Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (tt) docx

Tinh sạch protein
bằng phương pháp tủa (tt)




3. Tủa protein bằng phương pháp
điểm đẳng điện
Khi thay đổi pH của môi trường, mức
độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở
pH thấp, protein tích điện dương vì
nhóm amide bị proton hóa (thu nhận
proton). Ở giá trị pH cao, protein tích
điện âm vì các nhóm carbocyl trong
phân tử protein bị mất đi proton (mất
H
+
). Tại giá trị pI (Isoelectrics point -
điểm đẳng điện), protein không tích
điện. Điều này làm giảm tính tan của
protein vì protein không còn khả năng
tương tác với môi trường, khi đó, các
phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi
trường. Hiện tượng này được giải
thích bằng phương trình Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2
protein khác nhau thay đổi theo pH

Hình 2. Tỷ lệ protein tủa theo pH

)

Phương pháp này thường dùng cho
các protein đậu nành (có điểm đặng
điện khoảng 4.6)

4. Tủa protein bằng các non – ionic
polymer
Phương pháp này được thực hiện
bằng cách cho thêm non – ionic vào
trong dung dịch protein. Khi thêm
vào, số lượng các phân tử nước có thể
tương tác được với protein giảm
xuống. Người ta thường sử dụng
dextrans và polyethylen glycols.
µ
i
= µ
i
0
+ RT (ln m
i
+ f
ii
m
i
+ f
ij

+ m
j
)
Trong đó
µ
i
0
: điện thế hóa học chuẩn của phần
tử i
µ
i
: điện thế hóa học của phần tử i
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
m
i
, m
j:
nồng độ molar của phần tử i và
j
f
ii
: hệ số tương tác của phần tử i
f
ij
: hệ số tương tác giữa phần tử i và j
Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay
pH môi trường vượt ra ngoài điểm
đẳng điện mới xảy ra quá trình tương
tác giữa các cấu tử trong protein.

Muốm thêm loại non – ionic polymer
nào vào trong dung dịch protein tùy
thuộc vào trọng lượng phân tử của
protein đó. Cũng tương tự như tủa
protein bằng phương pháp điểm đẳng
điện. Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi
thêm non – ionic polymer) thì khả
năng hòa tan của protein cũng giảm
xuống. Các ion non – ionic polymer
thường sử dụng là các dung môi hữu
cơ như Ethanol hay Acetone. Các
dung môi khác ít sử dụng vì khó thao
tác và có thể gây biến tính protein.

Chú ý:
- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa
và giảm sự biến tính protein.
- Nồng độ ion: 0.05 – 0.2.
- Đối với chất tan có trọng lượng phân
tử càng cao thì lượng dung môi cần
cho quá trình tủa càng ít. Theo Scopes
(1982), khi bắt đầu tủa protein bằng
Acetone, nên tuân theo công thức sau:
[(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW]
Trong đó
(v/v)% là thể tích dung môi cần cho
quá trình tủa – tính theo %
MW: trọng lượng phân tử của chất tan
Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của
2 protein, tính tan của protein này sẽ

giảm vì sự hiện diện của protein kia.
Thuận lợi của phương pháp tủa bằng
cách sử dụng non – ionic polymers là
protein sản phẩm bền, và có thể sử
dụng ở nhiệt độ phòng.

5. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim
loại sẽ gắn với một phần của phân tử
protein. Thuận lợi của phương pháp
này là có thể tủa được protein trong
một dung dịch rất loãng. Các ion kim
loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion
như Mn
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
và
Cd
2+
sẽ gắn chặt vào các acid
carboxylic và các hợp chất có chứa
nitrogen. Các ion như Ca
2+

, Ba
2+
,
Mg
2+
và Pb
2+
sẽ gắn với nhóm chức
acid carboxylic. Các ion như Ag
2+
,
Hg
2+
, và Pb
2+
sẽ gắn chặt với các
nhóm có chứa lưu huỳnh.

MỘT SỐ PROTOCOL THAM
KHẢO

Tủa protein bằng acetone
1. Làm lạnh acetone xuống – 20
0
C.
2. Chuyển mẫu protein vào trong các
tube eppendorff thích hợp.
3. Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh
vào tube.
4. Vortex, ủ ở - 20

0
C trong 60 phút.
5. Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong
vòng 10 phút.
6. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Tránh
chạm tới phần cặn protein.
(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất
tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2
– 6) trước khi tiến hành bước 7)
7. Để cho acetone bay hơi tự do ở
nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30
phút.

Tủa bằng Acetone/TCA
(Trichloroacetic acid)
1. Chuẩn bị dung dịch TCA 10%
trong aceton. Bảo quản ở - 20
0
C cho
đến khi sử dụng.
2. Thêm 10 thể tích TCA 10% trong
acetone vào mẫu. Vortex. Ủ ở - 20
0
C
ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm).
3. Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi.
4. Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( -
200C). Vortex. Để ở - 20
0

C ít nhất 10
phút.
5. Ly tâm 15000 x g trong 5 phút.
Loại bỏ dịch nổi.
6. Để cặn khô tự nhiên trong không
khí.

Tủa bằng TCA/DOC
(Deoxycholate)
1. Chuẩn bị dung dịch DOC 2%.
2. Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ
1/1000. Ủ trên đá 30 phút.
3. Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho
nồng độ cuối cùng của TCA là 15%.
Vortex ngay (để tránh các khối tủa
lớn hình thành có thể manh theo các
phần tử tạp nhiễm).
4. Để yên ít nhất 1h. Tốt nhất là ủ qua
đêm.
5. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi có chứa TCA và các
chất tạp nhiễm
6. Thêm Ethanol lạnh hay Acetone
lạnh vào cặn để rửa.
7. Vortex kỹ cho cặn tan hoàn toàn.
Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
8. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút.
Cẩn thận loại bỏ dịch nổi.
9. Lặp lại bước rửa, ly tâm, loại dịch
nổi.

10. Làm khô cặn.

Tủa bằng Chloroform/Methanol
1. Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu.
Vortex kỹ.
2. Thêm 1 thể tích Chloroform.
Vortex.
3. Thêm 3 thể tích nước. Vortex.
4. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút.
(Lúc này, protein có thể còn trên phần
dịch nổi). Loại đi phần nước ở lớp
trên.
5. Thêm 4 thể tích Methanol. Vortex.
6. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút.
Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi.
Tránh chạm đến phần cặn.
7. Làm khô mẫu bằng buồng hút chân
không hay bằng không khí.