Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh cơ quan của lan thiên nga ( cycnoches chlorochiron) giai đoạn invitro

TRUONG DAI HOC HUNG VUONG

KHOA KHOA HQC Ty’ NHIEN

TRUONG NGQC TUAN

NGHIÊN CỨ UẢNH HƯỚNG CỦA CHAT DIEU HOA
SINH TRƯỞNG ĐÉN SV PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LAN
THIEN NGA (Cycnoches chlorochiron)GIAI DOAN IN VITRO

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Ngành: Sư phạm Sinh học

PHÚ THỌ, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


TRUONG DAI HOC HUNG VUONG
KHOA KHOA HQC TU’ NHIEN

TRUONG NGỌC TUÁN

NGHIEN GU UANH HUONG QUA CHAT DIEU HOA
SINHTRUONG DEN SU’ PHAT SINH CO QUAN CUA LAN
THIEN NGA (Cycnoches chlorochiron)GIAI DOA N IN VITRO

KHÓA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Ngành: Sư phạm Sinh học

Giáo viên hướ ng dẫn: TS. Trần Trung Kiên

PHÚ THỌ, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


LOI CAM ON
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm

ơn chân thành nhát tới thầy giáo hướng dẫn TS. Trần Trung Kiên đã hướng dẫn
tận tình, quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.

Em

xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm

nghiên cứu Công nghệ sinh học trường Đại học Hùng Vương cùng toàn thể các
thầy cô giáo trong Khoa Khoahọc Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương đã tạo
điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn

thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, ngày

tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trương Ngọc Tuấn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


LOI CAM DOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là của
tơi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận là trung thực. Mọi sự
giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thơng tin trích

dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép cơng bó.
Phú Thọ, ngày

tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Trương Ngọc Tuin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


DANH MUC VIET TAT
BAP
CT

:
:

Công thức

ĐC:
MS

Benzylamino purinne

Đối chứng
:

Môi trường Murashige & Skoog,

MT :

Môi trường

NAA:

Naphthtalen acetic acid

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


DANH MUC BANG
Bang 3.1. Anh hưở ng của BAP đế n sự phat trién than, 1 aia cay in vitro lan
Thién nga (Cycnoches ChlorOchirOn) ...c.ccccccceceseseeseeveseseteneseseeseeeeeseseenenenes 23

Ba ng 3.2. Ảnh hưở ng aia BAP dén

sự sinh trưở ng phát trển của lá cây ¿» vo

lan Thién nga (Cycnoches chlorochiron)
Bả ng 3.3. Ảnh hưở ng của BAP đế n hệ số nhân, dic dié m chd i aia cay in vitro

lan Thién nga (Cycnoches chlorochiron)

Bá ng 3.4. Ảnh hưở ng của chất điều hòa sinh trưởng NAA dén sự sinh trưở ng
phat trén aia cy in vitro lan Thién nga (Cycnoches chlorochiron)
129

Bang 3.5. Ảnh hưở ng aia NAA dén gy phat sinh lao cay in vitro lan Thién nga
(Cycnoches chlorochiron)

Bả ng 3.6. Ảnh hưở ng của NAA đến hệ số nhân chỗ ¡...................-....:-:5555:cz55+ 33
Ba ng 3.7. Ti Ệ sống sót khi ra cây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


DANH MUC HiNH
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến sr phat trén than,é ata cay in vitro lan
Thién nga (Cycnoches chlorochiron)

Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sr phát trỀn của thân............................--- 24
Hình 3.3. Ảnh hưởng BAP đến sy phát sinh rễ ..........................---.::55555::c222x 25
Hình 3.4. Ảnh hưở ng của BAP đến sy phát sinh lá.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến lệ số nhân chồ ¡....................-.....---55::::5+ 28
Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đế n sự sinh trưở ng phát trŠ n thân, tễ của cây in
viro lan Thiên nga (Cyenoches chlorochiron)

Hình 3.7. Ảnh hưởng của NAA đế n sự sinh trưở ng phát trỀ n của thân cây

Hình 3.8. Ảnh hưởng của NAA đến sr phát sinh IỄ.......................--....:555scccc2 31
Hình 3.9. Ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh lá..........................--------..ssc: 32

Hình 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến lệ số nhân chồ ¡....................---...:-:55552:: 33
Hình 3.11. RỄ cây sau ] tuần ra cây....................---.cccc

222tr

35


MUC LUC
PHAN 1: MO DAU...
1. Tinh cip thét aia dé tai...
2. Mục tiêu đề tài...
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế n.
3.1. Ý nghĩa khoa học...
3.2. Ý nghĩa thực LỄ,

Phần II: NỘI DUNG.....
CHƯƠNG 1. TONG QUAN VAN ĐÈ NGHIÊN CỨU...
1.1. Gi thệu chung về chỉ Thiên nga (Cycnoches )...

