Khảo sát mô hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin ở chuột nhắt trắng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.35 MB, 100 trang )
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
NGUYỄN NGỌC PHỤNG
KHẢO SÁT MƠ HÌNH
GÂY TỔN THƯƠNG THẬN CẤP
BẰNG CISPLATIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CẦN THƠ, 2021
i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
NGUYỄN NGỌC PHỤNG
KHẢO SÁT MƠ HÌNH
GÂY TỔN THƯƠNG THẬN CẤP
BẰNG CISPLATIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Chuyên ngành: Dược lý và Dược lâm sàng
Mã số: 8720205
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG
CẦN THƠ, 2021
I
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành
phố Hồ Chí Minh, em đã có rất nhiều kỉ niệm, đúc kết và học hỏi thêm nhiều kĩ năng
trong nghiên cứu khoa học cũng như kinh nghiệm sống. Qua đó, em nhìn nhận được
rõ hơn ưu điểm và khuyết điểm của bản thân để tiếp tục hoàn thiện
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô PGS.TS. Nguyễn
Thị Thu Hương. Cô đã tạo điều kiện tốt nhất, ln tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và
truyền đạt tri thức cho em trong suốt q trình hồn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trần Mỹ Tiên đã hỗ trợ và tạo điều kiện
tốt nhất cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trung tâm. Em xin gửi lời
cảm ơn đến ThS. Mai Thành Chung, ThS. Chung Thị Mỹ Duyên, ThS. Nguyễn
Hoàng Minh, DS. Đào Trần Mộng, ThS. Hà QuangThanh, Nguyễn Mai Trúc Tiên đã
giúp đỡ và động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại Trung tâm Sâm và Dược
liệu Tp. Hồ Chí Minh.
Em xin gửi lời cảm ơn Khoa xét nghiệm - Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic
Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một phần kinh phí trong quá trình nghiên cứu, phần xét
nghiệm chức năng thận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Tây Đô đã
truyền đạt kiến thức và kĩ năng, để em có đủ khả năng vận dụng kiến thức của mình.
Con xin gửi lời cảm ơn đến Cha, mẹ và gia đình đã ln ủng hộ, động viên,
tạo mọi điều kiện, là chỗ tựa vững chắc để tơi hồn thành luận văn này.
Lời cuối cùng, em xin kính chúc q thầy cơ, các anh chị và các bạn luôn dồi
dào sức khỏe, nhiều niềm vui và đạt nhiều thành công hơn nữa.
Em xin chân thành cảm ơn!
II
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các cơng trình
khác. Nếu khơng đúng như đã nêu trên, tơi xin chịu hồn tồn chịu trách nhiệm
về đề tài của mình.
Người cam đoan
NGUYỄN NGỌC PHỤNG
III
TÓM TẮT TIẾNG VIỆT
Cisplatin là một thuốc được sử dụng hiệu quả trong hóa trị liệu nhiều loại bệnh
ung thư. Tuy nhiên, độc tính trên thận là một trong những tác dụng phụ làm hạn chế
việc sử dụng cisplatin với chuyển biến từ tổn thương thận cấp đến tổn thương thận
mạn. Sử dụng cisplatin trong xây dựng mơ hình gây tổn thương thận cấp trên chuột
nhắt trắng là lựa chọn phù hợp do tính đơn giản và có nhiều điểm tương đồng với độc
tính trên thận do cisplatin gây ra ở bệnh nhân ung thư. Nghiên cứu được thực hiện
với mục tiêu khảo sát một mơ hình thực nghiệm gây tổn thương thận cấp bằng
cisplatin nhằm ứng dụng trong sàng lọc ứng viên có tác dụng bảo vệ thận từ dược
liệu. Đề tài đã chọn được liều và thời gian phù hợp cho mơ hình sàng lọc thuốc có tác
dụng bảo vệ thận trước độc tính của cisplatin là chuột nhắt trắng được tiêm phúc mô
cisplatin liều 15 mg/kg và sau 72 giờ ghi nhận có sự tăng nồng độ creatinin, BUN
(blood ure nitrogen) trong huyết tương và tăng hàm lượng MDA (malondialdehyd,
một marker của tổn thương oxy hóa tế bào) trong dịch đồng thể thận. Quercetin, một
flavonoid phổ biến trong thực vật được sử dụng làm hợp chất thiên nhiên thử nghiệm,
ở liều uống 30 mg/kg và 50 mg/kg đều làm giảm nồng độ creatinin, BUN trong huyết
tương và hàm lượng MDA trong thận, thể hiện tác dụng bảo vệ thận trước tổn thương
gây ra bởi cisplatin. Bột chiết từ thân rễ sâm Việt Nam (panax vietnamensis Ha et
Grushv.), một dược liệu đặc hữu của Việt Nam được sử dụng làm dược liệu thử
nghiệm, ở liều uống 100 mg/kg và 200 mg/kg đều làm giảm nồng độ creatinin, BUN
trong huyết tương và hàm lượng MDA trong thận. Những nghiên cứu tiếp tục trên
thực nghiệm cần được thực hiện để góp phần sàng lọc các hợp chất hay dược liệu
tiềm năng trong việc giảm tác dụng phụ trên thận của cisplatin trong điều trị bệnh ung
thư.
Từ khóa: Mơ hình thực nghiệm gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin, Quercetin,
Sâm Việt Nam
IV
TÓM TẮT TIẾNG ANH
Cisplatin is a widely used and highly effective cancer chemotherapeutic agent.
