Bài giảng thí nghiệm vi sinh vật học (nguyễn thanh hòa)

15/11/2021

AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm vi sinh vật có thể là trải nghiệm lý thú và vui vẻ, tuy nhiên
các bạn cần phải chú ý những nguy cơ tiềm ẩn. Một số nội quy trong
phịng thí nghiệm các bạn phải chú ý như sau:
¢

¢
¢

THÍ NGHIỆM

¢

VI SINH VẬT HỌC

GV: Nguyễn Thanh Hồ

¢

¢
¢

1

Giữ gìn trật tự, vệ sinh của phịng. Bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối
khi cấy truyền vi sinh vật.
Tuyệt đối khơng ăn uống, hút thuốc trong phịng thí nghiệm.
Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây ra
quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân.

Không tự ý sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ của phịng thí nghiệm
khi chưa được phép và chưa được hướng dẫn.
Kết thúc thí nghiệm và bài thực hành, các dụng cụ, thiết bị, hoá chất
vừa sử dụng xong đều phải được vệ sinh theo đúng quy trình và xếp
vào nơi quy định.
Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ và theo đúng yêu cầu.
Khi rời phịng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khố cửa.

2

NHỮNG QUY ĐỊNH VỀ AN TỒN
¢

¢
¢

¢

¢

¢

¢
¢

3

BÀI 1:

Khi sử dụng hố chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng hoặc tuân theo

những hướng dẫn của kỹ thuật viên, cán bộ phịng thí nghiệm.
Sinh viên sử dụng áo blouse khi thực hiện thí nghiệm

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

Những hoá chất độc hại phải được xử lý riêng, tuân theo yêu cầu của
quản lý PTN
Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải được xử lý nhiệt (thanh trùng
121oC trong 30 phút) trước khi thải ra ngồi mơi trường.
Chất thải lỏng cần được phân loại (axit, bazơ, dung môi, dung dịch
có kim loại nặng) và chứa vào các thùng đựng chất thải riêng biệt.
Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hố chất) có tính chất độc hại phải
để trong tủ hút và xử lý theo lịch riêng của nhà trường.
Các dung môi độc hại, dễ bay hơi phải được tiến hành trong tủ hút.
Trước khi rời phịng thí nghiệm phải rửa sạch tay.

4

1


15/11/2021

I. KHÁI NIỆM
1.

CHUNG
Mục đích, ý nghĩa:
— Có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh vật.

— Được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên cứu

A. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật.

2.

Yêu cầu đối với mơi trường dinh dưỡng:
— Thành phần phải có :

- Các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ),
- Các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt,..),
một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor,
Molipden,..).
- Các yếu tố sinh trưởng:
— Phải cân đối về thành phần để đảm bảo các yêu cầu hóa lý như độ ẩm, độ
nhớt, áp suất thẩm thấu, pH thích hợp
— Phải đảm bảo tuyệt đối vơ trùng.
3.

5

6

II. PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG
1.

2.

1.

Mơi trường tự nhiên
Mơi trường tổng hợp
Mơi trường bán tổng hợp

Pha chế :
—
—
—

Theo mục đích sử dụng
—
—
—

3.

III. CÁCH LÀM MƠI TRƯỜNG

Theo thành phần
—
—
—

—

Mơi trường phổ dụng
Mơi trường riêng biệt
Mơi trường chuẩn đốn phân biệt

Cân đong, pha chế chính xác theo đơn.
Thử pH mơi trường.
Đóng miệng bình bằng nút bơng rồi bọc giấy để tránh bị
ướt lúc thanh trùng.
Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người
chuẩn bị.