1.1.1. Wị trí phân loại và phân ló...
1.12. Đặc điểm hình thái.
1.1.3.Lan Thién nga ( Cycnoches chlorochiron).
1.2. Kĩ thuật nhân gid
ng bing nudi ciy mé - É bào thực vật
1.2.1. Khái nệm...

1.2.2. lịch sử phát trền aia kỹ thuật nhân gó ng hằng ni aty mé - € bào
thực vậ

1.2.3. Cơ sở khoa học qìa ni qấy mơ - Ế bào thực \ật.
1.2.4. Các giai đoạn trong k thuậ
t nhân ging in vitro..
1.2.5. Các điều kện nuôi diy in vitro...

1.2.6. Môi trường nuôi dấy in vitro...
1.2.7. Tầm quan trọ ng dìa phương pháp ni cấy mơ - É bào thực \ật..

1.3. Tình hình nghiên cứu lan Thiên nga.
1.3.1. Tình hình nghiên du trên thỄ gửi.

1.3.2. Tình hình nghiên qdứu trong nước...

1.4. Các chút điều hòa sinh trưở ng.....


1.4.1. BAP ( 6- Benzylaminopurine,

1.4.2, NAA ( Naphthalene Acetic Acid).....
1.5. Giá thể ra cây lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron).....

Chương 2. ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP....
NGHIÊN CỨU....
2.1. Đối tượ ng và phạm vi nghiên aru

2.2. Nội dung nghiên cữu.....
2.3. Phương pháp nghiên cứ u.

2.3.1. Phương pháp luậ

2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệ m....

2.3.3. Phương pháp thu thập sơ lệu.....
2.3.4. Phương pháp xử lý lệu..

CHƯƠNG III: KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.
3.1. Anh hud ng aia BAP dén gr phat sinh hinh thai cay in vitro lan Thién nga
(Cycnoches chlorochiron)....

3.1.1, Ảnh hưởng dìa BAP đến

....23

sự phat sinh than, ré aia céy in vitro lan Thién

nga ( Cycnoches chlorochiron)....

3.1.2. Ảnh hưởng aia BAP đến sự sinh trưởng phat trién aia lé cay in vitro lan
Thién nga (Cycnoches chlorochiron)....

3.1.3. Ảnh hưởng qìa chát điều hịa sinh trưởng BAP đến sự phát sinh chỗi aia
cay in vitro lan Thién nga (Cycnoches chlorochiron)...

3.2. Anh hưởng của chat diéu hoa sinh truéng NAA dén sự sinh trưởng phát
trỀn của cây in vio lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron)....
3.2.1. Ảnh hưởng da clát điều hòa sinh trưởng NAA đến sự sinh trưởng phát
trền thân, rỄ dìa cây in vitro lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron)....

3.2.2. Ảnh hưởng qìa clát điều hịa sinh trưởng NAA đến sự phat sinh la aia
cây in vitro lan Thiên nga (Cyenocheschlorochiron).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


3.2.3. Anh huéng aia NAA dén hệ 86 nhan choi, đặc diém chdi aia cay in vitro

lan Thién nga (Cycnoches chlorochiron)......
3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến ti
chlorochiron) khi ra cay...

sống sót của lan Thiên nga (Cycnoches

KET LUAN VA KIEN NGH..
1. Kết luận....
2. KẾn nghị..

TAI LIEU THAM KHAO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


PHAN 1: MO DAU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hộ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vat bn
nhất

với

khong

trên

(Dressler1993). Day

35.000

loài

phân

bố

rộng

rãi trên

toàn

thể

giới

la ho hoa dep và thường có hương thơm nên rất được ưa

chuộng. VỆt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí lậu nhệt đới thích hợp cho

ar phat trién aia cdc loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Vệt Nam của Trần
Hợp thì Vệt Nam

có 137 - 140 chỉ với trên 1000 loài [3]. Trong những năm gần

đây, đờ¡ số ng kinh ế được nâng cao, nhu cầu về thưở ng thức hoa của người VỆt

Namngày càng được quan tâm và phát trể n, chính vì vậy vệc cung đíp cây lan
gi ng cho thị trường ngày càng được quan tâm. Tuy nhiên, các gống hoa lan
phỏ bến trên thị trường nước ta hiện nay chủ yếu là do nhập ngạ¡ từ Thái Lan,

Đài Loan, Trung Quốc... vệc ty nhân gống đề cung cấp cho thị trường trong
nước vẫn còn nhều han ch’. Lan rừng rực w síc màu như những gống lan
ngọ ¡ nhập nhưng lạ¡ có vẻ đẹp tự nhiên và phần ln có hương thom vì vậy ln