One of the limiting cisplatin use is nephrotoxicity, its side effect causes the AKI
(Acute kidney injury) to CKD (Chronic kidney disease) transition. Cisplatin rodent
model is a well appreciated and widely used model due to its simplicity and it has
many similarities to human cisplatin nephrotoxicity. The present study aims to set up
a mouse model of acute kidney injury induced by cisplatin in order to select medicinal
candidates for the renoprotective effects. The issue determined the appropriate
dosage and time, which is established for protective screening models of cisplatin
kidneys. The mice were injected intraperitoneal with 15 mg/kg after 72 hours, which
resulted in a significant increase in plasma concentrations of creatinine, BUN (blood
ure nitrogen), and renal MDA (malondialdehyde) levels. Quercetin, one of the
important bioflavonoids found mostly in plants was used as a natural compound
reference. Quercetin at the oral doses of 30 mg/kg and 50 mg/kg ameliorated plasma
creatinine, BUN and renal MDA levels in cisplatin-subjected mice. Vietnamese
ginseng (panax vietnamensis Ha et Grushv.), an endemic Vietnamese medicinal plant
was used as herbal reference. Treatment of powdered ethanol extract from processed
Vietnamese ginseng at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg decreased plasma
creatinine, BUN, and renal MDA levels in cisplatin-subjected mice, suggesting the
reno-protective effect of quercetin on cisplatin-induced nephrotoxicity. Further
experimental and clinical investigations are required to contribute to the inspection
of potential compounds or medicinal products in reducing renal side effects of
cisplatin in cancer treatment.
Keywords: Cisplatin-induced nephrotoxicity, Quercetin, Vietnamese ginseng
V
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ I
TÓM TẮT TIẾNG VIỆT ....................................................................................... II
TÓM TẮT TIẾNG ANH ....................................................................................... IV
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... II
MỤC LỤC .................................................................................................................V
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ VIII
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... IX
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................X
DANH MỤC VIẾT TẮT ....................................................................................... XI
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ THẬN ....................................................................................3
1.1.1. Sinh lý thận .......................................................................................................3
1.1.2. Tổn thương thận ................................................................................................4
1.2. TỔNG QUAN VỀ CISPLATIN ..........................................................................9
1.2.1. Giới thiệu về cisplatin (CP) ...............................................................................9
1.2.2. Cơ chế tác động kháng ung thư và cơ chế gây tổn thương của cisplatin .......10
1.3. MƠ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG THẬN .........................................................14
1.3.1. Mơ hình gây độc thận với vancomycin ...........................................................16
1.3.2. Mơ hình gây độc thận với gentamicin.............................................................16
1.3.3. Mơ hình gây độc thận với acetaminophen ......................................................16
1.3.4. Mơ hình gây độc thận với cisplatin .................................................................16
1.4. QUERCETIN .....................................................................................................18
1.4.1. Giới thiệu về quercetin ....................................................................................18
1.4.2. Tác dụng dược lý.............................................................................................18
1.4.3. Một số nghiên cứu về tác dụng bảo vệ thận của quercetin .............................19
1.5. SÂM VIỆT NAM ...............................................................................................19
1.5.1.Thực vật học .....................................................................................................19
1.5.2. Thành phần hoá học ........................................................................................20
1.5.3. Tác dụng dược lý của sâm Việt Nam ..............................................................20
1.5.4. Tóm tắt các nghiên cứu trên sâm Việt Nam chế biến .....................................22
1.5.5. Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận của các loài panax khác .................23
VI
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................24
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................24
2.1.1. Động vật thử nghiệm .......................................................................................24
2.1.2. Tác nhân gây mơ hình tổn thương thận ..........................................................24
2.1.3. Thuốc khảo sát đáp ứng với mơ hình tổn thương thận ...................................24
2.1.4. Thiết bị và hóa chất trong nghiên cứu .............................................................25
2.2.2. Khảo sát mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin trên chuột nhắt trắng
.................................................................................................................................26
2.2.3. Khảo sát tác dụng của quercetin trên mơ hình gây tổn thương thận bằng
cisplatin ...................................................................................................................28
2.2.4 Khảo sát tác dụng của bột chiết sâm Việt Nam trên mơ hình gây tổn thương
thận bằng cisplatin ..................................................................................................29
2.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHỈ SỐ SINH HOÁ ..................................29
2.3.1. Định lượng creatinin trong huyết tương..........................................................29
2.3.2. Định lượng nồng độ blood ure nitrogen (BUN) ..............................................30
2.3.3. Phương pháp định lượng malondialdehyd (MDA) trong dịch đồng thể thận
chuột ........................................................................................................................31
2.3.4. Phương pháp quan sát đại thể và vi phẫu tiêu bản tế bào thận .......................32
