THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Bài 1
TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH SẢN PHẨM DNA &
RNA TỪ VI KHUẨN E.COLI & NẤM MEN BẰNG
PHENOL – CHLOROFORM
I. NGUYÊN TẮC
Trong các phương pháp chiết xuất và tinh chế DNA thì phương pháp
chiết xuất bằng phenol và chloroform là những phương pháp cơ bản.
Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết xuất DNA với nhiệt độ
thường ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 độ C) nhưng khi lẫn với
khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử
phenol ở giữa các phân tử nước vây quanh. Khi pha hỗn hợp này vào
dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kỵ thuỷ nên có khuynh hướng
lien kết vào vùng kỵ thuỷ của protein ở bên trong cấu trúc của các phân
tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị
thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài.Các nhóm kị thuỷ này của protein
khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein
khác nhau.
Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước và có thể hút sang
ống chứa khác. Thao tác loại bỏ protein, lipid và các chất tan trong dung
dịch DNA là chiết xuất bằng phenol rồi bằng phenol-chloroform sau đó
bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcohol (24:1). Sử dụng cả
hai loại dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao nhưng cũng có thể
dùng chỉ một loại. Tuy nhiên, nhiều khi cần phải loại bỏ hoàn toàn
phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng
chloroform hoặc ether. Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức
độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính
protein tan trong nước, trong khi đó sử dụng chloroform hay
chloroform-isoamyl alcohol thì phải trộn đảo kỹ vì các chất này không
tan trong nước. Pha them chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ của
phenol tăng nên làm tăng hiệu quả biến tính protein.
II. THAO TÁC TIẾN HÀNH

• Chuẩn bị dung dịch (stock)
• Điều chế phenol
1/ Đun nóng (cách thuỷ) phenol tinh thể đông cứng (loại đặc
biệt) ở 68 – 80 độ C để làm tan chảy. Thêm oxine (8-
hydroxyquinoline) ở 0,05 – 0,1% (có tác dụng phòng ngừa oxi
hoá phenol.
2/ Thêm khoảng ½ - 1/3 dung dịch Tris 1M (pH 8,0), trộn đều rồi
để yên, loại bỏ lớp nước mặt rồi lặp lại thao tác một lần nữa. Tris
có tác dụng làm phenol bão hoà trở nên trung tính. Khi đó, dưới
lớp dung dịch đệm là lớp phenol, mỗi lần cần sử dụng phenol thì
cho pipet (bịt đầu trên) xuống lớp phenol và hút lượng phenol
cần dùng vào ống Eppendorf 1,5 µl.
3/ Cho 1 lượng chloroform tương đương để tạo dung dịch hỗn
hợp 500 µl phenol: 500 µl chloroform.
4/ Bảo quản ở 4 độ C, có thể để đến vài tháng.
• Chiết xuất phenol và chloroform
Phối trộn với phenol vừa điều chế với dung dịch chloroform với
tinh thể tương đương bảo quản ở điều kiện 4 độ C.
• Tách chiết DNA & RNA
• Tách chiết DNA
1/ Thêm vào 100µl dung dịch đồng nhất của vi khuẩn E.coli một
lượng tương đương hỗn hợp dung dịch phenol : chloroform (1:1).
2/ Dùng máy Vortex trộn đều để tạo thành dạng huyền dịch. Nếu
cần chiết xuất DNA phân tử lượng lớn thì cần tránh trộn mạnh,
cần thêm thời gian chiết xuất.
3/ Ly tâm ở nhiệt độ phòng (30 độ C) khoảng 2 phút ở 10.000v/p
(RPM) với ống Eppendorf ở tốc độ cao.
4/ Hút 200µl lấy lớp nước dung dịch nổi ở trên ( lớp trên nếu
nồng độ muối NaCl của dung dịch thấp hơn 1,5M) chuyển sang
lọ mới.