được ưa chuộng đồ¡ với những người chơi lan. Thế gi lan rừng tắt phong phú
với nhều chủng loại trong đó phải kể đến chỉ Cyenoches chlorochilon (lan
Thiên nga)
Lan Thiên nga (Cycnoches chlorochilon) 1a loai hoa tắt đẹp và quý hếm
lan Thiên nga là loại lan béu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ

cao

khqả ng 300 - 1600m, phát trn trong nhệt độ mát đế nấm nóng. Tại Việt Nam,
cay co mito

mền Bắc. Lan Thiên nga tắt sai hoa, nở nhỀ u hoa to 6 - 7 cm, moc

từng chùm, mỗ¡ bông hoa có hình giống như một chú chim thiên nga. Hện nay,
Lan Thiên nga tt ít được tìm thế y trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo
rết. Người chơi hoa ai cũng muốn sở lữu lan Thiên nga trong vườn khến giá

thành của lan Thiên nga tự nhiên bị đầy lên át cao và trở thành loài ngày càng
bị săn lùng khai thác nhiều hơn đến cạn kệt.VỆc nhân gồ ng lan Thiên nga theo

phương pháp truyền thố ng rắt chậm không đáp ứng đủ như cầu người chơi.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


Ngày nay cùng với sự phát trÊn của công nghệ
(in vitro) la cơng cụ đắc lực trong vc

sinh học thì nhân gố ng

bao bn va phát trn các loài lan q

hẾm. Trong nhân gống iz wio, ngồi mơi trường ni dấy cơ bản, người ta

thường bổ sung thêm vào môi trường ni dây các vitamin, các chất điều hịa
sinh trưởng, đường, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa qui nhu: chuối, nước
dừa, khoai tây...chúng có ảnh hưởng at bn đến hệ số nhân và chất lượng của

choi, cing như có ảnh hưởng lớn ới khả năng phát sinh cơ quan.
Đã có nhiều các cơng trình nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều
hòa sinh trưởng trong vệc nhân gố ng ¿w viø aia nhéu loài lan như Đai châu
hay Hồng thảo, tuy nhiên các cơng trình nghiên dđữu về lan Thiên nga gi Vt

Nam và trên thể giới vẫn cịn tắt ít và chưa đầy đủ. Chính vì vậy chúng tôi lựa

chọn thực hện đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng dia chất điều hòa sinh trưởng
đến sr phát sinh cơ quan của lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) giai

đoạn ïn vitro”.

2.Muc tiêu đề tài
Đánh giá được nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng i sr phát sinh
cơ quan sinh dưỡng của lan Thiên nga ( Cyenoehes chlorochiron).
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết qu

nghiên cứu đề tài sẽ cung cip cac dẫn lệu khoa học làm cơ sở

đánh giá những tác động của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng phát
sinh co quan cay in vitro loai lan Thién Nga

(Cycnoches chlorochiron).

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết qui nghiên cứu sẽ đượ cứng dụng trong ni cảy mơ lồi lan Thiên
nga (Cycnoches chlorochiron) góp phần sản xuất gỐ ng có hiêu quả cao, clát
lượng Ốt,ứng dung vao sin xwit, nang cao héu qui kinh É trên địa bàn tinh
Phu Tho.

TRUONG BAI HOC HUNG VUONG



- Rễ: Rễ

của các đại dện chỉ Thiên Nga

là rỄ khí sinh, mảnh,

hình trụ,

màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thườ ng ôm l y giá thể hoặc bng

thõng xuống. Ở một số lồi được bao bọc bởi p mô hútẩm day bao Bm a
những p É bào chết chứa đầy khơng khí do đó có ánh lên màu xám bạc. Chều
dài rễ từ 3- 5 cm; tễ thường mọc từ phần gốc của thân hoặc có thể ở máu thân
một vài loài[4].
- Lá: mọc thành hai dãy so le, khơng có cuống mà chỉ có bẹ ơm ly thân.
La thud ng atng,to, bin ming, be mặt thường nÏễn
- Hoa: Hoa don tinh, đối

xứng hai bên, màu sic

sặc sỡ, hoa ở

vào mùa

thu, có hương thơm dịu, lâu tàn.Nhị hoa cong như cổ chim thiên nga, cánh hoa

đày, hoa to có kích thước từ 4-6em[4].
- Cụm hoa:Cụm hoa chùm tir 12-15 hoa trén 1 cum. Cum hoa dài thường

rũ thong xu6 ng, nhieu loai hoa co gid tri làm cả nhị4].
- Qui: Qưả nang thường hình chạy hoặc hình con suốt, chữa tắt nhều lạt

rằm xen ñn những sợi lông minh. Hat tắt nhỏ, bầu như không trọ ng lượ ng, bao
quanh lạt là p

màng dạng nắt võng, trong suốt chứa đầy khơng khí đỄ dàng

bay cùng hạt trong khơng khí nhờ gió[4].

- Hạt: Một qui chữa từ 10.000 đến 100.000 lạt, đôi khi đến 3 trệu hạt
nên lạt lan có kch thước át nhỏ, phơi hạt chưa phân hóa. Sau 12 - 18 thang hat
chín phát tán nhờ

gió. Khi gặp mm

cộng sinh tương thích trong điều kện phù

hợp lạt ẽ my mà m{4].
1.1.3.Lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron).

