Nghiên cứu thiết bị phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng atp và ứng dụng trong giám sát vệ sinh thực phẩm

663

i

_

ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HỖ CHÍ MINH
SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG

BAO CAO NGHIEM THU

Dé tai:

NGHIÊN CỨU THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP
KIỂM TRA NHANH VI SINH VẬT BẰNG ATP
-VA UNG DUNG TRONG

GIAM SAT VE SINH THUC PHAM

Cø quan chủ trì: Trường DH Khoa học tự nhiên

Đại học Quốc gia TP. HCM

Chủ nhiệm đệ tài: PGS.TS. TRAN LINH THƯỚC

TP. HCM 8/2003
ay


MUC LUC

PHAN 1: DAT VAN DE
11.M6 DAU...
1.2. MUC TIEU

1.3. NỘI DUNG
14. TÓM TAT CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI

“

SINH VẬT BANG ATP..

PHAN 2: VAT LIEU VA PHUGNG PHAP
2.1. VAT LIBU..

2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.
2.1.5.

GIỐNG VI SINH VẬT.
PLASMID...
sẻ
VẬT TƯ, LINH KIÊN CỦA MÁY ĐẾM ÁNH SÁNG.
DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
HOA CHẤT....

2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. THỰC HIỆN PHẢN

ỨNG PHÁT SÁNG VÀ ĐO LƯỢNG

ÁNH

SÁNG

22.2. LY TRÍCH ATP TỪ TẾ BÀO VÀ ĐỊNH LƯỢNG ATP BẰNG PHẢN
wed
ỨNG PHÁT SÁNG...
2.2.3, XAY DUNG ĐƯỜNG TƯƠNG. QUAN ¡TUYẾN TÍNH GIỮA MẬT BỘ TẾ
BÀO VI SINH VẬT VÀ LƯỢNG ÁNH SÁNG TƯƠNG ĐỐI PHÁT RA
es
ve
(RLU)...
2.2.4. DINH LƯỢNG TONG vĩ SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG MẪU SUA.
2.2.5. LAY MAU THIT VA MAU BE MAT LO MO HEO..
2.2.6. TACH CHIET PLASMID BANG PHUONG PHAP SDS - KIỆM.
as
2.2.7. ĐIỆN BIẾN NẠP DNA VÀO vi KHUAN E. coli..
2.2.8. PHAN TICH VECTOR TAI TO HOP BANG ENZYME CẮT 'GIỚI HẠN.......
se
...
2.2.9. PHẢN ỨNG LOẠI BO NHOM PHOSPHATE
2.2.10. PHAN UNG NOIDOAN DNA NGOAILAI VÀO PLASMID .
2.2.11. LY TRICH LUCIFERASE TAI TO HOP RA KHOL TE BAO VI KHUAN
Seo 2Ơ
VÀ THỬ HOẠT TÍNH..........
—....
2.2.12, PHAN TICH TONG PROTEIN.

2.2.13. NUOI SINH KHOI TE BAO VA CHUAN BI DICH LUCIFERASE TAI
TỔ HỢP THÔ..
cư
wo 2]
2.14. TINH CHE LUCIFERASE TAI TỔ HỢP. BẰNG SẮC KÝ Al LUC 'GIỮA
ION Ni” VÀ POLYHISTIDINE.................
2222111 .........
..ererrrei 22

2.2.15. PHAN TICH PROTEIN BANG DIEN DI TREN GEL

POLYACRYLAMIDE CÓ SDS (SDS-PAGE)..............
2.2.16. ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD.
PHAN 3: KET QUA VA BIEN LUAN

3.1. THIẾT KẾ VÀ CHẾ TẠO THIẾT BỊ DEM ANH SÁNG....................
..e 26
3.1.1. MÔ TẢ CẤU TẠO VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ
3.1.2. KIEM TRA TINH NANG CUA THIET BI

.26
35

3.1.2.1. Độ ổn định của tín hiệu đo được

35

3.1.2.2. Xác định khoảng tuyến tính để định lượng ATP

.36

3.1.2.3. Xác định khoảng tuyến tính để định lượng tế bào vi sinh vật.......................... 39

3.2. NGHIÊN CỨU CÁC DIEU KIỆN CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
NHANH VI SINH VẬT BẰNG PHAN UNG PHAT SANG THONG QUA

3.2.1. KHẢO SAT HAM LUGNG LUCIFERASE, Mg” VA LUCIFERIN THICH
HỢP TRONG PHAN UNG PHAT SÁNG..................... s1
eee

¿

3.2.1.1. Khảo sát lượng luciferase cần cho phần ứng phát sáng

3.2.1.2. Ảnh hưởng của lượng Mẹ”?

3.2.1.3. Ảnh hưởng của lượng lucif€rin....................... che

ereeeeo 44

3.2.2. NGHIEN CUU DIEU KIEN LY TRICH ATP RA KHOI TE BAO VI SINH
3.2.2.1. Khảo sát lượng chat ly trich B/S Extractant cho hiéu qué ly trích cao nha
3.2.2.2. Hiệu quá ly trích ATP từ tế bao cla chat ly trich n-DTMAB
3.2.2.3. So sánh hiệu quả ly trích ATP từ tế bào bởi các chất ly trích khác nhau..

3.2.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI SINH

VẬT VÀ LƯỢNG ÁNH SÁNG PHÁT RA.................................. _—... 39

3.3. ĐỊNH LƯỢNG TẾ BẢO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG MẪU SỮA,

s79

0

15 v11 ............

50

3.3.1. ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG SỮA............ —.
3.4. THÀNH

PHẦN

CỦA BỘ HOÁ

CHẤT TỰ PHỐI TRỘN

DÙNG

TRONG

ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT.................................-....s. 62
3.5. CÁC NGHIÊN CỨU ĐĨN ĐẦU: DỊNG HỐ, BIỂU HIEN VA TINH
CHE LUCIFERASE TAI TO HGP DUNG CHO BỘ HOÁ CHẤT ĐỊNH
LƯỢNG NHANH VI SINH VẬT ĐỰA VÀO ATP..................................e.eee 64
3.5.1. CẤU TRÚC PLASMID THỂ HIỆN LUCIFERASE pQE-30/4c+..................... 65

3.5.2. CHON DONG VI KHUAN E. coli XL1-Blue MANG PLASMID THE HIEN
LUCIFERASE pQE- 30luc+ (E. coli XL1-Blue/pQE-30luc+).
3.5.3. KIỂM CHỨNG SỰ BIEU HIỆN CUA LUCIFERASE TAI TO HOP BANG
HOAT TINH VA BANG DIEN DI TREN GEL POLYACRYLAMIDE

BIẾN TÍNH (SDS- PAGE)...

