗi năm vì viêm gan siêu viB

[12]. Siêu vi B là

chủng virus DNA nhỏ khoảng 3.2 kb, đường kính 42nm có vỏ, thuộc gia đình
Hepadnaviridae virus. Bộ gene của virus viêm gan B là một chuỗi DNA kép
khơng hồn tồn có kích thước 3.2 kb, chứa 4 bộ khung mở che phủ nhau, mã
hóa cho các protein bề mặt (surface) là preSl, preS2 va 8; 16i (core) chứa
protein

lõi tổng hợp kháng

nguyên

HBeAg;

precore (PC) có 2 codon khởi đầu là AUG

X va polymerase

[1]. Vung

liên quan đến tổng hợp profein |

precore (tién than cla HBeAg) va core protein (sản xuất HBcAg). Vùng BCP

(base core promoter) từ nucleotide 1751 đến 1769 có chức năng thúc đẩy

vùng PC sinh tổng hợp kháng nguyên HBeAg [1]. Đột biến precore là đột
biến ở vị trí 1896 từ nucleotid G —› A của vùng precore chuyển codon TGG
(codon 28) của acid amin tryptophan thành TAG, ảnh hưởng đến quá trình

dich ma di truyền từ mRNA thành HBeAg. Đột biến vùng core promoter tại
vị trí 1762-1764, cụ thé ở vị trí 1762 (A — T) và ở vị trí 1764 (G — A) gây
gián đoạn quá trình chuyển mã từ nhân làm cho virus viêm gan B không thể

tạo ra được HBeAg nữa hoặc nếu có thì với nồng độ rất thấp [5]. Năm1986,
Bonino bắt đầu mô tá thể bệnh viêm gan B mạn với HBeAg (-) và aniHBe


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

vl {

(+), đây là thể bệnh khơng có hiện diện của HBeAg nhưng vẫn tổn tại HBV-

DNA, và bệnh gan vẫn tiếp tục tiến triển. Tổn thương gan ở bệnh nhân với thé

bệnh HBeAg (-) thường nặng hơn thể bệnh có HBeAg (+) [4]. Do đó, việc
phát hiện đột biến precore là bước quan trọng phải thực hiện vì bệnh nhân có
nguy cơ cao thành xơ gan hay ung thư gan [7], [13]. Bên cạnh đó, khi bệnh

nhân phát hiện mang HBV có các đột biến này thì phải được điều trị bằng
thc kháng virus suốt đời.
Hệ thống máy giải trình tự gen Miseq của hãng Illumina là một trong

những hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới với nhiều ưu điểm nổi trội như
cơng suất giải trình tự 15GB/1

lần chạy, giải đồng thời 16 hệ gen vi sinh

vật/1lần chạy, độ chính xác 99,9%, giải trình tự các đoạn gen và cả genome

các vi sinh vật, phân tích đồng thời 96 mẫu/1 lần chạy [25]. Chính vì thế, đề
tài này thực hiện với mục

tiêu: Xác

định tỷ lệ đột biến precore

va core

promoter ở bệnh nhân viêm gan B mạn phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự
gen thế hệ mới tại bệnh viện Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ.

2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Tắt cả bệnh nhân được chân đoán viêm gan
virus B mạn tính đến khám và điều trị tại bệnh viện Trường Đại Học

ŸY Dược

Cần Thơ.
- Tiêu chuẩn chọn mẫu: Bệnh nhân mới, chưa điều trị đặc hiệu; không

đồng nhiễm HCV và HIV; đồng ý tham gia nghiên cứu và có đủ tiêu chuẩn
chân đoán viêm gan B mạn với:
+ HBsAg duong tinh hon 6 thang.
+ Men gan ALT > 2 ULN.