Lan Thiên nga (Cyenoehes chlorochilon) là lai hoa tắt đẹp và quý hếm
lan Thiên nga là loại lan bu

sinh trong rừng lá tộng trên thân cây ở độ

cao

khai ng 300 - 1600m, phát trn trong nhệt độ mát đế nấm nóng. Tại Việt Nam,
cây có mặ tở mền Bắc. Lan Thiên nga tắt sai hoa, nv nhều hoa to 6 - 7 cm, mọc

từng chùm, mỗ ¡ bơng hoa có hình gống như một chú chim thiên nga. HỆn nay,
Lan Thiên nga tt ít được tim thay trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG

rẾt và qn kệt..Việc nhân gố ng lan Thiên nga theo phuong phap truyén thing
tắt chậm không đáp ứng được nhu cầu thực É.
Ngày nay với sr phát trÊn của cơng nghệ

sinh học thì nhân gống

(ï

vitro) la cơng cụ đắc lực trong vệc bảo tồn và phát trển các loài lan q hếm.
Trong nhân gi ng im vửzo, ngồi mơi trường nuôi đấy cơ bản, người ta thường
bồ sung thêm vào mơi trường ni ấy

các vitamin, các chất điều hịa sinh

trưởng, đường, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa quả như: chuối, nước đừa,
khoai tây...chúng có ảnh hưởng át 6n đến lệ số nhân và chất lượng của choi,
cũng như có ảnh hưởng

En

tới khả năng phát sinh cơ quan.

Hện

nay véc

nghiên đru về lan Thiên ngaở nước ta cịn ít tuy nhiên vì giá trị thương phẩm

qủa chúng tắt cao nên người ta đã áp dụng công nghệ nuôi cay mơ để nhân
nhanh và bảo vệ ngn gen của lồi này vừa tránh bị khai thác quá mức vừa
nâng cao hiệu quả kinh É.

1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô -tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm

Kỹ thuật nuôi ciy mô - € bao thre vat hay nhan ging in vitro đều là
thuật ngữ mô ti các phương pháp nuôi cáy các bộ phin thre vat (6 bao don, mơ,
cơ quan) trong ống nghệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp như muố
khống, vitamin, đường
kiện vơ trùng.

và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều

Kỹ thuật nudi ciy mô - € bao thre vật cho phép tái sinh chỗ¡

hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước

kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản đùa É bào

như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa clát đối với €
bào

và

mơ

trong q trình ni

cy.

Hện

nay, các nhà khoa

học

sử

dụng

hệ

thống ni ấy mô thực vật để nghiên ru ất œđ các vấn đề có liên quan đến
thực vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền lọc và cấu trúc thực vật.

Kỹ

thuật ni đíy mơ - É bào thực vật cũng mở rộng tềm năng nhân gồng vơ tính
đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh Ế và thương mại
trong đờ¡ số ng hàng ngày của con người.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giỗng bằng nuôi cấy mô -tế bào

thực vật

Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt ần đầu tiên
đưa ra ý tưởng cíy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng những thí nghệ m của
Haberlandt khi đó với các É bào mơ mềm bều bì đã bị thất lại do chúng không
thể phân chia được [9]. Năm

1922, Kotte cling Wi Robbins da Bp hi thi nghiệm

aia Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu iễ một cây hòa thảo (cây ngô).
Hai tác gả đã nuôi được trong một thời gian ngin (12 ngày) trên mơi trường
ng có chứa đường glucozo và muối khoáng thu được hệ tễ nhỏ [9]. Năm 1934,

tắt đầu giai doan thir 2 aia lich at nudi cy mô € bao thực vật khi White (ngườ ¡
Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài,
trên môi trường ưng có chứa đường,

một số muối khống và dịch chết đắm

men [9]. Trong thời gian 1941 - 1952, nhều chất điều kích thích sinh trưởng
thuộc n

ợc ni dây và tổng hợp thành công: axit naphthalene

axetie (NAA), axit 2,4 D - dichlorophenoxy axetic (2.4 D)...Năm

1954, Skoog

va Miller di phát hiện ra các hợp clất có thể điều khển sr nhân chồi. Skoog
phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tỉnh địch cá bẹ kích thích sinh trưở
ng rõ rệt
trong ni cáy các mả nh mô thân cây thuôc lá. Một năm sau, chất đó được tổng

hợp thành cơng và được Skoog gpi 1a kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào.
Skoog va Miller di chứng minh sr bệt hóa của tễ, chỗ¡ trong nghiên cứu nuôi
cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đố¡ của auxin/cytokinin và từ
đó đưa ra quan niệm điều khển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở
thực vật. Thành cơng của Skoog và Miller din đến nhều phát hện quan trọ ng,

nở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi đấy mô ế bào thực vật. Năm 1962,
Murashige và Skoog đã cải tến môi trườ ng nuôi đấy, đánh dấu nột bước tẾ n trong
kỹ thuật ni íy mơ.
Mơi trường của bo đã được dùng làm cơ sở cho vệc nuôi dy nhéu Iai

cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay [9]. Trong khoảng thời gian

từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi ấy

bào đơn đã được phát trên và hoàn thện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


dần. Melcher va Beckman da nuéi cay các tễ bào đơn trong các bình dung tích
n

có sục khí va bd sung chit dinh dưỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các É

bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh từ É bào đã mở

nhirng trén vọng

mới cho chọn dòng đột bến, sản xuất các chất trao đổi thr cip...Nim 1960 1964, Morel cho tằng có thé nhan ging v6 tinh dja lan bing nudi cay đỉnh sinh

trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan. Tir Kt

là cây nuôi dây mô đầu tiên được thương mại hóa.