5/ Chiết xuất lặp lại 3 lần với phenol-chloroform.
6/ Lần 3 thì cho máy quay 12.000 v/p , ở nhiệt độ -5 độ C. Sau đó
hút 100µl dịch nổi, bổ sung 300µl cồn lạnh ở 70 độ C.
Chú ý: với DNA phân tử lượng thấp nên dùng phương pháp chiết
xuất phenol-chloroform và choloroform với NaCl lớn hơn 0,1M.
DNA nhỏ có thể hoà tan trong phenol.
• Tách chiết RNA
1/ Mỗi nhóm bổ sung vào eppendorf 1,5 ml thêm 100µl dịch
đồng nhất, 1000µl chloroform, quấn parafilm tiến hành vortex
trong 10 phút sau đó ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút.
2/ Hút phần dịch nổi khoảng 500µl. Đem đi ly tâm 10.000 v/p
trong 10 phút.
3/ Thu 400µl dịch nổi vào eppendorf khác, bổ sung 100µl
potassium acetat 5%và 500µl ethanol lạnh. Vortex 10 phút (ủ
lạnh và vortex gián đoạn). Ly tâm 10000 v/p trong 15 phút.
III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
IV. CÂU HỎI THẢO LUẬN
• Cho biết vai trò của phenol, chloroform trong kỹ thuật di truyền và
các ngành sinh học khác?
Phenol làm biến tính protein rồi sau đó tủa protein.
Chloroform làm tăng tính kỵ nước của phenol và làm tăng hiệu quả
biến tính protein.
• Tại sao tách chiết DNA & RNA lại nên sử dụng hỗn hợp chloroform
& phenol mà không thể sử dụng riêng lẻ hay các thành phần hỗn hợp
khác?
Vì dung dịch chloroform & phenol làm cho hiệu quả tách chiết DNA
là cao nhất nhưng cần phải loại bỏ phenol ra khỏi dung dịch nên bắt
buộc phải dùng ether và chloroform để loại bỏ hoàn toàn phenol.
• Các điều lưu ý khi làm việc với phenol-chloroform trong kỹ thuật di
truyền là gì?

Phải mang gang tay, khẩu trang y tế khi thực hiện các thao tác với
các hợp chất trên cần hết sức cẩn thận. Tránh để dây, bắn vào da hay
hít phải khí bay ra vì phenol là chất gây bỏng lạnh, chloroform là
chất gây mê.
Bài 2
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA & RNA TỪ VI
KHUẨN E.COLI & NẤM MEN
I. NGUYÊN TẮC
• PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ QUANG HỌC
Ánh sáng khi đi qua môi trường lỏng sẽ bị các phần tử vật chất trong môi
trường đó hấp thu một phần. Sự hấp thu ánh sáng gia tăng khi nồng độ các
phần tử vật chất trong môi trường đó gia tăng. Dựa vào nguyên lý trên người ta
có thể đo nồng độ các phần tử vật chất trong môi trường lỏng thong qua mối
quan hệ giữa cường độ ánh sang trước và sau khi đi qua môi trường.
Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sang mạnh
nhất) ở một độ dài song nhất định tuỳ thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ: đỉnh
hấp thụ của các nucleic acid là ở 260nm trong vùng tử ngoại. Sự hấp thụ này là do
sự tương tác giữa các photon với các electron và vòng purine và pyrimidine.
Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị đo OD (Optical Density). Một đơn vị hệ
số chuyển đổi OD tương ứng với:
• 50 µg/ml DNA sợi đôi
• 40 µg/ml DNA sợi đơn hay RNA
Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra nồng độ nucleic của dung dịch.
C (mg/ml) = A
260nm
.k.n
C: nồng độ DNA, RNA
A
260nm
: trị số OD đo được

k: đơn vị hệ số chuyển đổi
n: số lần pha loãng
Bên cạnh đó, người ta còn tính tỷ lệ OD
260nm
/OD
280nm
để ước lượng độ tinh sạch của
dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 dung dịch nucleic
acid được xem là tinh sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn
nhiều khi đó việc định lượng nucleic acid bằng mật độ quang học sẽ không còn
chính xác.
Đối với dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ bước song A
260nm
tăng lên khi phân tử
DNA bị biến tính tức là hai sợi đơn tách rời nhau. Người ta gọi đó là hiệu quả siêu
sắc.
• PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI GEL AGAROSE:
Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc
phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối
lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh
hơn.
Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein. Bài
này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid.
Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là cac
gel. Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic
acid đi qua, phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển càng trong gel càng
chậm. Tuỳ theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người
ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide.
Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan
sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu

qua đối với UV)
Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA
sợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleic (cặp base –bp). Các nồng độ agarose
khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác
nhau.
Gel polyacrylamide có lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn
có kích thước dưới 500 bp. Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai
phân tử DNA chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta
sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau:
Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen
vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều
này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Hoặc có thể hiện hình các
Nu AgNO
3
1% tạo muối bạc trong môi trường kiềm.
Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng
vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.
Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm màu riêng biệt.
Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder). Đó là hỗn hợp
của nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ
cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các
phân tử trên gel với thang chuẩn. một số thang DNA thông dụng: X174-Hae III,
…
II. DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
• Hoá chất: Nước cất vô trùng.
• Vật liệ và dụng cụ:
• Dung dịch DNA, RNA
• Curvet
• Eppendorf 1,5 ml

• Pipetman các loại 0,5 µl – 10 µl; 20 µl – 100 µl; 200 µl
– 1000 µl, đầu típ tương ứng
• Cốc chứa nước thải, giấy thấm
• Máy đo mật độ quang
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
• PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (OPTICAL DENSITY)
Tiến hành tương tự như nhau ở cả hai loại dung dịch DNA và RNA theo các bước
sau:
Bước 1: Pha loãng 10 lần bằng cách trộn chung 100 µl dịch acid nucleic với 0,9 ml
nước cất, trộn kỹ bằng pipetman và xen lẫn vortex. Lưu giữ lạnh và đậy nắp kỹ.
Bước 2: Pha loãng tiếp 2 lần bằng cách hút bổ sung 1ml nước cất.
Bước 3: Chuẩn OD bằng nước cất và tiến hành đo ở 2 bước sóng 260nm và
280nm.
Bước 4: Ghi nhận kết quả và tính toán kết quả.
• PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI DEL AGAROSE (GEL
ELECTROPHORESIS)
Đổ gel agarose:
• Cân 0,5g agarose, cho vào erlen 100ml, bổ sung 25ml
dung dịch TAE 1X.
• Đun chảy, để nguội đến 35-40
o
C, thêm vào 2 µl
Ethidium bromide (hoặc AgNO
3
1%), lắc đều.
• Trong lúc chờ nguội, chuẩn bị bản điện di, lắp lược
vào khuôn.
• Đổ agarose lỏng vào khuôn.
• Đợi khi gel đông, đặt bản điện di vào bồn điện di và
tháo lược ra.

Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu:
• Chuẩn bị một miếng parafilm, hút 10 µl dung dịch
DNA ở mẫu điện di đặt lên miếng parafilm, (Đối với
sản phẩm cắt giới hạn, sử dụng hết lượng mãu có 10
µl).
• Thay đầu típ, hút 10 µl dung dịch nạp mẫu, trộn đều
với dung dịch DNA ở trên.
• Dùng pipetman hút toàn bộ dịch vừa trộn nạp vào
giếng.
• Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực.
• Điện di với hiệu điện thế 120V, trong 30-45 phút.
• Xem kết quả bằng đèn UV. Phân tích kết quả.
IV. KẾT QUẢ
V. CÂU HỎI THẢO LUẬN
• Mục đích của việc đo mật độ quang (OD) của sợi DNA hay RNA ở bước
sóng 260 và 280? Tại sao phải quan tâm đến tỷ lệ OD
260nm
/OD
280nm
?
Vì đây là đỉnh hấp thụ của acid nucleic và protein. Ta
dùng tỉ lệ 260/280 là để ước lượng độ tinh sạch của dung
dịch nucleic acid.
• Nếu tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
vượt quá tỷ lệ cho phép hoặc chưa đạt đến tỉ lệ
cho phép thì chúng ta có thể kết luận như thế nào về mẫu DNA/RNA vừa
tinh sạch được?