2. Lọc : tách cặn bã, bụi bẩn bằng phương pháp

Theo tính chất lý học

¢

Mơi trường lỏng
Mơi trường đặc
Mơi trường xốp

¢

—
—
—

7

Cách gọi tên : theo tên tác giả hoặc theo nguồn thức ăn N và C

¢

Lọc qua bơng, vải màu, giấy lọc
Lọc bằng lịng trắng trứng
Dùng phễu lọc nóng

8

2


15/11/2021

III. CÁCH
3.

III. CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG

LÀM MÔI TRƯỜNG

4. Khử trùng môi trường : tất cả môi trường đều phải vô
trùng, tùy loại mơi trường, tùy u cầu thí nghiệm
mà chọn chế độ thanh trùng.
— Phương pháp Pasteur : đun nóng phân đoạn ở
nhiệt độ 60-75oC trong 15 đến 30 phút hay ở
80oC trong thời gian 10-15 phút
— Phương pháp Tinđan : thanh trùng ở nhiệt độ cao
liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần,
mỗi lần cách nhau 24 giờ
— Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa
áp suất.

Phân phối mơi trường
¢

¢
¢
¢

Mơi trường được phân phối vào bình cầu,
bình tam giác, ống nghiệm,.. sau thanh
trùng vào ống nghiệm hoặc hộp petri.
Thạch nghiêng khoảng 5ml
Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm
Hộp petri tráng đều dầy 3mm.

5.

9

Bảo quản và kiểm tra môi trường

10

B.

11

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

12

3


15/11/2021

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY
1. ĐỊNH
¢

¢

NGHĨA

a.

Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu
nghiên cứu vào mơi trường thức ăn với mục
đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt
trong đó và thu nhận các canh trường cần
thiết cho nghiên cứu.
Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh
trường vi sinh vật từ môi trường này sang
môi trường khác với mục đích nhận giống
và giữ giống.

Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: tiến hành
từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng).

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối.
Các dụng cụ cần thiết: que cấy nhọn hoặc

vòng, pipet, que trang,..

13

14

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY

b.

—
—
—
—

c.
d.

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY

Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng
Theo hình chữ chi
Theo hình vịng xoắn
Theo những đường song song
Theo một đường thẳng

Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng
Cấy trên thạch hộp
—
—

—
—

Hình chữ chi trên tồn mặt thạch
Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp
Theo các đường song song
Chấm điểm

Phương pháp cấy trên hộp thạch

15

16

4


15/11/2021

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY

e.

Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ
—
—

Dùng pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que

trang dàn đều giọt canh trường trên mặt thạch
Cấy bề sau
ü
ü

Giống – ống nghiệm – hộp thạch
Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường.

Phương pháp cấy trên thạch hộp

17

18

CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM

CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM

Hộp petri
(wikipedia.org)

Que cấy
Pipet
(raylab.co.nz)

Cốc đong
(clarelibrary.ie)

19

Chổi rửa

Giá đựng ống nghiệm

Cốc đong, ống nghiệm

Đèn cồn

20

5


15/11/2021

CÁC THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM

BÀI 2 :
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

21

22

I. CANH TRƯỜNG TẬP TRUNG
¢ Canh

trường tập trung : là canh trường trong đó
một lồi (có khi vài loài) vi sinh vật xác định
chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng.

A. PHÂN LẬP VI SINH VẬT

23

¢ Sử

dụng mơi trường chọn lọc hoặc là điều kiện
chọn lọc để phân lập canh trường tập trung
(môi trường hoặc điều kiện chỉ thích hợp cho
một lồi vi sinh vật nhất định, cịn các lồi khác
thì khơng thể hoặc khó phát triển)

24

6


15/11/2021

A.

PHƯƠNG PHÁP PHA LỖNG MƠI TRƯỜNG LỎNG

II. CANH TRƯỜNG THUẦN KHIẾT
Cách thực hiện :

¢ Canh

trường thuần khiết : là canh trường mà tất cả các

vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế bào ban đầu.
¢ Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện
từ canh trường tập trung.
¢ Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết :

1.Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã
vô khuẩn
2.Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên
cứu vào ống nghiệm thứ nhất
3.Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống
nghiệm thứ hai

v Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng

4.Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba,
bốn...

v Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc
v Phương pháp tách từng tế bào

5.Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ
chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên
cho canh trường thuần khiết.

Ví dụ : Pha lỗng Pasteur

25

B.

26

PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VSV
¢

Ngun tắc : tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên mơi trường
đặc
¢ Cách tiến hành :
¢

1.