qưả đó, lan được xem

Năm 1966, Guha & cộng sự

đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cry tai phan cay cà độc dược. Sau đó Bourin &
Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc

lá. Vậệc tạo cây đơn bội thành

cơngở nhều lồi thre vật thơng qua ni cá y bao phin va hạt phấn đóng gop rat

n

cho các nghiên cứu di truyền và lai ạo gống. Từ những năm 1970 trở đi,

các nhà khoa học đã chú ý vào triỀn vọng của kỹ thuật nuôi đá y protoplast, khi 2
tác gä người

Nhật

là Nagata và Takebe

đã thành công trong việc

làm cho

protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose. Melchers va cộng sự (1978) đã lai tạo

thành công protoplast của cà chua với protoplast dủa khoai tây, mở ra một trên
vọng mới trong lai xaở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kện nhát đị nh, các

protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên
ngồi, do đó chúng là những đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền
thực vật [8]. Từ đó đến nay, cơng nghệ ni dy mé - € bao the vat di duge phat

trên với ốc độ nhanh trên nhều cây khác và được ứng dụng tộng rãi trong nhân
gốồ ng nhều lồi thực vật, chọn dịng chố ng chịu, lai xa, chuyển genở thực vật...

1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô -tế bào thực vật

1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho ni đá y mơ É bào thực vật. Ơng đã đưa ra giả thuyết về tính tồn
năng của É bảo trong cuốn sách "Thực nghệm về nuôi cá y tách rời". Theo ông:

“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượ ng thong tin di

truyén (DNA) dần thết và đủ của œ sinh vật đó. Khi gặp điều kện thích hợp,
mỗi É bào đều có thể phát trŠn thành một cá thể hồn chỉnh” [ 9]. Tính tồn năng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


aia

bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cáy

mô É bào thực vật. Cho đền ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả

năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một Ế bào riêng rẽ.
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phản hóa
Sự phân hóa € bào là sy chuyển hóa các É bào thành các mơ chun hóa,
đảm nlận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi É bào đã phân

hóa thành mơ chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình.
Trong những điều kiện mơi trườ ng thích hợp, chúng lị¡ có thể trở về dạng É bào
phơi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các É bào
mớ¡ có khả năng tái sinh thà nh cây hồn chỉnh. Q trình đó được gọi là sự phản

phân hóa É bào. Về tản chát thi sr phân hóa và phản phân hóa là một q trình
điều hồ hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển aia
cá thể có một số gen được hoạt hóa (mà von trước day bi han chế) để go ra tinh
trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xả y ra theo một

chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc đùa phân tử DNAở

mỗi É bào. Mặt

khác khi cho ế bảo rằm trong một khố¡ mô của cơ thê thườ ng bị ức chế bởi các

É bào xung quanh. Khi tách riêng từng É bào hoặc gäm kích thước của khối
mơ s tạo điều kện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của Ế bào, q trình hoạt
hóa sẽ được xả y ra theo một cấu trúc nhất đị nh sẵn có trong bộ gen đó.

1.2.4. Các giả đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Q trình ni cảy ¿ø viro được

chia ra 5 giai đoạn:

* Giai đoạn 1: Chọn bọc và chuẩn lị cây mẹ
Trước khi tến hành nhân gi ng in vitro can chon be cin thận các cay me

(cây cho nguồn mẫu nuôi chy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc bệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Vệc trồng các cây mẹ trong điều kện
mơi trườ ng thích hyp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hệu quả trước
khi ấy mẫu dáy s
trưởng của mẫu

làm gảm

ty

mẫu

nhễm,

tăng khả năng sống và sinh

dy in vitro.

* Giai doan 2: Nudi diy khởi động

TRUONG BAI HOC HUNG VUONG


Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cy in vitro. Giai doan nay din

đảm bảo các yêu cầu: ÿ

nhễm thắp, ÿ

sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng

Ốốt. Khi ấy miu dần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát trền của cây. Quan
trọng nhất là đỉnh ch ¡ ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, cuố¡

cùng là đoạn thân, mảnh lá...Chỗ¡ ngon, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh
các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc...ở súp lơ thì dung hoa tự

non,ở lầu bí các mả nh lá mằm là ngun lệu ni cá y thích hợp để nhân nhanh
in vitro. Choi non mày nằm từ lạt cũng có thể được sử dụng làm mẫu cá y.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mơ ni cáy phát sinh hình thái và tăng nhanh số

lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồ¡ nách, ạo chồ¡ bắt đị nh, ạo phơi
vơ tính. Phải xác định được mơi trường và điều kện ngoai đinh thích hợp để có

hiệu qui là cao nhất. Nếu mơi trường có nhều cytokinin sẽ kích thích ạo chồ¡.