+ HBeAg (+) vai HBV-DNA > 10° copies/ml hay c6 ALT > 2 ULN
hoặc HBeAg (-) vi HBV-DNA 10*- 10°copies/ml [3].

|


Gen PLIB Tai ligu phuc vu hoc tap, nghién citu khoa hoc

WỊ [ \

- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca.
- Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu tồn bộ
- Nội dung nghiên cứu:
+ Đặc

điểm

chung

của đối tượng

nghiên

cứu:

nhóm

tuổi, giới tính;

nghề nghiệp; nơi cư trú; lý do đến khám

+ Tỷ lệ viêm gan B mạn thê HBeAø (-) ở bệnh nhân viêm gan B mạn: xét
nghiệm HBeAg bằng test định tính
+ Tỷ lệ đột biến precore ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính thé HBeAg

(-); Mối liên quan giữa đột biến của virus viêm gan B với tỷ lệ HBeAg (-):
bệnh nhân viêm gan B mạn thé HBeAg (-) có néng d6 HBV-DNA >10°
copies/ml sẽ được giải trình tự gen vùng precore, nằm ở đoạn gen core từ
nucleotide

1742-1901

của HBV

để tìm đột biến precore; sau khi xác định

được đột biến precore, core promoter, tim mối liên quan giữa tỷ lệ có hay

khơng có đột biến precore, core promoter với ty lé HBeAg (-) va (+) ở bệnh
nhân viêm gan B mạn thông qua phép kiểm định Chi quare %.
- Các

bước

tiến hành

nghiên

cứu:

chuẩn bị phiếu thu thập số liệu;

chuẩn bị bệnh nhân; tiến hành khai thác bệnh sử, khám lâm sàng: ghi nhận
những thông tin thu thập được và kết quả xét nghiệm.
- Xử lý số liệu thống kê: phần mềm SPSS 16.0
4. Kết quả nghiên cứu
4.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân viêm gan B mạn nghiên cứu

- Nhóm tuổi: Nhóm tuổi mắc bệnh cao nhất là > 45 chiếm 49,2%, kế
đến < 35 tuổi là 32,3% và 35-45 tuổi chiếm 18,5%.
- Giới tính: nam (58,5%); ni (41,5%)


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

[

4

- Viêm gan B mạn có HBeAg (-) là 52,3% và có HBeAg (+) là 47,7%

4.2. Kết quả phát hiện đột biến vùng C của HBV ở bệnh nhân nghiên cứu
- Có 14 loại variant trong tơng số 65 mẫu nghiên cứu
- Sự sai khác ở vị trí C1827A chiếm tỷ lệ 98,46%, G1896A và A1762T

đều là 24,6%.
- Tần suất đột biến: 1 đột biến (29,2%), 2 đột biến (6,15%), 3 đột biến
(7.7%) và 4 đột biến (10,8%).
4.3. Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ ung thư gan và xơ gan
- Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ ung thư gan: T1753C
(7,7%).

A1762T

(24,6%),

GI896A

(21,5%),

A1846T

(3,1%),

G1896A

(24,6%) và G1899A (6,2%).
- Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ xơ gan: A1726 (1,5%),
AT727T (4,6%) và C1730A (4,6%).
4.4. Liên quan giữa đột biến precore và core promoter với một số yếu tố
- Liên quan giữa đột biến precore với một số yếu tố: Tỷ lệ đột biến
precore khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa giới, tình trạng HBV-DNA

trước khi điều trị và đáp ứng điều trị sớm. Đột biến precore ở nhóm viêm gan
HBeAg

(-) chiếm tỷ lệ 47,1%, cao hơn có ý nghĩa so với nhóm viêm gan

HBeAg (+) với p < 0,001.Tỷ lệ đột biến precore ở độ tuổi > 45 chiếm tỷ lệ
60% cao hơn có ý nghĩa với nhóm < 45 tuổi, với p < 0,01 (OR= 0,37; khoảng
tin cậy 95% 0,25 - 0,53).
- Liên quan giữa đột biến core promoter với một số yếu tố: Tỷ lệ đột
biến core promoter không khác biệt giữa các nhóm tuổi, giới, mật độ HBV-

DNA trước điều trị, đáp ứng với điều trị tiên phát.Tuy nhiên đột biến core


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

X

promoter 6 bénh nhân viêm gan B có HBeAg

(-) là 32,4% cao hơn nhóm

HBeAg (+) la 9,7% (p< 0.01).
5. Kết luận
1) 100% BN

viém gan B mạn nghiên cứu đều phát hiện có sai khác

(variant) với 14 loại variant khác nhau, trong đó, có 9 loại đột biến được phát hiện.