2.4. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ......................................................................................32
2.5. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU .................................................................32
2.6. XỬ LÝ CHẤT THẢI Y TẾ ...............................................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .........................................................................................34
3.1. KHẢO SÁT MƠ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG THẬN CẤP BẰNG CISPLATIN
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG ............................................................................34
3.2. KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG CỦA MƠ HÌNH VỚI THUỐC THỬ NGHIỆM .......38
3.2.1 Khảo sát tác dụng bảo vệ thận của quercetin trong mô hình tổn thương thận cấp
trên chuột nhắt trắng ...............................................................................................38
3.2.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ thận của bột chiết sâm Việt Nam trong mơ hình tổn
thương thận cấp trên chuột nhắt trắng .......................................................................45
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................52
4.1. TỔN THƯƠNG THẬN GÂY BỞI CISPLATIN ..............................................52
4.2. TÁC DỤNG BẢO VỆ THẬN CỦA QUERCETIN ..........................................55
4.3. TÁC DỤNG BẢO VỆ THẬN CỦA SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN ................56
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................60
5.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................60
5.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................................60
VII
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC ................................................................................................................... I
VIII
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Phân loại tổn thương thận cấp theo KDIGO 2012 ......................................5
Bảng 1.2. Phân độ suy thận cấp theo RIFLE (Rifle Risk Injury Failure Loss Endstage) [43]....................................................................................................................6
Bảng 1.3. Đánh giá mức độ suy thận dựa vào nồng độ creatinin ..............................9
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu trên mơ hình in vivo gây độc thận. ............................15
Bảng 1.5. Tóm tắt những tác dụng dược lý của rễ và thân rễ sâm Việt Nam ...........21
Bảng 2.1. Quy trình định lượng creatinin .................................................................30
Bảng 2.2. Qui trình định lượng BUN ........................................................................31
Bảng 3.1. Phân suất tử vong trong mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin
trên chuột nhắt trắng..................................................................................................34
Bảng 3.2. Nồng độ creatinin trong huyết tương và hàm lượng MDA trong dịch đồng
thể thận trong mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin trên chuột nhắt trắng
...................................................................................................................................35
Bảng 3.3. Nồng độ BUN trong mơ hình tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15
mg/kg trên chuột nhắt trắng ......................................................................................36
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát mô học thận mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng
cisplatin liều 15 mg/kg trên chuột nhắt trắng ............................................................37
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tác dụng của quercetin trên nồng độ creatinin trong mơ
hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15 mg/kg trên chuột nhắt trắng ...38
Biểu đồ. 3.3. Kết quả định lượng creatinin (mg/dl) khi khảo sát tác dụng của
quercetin trên tổn thương thận cấp gây bởi cisplatin ................................................39
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tác dụng của quercetin trên nồng độ BUN trong mô ....40
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tác dụng của quercetin trên hàm lượng MDA trong mơ
hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15 mg/kg trên chuột nhắt trắng ...42
Bảng 3.8. Phân tích mơ học thận và tác dụng của quercetin trong mơ hình gây tổn
thương thận cấp bằng cisplatin..................................................................................43
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tác dụng của bột chiết sâm Việt Nam trên nồng độ
creatinin trong mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15 mg/kg trên
chuột nhắt trắng. ........................................................................................................45
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tác dụng của quercetin trên nồng độ BUN trong mơ
hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15 mg/kg trên chuột nhắt trắng ...47
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tác dụng của bột chiết sâm Việt Nam trên hàm lượng
MDA trong mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin liều 15 mg/kg trên
chuột nhắt trắng .........................................................................................................48
Bảng 3.12. Phân tích mơ học thận và tác dụng của bột chiết sâm Việt Nam trong mơ
hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin ............................................................50
IX
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Nồng độ creatinin trong huyết tương trong mơ hình gây tổn thương
thận cấp bằng cisplatin trên chuột nhắt trắng ............................................................36
Biểu đồ 3.2. Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể thận trong mơ hình gây tổn
thương thận cấp bằng cisplatin trên chuột nhắt trắng. ..............................................36
Biểu đồ 3.4. Kết quả định lượng nồng độ BUN trong huyết tương thận cấp chuột
khi khảo sát tác dụng của quercetin trên tổn thương thận cấp gây bởi cisplatin ......41
Biểu đồ 3.5 Tác dụng quercetin trên hàm lượng MDA trong thận chuột trong mơ
hình tổn thượng thận cấp bằng cisplatin. ..................................................................42
Biểu đồ 3.6. Kết quả định lượng creatinin (mg/dl) khi khảo sát tác dụng của bột
chiết sâm Việt Nam trên tổn thương thận cấp gây bởi cisplatin ...............................46