Điều kện ni đấy thường là 25 - 272C và 16 giờ chếu sáng/ngày, cường độ

ánh sáng 2000 -4000 lux. Tuy nhiên đố¡ với mỗ¡ loại đối tượ ng ni dấy địi hỏ¡
có chế độ ni aay khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chế u sáng 9

giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsisở giai đoạn đầu cần che 6 i.
* Giai đoạn 4: Tạo cây in viro hoàn chỉnh

Đề ạo tễ cho chồi, người ta chuyển chỗ¡ từ môi trường nhân nhanh sang

môi trường tạo lễ. Môi trường tạo 1 thường được bồ sung một lượng nhỏ
Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân
nhanh giau cytokinin sang mơi trường khơng chữa chát điều hịa sinh trưở ng.
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườm

ươm với ÿ Ệ sống cao, cây sinh

trưởng ốt cin dam bio mit số yêu cầu: Cây trong óng nghiệm đã đạt được

những tiêu chuin hình thái nhất định (số lá, s rễ, chều cao cây). Cây con cao
5-7 em và có từ 3 - 4 lá có thể chuyển sang cá y vào bầu đất mùn vô trùng có bổ
sung các chất dinh dưỡng. Có giá thể tép nhin cay in vitro thích hợp: giá thể

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


10

sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh dugc d6 4m, sr chéu sang
của vườm ươm, cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [6].

1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kện tiên quyết đối với thành công của quá trình ni cây in
vitro. Néu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kện vơ trùng thì mẫu sẽ

bị nhễm rá m, khuẩn.
* Vô trùng dụng cụ và môi trường: Để vô trùng dụng cụ và môi trường
nuôi cá y, có thể sử dụng nột trong các phương pháp sau:
- Khử trùng khô: Phương pháp này chỉ dùng cho cdc dung a

bing kim

lại, thuỷ tỉnh, các dụng cụ có tính chịu nhệt. Các dụng cụ trước khi đem sấy
phải được gói kín bằng gắy nhơm và chỉ được mở trong th ciy vô trùng. ThẾt

bị dùng khử trùng khô là lị sí y, tủ siy, nhiét dé thud ng ding la 121°C - 180°C,
trong 90 - 120 phút.

- Khử trùng ướt: Là phương pháp áp dụng hệu qui và phổ bẾn trong vô
trùng môi trường và các dụng œụ nudi cly. ThẾt bị sử dụng là mồ¡ lắp vô trùng,

nhệt độ thường dùngở 121C.
- Mang le: Ding dé loa i bd các tác nhân gây nhễm có kích thước 0,025 10um khỏi môi trường nuôi đấy, nước cất... Đây là phương pháp phù hợp với
các môi trường mà thành phằn của chúng bị phân huỷ ở nhật độ cao.
* Vô trùng nẫu dây: Với các loại nẫu đây khác nhau hoặc cùng loại mẫu
cấy nhưng ở các vị trí khác nhau... thì phương pháp khử trùng mẫu dïy là khác
nhau. Phương pháp phổ bến trong vơ trùng mẫu díy hiện nay là sử dụng hóa

chất có khả năng tiêu dệt vi sinh vật như cồn 70°, các chất làm gäm sức căng
bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotofo, teepol, thủy ngân hoặc các chít kháng

sinh,... Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nòng độ, thời gian xử lý hóa chất
khử trùng. Một hóa chất được lựa chọn dé vơ trùng phải đảm tảo 2 thuộc tinh:
Có khả năng diệt vi sinh vật Ố t và không hoặc ítảnh hưởng mẫu thực vật [§].

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


18

1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng
1.4.1. BAP ( 6- Benzylaminopurine)

Chất điều hòa sinh trưởng BAP là 1 loại hooc mơn thực vật thuộc nhóm
cytokinin có cơng thức hóa học là C¡H¡¡Nscịn được gọi là 6-Benzylaminopurine

BAP có chức năng kích thích sự phân chia ế bào, lam chim qua trình già
aia € bao, hoat héa sr phan hóa, kích thích phát sinh chồ¡ thân trong ni cíy
mơ

callus, vì vậy

BAP được

sử dụng pho

bến

trong

nuôi dy

mô

thực vật,

thường được kết hợp với 2,4D hoặc NAA trong giai đoạn nhân chồ ¡.
Hormone BAP con là nột lạ¡ enzyme ức chế trong cây, kéo dài thờ¡ gian
lưu trữ hoa qui. Ví dụ: xử lý 10 đến 15 ppm BAP có tác dịng kéo dài thời gian
lưu trữ đa bông đi xanhở nhỆ tđộ 6-10°C.
1.4.2. NAA

( Naphthalene Acetic Acid)

NAA hay còn gòi là 1-Naphthaleneacetic acid, a-naphtalene acetic acid 1a
lợp chất hữucơ với công thre la C;7H)O,Na. NAA

là hormone 6 ng hyp trong

nhóm Auxin. Có tác dụng kích thích q trình ngun phân, kéo dài É bào, kích
thích cây nả y chồ¡ và ra tễ phụ.