2) Tan suất số đột biến theo mẫu là: mẫu có 1 đột biến là 29,2 % (19/65), 2
đột biến 6,15% (4/65), 3 đột biến 7,7% (5/65) và 4 đột biến 10,8% (7/65).
3) Tỷ lệ đột biến precore trên bệnh nhân viêm gan B mạn là 24,6%, đột

bién core promoter la 21,5%.
4) Các đột biến trên vùng BCP/PC của HBV

đặc hiệu cho xơ gan là

A1726C, A1727T, C1730G (chiếm 10,7%) và các đột biến liên quan đến ung
thư tế bào gan là T1753C, A1762T,

G1764A,

A1846T,

G1896A,

G1899A

(chiếm 87,7%).
5) Đột biến PC/BCP liên quan đến thể HBeAg (-), p<0,05 và tuổi bệnh
nhân >45t. Chưa thấy mối liên quan giữa đột biến với đáp ứng điều trị sớm
sớm ở bệnh nhân.


(re

e

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

X

PHAN

\

`

2

TOAN VAN CONG TRÌNH NGHIÊN CỨU


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

\>

K(t

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TAT

_Chữviếttất| — Tiếng Anh
|A
'BCP_

Tiếng Việt

deaths:
7 | Base core promoter

:

cytosine.
cs

—

‘DNA mw

Cong su

[Dggrevrfbziadflie acid

G _| Guanine
HBcAg

Hepaties B core antigen

Kháng nguyên lõi

HBeAg

Hepatitis B e —m

Kháng nguyên vỏ

HBsAg

Esgsdds B surface antigen

Kháng nguyên bề mặt

HBV

Hepatitis B Virus

Virus gay viém gan B

PC

Precote

a

Thymine

VGBMT

|

|

Viém gan B man tinh


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Vite

Yn

DANH MUC BANG
Bảng 3.1. Đặc điểm chung bệnh nhân viêm gan B mạn nghiên cứu.............. 26
Bảng 3.2. Phân bồ các loại variant vùng C của HBV được phát hiện............. 27

Bảng 3.3. Tần suất đột biến theo mẫu nghiên cứu được phát hiện.................. 28
Bảng 3.4. Tỷ lệ đột biến precore/core promoter được phát hiện ...................... 28
Bảng 3.5. Các đột biến BCP/PC có liên quan đến nguy cơ xơ gan, ung thư gan
Vũ Gỗ Xơ giải ÊU

EH HD sinh

Hung

haa Gin Ga 066000510162429.exsssgeesoereesee 30

Bảng 3.6. Liên quan giữa đột biến precore với đặc tính dân số vả đáp ứng sớm
với điều tị của bệnh zihÊn VICI Ban

HINH. ái. con

rveaenniriBiditlissiea 31

Bảng 3.7. Liên quan giữa đột biến core promoter với đặc tính dân số và đáp
ứng sớm với điều trị của bệnh nhân viêm gan B mạn .................................5 55+ 32


(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

KV
DANH MỤC HÌNH VỆ

Hình 1.1. Phân bố nhiễm HBV theo các vùng dịch..........................--22- 2222222522 3
Hình 1.2. Cấu trúc các phần tử HBV dưới kính hiển vi.......................
2. SE 2 6
Hình 1.3. Cấu trite b6 gen HBV ou... ccccccssccsssesssecssesssecesecssesssecesecesssssessseesseeeen 7
Hình 1.4. Biểu hiện sự chuyền đổi huyết thanh và các dấu ấn huyết thanh ở
Miu

00008 .................ẢÝắ&

ll

Hinh 1.5. B6 gen HBV gém 3 gen C, X va S va vùng sao chép ngược RT

polymerase trên bộ gen HBV...............
¿(+2 x1 .........
k SE SE SE SE ...
2 cv. 12
Hình 1.6. Hinh ving precore, core promoter ...........c:cccccsccssssesesescceeeecsceeeeceees 13


(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

XV

DANH MUC BIEU DO

Biểu đồ 3.1. Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ ung thư gan
Biểu đồ 3.2. Các loại đột biến có liên quan đến nguy cơ xơ gan

eee eee

eee eee ee eee


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

1

PHAN MO DAU
Hiện nay trên thế giới có khoảng 240 triệu người bị viêm gan B mạn và
xấp xỉ 780.000 người chết mỗi năm vì viêm gan siêu vi B