Biểu đồ 3.7. Kết quả định lượng nồng độ BUN trong thận cấp chuột khi khảo sát tác
dụng của bột chiết sâm Việt Nam trên tổn thương thận cấp gây bởi cisplatin .........47
Biểu đồ 3.8. Tác dụng bột chiết sâm Việt Nam trên hàm lượng MDA trong thận
chuột trong mơ hình tổn thượng thận cấp bằng cisplatin. .........................................49
X
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ lát cắt dọc của thận (a), tháp thận gồm các nephron (b) và nephron
(c) [91] .........................................................................................................................4
Hình 1.2. Cơng thức của cisplatin .............................................................................10
Hình 1.3. Cơ chế gây độc thận của cisplatin [71]. ....................................................11
Hình 1.4. Sơ đồ tổng quan sinh lý bệnh về nhiễm độc thận do cisplatin [63] ..........12
Hình 1.5. Các chất trung gian gây tổn thương thận [70]...........................................14
Hình 1.6. Cấu trúc quercetin [81]..............................................................................18
Hình.1.7. Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) [11] ........................19
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu trong mơ hình tổn thương thận cấp ..............................27
Hình 2.2. Phương trình tạo phức giữa MDA và thuốc thử TBA ..............................31
(nhuộm H&E, x10, n = 3) .........................................................................................37
(nhuộm H&E, x10, n = 3) .........................................................................................38
Hình 3.4. Vi phẫu thận chuột lô chứng sinh lý (nhuộm H&E, x10, n = 3) ...............44
Hình 3.5. Vi phẫu thận chuột lơ chứng bệnh lý (nhuộm H&E, x10, n = 3)..............44
(nhuộm H&E, x10, n = 3) .........................................................................................44
(nhuộm H&E, x10, n = 3) .........................................................................................44
Hình 3.8. Vi phẫu thận chuột lô tiêm cisplatin, uống quercetin 50 mg/kg ...............45
Hình 3.9. Vi phẫu thận chuột lơ chứng sinh lý (nhuộm H&E, x10, n = 3) ...............50
Hình 3.10. Vi phẫu thận chuột lô chứng bệnh lý (nhuộm H&E, x10, n = 3) ............51
Hình 3.11. Vi phẫu thận chuột lơ tiêm cisplatin, uống bột chiết sâm Việt Nam 100
mg/kg (nhuộm H&E, x10, n = 3) ..............................................................................51
Hình 3.12. Vi phẫu thận chuột lô tiêm cisplatin, uống bột chiết sâm Việt Nam 200
mg/kg (nhuộm H&E, x10, n = 3) ..............................................................................51
XI
DANH MỤC VIẾT TẮT
VIẾT TẮT
ADQI
TIẾNG ANH
TIẾNG VIỆT
The Acute Dialysis Quality
Hội đồng hoạch định chất
Initiative
lượng lọc máu cấp
AKD
Acute Kidney Disease
AKI
Acute kidney Injury
ARDS
Acute Respiratory Distress
Syndrome
Bệnh thận
Tổn thương thận cấp
Hội chứng suy hô hấp cấp
Bệnh lý
BL
BMDMs
Bone Marrow – Derived
Macrophages
Đại thực bào có nguồn
gốc từ tuỷ xương chuột
BUN
Blood urea nitrogen
Nitơ ure máu
Bộ Tài nguyên và Môi
BTNMT
trường
Bộ Y tế
BYT
CKD
Chronic Kidney Disease
Bệnh thận mạn
COX-2
Cyclooxygenase -2
CP
Cisplatin
Cisplatin
CRRT
Continuous Renal
Replacement Therapy
Trị liệu thay thế thận liên
tục
DAMPs
Damage associated molecular
pattern
Các mẫu phân tử liên quan
đến tổn thương
DMF
Dimethylformamide
XII
DNA
Deoxyribonucleic acid
Acid deoxyribonucleic
(ADN)
Dòng tế bào khối u vú để
tạo ra mơ hình ung thư vú
trên chuột
EMT6
FDA
Food and Drug
Administration
Cơ quan quản lý thực
phẩm và dược phẩm của
Mỹ
Chất ức chế miễn dịch
FK506
G6PD
GFR
GGT
Tacrolimus
Glucose-6-phosphat
Enzyme nội bào xúc tác
dehydrogenase
cho các phản ứng hóa học.
Glomerular Filtration Rate
Tốc độ lọc cầu thận
Gamma Glutamyl
Transpeptidase
GSH
Glutathione
HMG-CoA
3 - Hydroxy - 3 methylglutaryl coenzyme
HPLC
IARC
macrolide được phân lập
từ nấm Streptomyces
tsukubaensis
sodium salt A
High performance liquid
chromatography
International Agency for
Research on Cancer
Chất chống oxy hóa nội
sinh glutathion
Phương pháp sắc kí lớp
mỏng hiệu năng cao
Cơ quan nghiên cứu ung
thư quốc tế
ICAM-1
Intercellular Adhesion
Molecule 1
Phân tử kết dính gian bào
IL - 1
Interleukine-1
Cytokine interleukin-1
XIII
IL - 6
Interleukine-6
Cytokine interleukin-6
IL- 10
Interleukine-10
Cytokine interleukin-10
i.p.
Intraperitoneal
Tiêm phúc mô
JNK
c-Jun N-terminal Kinase
Con đường truyền tín hiệu
JNK
KDIGO
Kidney Disease: Improving
Global Outcomes
Hội đồng cải thiện kết quả
toàn cầu về bệnh thận
LLC-PK1
LLC-PK1
Tế bào thận lợn
M-R2
Majonoside – R2
Majonosid– R2
MAPK
Mitogen-activated protein
kinase
Protein hoạt hóa phân bào
MDA
Malondialdehyde
Malondialdehyd
MPO
Myeloperoxidase
Enzym myeloperoxidase
NADPH
β - Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate
tetrasodium
β - Nicotinamid adenin
dinucleotid phosphat
tetrasodium
NFκB
Nuclear factor kappa B
Tín hiệu tiền viêm
NO
Nitric oxide
Nitric oxid
OCT2
Organic cation transporter 2
Chất vận chuyển Cation
hữu cơ 2
OVA
Ovalbumin
PPD
Protopanaxadiol-type saponin
P21
Tuner protein p21
Gen ức chế kinase phụ
thuộc vào cyclin
P53
Tuner protein p53
Gen ức chế khối u p53
XIV
Q
Quercetin
QĐ
RAA
RNA
RIFLE
Quyết định
Renin - Angiotensin II Aldosteron
Ribonucleic Acid
Hệ thống Renin Angiotensin II Aldosteron
Acid ribonucleic
Risk, Injury, Failure, Loss, En
d-stage kidney disease
ROS
Reactive Oxygen Species
Các gốc oxy hoạt động
SOD
Superoxide dismutase
Superoxid dismutase
RRT
Renal Replacement Therapy
Liệu pháp thay thế thận
S.C.
Subcutaneously
Tiêm dưới da
sCr
Serum Creatinine
Nồng độ creatinin trong
huyết thanh
STD
Standard
Dung dịch chuẩn
Toll – like receptor 4
Protein ở người được mã
hoá bởi gen TLR4
(Thụ thể TLR4)
TLR4
TGF-β1
TNF- α
Transforming Growth Factor
beta 1
Tumor Necrosis Factor
Yếu tố hoại tử khối u
alpha
Thông thư liên tịch
TTLT
WHO
Yếu tố tăng trưởng biến
đổi beta 1
World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các nghiên cứu dược lý thực nghiệm trên động vật (dược lý tiền lâm sàng) là
bước quan trọng và cần thiết để làm tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng. Nhiều mơ
hình động vật thực nghiệm đã được nghiên cứu để xác định được cơ chế gây bệnh và
ứng dụng trong sàng lọc, thử nghiệm các thuốc mới trong điều trị. Dẫu biết động vật
chưa hẳn là mơ hình hồn hảo của con người vì mọi lồi ln có sự khác biệt nhưng
lồi gặm nhấm, đặc biệt được đánh giá cao vì chúng gần giống khoảng 80 phần trăm
gen của người. Năm 1980 các nhà nghiên cứu bắt đầu tạo ra các mơ hình chuột mắc
bệnh ở người như Alzheimer, bệnh tim và xơ nang… Năm 1999, Hass và cộng sự đã
chứng minh trên lâm sàng cisplatin điều trị hiệu quả các bệnh ung thư [31].