Chưa đạt tỷ lệ cho phép nghĩa là dung dịch bị nhiễm
protein (hay phenol). Còn nếu tỷ lệ vượt quá mức cho
phép nghĩa là DNA bị biến tính (hai sợi đơn tách rời
nhau).
• Nêu các cách định lượng DNA/RNA theo quan điểm của anh/ chị?
Điện di: Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích
thước. Định lượng: làm lượng tương đối so với thang hàm
lượng.
Mật độ quang: Cho phép định lượng tương đối nồng độ có
trong mẫu nucleic acid.
• So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide
trong kỹ thuật điện di?
Gel agarose: có lỗ đường kính trung bình cho phép phân
tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10.000
cặp nucleic, thường nhuộm bằng ethidium bromide.
Gel polyacrylamide: có lỗ nhỏ, phân tách những đoạn
DNA sợi đơn có kích thước dưới 500 bp. Các phân tử
DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của
chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.
Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm
màu riêng biệt.
• Hãy cho biết ứng dụng một số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và
polyacrylamide mà em biết trong lĩnh vực thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật
di truyền?
Gel agarose: ứng dụng trong chẩn đoán di truyền phân tử
hay in dấu môi trường, lập bản đồ hạn chế DNA được tạo
dòng.
Gel polyacrylaminde: dùng để phân lập các đoạn DNA.
Bài 3
TÁCH CHIẾT, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA

TỪ MÔ THỰC VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP BOOM
I. NGUYÊN TẮC
Việc thu nhận DNA từ mô tế bào thực vật in vitro được tiến hành thông
qua nhiều bước. Các phân đoạn nhân được cô lập trong bước thứ nhất
và DNA được tách chiết trong bước thứ hai chủ yếu dựa trên kỹ thuật ly
tâm vùng.
Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm:
Phá màng tế bào và màng nhân
Mô thực vật thường được sử dụng làm vật liệu để cô lập nhân và tách
chiết DNA vì tế bào thực vật in vitro tương đối đồng nhất về kích thước,
thích hợp cho việc phân đoạn kỹ thuật li tâm. Người ta có thể phá màng
tế bào bằng phương pháp hoá học, cơ học hay siêu âm. Để đảm bảo sự
toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, tế bào được phá vỡ trong những
điều kiện gần với điều kiện sinh lý bình thường (dung dịch đẳng trương,
pH sinh lý, sự hiện diện của một số ion…). Huyền phù tế bào trong môi
trường vừa kể trên có tên là dịch đồng nhất (homogenate). Dịch đồng
nhất được phân đoạn qua ly tâm, các bào quan sẽ được phân tách dựa
vào khối lượng của chúng.
Loại protein
Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần
nhiễm, mà quan trọng nhất là protein, tương bào. Sự tách chiết dựa trên
nguyên tắc hoà tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid /
protein) trong hai pha không hoà tan (phenol, chloroform). Một số tác
nhân tách chiết thông dụng là:
Các hạt Celite: Cũng có thể tóm bát Nucleic Acid bằng các hạt Celite
mà không cần bát các protein biến tính.
Kết tủa DNA (DNA precipitation)
Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid được tinh sạch nằm trong một thể
tích dung dịch lớn. sự tủa kết hợp với li tâm cho phép thu nhận nucleic
acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hoà lại trong nước

theo nồng độ mong muốn. Có các kiểu chính:
• Tủa bằng ethanol:được thực hiện ở nồng độ muối cao,
nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol / thể tích
dung dịch cần tủa). Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa.
• Tủa bằng isopropanol: khác với kiểu tủa trên là không
cần muối, có thể sử dụng 0,8 – 1 thể tích isopropanol/
thể tích dung dịch cần tủa. Những đoạn DNA thật ngắn
dù ở nồng độ cao cũng không tủa bằng cách này nên có
thể dễ dàng loại chúng.
II. DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
• Hoá chất
• Dung dịch Diatom
• Nước cất
• HCl đậm đặc
• Hạt celite (diatom)
• Dung dịch đệm li giải L6
• Guanidine thyocynate
• Tris HCl
• EDTA
• Triton X-100 (hoặc SDS 10%)
• Dung dịch đệm rửa L2
• Guanidine thyocynate
• Tris HCl
• Triton X-100
• SDS 10%
• Chloroform: isoamylalchohol (24:1)
• Dung dịch TE 10X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M)
• Ethanol tuyệt đối
• Ethanol 70%
• Dung dịch acetol

• Vật liệu và dụng cụ
• Mô thực vật
• Eppendorf 1,5 ml
• Eppendorf 2ml
• Pipetman các loại 20 µl – 100 µl; 200 µl – 1000 µl, đầu típ
tương ứng
• Pipette Pasteur
• Que thuỷ tinh đầu uốn cong
• Ống nghiệm thuỷ tinh
• Cốc đựng đá
• Cốc đựng típ và chất thải
• Vải lược, dao cắt
• Máy nghiền
• Máy ly tâm
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
• CHUẨN BỊ
Mỗi nhóm chuẩn bị 2 Eppendorf 1,5ml chứa:
• Dung dịch L6 900µl
• Dung dịch Diatom 20µl
• Mẫu mô thực vật 200µl
IV. THAO TÁC THỰC HÀNH
Bước 1
Nhóm trực cân 30g mẫu mô thực vật bổ sung 70ml nước cất, nghiền
nhỏ và làm lạnh trong đá. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu
dịch đồng nhất và tiếp tục được giữ lạnh trong đá.
Bước 2
Bổ sung vào eppendorf 1,5ml (chứa L6 và Diatom) 100µl dung dịch
đồng nhất, tiến hành Vortex trong 3-5 phút sau đó ly tâm 13.000
vòng/phút trong 5 phút.
Bước 3

Hút bỏ phần dịch nổi và chừa khoảng 200µl phần dịch cặn. Bổ sung
1ml dung dịch L2 đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Tiếp
tục lặp lại bước 3 thêm hai lần nữa.
Bước 4
Rửa bằng 1ml ethanol 70%(thao tác tương tự bước 3) 1 lần. Rửa 1
lần bằng 1ml acetone. Sau đó hút bỏ acetone và để khô tự nhiên.
Bước 5
Bổ sung 200µl dung dịch TE 1X đem Vortex 10 phút; sau đó ly tâm
tiếp 13.000 vòng/phút trong 20 giây. Hút 200µl phâng dich nổi
(chứa AND) qua 1 eppendorf khác và bảo quản lạnh ở nhiệt độ
-15
o
C. dung dịch TE có tác dụng bảo quản DNA.
V. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Nêu các vai trò và cấu tạo của các hoá chất dùng trong bài như
dung dịch L2, L6 hay Diatom?
Diatom thành phần gồm có: nước cất, HCl đậm đặc, hạt celite (diatome),
vai trò của hạt celite là tóm bát các DNA, không bắt protein biến tính.
L2 thành phần gồm: Guanidine Thyocynate, tris-HCl, có vai trò là làm bất
hoạt enzyme nuclease biến tính protein.
L6 thành phần gồm: Guanidine Thyocynate, tris-HCl, EDTA, Triton X-
100, có vai trò là dung dịch ly giải làm biến tính DNA
2. Giải thích tại sao lại sử dụng L2, L6 hay Diatom trong việc tách
chiết DNA?
Vì chúng có hạt celite dùng để bắt DNA, còn L2 và L6 dùng để biến tính
DNA.
3. Có thể thay thế mẫu gan bò thành các mẫu nguyên liệu khác
không như mẫu tóc, mẫu da hay mẫu máu người?
Có vì trong các mẫu này đều có chứa DNA và RNA nhưng phải sử dụng
thêm một số dung dịch hoặc một số kỹ thuật tách chiết khác nhau cho các mẫu

khác nhau.
4. Mục đích của việc ly tâm hay vortex nhiều lần là gì?
Vortex: để đồng nhất hoá mẫu hay dung dịch và để phản ứng xảy ra hoàn
toàn.
Ly tâm: dùng để phân tách các lớp rõ rang để thu dịch đồng nhất dễ.
5. Nêu vai trò và tác dụng của ethanol và acetone trong tách chiết
DNA.
Ethanol: ethanol tuyệt đối: tủa DNA, RNA. Ethanol 70%: để loại bỏ các
chất tẩy (dung dịch đệm) trong khi không làm ảnh hưởng đến DNA do DNA
không làm tan trong ethanol.
Acetone: phá vỡ liên kết giữa Diatom và DNA.
BÀI 7
XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH SẠCH CỦA DNA PLASMID
E.COLI BẰNG KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN
I. MỤC ĐÍCH
Enzyme cắt giới hạn được sử dụng trong kỹ thuật di truyền thuộc nhóm II.
Các enzyme này có khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và
cắt DNA ngay tại trình tụ nhận biết đó. Enzyme cắt giới hạn cắt phân tử
DNA thành những đoạn DNA ngắn hơn. Do vậy, chúng được sử dụng cho
nhiều mục đích khác nhau như: cắt nối DNA tạo DNA tái tổ hợp, phân tích
tái tổ hợp, đột biến, đa dạng di truyền.
Trong phạm vi bài thực hành này, enzyme cắt giới hạn sử dụng nhằm để
phân tích plasmid. Plassmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra
dung dịch plasmid thu được có phải là plasmid cần thu nhận hay không?
Phương pháp phân tích DNA và vector tái tổ hợp chứa DNA bằng phản
ứng cắt giới hạn có thể ứng dụng trong các trường hợp sau:
- Kiểm tra dung dịch vector, plasmid thu được sau khi nhân bản in vivo
trong tế bào chủ.
- Kiểm tra vector tái tổ hợp thu được sau khi cắt nối bằng enzyme cắt
giới hạn đó.

II. NGUYÊN TẮC
Đầu tiên plasmid được cắt bằng một hay một số enzyme cắt giới hạn
thích hợp.
Sản phẩm cắt được điện di gel agarose. Việc phân tích số lượng và
độ dài các đoạn DNA thu được sau phản ứng cắt sẽ cho biết thông
tin cần thiết về plasmid cần kiểm tra.
Để phân tích plasmid bằng phản ứng cắt giới hạn cần phải có thông
tin về bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid quan tâm. Dựa vào
bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid quan tâm và loại enzyme
thích hợp được chọn lựa cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid.
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
1. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
- Dung dịch DNA thu ở bài trước
- 01 eppendort 1,5ml
- Pipettman các loại: 0,5- 10 µl; 10- 100 µl; 100-
1000µl + đầu típ
- Nước cất vô trùng
- Enzyme cắt giới hạn, buffer
- Chậu thủy tinh
- Cốc thủy tinh 100ml, 250ml
- Agarose
- Dung dịch TAE 1X, 10X
- Bộ điện di
- Tủ ấm 37
o
C hay Bể ổn nhiệt
2. Thực hành
Dựa vào bản đồ plasmid của pBlueScript, chọn enzyme cắt giới hạn sử
dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đoán kết quả.
- Tiến hành các phản ứng cắt giới hạn theo các bước:

- Chuẩn bị 02 eppendorf sạch, rửa cồn 70
o
- Thiết lập phản ứng cắt với thành phần như sau:
DNA plasmid 10 µl
Dung dịch đệm 10X 4 µl
Enzyme cắt giới hạn 1 µl
Nước cất vô trùng bổ sung cho đến thể tích 5 µl
- Ủ hỗn hợp qua đêm
- Bổ sung dung dịch đệm chạy mẫu (Load Buffer)
- Chạy gel điện di agarose, quan sát và thu nhận kết quả.
- Tiến hành các nhóm DNA đã được tách chiết và tinh sạch: DNA động vật
(gan heo).
IV. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
V. CÂU HỎI THẢO LUẬN
1. Vai trò của enzyme cắt giới hạn là gì? Tại sao phải cần
dùng enzyme cắt giới hạn trong kỹ thuật di truyền.
2. Vai trò của kỹ thuật cắt giới hạn trong sinh học? Liệt
kê chi tiết từng ứng dụng trong thực tế.
BÀI 8
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO VẬT CHỦ E.COLI
TÁCH DNA TẠO DÒNG
I. NGUYÊN TẮC
E.coli đóng vai trò chủ yếu trong chuyển gen đến các sinh vật khác. E.coli
là sinh vật chuẩn để tạo dòng gen, là vi khuẩn được nghiên cứu kỹ nhất trong
công nghệ chuyển gen. Nó dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen
chủ như phage hay plasmid qua biến nạp hay tải nạp. Những protein đầu tiên
như: insulin, somatostatin và đến nay hàng trăm protein khác được tạo ra từ
tế bào E.coli đã đi vào sản xuất công nghiệp.
Kỹ thuật chuyển gen (transgensis engineering) là kỹ thuật chuyển một đoạn
DNA từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng cách sử dụng plasmid hoặc thực

khuẩn thể là thể truyền.
Plasmid là các phân tử mạch vòng, kép nằm ngoài và có khả năng nhân đôi
độc lập với DNA của nhân vì plasmid chứa ít nhất một trình tự DNA vị trí
bắt đầu sao chép. Chúng xuất hiện trong vi khuẩn hoặc ở ế bào nhân thực
(Saccharomyces cerevisiae). Kích thước 1- 400 (kbp), chứa nhiều gen hoặc
một nhóm gen mang lại ưu thế chọn lọc cho tế bào vi khuẩn chứa nó.
Các giai đoạn chủ yếu trong kỹ thuật chuyển gen vào E.coli
Giai đoạn 1: Tách DNA của tế bào cho và tách plasmid ra khỏi tế bào vi
khuẩn E.coli.
Giai đoạn 2: Cắt và nối DNA của tế bào cho vào DNA plasmid tại những vị
trí xác định tạo nên DNA tái tổ hợp. Việc cắt và nối được thực hiện bởi
enzyme cắt giới hạn và ligase.
Giai đoạn 3: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận và tạo điều kiện cho
DNA tái tổ hợp được biểu hiện.
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
1. Dụng cụ
- Eppendorf 1,5- 2ml
- Pipettman các loại 0,5- 10µl, 10- 100µl, 100- 1000µl và các đầu típ
tương ứng.
- Đĩa Petri
- Cốc 100ml
- Đũa thủy tinh
- Đền cồn
2. Hóa chất
- Môi trường LB
- Buffer
- Etanol 70
o
, 96
o

3. Thiết bị
- Máy vortex
- Máy ly tâm
- Tủ ấm
Chuẩn bị môi trường LB
- Yeast extract 1,25g
- Tryptone 2,5g
- NaCl 2,5g
- Agar 5g
- Nước cất đến thể tích 250ml
Hấp tiệt trùng môi trường.
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
- Đổ đĩa Petri môi trường LB trong điều kiện vô trùng bổ sung
antibiotics, đợi đông.
- Hút 200µl dịch chứa vi khuẩn E.coli đã hoạt hóa thêm vào ống
eppendorf chứa DNA đã được xử lý với enzyme cắt giới hạn.
- Đặt trong đá 10 phút.
- Hút 200µl dịch từ eppendorf và cấy trải trên môi trường LB trong
điều kiện vô trùng (tủ cấy).
- Ghi nhãn: tên nhóm, ngày thực hiện, môi trường, tên giáo viên.
- Ủ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển.
IV. KẾT QUẢ
V. TRẢ LỜI CÂU HỎI
1. Nêu thuận lợi và khó khăn khi sử dụng kỹ thuật chuyển gen?
Thuận lợi
Khó khăn
2. Định nghĩa kỹ thuật gen và công nghệ gen?
Kỹ thuật gen
Công nghệ gen
3. Antibiotics đóng vai trò như thế nào khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy

DNA tái tổ hợp?
BÀI 9 +10
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO VẬT CHỦ E.COLI
KIỂM TRA DNA TẠO DÒNG BẰNG PHẢN ỨNG
PCR
I. NGUYÊN TẮC
PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis phát minh năm 1985 và nhận
giải nobel hóa sinh năm 1993. Đây là kỹ thuật nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một
đoạn DNA trong ống nghiệm. dựa trên đặc tính hoạt động của DNA polymerase,
có sự hiện diện của những đoạn mồi chuyên biệt để hoạt đông tổng hợp một đoạn
DNA mới từ mạch khuôn.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt. Đây là phương pháp xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế
bào với độ chính xác cao.
Các thành phần trong phản ứng PCR
Enzyme
1. Các đặc tính enzyme DNA polymerase và định nghĩa đơn vị (unit) của mỗi
loại (hãng) sản xuất là khác nhau. Cần kiểm tra thông tin trên các tờ hướng
dẫn đi kèm hóa chất.
2. Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích
thước phản ứng PCR. Tuy nhiên, thành phần này chỉ nên hiệu chỉnh khi 1)
sản phẩm PCR lớn hơn 5kb; 2) có khả năng hoạt tính của enzyme bị giảm
sút do thiếu sót ở khâu bảo quản; 3) đã tiến hành hiệu chỉnh bằng nhiều
cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc không có gì.
3. Không nên tăng enzyme quá 2U (5µl) trên 50 µl tổng thể tích phản ứng vì
các chất trong dung dịch bảo quản enzyme có thể gây ức chế phản ứng
4. Việc thay đổi loại DNA polymerase có thể làm thay đổi hiệu suất của phản
ứng PCR.
5. Khi tính toán chiến lược cloning bằng hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA
polymerase có đặc tính tạo đầu treo A ở đầu 3' hay không. Nếu không thì

cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow và ATP.
6. Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3
´→5´ exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại
DNA polymerase có hay không có hoạt tính này.
Buffer
1. Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều
vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương
ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
2. Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến các phản
ứng microarray hoặc DHPLC.
3. Nhiều loại buffer đã có sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý
khi tối ưu hóa nồng độ Mg2+
Nồng độ Mg
2+
và dNTP
1. Việc tăng nồng độ ion Mg
2+
có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm không
đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg
2+
thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR
thấp.
2. Nồng độ ion Mg
2+
tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA
template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1 lượng
nhất định ion Mg
2+
).
3. Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0.5 đến

2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM.
4. dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên
chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại.
5. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không
làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố
khác.
DNA khuôn (Template) và mồi (Primers)
1. Nồng độ tối ưu DNA template là từ 1) đối với các mẫu DNA tương đối
đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA): 1 pg - 10 ng / 50 µl tổng thể
tích phản ứng; 2) đối với mẫu DNA genome thì từ 20 - 500 ng/50 µl tổng
thể tích.
2. Nồng độ primer thường tối ưu ở 10 mM mỗi loại.
Chất khác
1. Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến
tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR.
Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase.
2. Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.
3. Một số buffer đã có chứa sẵn loading buffer để có thể điện di ngay sau
PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này không cao và sản
phẩm sau đó ko dùng trực tiếp cho đọc trình tự mà cần phải tinh sạch qua
cột.
4. Đối với các máy luân nhiệt (thermocycler) không có gia nhiệt trên nắp thì
nên bổ xung mineral oil để tránh bay hơi mẫu.
Các giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR
 Biến tính (denaturation): phân tử DNA khuôn mẫu bị biến tính ở
nhiệt đọ cao (thường là 94 – 95
o
C) trong thời gian khoảng 1 phút.
Các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt gãy vầ tạo thành sợi DNA
đơn.

 Bắt cặp (annealing): nhiệt độ được hạ thấp khoảng 45-56
o
C, cho
phép các đoạn mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn.Giai đoạn này
kéo dài khoảng 1 phút.
 Kéo dài (extension/ elongation): nhiệt độ gia tăng đến 72
o
C, giúp
cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. DNA
polymerase di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm
khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung.
Giai đoạn này kéo dài 1 phút đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài
trình tự DNA.
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
1. Dụng cụ và vật liệu
- DNA tái tổ họp thu nhận thu bài trước
- Eppendorf 1,5- 2ml
- Pipettman các loại 0,5- 10µl, 10- 100µl, 100- 1000µl và các đầu típ
tương ứng.
- Đĩa Petri
- Cốc 100ml
- Đũa thủy tinh
- Hóa chất
- Dung dịch đệm Taq polymerase 10X
- MgCl
2
- Taq DNA polymerase
- Agarose
- Ethanol 70
o

- Phenol
- Chloroform
2. Thiết bị
- Máy Vortex
- Bếp điện
- Máy PCR
- Bộ điện di
- Máy chụp gel UV
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Phần A: Tách chiết DNA và thu nhận DNA tái tổ hợp
Thao tác thực hiện
- Lựa chọn nhóm vi khẩn đặc tưng trên hai đĩa Petri
- Tiến hành tách chiết và thu nhận DNA tái tổ hợp bằng phương pháp
Phenol- Chloroform theo bài 1.
Phần B: Kiểm tra kết quả DNA tái tổ hợp bằng phản ứng PCR
Thao tác thực hiện
- Thiết lập phản ứng PCR trong eppendorf 0,5ml với thứ tự bổ sung các
thành phần và thể tích:

• Dung dịch đệm Taq polymerase 10X cho phản ứng PCR 5µl
• MgCl
2
25mM 3µl