[12]. Siêu vi B là

chủng virus DNA nhỏ khoảng 3.2 kb, đường kính 42nm có vỏ, thuộc gia đình
Hepadnaviridae virus. Bộ gene của virus viêm gan B là một chuỗi DNA kép
khơng hồn tồn có kích thước 3.2 kb, chứa 4 bộ khung mở che phủ nhau, mã
hóa cho các protein bề mặt (surface) là preS1, preS2 và §; lõi (core) chứa
protein

lõi tổng hợp khang

nguyén

HBeAg;

precore (PC) có 2 codon khởi đầu là AUG

X va polymerase

[1]. Vùng

liên quan đến tong hop protein

precore (tién than cia HBeAg) va core protein (sản xuất HBcAg). Ving BCP
(base core promoter) tir nucleotide

1751 đến

vùng PC sinh tổng hợp kháng nguyên HBeAg

1769 có chức năng thúc đây
[1]. Đột biến precore là đột

biến ở vị trí 1896 từ nucleotid G —› A của ving precore chuyén codon TGG

(codon 28) của acid amin tryptophan thành TAG, ảnh hưởng đến quá trình
dịch mã di truyền từ mRNA

thành HBeAg. Đột biến vùng core promoter tại

vi tri 1762-1764, cu thé 6 vi tri 1762 (A — T) va 6 vi tri 1764 (G — A) gay

gián đoạn quá trình chuyền mã từ nhân làm cho virus viêm gan B không thể
tạo ra được HBeAg nữa hoặc nếu có thì với nịng độ rất thấp [5]. Năm1986,
Bonino bắt đầu mô tả thể bệnh viêm gan B mạn với HBeAg (-) và antHBe

(+), đây là thể bệnh khơng có hiện diện của HBeAg nhưng vẫn tồn tại HBVDNA, va bệnh gan vẫn tiếp tục tiến triển. Tổn thương gan ở bệnh nhân với thể

bệnh HBeAg (-) thường nặng hơn thể bệnh có HBeAg (+) [4]. Do đó, việc
phát hiện đột biến precore là bước quan trọng phải thực hiện vì bệnh nhân có

nguy cơ cao thành xơ gan hay ung thư gan [7], [13]. Bên cạnh đó, khi bệnh

nhân phát hiện mang HBV có các đột biến này thì phải được điều trị bằng
thc kháng virus suôt đời.


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

2

Hệ thống máy giải trình tự gen Miseq của hãng Illumina là một trong

những hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới với nhiều ưu điểm nổi trội như
cơng suất giải trình tự 15GB/1 lần chạy, giải đồng thời 16 hệ gen vi sinh
vat/11an chạy, độ chính xác 99,9%, giải trình tự cac doan gen va ca genome

các vi sinh vật, phân tích đồng thời 96 mẫu/1 lần chạy [25].

Chính vì thế, đề tài này thực hiện với mục tiêu xác định tỷ lệ đột biến
precore và core promoter ở bệnh nhân viêm gan B mạn phát hiện bằng kỹ thuật

giải trình tự gen thế hệ mới tại bệnh viện Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ.


(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TINH HiNH NHIEM VIRUS VIEM GAN B
1.1.1. Tình hình nhiễm virus viêm gan B chung trên thế giới
Trên toàn cầu nhiễm HBV chia làm 3 vùng dịch, ước tính có 45% dân

sống ở vùng dịch cao ( tỷ lệ nhiễm HBV

> 8%) bao gồm Châu Á, Đông Nam

Á, Châu Phi đưới Sahara và các đảo Thái Bình Dương: 43% dân song trong
vung dich trung binh (2-7%) gom các nước Ấn Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Mã

Lai, Singapore, Indonesia, Thái Lan; 12% trong vùng dịch thấp < 2% như Úc,

Nhật và New Zealand [37].

* cự thụalMrýes
grv ren me*y n9

rế pvev-vlervrvs rể hematin Rutan anhown (Hen)

a marke

ot eneonic MAY inaction are hand nn tented rtata anct

Hình 1.1. Phân bố nhiễm HBV theo các vùng dịch.
(Nguôn: MMWR

Recomm Rep, 2006 [37])

Viêm gan virus B mạn tính là một vân đề nghiêm trọng của y tÊ cộng
đồng với khoảng xấp xỉ 400 triệu người bị nhiễm trên toàn cầu. Theo WHO


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

4

(World Health Organization) hiện nay trên thế giới có 240 triệu người bị
nhiễm viêm gan virus B và xấp xỉ 780.000 người chết mỗi năm vì nhiễm virus
viêm gan B. Trong đó, có khoảng 650.000 người chết vì xơ gan và ung thư
gan do nhiễm viêm gan B mạn (VGBMT)

và 130.000 người vì viêm gan B

cấp [63]. Tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn của người lớn ở Sahara Châu Phi và

Tây Á 5 - 10% dân số, ở Trung Đông và Án Độ chiếm 2 - 5% dân số, Tây Âu
và Bắc Mỹ < 1% dân số. Tại Hoa Kỳ, theo kết quả một nghiên cứu đoàn hệ từ
năm

1990-2005,

tỷ lệ viêm gan virus B là 78%,

tỷ lệ mắc

trung bình

1.9-

8.5/100.000 người, số mới mắc xấp xỉ 232.000 người [35]. Ở Châu Á, thống
kê có khoảng 5 - 10% ở người lớn, 90% trẻ em nhiễm HBV

mạn và 75%

trong số đó dẫn đến viêm gan mạn, xơ gan, ung thư gan. Trung bình có
khoảng 50 triệu người mắc viêm gan B moi hang nam [51].

1.1.2. Tình hình viêm gan B man thé HBeAg (-) trên thế giới
Viêm gan B man tinh thé HBeAg (-) cé phan bé khắp thế giới và tỷ lệ
ngày càng tăng, nhất là vùng Châu Á. Theo nghiên cứu đoàn hệ của Funk

(2002), tần suất viêm gan B mạn HBeAg (-) cao nhất là 36% ở vùng Châu Á

Thái Bình Dương, kế đến là 24% ở Trung Đông và 22% ở Mỹ và Châu Âu
[40]. Tác giả Vutien và cộng sự nghiên cứu §28§ bệnh nhân ở Chau A và Châu
Mỹ, ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân viêm gan B man thé HBeAg (-) la 67,6% [62].
Nghiên cứu của Ming Shi và cộng sự ở Trung Quốc cho kết quả tỷ lệ viêm

gan B mạn thể HBeAg (-) là 32,6% [52].
1.1.3. Tình hình nhiễm virus viêm gan B chung ở Việt Nam
Việt Nam được ghi nhận

là vùng nhiễm HBV

cao trên thế ĐIỚI, VỚI tỷ

lệ nhiễm từ 10 - 20% [41]. Năm 2003, Hipgrave và cộng sự nghiên cứu trên

1579 người từ Thanh Hóa đến Hà Nội theo các nhóm tuổi, ghi nhận tỷ lệ
HBsAg (+) ở trẻ sơ sinh là 12,5%, trẻ nhỏ là 18,4%, thanh thiếu niên là 20,5%

và người lớn là 18,8%. Tỷ lệ trẻ có HBeAg (+) là khá cao, cao nhất ở trẻ sơ


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

5

sinh là 85,1%, trẻ nhỏ là 88,1%, thanh thiếu niên là 71,1% và người lớn là

30,4% [41]. Ở miền Trung, theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Bàng, người
mang HBsAg cé ty 1é 1a 8,9% [1]. Theo Huỳnh Thị Kim Yến (2012), tỷ lệ

nhiễm virus viêm gan B ở người dân, quận Ninh Kiéu, Thanh phé Can Tho la 7% [25].
1.1.4. Tình hình viêm gan B man thé HBeAg (-) & Viét Nam
G Viét Nam, bénh viém gan virus B man thé HBeAg âm tính ngày càng
được quan tâm vì tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng. Nghiên cứu của Nguyễn Thị

Kim Chính (2009) ở Hà Nội về đặc điểm bệnh nhân viêm gan B thể HBeAg
âm tính và dương tính, ghi nhận tỷ lệ viêm gan B man thé HBeAg am tinh là

58,5% [2]. Trần Xuân Chương nghiên cứu ở Huế, cũng ghi nhận tỷ lệ bệnh
nhân viêm gan B mạn thể HBeAg (-) 54,3% [3]. Tần suất viêm gan B mạn thể
HBeAg

(-) ở nghiên cứu của Phạm Thị Lệ Hoa tại Thành phố Hồ Chí Minh

lên đến 59,5% [7].