2.
3.
4.

5.

27

Phương pháp tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cao
— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính protease cao
— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính amylase cao
— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cellulase cao

Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng trong các
ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô
trùng
Đem vật phẩm đã pha lỗng cấy trên mơi trường thạch hộp đã vơ

khuẩn
Ni ở điều kiện thích hợp
Sau 1 - 2 ngày, quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt,
dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền
lên ống thạch
Ni ở nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết.

— Tuyển chọn chủng VSV có khả năng chịu mặn
— Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VSV

28

7


15/11/2021

¢

¢

C . PHƯƠNG PHÁP TÁCH TỪNG TẾ BÀO
Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương
đối lớn (nấm men, bào tử nấm mốc)
Cách tiến hành : có 2 cách
1. Tách từng giọt chỉ chứa một
tế bào có kiểm tra bằng kính
hiển vi
2. Tách từng tế bào nhờ dụng
cụ vi thao tác

(micromanipulateur)

TÁCH TỪNG GIỌT CHỈ CHỨA MỘT TẾ BÀO CĨ
KIỂM TRA BẰNG KÍNH HIỂN VI
1. Pha loãng Pasteur ( đến mức mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai
tế bào vi sinh vật)
2. Dùng que cấy nhọn chấm từng giọt nhỏ canh trường đã pha
loãng lên lá kính vơ khuẩn. Chấm thành ba bốn hàng và các
giọt cách xa nhau vừa phải để dễ quan sát.
3. Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dưới rồi đặt lên
phiến kính lõm, bơi vazơlin quanh mép lá kính, giữ khơng cho
các giọt bị khơ
4. Quan sát dưới kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một
tế bào
5. Đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bơng hoặc giấy lọc tẩm
nước, đem ni ở nhiệt độ thích hợp

Micromanipulateur
(www.lavallab.com)

29

30

III. PHÂN LẬP VI SINH VẬT YẾM KHÍ
2. DÙNG HỘP PETRI LỘN NGƯỢC

III. Phân lập vi sinh vật yếm khí
1. Dùng pipet Pasteur

1. Pha lỗng rồi cho vào ống thạch như trên

1. Pha loãng vật phẩm nghiên cứu, lấy 1 giọt cho
vào ống thạch, lắc đều
2. Hút một ít mơi trường đã trộn vi sinh vật nói
trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín
đầu nhỏ của pipet
3. Nuôi trong tủ ấm 1 – 2 ngày
4. Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có
khuẩn lạc riêng biệt cho vào mơi trường ni
cấy thích hợp

31

2. Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy

nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng
paraphin bôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri
đã vô trùng và đặt lộn ngược trước).
3. Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách
thạch có khuẩn lạc đem cấy vào mơi trường
thích hợp

32

8


15/11/2021

I. ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP
¢

¢
¢

B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
¢

33

34

P HƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

PHƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU
¢

Định nghĩa: là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có
trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng
Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm như vậy ta đếm cả những tế bào
đã chết trước lúc làm tiêu bản.
Các phương pháp định lượng trực tiếp :
1.
Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu
2.
Phương pháp Brit
3.
Phương pháp Vinogratxki - Sungina

Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi
sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như
nấm men, bào tử nấm mốc

¢
¢

¢

¢

Buồng đếm hồng cầu
(Hemocytometer)
(wikipedia.org)

Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha lỗng canh trường
Dùng bơng tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá
kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng
trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu)
Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô
lớn chéo nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô
vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong
mỗi ơ.
a.1000.f
h.S
a là số tế bào trung bình có trong 1 ơ
f là hệ số pha lỗng của canh trường
h là bề sâu của lưới đếm

S là diện tích một ơ
1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm 3.

trong đó:
Ơ màu
Đỏ
Xanh lục
Vàng
Da trời

35

Kích cỡ
1 x 1 mm
0.25 x 0.25 mm
0.20 x 0.20 mm
0.05 x 0.05 mm

Diện tích
1 mm2
0.0625 mm2
0.04 mm2
0.0025 mm2

36

9


15/11/2021

PHƯƠNG PHÁP VINOGRATXKI - SUNGINA
PHƯƠNG PHÁP BRIT
¢ Phạm

vi sử dụng : dùng để định lượng vi sinh vật có
trong sữa hay một số vật phẩm lỏng.

¢ Cách
1)
2)

3)
4)

tiến hành:

Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng
khi quan sát.
Dùng micropipet đã vơ trùng lấy chính xác 0,01 ml vật
phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lên phiến kính sạch với
diện tích nhất định (2 - 4 cm2).
Để khơ, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.
Để khô và quan sát dưới kính hiển vi và đếm

37

¢
¢

Phạm vi sử dụng: dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn.
Cách tiến hành:

1) Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh
rồi chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và
để yên trong 1 - 2 giây.
2) Dùng micropipet đã vơ trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một
diện tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm 2).
3) Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, lỗng (0,1%). Lại để khơ và cố định bằng
cồn tuyệt đối trong 5 phút.
4) Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ. Trong quá trình nhuộm phải theo
dõi để thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi.
5) Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống
như phương pháp Brit.

38

II. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC PHÁT TRIỂN TRÊN
MƠI TRƯỜNG THẠCH

¢

Định nghĩa: là phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo cấy một lượng

¢

nhất định vật phẩm nghiên cứu lên mơi trường thức ăn thích hợp, ni trong 36 - 48 giờ,
sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.

¢
¢

Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn
Nhược điểm:
—

Tốn thời gian, cơng sức

—

Khi cấy từ các vật phẩm pha lỗng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc
chênh nhau 10 lần

—

Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng
đơi, từng khối thì khi phát triển trên mơi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành
một khuẩn lạc. Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật
có trong vật phẩm nghiên cứu.

—

39

Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong
hộp petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra
kết quả.

¢

Cách tiến hành:
1)
2)

3)
4)

Khơng có loại mơi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng
phát triển.

5)

Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng : pha loãng Pasteur ( tỷ lệ 1:10)
Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng
lỏng bằng cách: Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả
vào bình tam giác dung tích 250 ml đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng. Lắc
đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trên.
Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm
pha loãng cuối cùng lên hộp petri đã chứa sẵn mơi trường vơ trùng.
Ni ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.
Đọc kết quả

40

10


15/11/2021

ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG KHƠNG KHÍ
¢

¢

Ngun tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100
cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương
với lượng vi sinh vật có trong 10 lít khơng khí
Cách tiến hành:

B ÀI 3 :
KÍNH HIỂN VI.
CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT
SỐNG. QUAN SÁT NẤM MEN

1) Đặt hộp petri có mơi trường đặc đã vơ trùng ra chỗ khơng khí định

nghiên cứu.
2) Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp

và để vào tủ ấm.
3) Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc.
¢

Tính tốn: đo đường kính hộp petri để tính điện tích rồi suy ra lượng
vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m3 khơng khí theo ước tính của
Omelianxki.

41

42

Cấu tạo kính hiển vi
Cách sử dụng :
1. Dùng kính tụ quang điều chỉnh ánh sáng
2. Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng
cách giữa vật kính và khay kính.
3. Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa.
Đặt tiêu bản lên khay kính và mắt nhìn
bên ngồi, điều chỉnh tiêu bản để chọn
được vùng định quan sát.
4. Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt
dầu lên tiêu bản. Từ từ đưa vật kính lại
gần sát tiêu bản. Khơng làm nhanh q,
tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính
5. Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển
nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm
việc tương ứng, khi thấy ảnh của vật thì
dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều
chỉnh cho ảnh rõ nét.

A. KÍNH HIỂN VI

43

44

11

15/11/2021

CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
1. Bảo quản sau khi sử dụng kính
¢
¢

¢
¢

¢

Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ
Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bơng tẩm dung mơi hữu cơ như xilen hay toluen lau
nhẹ đầu vật kính cho thật sạch.
Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu

B. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT
VI SINH VẬT SỐNG

Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục. Xếp khăn lại, đặt lên khay kính
rồi hạ vật kính chạm sát khăn.
Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon. Chuyển kính vào tủ lớn có hệ
thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn.