“

3.5.4. TĨNH CHẾ LUCIFERASE TAI Tổ HOP.

PHAN 4: KET LUAN
MUC LUC


DAT VAN DE


1.1.MỞ ĐẦU
Bệnh gây
biến thực phẩm,
Ở các nước tiên
chiếm tỷ lệ 1/10

ra bởi thực phẩm luôn luôn là mối lo
của các cơ quan quản lý vệ sinh thực
tiến như Mỹ, hàng năm có khoảng 2 24
dân số. Ở các nước đang phát triển,

ngại của các nhà sản xuất, chế

phẩm và của người tiêu dùng.
triệu ca bị bệnh do thực phẩm,
có diéu kiện vệ sinh kém như

nước ta, tỷ lệ mắc bệnh do thực phẩm chắc chắn còn cao hơn nhiều.
Trong các nguyên nhân gây bệnh do thực phẩm, vi sinh vật là nguyên nhân
quan trọng gây ngộ độc và nhiễm bệnh thông qua thực phẩm.
Người tiêu dùng ngày nay đã biết các nguyên nhân gây ra các cơn dịch bệnh
do thực phẩm nên đồi hỏi các nhà sản xuất, chế biến thực phẩm phải đảm bảo cung
cấp thực phẩm vệ sinh, an toàn, nhất là về mặt vi sinh vật. Do vậy, an toàn, vệ sinh
đã trở thành tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của thực phẩm trên thế giới.
Hiện nay, để đầm bảo chất lượng quan trọng này, các nhà sẵn xuất, chế biến
thực phẩm trên thế giới đã chuyển từ việc quần lý chất lượng dựa trên việc kiểm tra

chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm, sang một hệ thống quần lý

chất lượng mới hữu hiệu hơn gọi là HACCP (Harzard Analysis and Critical Control
Point, tam dich là Phân tích các mơi nguy và Điểm kiểm soát giới hạn). Đây là một
hệ thống quản lý vệ sinh thực phẩm dựa trên việc phòng ngừa sự nhiễm vi sinh vật
liệu,
gây bệnh trên tất cả công đoạn của qui trình sản xuất và chế biến, từ nguyên
chuẩn bị sắn xuất, trong quá trình sản xuất cho đến thành phẩm. Hiện nay, trong lĩnh

vực chế biến thực phẩm như sữa, thịt, bia... HACCP là tiêu chuẩn để đánh gid hé
thống đấm bảo chất lượng của nhà sản xuất và chế biến thực phẩm để sản phẩm của
họ được chấp nhận trên thị trường châu Au, châu Mỹ và trên thế giới. Như vậy,
của nhà
ngoài bản thân thực phẩm phải đạt chất lượng, hệ thống đảm bảo chất lượng
sản xuất cũng trở thành một tiêu chuẩn để sản phẩm được chấp nhận.

Ở Việt Nam, hầu hết các đơn vị sân xuất và chế biến thực phẩm chưa xây

san
dựng được hệ thống HACCP, do vậy, việc đảm bảo an toàn, chất lượng vệ sinh
phẩm chưa được chặt chẽ. Trong thời gian tới, khi thị trường mở rộng chung cho tồn
hơn.
khối Đơng Nam Á (ASEAN), tính cạnh tranh về chất lượng sắn phẩm sẽ triệt để
bị
Do vay, các đơn vị sản xuất và chế biến thực phẩm Việt Nam cần chủ động chuẩn
vậy
để đủ sức cạnh tranh, Xây dựng hệ thống HACCP trong chế biến thực phẩm do
khẩu, do yêu
là một nhu cầu bức thiết. Đối với lĩnh vực chế biến thủy hải sản xuất

hệ thống
cầu bức thiết của thực tiễn, thời gian qua, nhiều đơn vị đã nỗ lực xây dựng
hàng thủy
HACCP và gần đây các thị trường Châu Âu, Nhật Bản, Mỹ đã chấp nhận
san cha Việt Nam.

Trang

Í


Để kiểm tra chất lượng vệ sinh vi sinh vật của thực phẩm, phương pháp thông

dụng là đếm số khuẩn lạc. Đây là một phương pháp vi sinh vật truyền thống, đã được
kiểm chứng trong thời gian dài, tin cậy và được dùng làm phương pháp chuẩn ở mức

quốc gia và quốc tế. Tuy nhiên phương pháp này có một số nhược điểm là cẩn có

người có tay nghề về vi sinh vật, tốn thời gian, cần từ một đến vài ngày mới cho kết

quả. Vì vậy, phương pháp này thường dẫn đến tình huống việc đã rồi: tức là có biết
được ngun liệu, bán thành phẩm khơng đạt chất lượng thì cho đến khi biết kết quả,

các nguyên liệu, bán thành phẩm đó đã đi vào thành phẩm vì q trình sản xuất
khơng thể dừng lại trong khi chờ kết quả phân tích. Nói cách khác, phương pháp này

khơng thích hợp với tính chất phịng ngừa sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thành
phẩm của hệ thống HACCP.

Để khắc phục nhược điểm chậm cho kết quả của phương pháp vi sinh vật

truyền thống, nhiều phương pháp để kiểm tra vi sinh vật cho kết quả nhanh hơn đã
được nghiên cứu và sử dụng. Một trong những phương pháp nhanh được sử dụng

nhiều là phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bing ATP.

Phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng ATP được dựa trên sự phát sáng

sinh học bởi phản ứng luciferin - luciferase ở con đom đóm. Phương pháp này có ưu

điểm là ngồi việc dễ thực hiện, cịn cho kết quả chính xác, độ nhạy cao chỉ trong
vài phút đến vài giờ. Do vậy, có thể dùng phương pháp này để kiểm tra nhanh chóng
nguyên liệu tại hiện trường, trước khi nhập kho, kiểm tra tình trạng vệ sinh của thiết

bị, nhà xưởng trước khi vào sản xuất, theo đỗi phát hiện ngay sự nhiễm vi sinh vật
trong khi sẩn xuất, nhờ vậy có thể có biện pháp xử lý khắc phục ngay... Một cách

tóm lược, phương pháp này là một công cụ hữu hiệu để kiểm tra và giám sát vệ sinh,
phòng ngừa sự nhiễm vi sinh vật vào sản phẩm, nên là một cơng cụ rất hữu hiệu cho
chương trình HACCP.

Phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng ATP đã được sử dụng nhiều bổi

các nhà sẩn xuất và chế biến thực phẩm lớn trên thế giới từ những năm 1980.

Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng ATP đã được sử dụng để kiểm tra vi sinh
vật trong nhiều dạng mẫu khác nhau như: chẳng gốc, chủng trong quá trình lên men,

bùn hoạt tính, nước uống, nước trong q trình sản xuất, chế biến; dịch từ cơ thể
(sữa, nước tiểu, máu...), thực phẩm (thịt, rau, quả, thực phẩm chế biến đông lạnh...);
sân phẩm đã thanh trùng hoặc khử trùng (sữa thanh trùng, đỗ hộp...), mỹ phẩm...
Ở nước ta đáp ứng cho yêu cầu nâng cao chất lượng vệ sinh và an toàn thực

hội nhập với thị trường thế giới, yêu cầu về xây dựng chương trình
phẩm để có thể
HACCP trong các đơn vị sản xuất và chế biến thực phẩm, phương pháp kiểm tra
nhanh ví sinh vật bằng ATP sẽ là một công cụ tất.hữu hiệu.

Trang

2


Tại Việt Nam, đối với các nhà sản xuất, chế biến thực phẩm như sữa, bïa, thịt,
thực phẩm chế biến xuất khẩu, đỗ hộp..., phương pháp này có thể được dùng để làm
công cụ kiểm tra nhanh tổng vi sinh vật trong nguyên liệu, để giám sát vệ sinh trong
đây chuyền sẵn xuất, trong thành phẩm, để xây dựng chương trình ATP... Đối với cơ

quan quần lý nhà nước, phương pháp này có thể được dùng để kiểm tra nhanh tại
biện trường tình trạng vệ sinh của cơ sở sắn xuất, kiểm tra chỉ tiêu vi sinh của nước
nguyên liệu, nước thải...

Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp này tại Việt Nam gặp khó khăn là thiết
bị, hóa chất đắc tiền và chỉ phí kiểm tra cao (6.000 USD/máy xách tay và 23.000
USD/máy phịng thí nghiệm, 240 UST/bộ Kit cho 100 lân kiểm tra).
Trong bối cảnh hiện nay, để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người

tiêu dùng Việt Nam cũng như để đưa được sản phẩm thực phẩm chế biến nội địa ra
thống
thị trường thế giới. các nhà sắn xuất Việt Nam cần nhanh chóng thiết lập hệ
bảo đầm an tồn vệ sinh thực phẩm của mình, xây dựng chương trình HACCP trong
hệ thống chung về quản lý chất lượng sản phẩm tại đơn vị. Do vậy việc áp dụng
phương pháp kiểm tra nhanh ví sinh vật thay cho phương pháp truyền thống là một
nhu cầu bức thiết của thực tiễn.

1.2. MỤC TIEU
Để tài "Nghiên cứu thiết bị, phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bing ATP

bị
và ứng dụng trong giám sát vệ sinh thực phẩm" nhằm nghiên cứu chế tạo thiết
đếm ánh sáng và nghiên cứu hóa chất của phần ứng phát sáng dùng trong định lượng
vụ
vi sinh vật bằng ATP tạo cơ sở để có thể ứng dụng phương pháp này vào phục

thực tiễn sản xuất tại Việt Nam.

1.3. NỘI DUNG
Đề tài đã được Hội đẳng xét duyệt thông qua với các nội dung chính như sau:

L. Thiết kế và chế tạo một thiết bị đếm ánh sáng để kiểm tra nhanh ví sinh vật

bằng phản ứng phát sáng can ATP.

2. Khảo sát các điều kiện về hoá chất để xác định ATP vi sinh vật.
3. Thử nghiệm định lượng ví sinh vật tổng số hiện diện trên bể mặt thiết bị,
nhà xưởng và thực phẩm chế biến.
Trang

3


1.4. TOM TAT CO SO KHOA HOC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI
SINH VẬT BẰNG ATP

Sự phát sáng sinh học ở Đom đóm là sự phát sáng do phản ứng ôxy hóa
luciferin bởi enzyme luciferase, khi có sự hiện diện của ion Mẹ?” và cdn ATP theo
phần ứng sau:
ott
luciferase + luciferin + ATP

————

lueiferase - lucifery-AMP +O;

——>

luciferase - luciferyl-AMP + PP;
luciferase + oxuciferin + AMP + CĨ¿ + Av (560nm)

Một phân tử Iuciferin khi bị ơxy hóa theo phương trình nêu trên sẽ phóng thích

một quang tử ánh sáng. ATP là một cơ chất tham gia vào phản ứng phát sáng và số
vào
lượng quang tử ánh sáng phát ra tỷ lệ thuận với số lượng phân tử ATP tham gia
lượng ánh
phản ứng. Trong điều kiện có sự hiện diện thừa của luciferin, luciferase,

sáng sinh ra bởi phản ứng này sẽ phụ thuộc vào lượng ATP hiện diện trong phản
có
ứng. Bằng một thiết bị có khả năng đếm được lượng ánh sáng phát ra, người ta
tương quan
thể định lượng được lượng ATP dựa vào một đường chuẩn thể hiện mối
giữa lượng ánh sáng đo được và lượng ATP.

Mặt khác, tất cả tế bào sinh vật đều chứa ATP có lượng tưởng đối ổn định
về
(lượng ATP trung bình ở vi sinh vật là 0,3fg/tế bào hay 10'g/tế bào). Do vậy,
nguyên tắc, có thể định lượng vi sinh vật bằng trị số ATP được ly trích ra khỏi tế bào
lượng
bằng cách dựa trên một đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa
RLU
ánh sáng phát ra đo được (do phan ting véi luciferase. luciferin) thé hiện bằng
pháp
(Relative Light Units) va lượng tế bào vi sinh vật (được xác định bằng phương
đếm số khuẩn lạc thơng thường) (Hình 1.1).
rase
Qui trình định lượng vi sinh vật bằng phần ứng phát sáng luciferin-lucife

cần ATP eó thể được tóm tắt như sau: hút huyển phù tế bào vì sinh vật vào ống đo,
ánh
tiến hành ly trích ATP ra khỏi tế bào. Đặt ống đo vào buồng đo của thiết bị đếm

và đọc lượng ánh
sáng, sau đó bổ sung hỗn hợp luciferin-luciferase. Tiến hành đo

(Hình
sáng phát ra được hiển thị bing RLU. Qui đổi lượng RLU thành mật độ tế bào
1.2).