Thận là một cơ quan đóng vai trị quan trọng có chức năng lọc máu, duy trì
cân bằng hóa học, bài tiết chất thải, duy trì cân bằng nước và điện giải trong cơ thể.
Tổn thương thận cấp không những dẫn đến các rối loạn chức năng của các cơ quan
như phổi, não, gan, tim và các cơ quan khác trong cơ thể mà còn ảnh hưởng đến các
phác đồ điều trị, gây giảm hiệu quả điều trị [76]. Thuốc khi vào cơ thể đa số được
chuyển hóa ở gan và thải trừ qua thận. Rất nhiều loại thuốc gây ảnh hưởng đến thận
theo cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Các kháng sinh nhóm aminoglycosid (neomycin,
gentamycin) là nguyên nhân gây tăng nồng độ creatinin máu; các cephalosporin thế
hệ 1 (cefadroxyl, cefalexin) gây nhiễm độc ống thận; các NSAID ức chế việc sản xuất
prostaglandin, làm giảm lưu lượng máu đến thận, giảm độ lọc cầu thận dẫn đến suy
thận.
Tổn thương thận khi hóa trị là một trong những tác dụng phụ ảnh hưởng lớn
đến quá trình điều trị ung thư. Hiện nay, bệnh ung thư là một trong những bệnh có tỉ
lệ gây tử vong cao, theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế
(International Agency for Research on Cancer – IARC), năm 2018 trên tồn thế giới
có 18,08 triệu ca ung thư mới mắc và có trên 9,5 triệu ca tử vong vì bệnh ung thư và
Việt Nam ước tính có 164,671 nghìn ca mới mắc, có trên 114,871 nghìn ca tử vong
chiếm 12% trong tổng dân số [30]. Cisplatin là một loại thuốc điều trị ung thư có
chứa platinum được chỉ định trong phác đồ hóa trị bệnh ung thư phổi, ung thư tinh
hoàn, ung thư buồng trứng, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư bàng quang, đầu
cổ. Việc điều trị bằng cisplatin trên lâm sàng đã được sử dụng từ lâu và chứng minh
đạt hiệu quả nhưng khi được sử dụng với liều cao hoặc kéo dài gây ra nhiều tác dụng
phụ nghiêm trọng như suy giảm miễn dịch, suy giảm thính lực, thị lực, gây độc tính
trên tủy xương, trên tế bào thần kinh và gây tổn thương thận. Tổn thương thận bắt
đầu vài ngày sau khi điều trị bằng cisplatin gây nên tình trạng nhiễm độc thận với sự
2
gia tăng nồng độ creatinin, nitơ ure máu (BUN), các gốc tự do và làm suy giảm các
chất chống oxy hóa trong các tế bào thận gây tổn thương oxy hóa thận [72].
Việc mơ phỏng mơ hình gây tổn thương thận bằng cisplatin trên chuột nhắt
trắng được lựa chọn do tính đơn giản và có nhiều điểm tương đồng với độc tính trên
thận của cisplatin gây ra ở người. Với mong muốn ứng dụng mơ hình thực nghiệm
gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin trong sàng lọc thuốc mới từ tự nhiên có tác
dụng bảo vệ thận, đề tài “Khảo sát mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin ở
chuột nhắt trắng” cần thiết được thực hiện với các mục tiêu như sau:
- Khảo sát mơ hình gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin trên chuột nhắt trắng
đực chủng Swiss albino.
-
Khảo sát đáp ứng của mơ hình với thuốc thử nghiệm là hợp chất quercetin và
bột chiết sâm Việt Nam.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ THẬN
1.1.1. Sinh lý thận
Hai quả thận nằm ở hai bên cột sống, ở vùng hạ sườn (vùng bụng ngay phía
dưới xương sườn), phía trước là các quai ruột. Hai quả thận có hình hạt đậu, trọng
lượng 113 – 170 gram mỗi quả [90].
Chức năng chính của thận [90]
- Chức năng ngoại tiết: Thận có tác dụng duy trì cân bằng giữa nhập - bài xuất
nước và các chất điện giải; Thải trừ các sản phẩm chuyển hoá của nitơ (ure, creatinin
và acid uric) và các chất độc nội sinh (trong quá trình chuyển hố và bệnh lý) - ngoại
sinh như các thuốc và một số chất gây độc khác.
- Chức năng nội tiết: Renin được tiết ra từ tổ chức cạnh tiểu cầu thận giúp điều
hồ huyết áp thơng qua hệ Renin - Angiotensin II - Aldosteron (RAA). Thận giúp sản
xuất erythropoietin tại vỏ thận kích thích tuỷ xương tạo hồng cầu.
Thận cũng tham gia vào chuyển hoá vitamin D, sản xuất prostaglandin, argininvasopressin, kallikrein - kinin, chuyển hoá calci, parathyroid, calcitonin.
Chức năng sinh lý thận
các chức năng của thận, duy trì cân bằng acid - base, chuyển hóa calci và
phosphat hoặc hồng cầu, điều hòa các chất, điều hòa natri, kali và các chất điện giải,
giải phóng độc tố, hấp thu glucose, acid amin và các phân tử nhỏ, điều hòa huyết áp,
sản xuất các loại hormon khác nhau (erythropoietin và kích hoạt vitamin D).
Cấu trúc thận [90]
Mỗi quả thận của người được cấu tạo từ hơn một triệu đơn vị thận (nephron).
Đơn vị thận vừa là đơn vị cấu tạo vừa là đơn vị chức năng.
- Mỗi đơn vị thận gồm có cầu thận và ống thận.
* Cầu thận: Gồm quản cầu Malpighi và nang Bowman là một túi bọc quản
cầu, thành nang có nhiều lỗ nhỏ. Quản cầu Malpighi gồm khoảng 50 mao mạch xếp
song song thành khối hình cầu. Ngăn cách giữa nang và mao mạch là một màng lọc
mỏng để lọc các chất từ mao mạch sang nang.
* Ống thận: Gồm ống lượn gần, quai Henle và ống lượn xa. Dịch lọc từ nang
đổ vào ống lượn gần (uốn khúc), tiếp đến là quai Henle (một ống hình chữ U). Ở đầu
lên của quai Henle tiếp với ống lượn xa cũng là một ống uốn khúc. Từ ống lượn xa
dịch lọc đổ vào ống góp. Ống góp khơng thuộc đơn vị thận, nó nhận dịch lọc từ một
số đơn vị thận để đổ vào bể thận.
- Hệ mạch của thận
Động mạch thận tách ra từ động mạch chủ lưng chạy tới rốn thận. Vào trong
thận, động mạch này chia nhỏ nhiều lần đến mỗi đơn vị thận, gọi là động mạch nhỏ
4
đến (động mạch hướng tâm). Trong cầu thận, động mạch đến lại phân nhỏ thành mao
mạch tạo ra quản cầu Malpighi. Các mao mạch của quản cầu tập trung thành động
mạch đi (động mạch ly tâm). Động mạch đi lại phân nhỏ thành mạng lưới mao mạch
quanh ống lượn gần, quai Henle và ống lượn xa. Cuối cùng mao mạch từ ống lượn
xa tập trung đổ vào tĩnh mạch thận.
Hình 1.1. Sơ đồ lát cắt dọc của thận (a), tháp thận gồm các nephron (b) và nephron
(c) [91]
1.1.2. Tổn thương thận
Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các gốc oxy tự do (ROS - Reactive
Oxygen Spcecies) đóng vai trị quan trọng trong sự tiến triển của tổn thương thận.
ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trị quan trọng trong
kết nối tế bào và cân bằng nội môi [32]. Nồng độ cao của ROS vượt quá khả năng
trung hòa của hệ thống chống oxy hóa nội sinh dẫn đến tình trạng stress oxy hóa gây
hại cho các thành phần của tế bào như protein, lipid, DNA, làm hỏng các cấu trúc tế
bào. Lipid là một trong những mục tiêu chính của ROS. Peroxy hóa lipid tạo ra
aldehyd có tính oxy hố, bao gồm malondialdehyd (MDA), acrolein, 4hydroxynonenal, 4-oxononenal và isolevuglandin. Những aldehyd này sẽ phản ứng
với protein và DNA, làm thay đổi chức năng và gây ra sự đột biến di truyền. MDA
được xem như là một dấu hiệu sinh học chính của tổn thương lipid do stress oxy hóa
[19].
Các tổn thương oxy hóa gây ra bởi ROS là ngun nhân chính gây suy giảm
chức năng dẫn đến sự lão hóa [32],[57]. Stress oxy hóa gây ra bởi sự thay đổi cân
bằng nội mơi oxy hóa khử trực tiếp gây tổn thương nhu mô thận, làm tăng sự rối loạn
5
chức năng và vi mạch máu của thận dẫn đến suy giảm chức năng thận, viêm và gây
ra sự chết tế bào (apoptosis) [52], [62]. MDA một hợp chất cuối cùng của q trình
peroxy hóa lipid, thường được sử dụng như một chỉ số đánh giá stress oxy hóa và một
số chỉ số lâm sàng đánh giá tổn thương thận như nồng độ creatinin trong huyết thanh,
nitơ ure máu (BUN), tốc độ lọc cầu thận và độ thanh thải creatinin [29], [81].
Theo KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcomes: Hội đồng cải
thiện kết quả toàn cầu về bệnh thận) 2012 phân loại tổn thương thận thành 3 nhóm
(Bảng 1.1) [64].
Bảng 1.1.Phân loại tổn thương thận cấp theo KDIGO 2012
Mức độ tổn thương
Tổn thương thận cấp
Acute Kidney Injury (AKI)
Bệnh thận mạn
Chronic Kidney Disease
(CKD)
Chỉ tiêu đánh giá
Thời gian diễn biến
Tăng creatinin huyết thanh
> 0,3 mg/dL trong 2 ngày
liên tiếp hoặc tăng 50% Không xác định
creatinin huyết thanh trong
7 ngày, hoặc thiểu niệu
GFR < 60 ml/ph/ 1,73 m² Tổn
trong 3 tháng
thương
thận
> 3 tháng
AKI hoặc GFR < 60 ml/ph/
Bệnh thận cấp
Acute Kidney Disease
(AKD)
1,73 trong < 2 tháng hoặc
Tổn thương
giảm GFR ≥ 35% hoặc
< 3 tháng
creatinin huyết thanh ≥ 50%
trong < 3 tháng
thận
a. Suy thận cấp
Suy thận cấp là tình trạng giảm chức năng thận đột ngột và kéo dài trong vài
giờ hoặc vài ngày, dẫn đến giảm mức lọc cầu thận, ứ đọng các sản phẩm chuyển hoá
nitơ (ure, creatinin) và các sản phẩm của q trình chuyển hố khơng nitơ (điện giải,
kiềm toan…). Các rối loạn này phụ thuộc vào độ nặng và thời gian kéo dài của tình
trạng suy thận mà có các biểu hiện như toan chuyển hoá, tăng kali máu, thừa dịch
trong cơ thể. Suy thận cấp nặng cùng với nguyên nhân của nó có thể dẫn tới suy đa
cơ quan như rối loạn đông máu, tổn thương phổi (ARDS), tổn thương não, ảnh hưởng
huyết động [8].
Phân độ RIFLE biểu hiện các giai đoạn khác nhau của rối loạn chức năng thận
như: R (Risk) nguy cơ suy thận, I (Injury) tổn thương thận cấp, F (Failure) suy thận
cấp, L (Loss) mất chức năng thận hoàn toàn và E (End) suy thận giai đoạn cuối. Qua
6
phân loại RIFLE giúp quá trình theo dõi bệnh nhân có thể thuận lợi hơn trong việc
chẩn đốn suy thận ở giai đoạn nguy cơ (suy thận sớm) khi chỉ số creatinin huyết
thanh gấp 1,5 lần bình thường hoặc thể tích nước tiểu ít hơn 0,5 ml/kg/giờ và kéo dài
trong 6 giờ để có những xử trí kịp thời tránh cho bệnh tiến triển thành những giai
đoạn tiếp theo. Hiện nay phân độ RIFLE được chọn làm tiêu chuẩn sử dụng phổ biến
trong lâm sàng và các nghiên cứu [61], [69], [88].
Bảng 1.2. Phân độ suy thận cấp theo RIFLE (Rifle Risk Injury Failure Loss Endstage) [43]
Phân độ RIFLE
Tiêu chuẩn Creatinin, GFR
(mức lọc cầu thận)
Tiêu chuẩn về nước tiểu
R – rish
Tăng creatinin huyết thanh x
Nguy cơ
1,5 lần hoặc giảm GFR > 25%
I – injury
Tổn thương
Tăng creatinin huyêt thanh x 2
lần hoặc giảm GFR > 50%
< 0,5 ml/kg/giờ trong 12 giờ
F - failure
Suy
Tăng creatinin huyết thanh x 3
lần hoặc giảm GFR > 75%
< 0,3 ml/kg/giờ trong 12 giờ
hoặc vô niệu trong 12 giờ
< 0,5 ml/kg/giờ trong 6 giờ
L – loss
Mất
Mất chức năng thận hoàn toàn trong > 4 tuần
E – endstade
kidney injury:
Giai đoạn cuối
Cần RRT trong > 3 tháng
(Suy thận giai đoạn cuối > 3 tháng)
Renal Replacement Therapy (RRT): Liệu pháp thay thế thận
Nguyên nhân: [88]
Suy thận cấp trước thận: Giảm tưới máu thận (60-70%).
+ Giảm thể tích máu lưu thơng: Mất máu, mất nước, dùng lợi tiểu.
+ Giảm cung lượng tim: Suy tim, rối loạn nhịp tim, chèn ép tim, hạ huyết áp.
+ Tái phân bố dịch trong cơ thể: Phỏng, viêm tụy cấp, hội chứng thận hư.
+ Giãn mạch ngoại vi: Nhiễm trùng, choáng phản vệ, thuốc gây mê.
Suy thận cấp tại thận: Giảm tưới máu thận (20% - 40%)
+ Bệnh cầu thận: Viêm cầu thận.
+ Bệnh mạch máu thận.
+ Bệnh ống thận, mô kẽ;
+ 74% hoại tử ống thận cấp do thiếu máu tưới thận.
7
Suy thận cấp sau thận: Giảm tưới máu thận (5% - 10%)
+ Phì đại tiền liệt tuyến.
+ U, sỏi cổ bàng quang – niệu đạo.
+ Tắc nghẽn niệu quản 2 bên do sỏi, u tử cung xâm lấn, xơ hóa sau phúc mạc.
Tiêu chuẩn chẩn đoán
ADQI (Acute Dialysis Quality Intiative) 2004 đề nghị dùng tiêu chuẩn RIFLE
trong chẩn đoán tổn thương thận cấp gồm 2 yếu tố GFR và thể tích nước tiểu (theo
bảng 1.2.).
b. Suy thận mạn
Suy thận mạn là hậu quả cuối cùng của các bệnh thận, tiết niệu mạn tính làm
chức năng thận giảm dần dần tương ứng với số lượng nephron của thận bị tổn thương
dẫn đến xơ hóa và mất chức năng khơng hồi phục. Biểu hiện lâm sàng của suy thận
mạn là mức lọc cầu thận giảm dần không hồi phục, tăng nitơ phi protein máu, rối loạn
cân bằng nội môi, rối loạn các chức năng nội tiết của thận. Các triệu chứng trên nặng
dần tương ứng với giảm mức lọc cầu thận dẫn đến suy thận giai đoạn cuối, lúc này
hai thận mất chức năng hồn tồn, địi hỏi phải thay thận [5].
Ngun nhân dẫn đến suy thận mạn là các bệnh thận mạn tính, dù đó là bệnh
cầu thận, bệnh ống-kẽ thận, bệnh mạch máu thận, hay bệnh thận di truyền. Các bệnh
thận mạn tính dù nguyên phát hay thứ phát, đều có thể dẫn đến suy thận mạn [5].
Khác với suy thận cấp, suy thận mạn là suy thận khơng có khả năng hồi phục,
sớm hay muộn sẽ dẫn đến suy thận giai đoạn cuối. Tổn thương mô bệnh học của suy
thận mạn là xơ hóa các nephron khơng có khả năng hồi phục. Số lượng nephron bị
xơ hóa và bị loại khỏi vịng chức năng tăng dần trong q trình tiến triển của bệnh.
Mức độ nặng của suy thận mạn tương ứng với số lượng nephron của thận bị mất chức
năng không hồi phục.