2. Bảo quản thông thường và định kỳ
¢
¢
¢
¢

¢

Giữ kính sạch sẽ ở nơi khơ ráo
Trong thời gian khơng dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính.
Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông.
Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính.
Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay
cầm thân kính, một tay đỡ đế kính.

45

46

I. TIÊU BẢN GIỌT ÉP
1. Phạm vi sử dụng : cho phép quan sát hình dạng,
xác định kích thước của tế bào vi sinh vật
Hình 1:
Cách lấy giống vi sinh vật

2. Cách làm :

47

48

12


15/11/2021

II. TIÊU BẢN GIỌT TREO
III. TIÊU BẢN VẾT
1. Phạm vi sử dụng : dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào
trong khuẩn lạc vi sinh vật hoặc phổ biến hơn là để nghiên cứu hình thái của
chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn, nấm mốc.

2. Cách làm :
¢

¢

¢

Dùng dao mổ cắt lấy một khối nhỏ môi trường thạch có cấy vi sinh vật đã mọc
dày đặc hay mọc thành các khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính sao cho phía
có vi sinh vật nằm ở bên trên.
Lấy một lá kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vịng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ
lá kính xuống rồi rút que cấy hay kẹp sắt ra ngay và giữ đúng vị trí của lá
kính.
Đặt tiêu bản nhận được lên một phiến kính đã có nhỏ sẵn một giọt nước hay
một giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40, cho phần vết nằm ở phía
dưới, ta sẽ thu được tiêu bản "vết". Cũng có thể dùng ngay phiến kính ép nhẹ
lên bề mặt của khuẩn lạc hay bề mặt của đám vi sinh vật rồi lấy ra làm tiêu
bản "vết"

Phạm vi sử dụng: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học.

49

50

IV. NHUỘM

MÀU VI SINH VẬT SỐNG

1. Ngun tắc : sử dụng thuốc nhuộm khơng độc hoặc ít độc với vi sinh vật
và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và
hoạt động sau khi nhuộm màu.

2. Các loại thuốc nhuộm : xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công

C. QUAN SÁT NẤM MEN

gơ 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001%

3. Cách làm: có hai cách
¢

Cách 1
1. Nhỏ một giọt thuốc nhuộm (khơng q lớn) lên phiến kính
2. Lấy một giọt canh trường vi sinh vật, hòa đều với thuốc nhuộm.
3. Đậy lá kính lên và đem quan sát.

¢

Cách 2
1. Nhỏ một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính. Dùng que cấy dàn đều thành một
vùng nhỏ rồi để khô tự nhiên
2. Nhỏ một giọt canh trường vi sinh vật lên vùng màu đã khơ.

3. Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.

51

52

13


15/11/2021

1. Đặc điểm hình thái

1. Đ ẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
Nấm men có dạng :
— Hình cầu (Torulopsis utilis)

¢

—
—
—
—
—
—
—

(Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces ellipsoideus)
Hình trụ (Pichia),

Hình quả dưa chuột
(Saccharomyces pasteurianus)
Hình quả chanh yên (Kloekera)
Hình bình (Pityrosporum)
Hình 1 đầu nhọn(Brettanomyces)
Hình tam giác (Trigonopsis)
Một số hình dạng đặc biệt khác

Hình thái nấm men thay đổi trong quá trình phát triển :
— Nấm men trẻ (qua 12 - 16 giờ nuôi cấy) màng mỏng, căng, nguyên sinh chất

— Hình trứng hay hình bầu dục

đồng nhất, khơng bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản
chiếm tỷ lệ cao.
— Nấm men trưởng thành (24 -48 giờ ni cấy) kích thước vng, khơng bào
lớn, số khơng bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm
10 -15%.
— Nấm men đã già (nuôi cấy từ 72 giờ trở lên) màng dầy, nhăn, nguyên sinh
chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như
khơng sinh sản nữa, khơng có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn.

Torulopsis utilis
(ageless.co.za)
Pityrosporum ovale
(med.sc.edu)

¢

Saccharomyces

cerevisiae
(chemistrydaily.com)

Trong một số điều kiện môi trường mà một số nấm men có tế bào
hình dài xếp nối nhau thành những đạng sợi gọi là khuẩn ty
(mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium).

Pichia farinosa
(anathenature.com)

53

54

2. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ

3. ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP

1)Dinh dưỡng: dị dưỡng cacbon, sống hoại sinh hoặc ký sinh.
2)Hô hấp: nấm men hô hấp tuỳ tiện
3)Sinh sản: sinh sản theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vô tính và sinh sản hữu tính

¢

nhờ kết hợp bào tử trái dấu.

¢

4)Khả năng tạo bào tử:
¢

Chỉ là một số nấm men và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định mới có khả
năng hình thành bào tử.
— Nang bào tử hình thành trong các canh trường nghèo chất dinh dưỡng, nhất là
nguồn cacbon.

—

—

¢

Nang bào tử thường chứa 1- 2 hoặc 4 bào tử. Một số ít loại có tới 8 bào tử.

Đóng vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa vật chất trong tự
nhiên, vơ cơ hóa các chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường
sinh thái.
Sản xuất các dung môi hữu cơ ( sử dụng nấm men để nấu rượu, nấu
bia, sản xuất cồn, glyxerin... )
Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein,
vitamin, axit amin …
Nấm men cũng được làm nở bột mỳ, gây hương nước chấm, sản
xuất một số dược phẩm... và gần đây còn được nghiên cứu sử dụng
để sản xuất cả lipit.

5)Khả năng chuyển động: Nấm men không chuyển động

55

56

14


15/11/2021

II.C ÁC CHỈ TIÊU ĐỂ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG
CANH TRƯỜNG NẤM MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH
¢

1. ĐỘ THUẦN KHIẾT

Người ta dựa trên 5 chỉ tiêu để đánh giá chất lượng
canh trường nấm men :
1.
2.

Độ thuần khiết
Tỷ lệ tế bào sống trên tổng số tế bào

3.
4.

Tỷ lệ tế bào nảy chồi trên tổng số tế bào
Số lượng tế bào trong 1 ml canh trường

5.

Chỉ tiêu công nghệ

57

Làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi
Nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có cùng đặc
tính hình thái thì có thể sơ bộ kết luận độ sạch của canh
trường
¢ Nếu không, đếm số tế bào lạ trong năm đến bảy kính
trường, lấy trung bình rồi suy ra độ thuần khiết của canh
trường
¢
¢

58

2. TỶ LỆ TẾ BÀO SỐNG TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO

3. TỶ LỆ TẾ BÀO NẢY CHỒI TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO

Nguyên tắc:
¢ Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua
màng tế bào sống
¢ Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu

Cách tiến hành:
Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH
hoặc H 2SO 4 10% lên phiến kính trộn đều. Đậy lá kính
lại, đặt lên khay kính và quan sát. Đếm số tế bào chung
và số tế bào đang nảy chồi rồi suy ra phần trăm.
¢ Tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế

bào con bé hơn hoặc bằng 1/2 tế bào mẹ.
¢

Cách tiến hành:
Cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc nhuộm
(đã pha lỗng 10 lần) lên phiến kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy
lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát. Tế bào
chết bắt màu xanh cịn tế bào sống khơng màu.

¢

u cầu : trong canh trường nấm men giống đem lên
men, lượng tế bào đang nảy chồi ít nhất phải chiếm từ 10
đến 15%. Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh trưởng
mạnh, số tế bào nảy chồi có thể đạt tới 70 - 80%

Yêu cầu : nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng lượng tế bào
chết không quá 2 - 4%.

59

60

15


15/11/2021

4. SỐ LƯỢNG TẾ BÀO TRONG 1 ML CANH TRƯỜNG
l

l

l

l

5. CHỈ TIÊU CÔNG NGHỆ

Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha lỗng canh trường
Dùng bơng tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm hồng cầu,
đặt lá kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng
trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu)
Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô
lớn chéo nhau tức là 80 ô vng nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ơ vng lớn tức là 100 ô
vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong
mỗi ơ.

Chỉ tiêu này thường được đánh giá thơng qua
khả năng của nấm men chuyển hóa nguyên liệu
đầu vào hay tạo thành sản phẩm sau một thời
gian nhất định. Việc xác định lượng sản phẩm
tạo thành giúp đánh giá chính xác và dễ thực
hiện hơn.

a.1000.f
h.S
trong đó:
a là số tế bào trung bình có trong 1 ơ
f là hệ số pha loãng của canh trường

h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích một ơ
1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm 3.

61

62

LÀM VẾT BÔI VÀ CỐ ĐỊNH VẾT BÔI
B ÀI 4 :
LÀM TIÊU BẢN
VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH
QUAN SÁT VI KHUẨN

Escherichia coli

63

Staphylococcus epidermidis

64

16


15/11/2021

N HUỘM MÀU

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

Nguyên tắc :
Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của
một số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc
biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie,
khi nhuộm phức chất này kết hợp với loại thuốc
nhuộm triphenylmetan (như gential violet, crystal
violet, metyl violet...) và iơt sẽ cho màu tím rất bèn
vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi sinh vật
có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương (+)
nếu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-) .

Ngun tắc:
¢

¢

Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp
với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng, bền vững.
Thuốc nhuộm thường dùng là các chất màu anilin, chủ yếu là loại kiềm và trung tinh.
Vì thành phần hóa học của tế bào các lồi vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế bào rất
khác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu khơng giống nhau. Tùy theo mục đích nghiên
cứu mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.

Các phương pháp : nhuộm màu đơn giản và nhuộm màu phức tạp

Dựa vào khả năng bắt màu gram người ta chia vi sinh vật
thành hai nhóm:
¢

¢

65

Gram dương (+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn,
các trực khuẩn hiếu khí có bào tử (Bacillus subtilis,
Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides), nấm men,
xạ khuẩn...
Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột như
Bacterium coli, Bacterium typhi, Bacterium
aerogenes, Bacterium proteus, vi khuẩn axetic...

Biến đổi màu tế bào
trong quá trình nhuộm Gram

66

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

B. QUAN SÁT VI KHUẨN

67

68

17


15/11/2021

Q UAN SÁT VÀ PHÂN BIỆT BỐN LOÀI NẤM MỐC

ĐIỂN HÌNH : M UCOR, R HIZOPUS,
A SPERGILUS VÀ P ENICILLIUM

C. QUAN SÁT NẤM MỐC

69

70

MUCOR VÀ RHIZOPUS

ASPERGILUS VÀ PENICILLIUM
Sợi nấm đa bào, đầu sợi
nấm mang bào tử phình to
ra , tạo thành các tế bào
hình chai (hay thể bình) rồi
hình thành chuỗi đính bào
tử (bào tử ngoại sinh).

Sợi nấm đơn bào, chúng
có khả năng tạo thành
bào tử nang (bào tử nội
sinh). Sợi màu trắng,
bào tử nang hơi vàng.

Mucor
Cuống của bào tử nang phân
nhánh và mọc lên ở bất kỳ vị trí
nào của sợi nấm.

71

Aspergilus

Rhizopus
Cuống bào tử nang không phân
nhánh, chỉ mọc lên ở những chỗ sợi
nấm ăn sâu vào môi trường, cuống
bào tử mọc thành cụm ba bốn cái ở
chân của cụm này có mọc ra nhiều
sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường trông
giống rễ bụi lúa gọi là rễ giả

Cuống của đính bào tử đơn bào.
các tế bào hình chai và đính bào tử
tỏa đều trên đầu sợi nấm sinh sản
như những tia nước đi ra đầu vịi
tưới.

Penicillium
Cuống đính bào tử đa bào, đầu
cuống phân nhánh nhiều lần thành
những đốt song song rồi mới hình
thành đính bào tử. Các tế bào hình
chai đính bào tử hướng lên cùng một
phía giống như cây chổi

72

18