Trang

4


a

a

ˆ

oe

"

Jog(RLU)

>

8

log (CFU/ml)

Hình 1.1: Đường tương quan tuyến tính giữa lượng ánh sáng

phát ra và mật độ tế bào vỉ sinh vật

Ống do chứa

je

huyền phù tế
bảo ví sinh

vat

&

EN

BS sung chat

ly trich ATP

Bổ sung hỗn

hep fee,

h

|
Phần ứng xây ra

sau khi bổ sưng hỗn

hợp luciferaseluciferin

Đặt ống đo

{

vào buồng đo

của máy đếm.

ánh sáng

e3

sẽ

Bảng hiển thị số.
|

————

RLU trên máy

đếm ánh sáng

Boc sé RLU đu được

Hình 1.2: Qui trình định lượng nhanh vì sinh vật bằng phân ứng phát
sdng luciferase-luciferin can ATP
Trang

5


VAT LIEU & PHUONG PHAP


2.1. VAT LIEU

2.1.1. GIONG VI SINH VAT
Các thí nghiệm ly trich ATP từ tế bào vi sinh vật và xác định tương quan giữa

lượng ánh sáng phát ra và số lượng tế bào vi sinh vật được thực hiện trên chủng
Salmonella

typhimurium

nhận

từ Trung

tâm

giống

vi sinh vật Nhật

Bản

(lapan

Collection of Microorganism, JCM).

Ching £. coli DH5œ (F enđAl hsđR17 (n/m(.) sup44 thi WV recAl gyrA96
AlacU169(0801acZAM15)) được cung cấp bởi hãng Takara, Nhật Bản
Chủng E. coli XLI-Blue (recAl endAl gyrA96 thí-l hsdR17 supE44 relAl lac

(E' proAB lac#4ZM15 Tn10(Te)J) được cung cấp bởi hãng Qiagen, Đức.
2.1.2. PLASMID

Plasmid pBluc+ mang gen mã hoá luciferase được cấu trúc tại Phịng thí

nghiệm Cơng nghệ Sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia
Tp. Hd Chi Minh. Plasmid nay làm nguyên liệu cung cấp luc+ trong quá trình đồng

hố /zc+ vào vector thể hiện pQE-30.

Hình 2.1: Cấu trúc plasmid pQE-30
Plasmid pQE-30 (Hình 2.1) được cung cấp từ hang Qiagen ding làm vector để
biểu hiện vượt mức gen ngoại lai. Plasmid này được thiết kế có kích thước 3400bp, là

một vector biểu hiện vì có chứa yếu tố T5 promoter được nhận diện bởi RNA
Trang

6


polymerase của E.coli va hai lac operator lam tăng khả năng kiểm sốt sự hoạt động
của T5 promoter tránh tình trạng “rồ rï” trong việc biểu hiện protein khi chưa được
cảm ứng. Trình tự gắn của ribosome, RBSII, cho phép tỉ lệ dịch mã cao. Với hai vị trí
kết thúc sự phiên mã có hiệu quả là ¿¿ và T1 giúp cho pQE-30 đừng sự phiên mã khi

cần thiết và đảm bảo sự ổn định trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp. Ngoài ra,

pQE-30 cdn mang mét ving multiple cloning site (MCS), cdc codon kết thúc trong
tất cả các khung đọc và một trình tự mã hố cho 6 histidine ở dau 5’ tao điều kiện
cho việc thiết kế cấu trúc thể hiện và tỉnh chế protein tái tổ hợp.

2.1.3. VẬT TƯ, LINH KIỆN CỦA MÁY ĐẾM ÁNH SÁNG
Ống nhân quang (Photomultiplying tube) dùng để chế tạo máy đếm ánh sáng
được thiết kế, đặt hàng và cung cấp bởi Công ty Hamamatsu, Nhật Bản; các linh
kiên điện tử, bán dẫn khác được nhập từ nước ngoài hoặc mua tại TP. HCM; buồng
đo và các phẩn cơ khí khác được gia công tại TP. HCM. Máy đếm ánh sáng được
nghiên cứu, thiết kế và chế tạo với sự phối hợp của Phòng Điện tử ứng dụng, Trung

tâm Kỹ thuật hạt nhân TP.HCM.

:

3.1.4. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
—_
~_
—_

Pipetman các loại
Đèn cồn, que trải, que cấy, thùng đá, ống nghiệm các loại, petri, eppendorf các
loại, tăm xỉa răng, ống Falcol 50ml, ống tiêm 50ml, bình tỉa đựng cồn (nước cất)

Máy quang phổ chuyên dụng GeneQuant pro- (Amersham Biosciences) dùng cho

DNA, RNA

và protein

—

Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)

—
—_
—
~

Máy
Máy
Máy
Máy

~

—_

—_

—
—
~_
—_
—
—_

Màng lọc vi khuẩn, giấy đo pH (Whatman)

ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Đức)
lọc nước siêu sạch EASY pure UV (Amersham Biosciences)
ly tâm lạnh tốc độ cao (Heraeus, Đức)
lắc ổn nhiệt Orbital Incubator $150 (Stuard Scientific, Anh)

Máy do 4nh sdng luminometer, ống đo (Phần Lan)

Máy quang phé ké Ultrospec 2000 (Amersham Biosciences)

Máy do pH (ORION, Anh)
May khudy ti gia nhiệt Bibby (Anh)
Tủ ấm vì sinh vật Memrnert (Đức)
Tủ sấy Memmert (Đức)
Nổi hấp Temy (Nhật)
Tủ lạnh sâu ~ 80°C (Sanyo. Nhat)

Trang

7

—
—
—

Téa lạnh -40°C (Medical Class. Nhat)
Tủ mát4- 10°C (Nhập
Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)

—

Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

~

May Vortex (KA, Mf)

—
—_

Bộ điện di axit nucleic (HORIZON®S58, Life Technologyru, Mỹ) và hộp đèn soi
UV (Hoefer, Mỹ)
Bộ điện di protein Hoefer®, b6 ngudn (Amersham Biosciences)

—
—
~

Thiét bi dién biến nap, cuvette (BIO - RAD, Mỹ)
Máy luân nhiệt PTC-I00TM (Mỹ)
Máy phá tế bào bằng siêu âm (Ultrasonic Cell Disruptor, Mỹ)

.

— Thiết bị tỉnh chế protein FPCL va phdn mém Unicorn version 3.10 (AKTA,
Amersham

Biocences)

—

Thiét bi chụp ảnh ImageMaster® (Amersham Biosciences)

—
~

Cét Ni-NTA tinh ché His_tag protein
Phan mém thiét ké méi Amplify 1.2

—

Phan mém phan tich DNA Jellyfish

2.1.5. HĨA CHẤT
Các hóa chất chính dùng cho phân ứng phát sáng được nhập khẩu từ các công
ty như sau:
~

Môi trường PCA (Difco, Mỹ)

—

Tryptone, cao ném men (HiMedia, Ấn Độ)

—

Bacto-agar (Difco, USA)

—

Potassium

acetate, sodium

sulfate (SDS), NaOH,

acetate,

axit acetic bang,

glycine,

sodium

dodecyl

glucose, Tris base, HCI, chloroform, phenol, ethanol tuyét

ddi, dung dich acrylamide 30% (w/v) va bis-acrylamide 0,8% (w/v), TEMED,
MgSO,, succinic acid, Coomassie Brilliant Blue G-250, NaCl, glycerol, imidazole,

benzamidine ~ HCl, phosphoric acid 85%, bromophenol blue, EDTA, Chloroform,
ammonium persulfate (APS), 8-hydroxyquinoline, xylene cyanol FF, orange G,
K,HPO,, KH3PO, (Prolabo, Merck va Amersham Biosciences)

—

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), streptomycine sulfate (Sigma, MY)
Enzyme c&t han ché Smal, lyzozyme, GFX TM&DNA
bands kit, Taq
polymerase, RNase (Amersham Biosciences)
Bộ tỉnh chế DNA từ gel agarose NuleoSpin® (Macherey - Nagel GmbH & Co,
Đức)

—
—

Các loại enzyme cắt hạn chế (Fermentas, Đức)
Thang phân tử lượng DNA 1 kbp (Biolabs. New England)
Trang

8


—

Thang phan ti lugng nhé (Low Molecular Weight) (Amersham Biosciences)

~

Adenosine

—.
—
—

Lueiferin (Biotium, Mỹ)
Nikel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) (Qiagen, Đức)
X-gal, IPTG, Pfu polymerase, alkaline phosphatase tif ruét bê non, cdc loai dNTP

5’-triphosphate (disodium salt) (ATP), luciferase, chất ly trích ATP

(FL-SAR), Dithiothreitol (DTT) (Sigma, My)

(Promega)

—
—

Agarose (SeaKem® LE Agarose, Mf)
Agarose Type I: Low EEO, EEC (Sigma, M¥)

-

Bovine Serum Albumin (BSA) (Boehringer Mannheim, Ditc)

—
-

Chit ly trich B/S Extractant (Biothema, MY)
Ammonium

Trimethyl
ly trích n-Dodecyl
Chất

—_

Bromide

(DTMAB),

Benzalkonium chloride !0%, PEG 4000, Ampicitlin, PEG 6000 (Wako, Nhật Bản)
Bộ kit định lượng ATP, ATP Monitoring Reagent (Labsystem, Phần Lan)

2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. THỰC HIỆN PHÁN ỨNG PHÁT SÁNG VÀ ĐO LƯỢNG ÁNH SÁNG
PHAT RA
Hỗn hợp phan ting phát sáng gém 200ul chia cdc thanh phần không thay đổi
gồm

BSA;

0,1M

ImM

Tris - Succinate (hoặc Tris - Acetate), pH 7,75, 0,0154mg

EDTA.

DTT;

200ug

Các thành phần ATP, MgSO., luciferin và luciferase có lượng

thay đổi tùy mục đích thí nghiệm. Các thành phần này được bổ sung vào ống đo theo
thif ty nhu sau: dung dich dém, DTT,

BSA, EDTA,

MgSO,,

luciferin, ATP

va cudi

cùng 1a luciferase. Trn nhanh hỗn hợp bằng máy rung vortex trong vài giây và đặt
ngay vào buông đo. Tiến hành đo và ghi nhận giá trị ánh sáng phat ra (RLU).

ỨNG PHÁT SÁNG
Chuẩn bị huyén phù tế bào Š. yphimariun (sau khi đã rửa sạch với nước cất
vô trùng) sao cho ODạuam đạt khoảng 0,3. Tiến hành ly trích ATP trong một hỗn hợp
500u] trong một ống eppendorf gồm các thành phan sau: 3001 huyền phù tế bào,
một dung tích thích hợp các chất ly trích (sao cho có lượng hoặc nổng độ mong
muốn), bổ sung nước cho đủ 500,1. Trộn hỗn hợp bằng máy rung vortex trong 15

giây. Dùng 50ul địch ly trích để thực hiện phần ứng phát sáng. Thành phần 200p!
hỗn hợp phần ứng phát sáng như sau: 110nl dụng địch đệm Trs - acetate 0,1M, pH
7,75, 504l dịch trich ATP va 40pl dung dich hỗn hợp phản ứng phát sáng luciferase Trang

9


luciferin. Tiến hành đo như mô tả ở trên. Thực hiện một đối chứng, thay 50ul dịch

huyền phù tế bào bằng 50p nước cất vô trùng.

2.2.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN TUYẾN TÍNH GIỮA MAT ĐỘ ©
TẾ BÀO VI SINH VẬT VÀ LƯỢNG ÁNH SÁNG TƯƠNG ĐỔI PHÁT
RA (RLU)

Chudn bj huyén phù tế bào S. typhimurium (sau khi da rita sach vdi mc cat

vơ trùng) có mật độ tương ứng khoảng 6x10*, 6x10°, 6x10°, 6x10", 6x10”, 47x10” và

6x10'° CFU/ml (được xác định theo phương pháp đổ đĩa như mô tả ở mục 2.2.4.2).
Dùng 135ul huyền phù tế bào ở mỗi nồng độ cho vào các ống đo. Bổ sung thêm 154
dung dich benzalkonium chloride 0,2% (w/v). Trộn bing cach vortex trong 15 gidy,
để yên 45 giây. Bổ sung thêm 50ul dung dich dém Tris — succinic 0,1M, pH 7,75.

Trộn đều. Đặt ống đo này vào buồng đo. Nạp nhanh 5Oul dung dịch hỗn hợp phản
ứng phát sáng luciferase - luciferin vào ống đo. Day buồng đo, tiến hành đo và ghỉ
nhận giá trị đo được.

2.2.4. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG MẪU SỮA
2.2.4.1. Qui trình thu mua và bảo quần sữa cho nhà máy
Sữa từ các đại lý hoặc từ các hộ nông dân được thu gom về các trạm trung
chuyển. Trong quá trình vận chuyển, sữa được chứa trong các bình (thường là các xơ
nhựa hay can 30 lí) đã được xử lý bằng nước xà phòng rửa chén và nước máy. Tại
các trạm trung chuyển, sữa trong các can nhựa 30 lít được xử lý thô trước khi đưa vào

bồn chứa lạnh 20°C bằng cách cho qua một vải lọc để loại bỏ các cặn. Tại đây, mẫu
sữa được kiểm tra vi sinh một cách định tính bằng cách dựa vào sự đổi màu của
methylen. Tuỳ vào sự hiện diện nhiều hay ít của vi sinh vật trong mẫu sữa mà sự đổi
mầu của methylen (từ mầu xanh chuyển sang mau tring) sẽ diễn ra nhanh hay chậm.

Sữa được xem là đạt kết quả vi sinh nếu thời gian chuyển hoàn toàn sang màu trắng

nhiều hơn 4 giờ. Cùng với các chỉ tiêu về độ béo, kháng sinh.. kết quả định tính vi
sinh này, nhà máy sẽ quyết định giá thành của sữa cho từng hộ nông dân. Sữa được

chứa trong các bổn 20°C sau 12 — 24 giờ sẽ được chuyển về công ty bằng các xe bổn.

“Trong quá trình thu mua và bảo quản sữa, sự nhiễm vi sinh vật chủ yếu từ khơng khí
và các dụng cụ chứa đựng trong q trình vận chuyển. Sữa là môi trường rất tốt cho

vi sinh vật phát triển, vì vậy nếu bảo quản khơng tốt cũng như bảo quần trong thời
gian quá đài (từ lúc vắt tới lúc về công ty) sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sữa. Để có
sự đánh giá chung về chỉ tiêu vi sinh của sữa thô, tại công ty, sữa sẽ được kiểm tra
định lượng vị sinh trước khi đựa vào sản xuất. Tổng vi sinh vật là một trong những
Trang

10


chỉ tiêu cần thiết về vi sinh đối với sữa và các sản phẩm từ sữa. Qui trình thu mua và
bảo quần sữa cho nhà máy được mính hoạ qua các Hình 2.2 — 2. 4.

2.2.4.2. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu sữa
tế bào
Thực hiện phần ứng phát sáng như mục 2.2.3 trong đó dịch huyền phù

sáng
S. typhimurium được thay thế bằng 135ul dịch sữa. Thực hiện hai phần ứng phát
vật
cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình. Đồng thời, xác định mật độ tế bào vi sinh

hiện diện trong mẫu sữa theo phương pháp đếm khuẩn lạc để so sánh hai phương

kế
pháp. Pha loãng mẫu sữa bậc 10. Hút vô trùng Iml ở mỗi ba nồng độ pha loãng

nutrient
tiếp nhau cho vào giữa hộp petri vô trùng. Thêm khoảng 20ml môi trường

xuôi và
agar đã hấp khử trùng và để nguội ở nhiệt độ 45 ~ 50C. Lắc tròn đĩa petri

ngược chiều kim đổng hổ, mỗi chiểu 5 lẫn. Để trên mặt phẳng ngang cho agar đông

hiện
tự nhiên. Khi môi trường đã đông, lật úp đĩa và ủ ở 37C. Đếm số khuẩn lạc
điện sau 24 giờ.

i

=

trung chuyển (A);
Hình 2.2: Can nhựa 30 lít dùng trong việc thụ gom sta vỀ các trạm
thu gom sữa (B)

Vệ sinh bằng nước xà phong rita chén và nước máy trước sau mỗi đợi

Trang

11


Hinh 2.3: Lay mdu sita (A) va dinh tinh vi sinh v@t hién dién trong mẫu sữa bằng phản
ting mau methylen (B)

Hình 2.4: Sữa được loại bỏ cặn trước khi đưa vào bên lạnh (A); bên chứa lạnh 20°C (B)

2.2.5. LẤY MẪU THIT VA MAU BE MAT LO MO HEO
2.2.5.1. Tóm tắt qui trình giết mổ

Trước khi giết mổ các mặt sàn được vệ sinh bằng cách rữa dưới vòi nước
giếng. Heo được mổ trực tiếp trên sàn xi măng cách mặt đất khoảng 20 — 30cm.

Trong suốt quá trình mổ, heo được rửa liên tục dưới vòi nước giếng. Bộ lòng heo sau

khi tách ra khỏi cơ thể, được chuyến sang mặt sàn inox để tiếp tục xử lý. Trong khí
Trang

12


đó, cơ thể heo được tách doc làm đơi, treo trên các giá inox. Lúc này việc mổ heo đã
hoàn tất và thịt heo được phân phối cho người tiêu dùng. Các hoạt động giết mổ
được mơ tả trong Hình 2.5 - 2.7.

Hình 2.7: Heo được mổ trên sàn (A); thịt heo được treo trên giá chờ phân

phối (B)

Trang

13


2.2.5.2. Dinh lượng vi sinh vật hiện điện trên bề mặt sàn mổ và mẫu thịt

2.2.5.2.1. Lấy mẫu bề mặt

Bể mặt sàn xi măng và bể mặt inox được sử dụng để thử nghiệm định

lượng tổng vi sinh vật. Thao tác lấy mẫu bé mặt được thực hiện tuân tự như sau:

Rửa hai tay, từ khuỷu xuống bàn tay bằng xà phịng và nước sạch
Rửa sạch bằng nước vịi
Lau khơ tay bằng khăn giấy
Khử trùng đôi bàn tay đến khuỷu bằng cồn
Đặt khn mẫu đo diện tích (10x10cem) đã khử trùng bằng côn vào điểm cần

kiểm tra

:

Nhúng ướt tampon bằng nước cất vô trùng, quet lấy sinh khối tế bào vi sinh
vật hiện diện trên bê mặt trong khung inox
Dũng kéo đã khử trùng bằng cồn cất lấy dau tampon và giữ trong eppendorf

1,5ml đã hấp vô trùng. Ghi ký hiệu mẫu

Lau sạch và sát trùng khung inox bằng côn, đặt lên vị trí khác cần kiểm tra và

thao tác lấy mẫu được thực hiện tương tự. Thao tác lấy mẫu bể mặt được mồ tả trong
các Hình 2.8, 2.9

Hình 2.8: Đặt khn mẫu đo diện tích vào điểm cần kiểm tra
(A): nhúng ướt tampon với nước cất vô trùng (B)
“Trang

14


Hinh 2.9: Quet sinh khối vi sinh vật tại điểm cần kiểm tra (Ä);
cắt lấy đầu tampon và giữ trong eppendorf (B)
2.2.5.2.2. Lấy mẫu thịt

Thịt được lấy ở vị trí bất kỳ trên thân heo sau khi mổ. Mẫu được đựng
trong túi vô trùng, ghỉ ký hiệu mẫu.

2.2.5.2.3. Dịnh lượng tổng vì sinh vật hiện diện trên bề mặt và mẫu thịt
Mẫu bê mặt và mẫu thịt sau khi lấy được phân tích ngay ở phịng thí
nghiệm.

Đối với mẫu bể mặt: bổ sung 700ml nước cất vô trừng vào các

vật trong 45
eppendorf đựng đầu tampon. Vortex mạnh để huyén phù tế bào vi sinh
tả trong mục

~ 60 giây. Sử dụng 135pl để thực hiện phẩn ứng phát sáng như mô
thời, tiến
2.2.3. Thực hiện hai lần thử cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình. Đồng

vật theo phương
hành pha lỗng bậc 10 dịch huyền phù trên và định lượng vỉ sinh
tự như trên với
pháp đếm khuẩn lạc như mô tả trong mục 2.2.4.2. Thực hiện tương

.
một đối chứng trên bể mặt sạch (đã hấp vơ trùng) trong phịng thí nghiệm

Đối với mẫu thịt: cân vô trùng 25g thịt cho vào túi đập mẫu vô trùng.

giây với tốc
Bổ sung 225m! nước cất vô trùng, tiến hành dập mẫu 3 lần mỗi lần 30

Lay 13544 dich thu
độ 230 vòng/phút bằng máy dập mẫu Stomacher® 400 Circulator.
hiện hai lân thử
được thực hiện phan tng phát sáng như mô tả trong mục 2.2.3. Thực
huyền phù
cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình. Đồng thời, pha loãng bậc 10 dịch
tả trong mục 2.2.4.2.
trên và định lượng vì sinh vật theo phương pháp đổ đĩa như mô

vi sinh vật bằng
Thực hiện đối chứng với nước cất vô trùng. Thao tác định lượng
phân ứng phát sáng cân ATP được mơ tá trong Hình 2.10~ 2.12
Trang

15


Hình 2.10: Hút huyền phù tế bào vi sinh vật vào ống do (A); bổ sung chất ly
trích ATP (B)

Hình 2.12: Bổ sung hỗn hợp phân ứng vào ống do (A); doc két qud RLU do được (B)

t

2.2.6. TÁCH CHIẾT PLASMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SDS - KIỂM
E. coli mang plasmid được nuôi cấy qua đêm ở 37C trong 80 — 100ml môi trường
Trang

16


LB có bé sung ampicillin néng độ 100pg/ml. Chuyén dịch nuôi cấy vào ống ly
tâm lớn. Ly tâm thu sinh khối ở 15.000g, 3 phút, nhiệt độ phòng. Rửa sinh khối
bằng 10ml nước cất, ly tâm thu sinh khối ở 15.000g, 3 phút, nhiệt độ phòng.
Thêm 2ml dung dich I, vortex k¥. Thêm 4ml dung địch II, đảo nhẹ vài lần, ủ 5 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm

3,5ml dung dịch H1 lạnh, đảo nhẹ vài lần và ủ

trong đá 10 phút. Thêm. 10041 chloroform. Ly tam thu dich ở 20.000g, 30 phút,
4°C, không thắng rotor.
Dịch nổi thu được thêm vào ốml isopropanol, vortex nhẹ sau đó để yên I0 phút ở

nhiệt độ phòng. Ly tâm thu tủa ở 15.000g, 10 phút, 25'C. Rửa tủa thu được trên

bằng 3ml ethanol 70% lạnh. Ly tâm 15.000g, 5phút, 4°C; lật ngược ống để bỏ
cthanol, thấm giọt cthanol cuối cùng bằng giấy thấm. Để khô tự nhiên 20 - 30
phút.

Cho vào 1ml TE IX và 100! RNase, vortex, ủ 37°C (>30 phút. Thêm 0,6 ml PEG
6000 20%, vortex, chia đều ra 2 eppendorf. Ủ ŒC trên 2 giờ. Ly tâm thu tủa ở
20.000g, 10 phút, 4°C. Thấm khô. Tráng với 0.5m] ethanol 100%. Ly tâm thu tủa
ở 20.000g, 3 phút, 4°C, để khô tự nhiên.
Thêm 0,5ml TE 1X va 0,5ml phenol đã cân bằng với TE, vortex kỹ. Ly tâm thu
dịch nổi ở 20.000g, I0phút, 4°C. Thêm 0,5ml chloroform lạnh, vortex. Ly tâm thu

dich nổi ở 20.000g, 10 phút, 4°C.

Thêm 40pt sodium acetate 3M va hon Iml ethanol 100% lanh, vortex. Ly tam thu

tia 3 20.000g , 10 phút, 4°C. Rửa tủa bing 0,5ml ethanol 70% lanh va ly tâm thu
tủa ở 20.000g, 10 phút, 4°C. Làm khô tự nhiên 30 ~ 40 phút (có thể đặt trong tử
37°C trong 20 phúU, thềm 300 - 500uÏ TE 1X, búng nhẹ.

Đo OD: xác định nỗng độ DNA, độ sạch của mẫu thu được. Điện đi kiểm tra mẫu
thu được.

2.2.7. ĐIỆN BIẾN NẠP DNA VÀO VI KHUẨN E. coli
Chuẩn bị tế bào E. coli kha nap:
+

Cấy 50ul huyển phù tế bào £. coii vào 20ml môi trường LB lổng, nuôi cấy lắc

qua đêm ở 37°C. Hút 3ml dịch nuôi cấy trên vào mỗi crlen ! lít chứa 350ml

mơi trường LB lồng (3 erlen), ni cấy lắc 250vòng/phút ở 37°C cho đến khi

giá trị OD„„, của dịch nuôi cấy đạt 0,45 — 0.5.

Trang

L7


+

+

Ngâm

các erlen trên vào nước đá trong 20 — 30 phiit. Lắc nhẹ để làm lạnh

đều môi trường. Cho dịch nuôi cấy vào các ống ly tâm đã được làm lạnh sẵn
và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000g, 4 phút, 4'C.
Rita sinh khối tế bào bằng nước Milli-Q lạnh vô trùng bằng cách vortex nhẹ.

Ly tâm thư lại sinh khối tế bào ở 4000g, 5 phút, 4°C. Rửa lại sinh khối tế bào

trong 50ml glycerol 10% lạnh. Ly tâm ở 5000g, 5 phút, 4°C, đổ bỏ nhẹ nhàng
phần dịch nổi.

+

Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 50ml glycerol 10% lạnh. Tiếp
tục ly tâm ở 5000g, 5 phút, 4°C. Lật ngược ống đổ bổ hết phẩn dịch trong,

thấm giọt glycerol cuối cùng bằng giấy thấm. Hòa sinh khối tế bào trong Iml
môi trường GYT lạnh. Vortex nhẹ để huyền phù sinh khối. Đặt vào chậu đá.
Nhanh

chóng

chuyển

dịch

tế

bào

vào

các

eppendorf

vd

trùng,

lạnh

(40Veppendorf) va git’ 6 -80°C. Sau khí chuẩn bị xong tế bào khả nạp lấy
một eppendorf tiến hành điện biến nạp để kiểm tra hiệu suất biến nạp (hút 10

~ 25ng DNA trong dung tich 1 - 2u] cho vào 40HÍ dịch tế bào khả nạp).
—_

Điện biến nạp DNA vào ví khuẩn E. coli:

+

Chỉnh máy điện biến nạp có điện dung 25uF, hiệu điện thế 2,5kV, điện trở

2000 và thời gian phát sung là 5,0 miligiây. Trộn đều, nhẹ nhàng 1- 2ul DNA

plasmid trong 40pl tế bào E. coli kha nạp. Giữ trong nước đá 5 phút (trong

trường hợp lấy từ tủ - 80°C, để giải đơng ở nhiệt độ phịng, sau khi tan để
nhanh vào chậu đá).

+

Nhẹ nhành hút lên bơm xuống vài lân và chuyển
mẫu (cuvette) điện biến nạp lạnh, gổ nhẹ để dịch
đáy. Lau khô hơi nước bám ở bể mat buồng mẫu
tụ) và đặt buồng mẫu vào máy biến nạp. Nhấn nút
chóng lấy buồng mẫu ra, cho vào iml môi trường

dịch tế bào trên vào buồng
tế bào nằm hoàn toàn dưới
(đặt biệt là bể mặt hai bản
cho máy hoạt động. Nhanh
SOC đã giữ ấm 37°C, dùng

pipet bơm lên xuống nhiều lần để trộn tế bào, chuyển sang một eppendorf vô
trùng. Nuôi cấy lắc ở 37°C trong 45 phút.

+

Lấy 200ul dịch trên (phân cịn lại có thể giữ trong tủ mát) trải trên môi trường
LB 2% agar đã hấp khử tring cé ampicillin nông độ 100ug/ml. Ủở‡€ trong
14 - I6giờ (hoặc ly tâm 10.000g, 2 phút thu sinh khối tế bào, đổ nhanh môi
trường, huyền phù nhẹ sinh khối với phân mơi trường cịn lại. Trải hết phần
dịch này).

Trang

l8


2.2.8. PHAN TICH VECTOR TAI TO HOP BANG ENZYME CAT GIGI
HAN
Phan tng cắt này được thiết kế cho plasmid pBéuc+ dé thu nhận gen /zc+ và
pQE-30 để thu nhận plasmid ở dạng mở vịng: thể tích phản ứng 400! gồm: 401
dung dich dém BamHI+

10X, 15ug DNA plasmid, 2ul BamHI (10U/,), 4u1 HindIII

(10U/ul). BS sung nước cho đủ 400ul. Ủ phan tng 37°C, 6 - 7 giờ. Tủa lại với sodium
acetate 3M và ethanol tuyệt đối. Rửa lại với cồn 70%, để khơ tự nhiên, hồ lại trong
TE. Xử lý pQE-30 với alkaline phosphatase. Tinh chế hỗn hop pBluc+ qua dién di
trén ge! agarose

1% và qua cột theo qui trình của bộ tỉnh chế DNA

từ gel agarose

NuleoSpin® để thu nhận gen luc+.

2.2.9. PHAN UNG LOAI BO NHOM PHOSPHATE
Để nâng cao hiệu quả nối, sau khi phản ứng cắt hạn chế hoàn thành DNA
plasmid tiếp tục được xử lý với alkaline phosphatase. Việc xử lý này sẽ loại bổ các
gốc phosphate ở đầu 5' của DNA, từ đó làm cho plasmid khơng thể tự đóng vịng trổ
lại trong q trình nối.
Thể tích phản ứng 506 gồm: 5ul dung dịch đệm alkaline phosphatase 10X,
DNA hồ tan trong TE, L alkaline phosphartase (1 U/nÌ). Bổ sung TE cho đủ 50ul. Ủ

phần ứng 37°C, 30 phút. Biến tính enzyme ở 70°C, 15 phút. Hỗn hợp sau biến tính sẽ
được bổ sung 10ul dung dịch nạp mẫu DNA 6X. Điện di, tinh chế theo NuleoSpin®
ki.

2.2.10, PHAN UNG NOI BOAN DNA NGOAI LAI VAO PLASMID

Các sản phẩm DNA sau khi qua tỉnh chế, được kiểm tra ndag độ qua việc đo

ODegunm Va kiém tra qua điện di trên gel agarose 1% với thang phân tử lượng DNA.

Khi mẫu đã đạt các yêu cầu, tiến hành thiết kế phần ứng nối.

Sự nối một đoạn DNA ngoại lai vào plasmid đã cắt vịng là do sự hình thành
cầu nối phosphodiester giữa nhóm phosphate ở dau 5’ va nhém hydroxyl 6 dau 3’

trên phân tử DNA dưới sự xúc tác của T4 DNA ligase. Các đầu 5' - P và 3' - OH có
thể ở đạng đâu bằng (blunt ends) hoặc đầu dính (sticky ends).

Thành phần phản ứng nối: 160fmole DNA plasmid (1), 945fmole DNA
lai (2), 1,BuI T4 DNA

17,3u (5).

buffer 10X (3), 4,5U T4 DNA

ngoại

ligase (4) va x pl Milli-Q cho du

Trang

19