Biểu hiện lâm sàng của suy thận mạn là mức lọc cầu thận giảm dần, tích lũy
nitơ phi protein trong máu và rối loạn nội môi nặng dần và rối loạn các chức năng nội
tiết của thận. Trong q trình tiến triển của suy thận mạn có những đợt tiến triển nặng,
làm thận mất chức năng nhanh hơn. Khi suy thận giai đoạn cuối, đòi hỏi phải điều trị
thay thế thận [5]. Một số biểu hiện lâm sàng như: Phù (mức độ nhẹ đến nặng, thiếu
máu mạn, mức độ nặng dần nếu không được điều trị, tăng huyết áp: Chiếm khoảng
80%), suy tim, viêm màng ngoài tim, ngứa, chuột rút, rối loạn tiêu hóa, xuất huyết:
có thể ngồi da, chân răng hoặc nội tạng, hơn mê [69], [82].
8
1.1.3. Các chỉ số chẩn đoán cận lâm sàng nhằm đánh giá chức năng thận
Trên lâm sàng, các xét nghiệm thực tế nhất nhằm đánh giá chức năng thận là
ước tính mức lọc cầu thận (GFR), kiểm tra albumin huyết thanh, protein toàn phần
trong huyết tương, protein niệu, BUN và creatinin [33], [83].
a. Độ lọc cầu thận (GFR)
Nhằm đo lường lượng máu được lọc bởi thận trong một khoảng thời gian kiểm
tra nhất định. Trường hợp cầu thận không thực hiện được đầy đủ chức năng lọc máu
sẽ dẫn đến sự suy giảm chức năng của thận. GFR bình thường cho một người đàn
ông trưởng thành là 90 đến 120 mL mỗi phút.
b. Albumin huyết thanh
Thông thường, chỉ số albumin huyết thanh là 35 – 50 g/L, chiếm 50 – 60%
protein toàn phần. Albumin giảm mạnh ở những người mắc bệnh lý cầu thận cấp như
viêm cầu thận cấp.
c. Protein toàn phần huyết tương
Là chỉ số phản ánh chức năng lọc của cầu thận. Chỉ số protein trong máu bình
thường ở mức 60 - 80 g/L. Người mắc bệnh thận thường bị giảm protein toàn phần
do màng lọc cầu thận bị tổn thương.
d. Protein niệu
Ở người khỏe mạnh là 0 – 0,2 g/lít/24 giờ. Ở người mắc bệnh thương tổn cầu
thận, viêm cầu thận cấp, suy thận, các bệnh lý tồn thân có ảnh hưởng tới thận (đái
tháo đường, lupus ban đỏ, tăng huyết áp),... thường bị tăng protein niệu lên trên 0,3
g/lít/24 giờ.
e. Creatinin
Chức năng thận được đánh giá chính xác hơn thơng qua độ lọc cầu thận ước
tính viết tắt là eGFR, được ước đoán dựa vào nồng độ creatinin máu. Creatinin là sản
phẩm của sự thối hóa creatin trong các cơ, được đào thải qua thận và là chỉ số phản
ánh chính xác chức năng của thận. Creatin đóng vai trị quan trọng cho việc sinh ra
nguồn năng lượng cho các cơ hoạt động, creatin bị thoái hóa trong các cơ sẽ tạo thành
creatinin và được lọc qua cầu thận. Vì vậy khi chức năng thận bị suy thì khả năng lọc
creatinin bị giảm dẫn tới nồng độ creatinin trong máu sẽ tăng cao hơn bình thường.
Chỉ số creatinin trong máu được dùng để đánh giá chức năng thận. Giá trị creatinin
bình thường đối với nam giới là 0,6 -1,2 mg/dl (53- 106 mmol/l) và nữ giới là 0,5 –
1,1 mg/dl (44- 97 mmol/l).
9
Bảng 1.3. Đánh giá mức độ suy thận dựa vào nồng độ creatinin
Mức creatinin (mmol/l)
Suy thận (theo độ)
< 130 mmol/l
Suy thận độ I
130- 299 mmol/l
Suy thận độ II
300- 499 mmol/l
Suy thận độ IIIa
500- 899 mmol/l
Suy thận độ III b
>900 mmol/l
Suy thận độ IV
f. Nồng độ urea nitrogen trong máu (BUN)
Xét nghiệm BUN đo lượng nitơ ure máu - một sản phẩm chuyển hoá của protein
trong máu giúp cung cấp các thông tin quan trọng trong các bệnh lý ở gan và thận.
Khi nồng độ của nitơ ure trong máu cao chính là dấu hiệu cảnh báo thận hoặc gan bị
tổn thương.
BUN tăng trên mức bình thường có thể gặp trong:
+ Suy tim sung huyết;
+ Tăng chuyển hoá protein (chẳng hạn như đói);
+ Tăng lượng protein hấp thu vào;
+ Chảy máu dạ dày-ruột;
+ Giảm thể tích (do phỏng, mất nước);
+ Nhồi máu cơ tim;
+ Bệnh thận (viêm vi cầu thận cấp, viêm đài bể thận cấp và hoại tử ống thận
cấp);
+ Suy thận;
+ Choáng (sốc);
+ Tắc nghẽn đường tiểu (do u, sỏi và phì đại tiền liệt tuyến).
BUN thấp hơn mức bình thường có thể gặp trong: Suy gan, ăn uống thiếu
protein, suy dinh dưỡng.
1.2. TỔNG QUAN VỀ CISPLATIN
1.2.1. Giới thiệu về cisplatin (CP)
Năm 1978, cisplatin là hợp chất chứa platinum đầu tiên được FDA phê duyệt
để chống lại bệnh ung thư [72]. Năm 1999, Hass và cộng sự đã chứng minh trên lâm
sàng cisplatin điều trị hiệu quả các bệnh ung thư [37].