Vì vậy NAA được

sĩ dụng rit phổ bến trong công nghệ nuôi cáy mô và

Ế bào thực vật. Kết lợp với BAP,NAA
nhân nhanh, kích

có tác dụng mạnh mẽ trong giai đoạn

thích ra rễ ở mô callus.

1.5. Giá thể ra cây lan Thiên nga (Cyenoches chloroehiron)

- Giá thể là tên gọi chung của các hỗn hợp các vật lệu có thể gữ nước,
tạo độ thoáng cho tễ cây là nơi để rễ cây lan bám vào sinhtrưởng và phát trền
cho cây

- Giá thể thườ
ng được dùng khi ra cây là các loại đớn, mụnsơ dừa bởi
chúng có khả năng gữ âm Ốt, 6t cho cây mới ra mơi trườ ng
- Ngồi giá thể rangười tathường bổ sungđá perlitđể ạo độ thoáng cho

tễ cây phát trỀn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


12

+ Fe: théu Fe lam giim ARN, protein nhung lai lam ting ADN

va cac

axit amin tự do làm cho các lễ bào không phan chia.
+ Bo: thếu Bo trong môi trường nuôi ấy thường gây lên bu

hện thừa

Auxin. Mô nuôi điy có bều hện ạo mơ so hóa mạnh nhưng thường là mô xốp,
mong nước, kém tái sinh...

* Thành phằn hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo - inositol:

+ Vitamin: Các vitamin hay được sr dụng là các vitamin nhóm B (BI,
B3, B6), ngồi ra mơi trường ni díy cịn sï dụng một số vitamin khác như
vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các mồng độ

khác

nhau.
+ Myo-inositol là một loại đường - rượu liên quan đến quá trình ơng hợp
phospholipit, pectin của thành tẾ bào và các hệ thống màng trong É bào, tham

gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyên đường và trao đồi hydrateacbon. Hàm
lượng sử dụng là 100 mg/I môi trườ ng .
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhéu lai miu nudi cay, môi trường

phải được bơ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trị quan trọng trong
phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tat ci các dạng tự nhiên đa
aminoaxit (dang L) đễ dàng được mô nuôi cáy lắp thụ, L-arginin dùng cho nuôi
cay tễ, L- tyrolin dùng cho nuôi đáy chồi, L- serin dùng cho nuôi cá y hạt phấn.
Nồng độ sử dịng mỗi lo ¡ 10- 100 mg/l.

- Thanh phần hữu cơ phức hợp: Được dùng trong môi trường nuôi cay dé
cung cip thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khống chất...Chúng được

sử dụng khi mơi trường khống xác định khơng đạt kết qui mong muốn

về sinh

trưở ng và phat trén cia miu nghiên du. Một số chất được sử dụng phô bến là:
Cazein thuy phan, dich chét im

men, dich chết hoa, củ, quả...

* Các chát điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thếu được trong
môi trường nuôi cá y, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật


13

vitro. Héu

qui tac dong ala chất điều hoa sinh trưởng phụ thuộc vào loại và

mồng độ chất điều hoà sinh trưởng sr dụng trong nudi cay.
- Nhóm

Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi ấy nhằm thúc đẩy sự

sinh trưở ng và giãn nở É bào, tăng cường các quá trình sinh tổ ng hợp và trao đỗ¡
chất, kích thích sy hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính...
(Epstein&cs,

1989).

Cac logi auxin thud ng sử dụng cho nuôi đấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)

+ NOA (Naphthoxy acetic acid)

+ a- NAA

(a-

Naphthalene

acetic

acid)

+ 2.4

D

(2.4 diclorophenoxy

acetic acid)... IAA ít sử dụng do kém bền với nhệt và ánh sáng, nếu dùng thìở
hàm

lượng cao

1,0 - 3,0 mg/I (Dodds & Robert,

1999). Các auxin khác có hàm

lượng sĩ dụng từ 0,1 - 2,0 mg/I.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia ế bào, sr hình thành và sinh
trưởng của chdi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin co bieu hénire ché gr tạo

1@ va sinh trué ng aia m6 sco nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sr phát

sinh phơi vơ tính của mẫu ni chy. Céc logi cytokinin thường dùng trong nuôi
cay mé la:

+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-mety]-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine) + BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm
nhữ ng rồng
nách,

đồng

lượng

sï dụng của cac Cytokinin dao dong tir 0,1 - 2,0 mg/l. Ở

độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sr hình thành chdi
thời ức

chế

mạnh

sy

cytokinin nói trên, kinetin và BAP

to

tễ

dủa

chồi nuôi cay.