1.2. ĐẠI CƯƠNG VÈ VIRUS VIÊM GAN B
1.2.1. Cấu trúc virus viêm gan B
Virus viém gan B là chủng virus DNA nhỏ, khơng hồn chỉnh, thuộc gia
dinh Hepanadviridae. Cac dang phan tit cua HBV gồm:
- Phan tir khang nguyén bé mat HBsAg: do té bao gan nhiém HBV sinh
ra trong nguyên sinh chất té bao, voi dang hinh cau cé kich thuéc 22 nm chi
có duy nhất ở protein bê mặt, cịn

hình sợi thì có độ dài khơng

có định.

Polypeptid bề mặt có 3 loại: chính (do gen SŠ mã hóa), trung bình (do gen
preS2 va S mã hóa), lớn (do gen preS1, preS2 va S ma hoa).

- Phan tir nhan: virion tinh khiết có protein HBc két tu lai thanh phan tir
nhan va tao ra vO boc cua genome HBV va polymerase.
- Tiểu thé Dane hay virion hoàn chỉnh đường kính 40 - 42 nm, bao bọc
ngồi lớp vỏ là lipoprotein, chứa 3 vỏ glycoprotein (hoặc kháng nguyên bề

mặt), bên trong vỏ là nucleocapsid (hoặc nhân). Nhân chứa bộ gen bao bọc


Í (re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

6

DNA kép, protein core và polymerase; nó liên quan đến tổng hợp DNA trong

tế bào nhiễm [36], [50].
HBV virion
“Dane
particle”

_

—

Subviral particles

pm

oe

Se

ee.

C

Filaments

(length variable)

Spheres

Hình 1.2. Cấu trúc các dạng phần tử HBV
bao gồm tiểu thể Dane, HBsAg hình sợi và hình cầu
(Nguồn: Hepatology, 2014 [50]).
1.2.2. Cấu trúc bộ gen HBV
Bộ gen HBV

là chuỗi DNA

kép khơng hồn tồn, có chiều dài 3200

nueleotid. Trong nhân tế bào gan, virus tồn tại ở dạng cccDNA là dạng của
mRNA,

mRNA

được biết như “pregenomic” RNA

dé téng hop HBV-DNA

của tiểu thể mới. Vùng gen core sản xuất kháng nguyên e có liên quan đến sự
sao chép virus ở mức độ cao, kháng ngun này có vai trị gây đáp ứng miễn

dịch sinh kháng thể [44].

Bộ gen HBV chứa 4 bộ khung đọc mở chồng lấp nhau, mỗi vùng đều
có chức năng riêng:
- Khung

S (surface) chtra gen preSl, preS2 va SŠ mã hóa 3 kháng

ngun bê mặt, giữ vai trị khởi động và dịch mã.


Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

7

- Khung C (core) chứa kháng nguyên lõi (HBcAg) và kháng nguyên e
(HBeAg), có 2 codon trong pha khởi động là AUG. Vùng preC (tiền lõi) có

tín hiệu về xếp chuỗi, liên quan đến điều hòa bài tiết HBeAg.
- Khung X mã hóa protein X chưa hiểu hết chức năng, nhưng có chức
năng chuyền hoạt tác động đến gen biểu hiện và tăng sinh.
- Khung P lớn nhất bao trùm cả khung X và C, mã hóa cho polymerase
của virus [36].

Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen HBV
(Nguồn: Hepatology, 2014 [50])
1.2.3. Đường lây truyền HBV
- Lây truyền qua đường tình dục: xấp xỉ 40% các trường hợp nhiễm
HBV mới ở Mỹ có liên quan đến quan hệ tình dục và 25% là do quan hệ tình
dục đồng giới.
- Lây truyền qua đường tiêm chích: ở Mỹ và Châu Âu tỷ lệ nhiễm HBV
mới mắc do lây truyền qua đường tiêm là 15%.


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

- Lây

8

truyền chu sinh (lây truyền dọc)

lây truyền

HBV

HBsAg (+), nếu kèm HBeAg (+) thì 90% mẹ lây nhiễm HBV

từ mẹ

có

sang con, và

trong số trẻ sơ sinh lây qua đường chu sinh thì 90% trẻ bệnh sẽ chuyển sang
viêm gan B mạn tính.
- Lây truyền ngang, đặc biệt là lây giữa các trẻ nhỏ và các thành viên
trong gia đình qua các vết xây xướt da, niêm mạc do tiếp xúc với vật nhọn
xun qua da có dính máu nhiễm HBV.
- Lây truyền qua đường truyền máu, hoặc sử dụng các sản phẩm sinh
học từ máu mà không qua sàng lọc nhiễm HBV [50].

1.3. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRONG NHIEM HBV VA DIEN TIEN TU’

NHIEN NHIEM HBV
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV
Virus viêm gan B không trực tiếp gây tôn thương tế bào gan mà thông

qua đáp ứng miễn dịch dịch thể với kháng nguyên của HBV, giúp thải trừ
HBV. Các nghiên cứu lâm sàng đã cho thấy, trong giai đoạn cấp có phản ứng
của tế bào T mạnh với nhiều kháng nguyên HBV. Các thành phần tham gia
phản ứng bao gồm phức hợp hịa hợp mơ lớp II và I, tế bào T CD4+, TCD§+,
tế bào T độc và Iymphocyte. Các nghiên cứu gần đây, đã chứng minh vai trò

cia IFNy va TNFa co thé tiéu diét HBV ma khéng giết chết tế bào đích.
Những bệnh nhân chuyền sang man tính sau nhiễm HBV cấp là do đáp ứng
miễn dịch không đủ mạnh để tiêu diệt HBV,

hậu quả là phá hủy tế bào gan

gây viêm gan mạn tính và có thể dẫn đến xơ gan [36].

1.3.2. Các dấu ấn huyết thanh nhiễm HBV
- HBsAg (hepatitis B surface antigen) và anti-HBs: HBsAg là dấu ấn

xác nhận nhiễm HBV, cũng có thể dùng để dự đốn lâm sàng và theo dõi điều
tri. HBsAg xuất hiện trong huyết thanh 1 - 10 tuần sau khi nhiễm cấp HBV,
biên mất sau 4 - 6 tháng đôi với bệnh nhân phục hồi sau giai đoạn nhiễm cấp.


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

Nhiém HBV

man khi HBsAg

9

kéo dai trén 6 thang. Hau hét anti-HBs xuat

hiện ngay sau khi HBsAg biến mất, một số trường hợp chỉ xuất hiện sau giai

đoạn cửa số kéo đài vài tuần hay vài tháng, anti-HBs có khả năng bảo vệ được
cơ thể khi nồng độ phải > 10u1U/ml [50].
- HBcAg

(hepatitis B core antigen) va anti-HBc:

HBcAg

la khang

nguyên chỉ hiện điện trong tế bào gan bị nhiễm, khơng tìm thấy trong huyết
thanh, là chỉ thị biểu hiện HBV

đang hoạt động và độ lây nhiễm cao. Anti-

HBc là dấu ấn miễn nhiễm trong giai đoạn này, khi HBsAøg đã biến mất và
anti-HBs xuất hiện.

- HBeAg (hepatitis B e antigen) và anti-HBe: HBeAg là dấu ấn cho sự
nhân đôi của HBV và một số biến thể của HBV. Không sản xuất HBeAg và
anti-HBe (+) chứng tỏ HBV ngừng hoạt động [36], [S0]. Tuy nhiên, như đã

trình bày ở trên, một số trường hợp có đột biến vùng tiền lõi hoặc vùng khởi
xứng core gây khơng sản xuất HBeAg (âm tính) nhưng HBV vẫn hoạt động
và phát triển, dẫn đến viêm gan B mạn, có thê tiến triển đến xơ gan và ung
thư gan sau này.

1.3.3. Diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV
- Giai đoạn dung nap mién dich (immune tolerance); xay ra 6 giai doan

đầu của nhiễm HBV, HBsAg phat hién trong mau sau 1 - 2 tháng và có kháng
thê chống lại kháng nguyên nhân (anti-HBc) chủ yếu là IgøM. HBV phát hiện
với nồng độ cao 10-10!” virion/ml, HBeAg (+) trong huyết thanh, 75-100%
tế bào gan được phát hiện có kháng ngun này. Tổn thương mơ học gan rất
ít, men gan ALTT ln bình thường, giai đoạn này khơng triệu chứng lâm sàng
và kéo dai tir 10-30 nam.
- Giai doan tai hoat déng (immune reactive HBeAg positive phase): sau
khi nhiễm HBV, co thé sé co dap ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nhằm
làm giảm tôn thương tê bào gan, nông độ virus trong máu và tê bào gan giảm.