Trong

các

loại

là hai loại được sử dụng tộng rãi hơn cả. Đa

số các trường hợp phải sử dụng phối hợp œ auxin và cytokininở những ÿ Ê

khác nhau.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


14

* Ngưồn cacbon Các mẫu ni đáy thực vật nói chung không thể quang

hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ dt thấp. Vì vậy phải đưa thêm những
hyp clút hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cá y. Loại hydratcacbon

được sử dụng phố bến là đường saccharose với hàm lượng từ 2 - 6% (W/y).
Niữ ng loại đường khác nhu fructose, glucose, maltose, sorbitol rat it ding. Ham
lượng đường thấp được sĩ dụng cho nuôi dây É bào trần, ngược bỉ hàm lượng

đườ ng cao cần cho nuôi cá y lạt phán và phôi.
* Các thành phần khác

- Tác nhân tạo gel quyết định trạ nh thái vật lý aia môi trường nuôi cá y.
Chit go gel được sử dụng phổ bến là agar. Nong độ agar sử dụng từ 0,5 - 10 %
(W/y) tuy theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng. Khi môi trường
nuôi đấy là mơi trường bng heặc bán bng thì khơng hoặc bổ sung tắt it agar.

- Than hạt tính được dùng để hip thy các chit mau, cdc hyp chit phenol,
cdc sin phim trao đổi chit tht cip...Trong trường hợp những chất đó có tác
dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào
môi trường, than hoạt tính làm thay đổi mơi trường ánh sáng do mơi trườ ng trở
nên sẫm vì Vậy có thể kích thích q trình tạo tỄ, một số trường hợp cịn có tác

dụng thúc đảy phát sinh phơi vơ tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan

ở các lồi cây gỗ. Nhưng than hoạt tính lại làm gảm hệu quả của các chất điều
hoa sinh trưở ng, nồng độ than hoat tinh thường sử dụng từ 0,2 - 0,3(W/) [8].

1.2.6.2. pH của môi trường
pH gủa đa số các môi trường nuôi ấy được điều chỉnh trong phạm

vỉ

5,5 -6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn

6,0 agar có thể tắt cứng, Nếu trong mơi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá
tị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kềm hoặc q axit thì GA3

s chuyển

sang dang khơng có hoạt tính.
1.2.6.3. Tính thẩm thấu của mơi trường
Hip thụ nước của É bào và mô thực vật trong nuôi cá y bị chỉ phố
¡ bởi thế

năng của nước trong dich bào và trong môi trường dinh dưỡng. Các thành phàn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG


15

chính có ảnh hưởng đến thể năng của nước trong môi trường bao gm:

Ham

lượng đường, hàm lượng agar, một s thành phần mươi khống. Đường vừa là
ngưồn cacbon cung cíp cho miu ni dây đồ ng

thời cịn tham gia vào điều chỉnh

khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao, mơ ni cáy khó
hút được nước. Hàm lượng đường thấp là một trong những nguyên nhân gây ra
hin tug ng thuỷ tỉnh hóaở mẫu nudi cay, đây là t ở ngại chính cho việc chuyển

cây từ Ống nghiệm ra vườn ươm hoặc đồ ng ruộ ng.
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật
Phương pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với vệc nghiên cứu lý

luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tẾp cho thre tễn sản
xuất và đời sống. Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho
viec tim hu sau sic vé bin chit aia sự sống. Thực É đã cho phép ching ta tach
và nuôi dây truéc hét la mé phan sinh (meristem) tồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun

hóa gọi là mô xo (callus) va tit m6 seo thi cd thé kich thich tai

sinh và ạo cây hoàn chỉnh. Vé mit thre tén sin xuit:

phuong pháp nudi cdy mô

được sử dụng dé phục trang và nhân nhanh các gống cây trồng q, có giá trị

kinh Ế cao. Hện nay phương pháp này đã trở thành phổ bến và áp dụng trong
công tác chọn gống cây trồng. Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời
gian ngin chúng ta có thể tạo được sinh khối n

có hoạt chit sinh học được tạo

ra vẫn gữ ngun được hoạt tính aia minh.

1.3. Tình hình nghiên cứu lan Thiên nga
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hện

nay nhu cầu về

hoa lan trên thé giới ngày càng lớn vì vậy vệc

nghiên cứu nhân gồ ng lan tắt được quan tâm và phát trên mạnh mẽ. Tuy nhiên
đối với lan Thiên nga thì véc nghién atu phat trén va nhan gid ng bing phuong
phap nudi cy m6 van cịn ít chưa phổ bến. Các nhà khoa học chủ yếu nghiên

aru vé cach trong và cách chăm sóc lan Thiên nga và nghiên cứu một số yếu 6
ảnh hưởng đến cây lan trưởng thành như nhiệt độ, độ âm, nước, ánh sáng ...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG