ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU BÌNH VÔI (STEPHANIA ROTUNDA LOUR.) SỬ DỤNG CHỈ THỊ RAPD

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU BÌNH VƠI
(STEPHANIA ROTUNDA LOUR.) SỬ DỤNG CHỈ THỊ RAPD

Hà Nội – 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU BÌNH VƠI
(STEPHANIA ROTUNDA LOUR.) SỬ DỤNG CHỈ THỊ RAPD

Người thực hiện
Lớp
Khố
Chun ngành
Giáo viên hướng dẫn

:
:

:
:
:

ĐẶNG HUYỀN TRANG
K63CNSHD
63
CƠNG NGHỆ SINH HỌC
TS. NINH THỊ THẢO

Hà Nội - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Đánh giá đa dạng di truyền một số
mẫu bình vơi (Stephania rotunda Lour.) sử dụng chỉ thị RAPD” là công trình nghiên
cứu của riêng tơi dưới sự hướng dẫn của TS. Ninh Thị Thảo. Các nội dung nghiên
cứu, các số liệu và kết quả nghiên cứu này là trung thực và chưa từng được cơng bố
trong bất kì một cơng trình nào. Nếu phát hiện bất kì sự gian lận nào tơi xin chịu
hồn tồn trách nhiệm.


LỜI CẢM ƠN

Khoá luận tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu
bình vơi (Stephania rotunda Lour.) sử dụng chỉ thị RAPD” là kết quả của quá trình
cố gắng của bản thân cùng với sự giúp đỡ tận tình, động viên khích lệ của thầy cô,
bạn bè và người thân. Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người
đã giúp đỡ em trong thời gian học tập – nghiên cứu khoa học vừa qua.
Em xin trân trọng gửi đến cô TS. Ninh Thị Thảo, người đã trực tiếp tận tình

hướng dẫn cũng như cung cấp tài liệu, thông tin khoa học cần thiết cho bài luận
này lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Em xin cảm ơn quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật đã
tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện khố luận tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học
và các giảng viên trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giảng dạy,
trang bị cho em kiến thức quý giá trong suốt quãng thời gian học tập tại Học viện.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân đã ln
bên cạnh ủng hộ, khích lệ tinh thần giúp em hồn thành khoá luận tốt nghiệp.
Do giới hạn kiến thức và khả năng lý luận của bản thân còn nhiều thiếu sót
và hạn chế, kính mong sự chỉ dẫn và đóng góp của các thầy, cơ để bài luận của em
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!


Hà Nội, ngày 09 tháng 9 năm 2022
Sinh viên thực hiện

ĐẶNG HUYỀN TRANG

MỤC LỤC
TÓM TẮT 9
PHẦN I. MỞ ĐẦU

10

1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................10
1.2. Mục tiêu và yêu cầu..................................................................................10
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1. Tổng quan về cây bình vơi.......................................................................11
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại......................................................................11
2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây bình vơi..................................................12
2.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị dược liệu của cây bình vơi........................13
2.1.4. Tình hình nghiên cứu cây bình vơi trên thế giới và Việt Nam.......15
2.2. Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử trong phân tích đa
dạng di truyền.....................................................................................................16
2.2.1. Khái niệm chỉ thị phân tử..................................................................16
2.2.2. Chỉ thị RAPD......................................................................................17
2.3. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử (RAPD) trong phân tích đa
dạng di truyền các cây dược liệu trên thế giới và tại Việt Nam.....................18
2.3.1. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di
truyền cây dược liệu trên thế giới....................................................................18
2.3.2. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di
truyền cây dược liệu tại Việt Nam...................................................................19


PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................20
3.2. Hoá chất.....................................................................................................21
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu....................................................22
3.3.1. Nội dung nghiên cứu...........................................................................22
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số...............................................................26
4.2. Kết quả RAPD-PCR.................................................................................28
4.3. Kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD.....................28

4.4. Thảo luận...................................................................................................37
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

37

5.1. Kết luận......................................................................................................37
5.2. Kiến nghị....................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO

38

PHỤ LỤC 40

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
AFLP
cs
DNA
ISSR
RAPD
PCR
PIC
RFLP
Rp
SSR
TAE

Tên đầy đủ
Amplified Fragment Length Polymorphism

Cộng sự
Deoxyribonucleic acid
Inter-Simple Sequence Repeats
Random Amplified Polymorphism DNA
Polymerase Chain Reaction
Polymorphic Information Content
Restriction Fragment Length Polymorphism
Resolving power
Simple Sequence Repeat
Tris base, acetic acid and EDTA


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Phân loại khoa học chi Bình vơi (Stephania spp)
Bảng 3.1. Danh sách 32 mẫu giống bình vơi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.2. Hố chất sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.3. Danh sách các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng RAPD-PCR
Bảng 3.5. Chu kì nhiệt của phản ứng RAPD-PCR
Bảng 4.1. Kết quả chỉ số OD và nồng độ DNA của 32 mẫu bình vơi nghiên cứu
Bảng 4.3. Kết quả phân tích của 14 mồi RAPD
Bảng 4.4. Giá trị PIC và Rp của 14 mồi RAPD
Bảng 4.5. Hệ số tương đồng của 32 mẫu giống bình vơi sử dụng chỉ thị RAPD


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cây bình vơi
Hình 4.1 Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số của 32 mẫu bình vơi.

Hình 4.2. Kết quả chạy điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPA01
Hình 4.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPC03
Hình 4.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPO01
Hình 4.5 Sơ đồ quan hệ di truyền của 32 mẫu bình vơi dựa trên chỉ thị RAPD


TĨM TẮT

Phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống bình vơi bằng chỉ thị phân tử
RAPD. Tách chiết DNA tổng số các mẫu có độ tinh sạch DNA cao và nồng độ của
DNA cao. Sau khi phân tích 14 mồi RAPD kết quả thu được cho thấy tất cả các
mồi đều cho đa hình. Các mồi đã tạo ra 1346 băng, trung bình 42,06 băng trên mỗi
mẫu bình vơi và 96,14 băng/mồi. Hệ số đa hình PIC biến động từ 0,09 đến 0,35 và
chỉ số sai khác giữa 14 mồi RAPD (Rp) dao động từ 0,31 đến 0,97.
Hệ số tương đồng của 32 mẫu giống bình vơi biến động từ 0,478 – 0,956. Ở
mức khoảng cách di truyền trung bình (0,752), 32 mẫu bình vơi nghiên cứu được
phân bố vào 7 nhóm chính trên sơ đồ quan hệ di truyền.


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Cây bình vơi (Stephania rotunda Lour.) được tìm thấy ở những vùng có núi
đá như: Hà Giang, Tun Quang, Hịa Bình, Hà Nam, Hải Phịng, Cao Bằng, Bắc
Kạn, Lạng Sơn,... Trong củ bình vơi có chứa alkaloid
bao gồm Ltetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Ngồi ra cịn có tinh
bột, đường khử oxygen, acid malic, men oxydase. Rotundin có tác dụng giảm đau,
an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hịa hơ hấp và tim mạch. Hàm lượng hoạt chất
này có trong củ bình vơi tươi khoảng 0,12 – 0,3%. Roemerin có tác dụng gây tê
niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp. Cepharanthin được coi là một chất có tác dụng

kích thích miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của
các thuốc chống ung thư. Ngồi cơng dụng điều trị bệnh, củ bình vơi cịn dùng làm
vật trang trí và được nhiều người ưa chuộng.
Trong những năm gần đây, các chỉ thị phân tử như RAPD, ISSR, SSR, DNA
Barcode đã được sử dụng phổ biến trong đánh giá di truyền và xây dựng cây phân
loài. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống bình vơi cung cấp dữ liệu ở
mức độ phân tử, giúp cho việc lai chọn tạo giống tiết kiệm được thời gian và công
sức. Nghiên cứu đa dạng di truyền cũng tạo cơ sở khoa học cho bảo tồn nguồn gen
các loài. Tuy nhiên các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây bình vơi ở Việt Nam
và trên thế giới còn rất mới mẻ.
Đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống bình vơi (Stephania
rotunda Lour.) sử dụng chỉ thị RAPD” được tiến hành để đánh giá đa dạng nguồn
gen của 32 giống bình vơi được thu thập ở một số tỉnh thành Việt Nam, từ đó đưa
ra những nhận định ban đầu và quan hệ di truyền của các giống bình vơi, góp phần
cung cấp dữ liệu và sử dụng trong cơng tác bảo tồn và lai tạo giống bình vôi phục
vụ sản xuất.
1.2.Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Xác định mối quan hệ di truyền của 32 giống bình vôi dựa trên chỉ thị phân
tử RAPD nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn, phân loại và chọn tạo giống mới.
1.2.2. Yêu cầu
- Tách chiết được DNA tổng số đảm bảo đạt tiêu chuẩn để làm khuôn cho
phản ứng PCR.
- Thiết lập thành phần và điều kiện của phản ứng RAPD - PCR phù hợp cho
sản phẩm có tính lặp lại cao, các sản phẩm sau điện di cho vạch băng rõ
ràng, sắc nét.


- Xác định được mối quan hệ di truyền của 32 mẫu giống bình vơi nghiên cứu
dựa trên kết quả phân tích chỉ thị RAPD.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Tổng quan về cây bình vơi
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Bình vơi là tên gọi của nhiều loại cây là dây leo có rễ củ thuộc chi bình vơi
(Strephania), họ Tiết dê (Menispemaceae).
Chi bình vơi có nguồn gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia. Ở Việt
Nam, cây bình vơi cịn có các tên gọi khác như là: cây củ một, củ mối tròn, dây
mối trơn, củ gà ấp… và mọc hoang tại nhiều vùng rùng núi.
2.1.1.2. Phân loại
Bảng 2.1. Phân loại khoa học chi Bình vơi (Stephania spp)
Giới (regnum)
Plantae
Ngành
Magloliophyta
Phân lớp
Magloliosida (Dicotyedones)
Bộ (ordo)
Ranunculales
Họ (familia)
Menispermaceae
Chi (genus)
Stephania
Lồi (species)
Rotunda
Chi Bình vơi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp,
đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát
(Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê). Một số lồi cơng bố tại Việt Nam:
Stephania glabra (Roxb) Miers, S. Kuinanesis, S. Pierrei Diels, S. Sinica Diels,

S.rotunda Lour,... Trên thế giới, chi Bình vơi có hơn 40 lồi. Ở Việt Nam, chi Bình
vơi có 13 lồi với 4 lồi đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam”. (Sách đỏ Việt Nam,
2007).


2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây bình vơi

Hình 2.1. Cây bình vơi
(Nguồn internet)
Bình vơi là cây mọc hoang dại, thích hợp ở nhiệt độ trung bình 21 – 23°C,
lượng mưa 2000 – 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 – 7.
Các loại bình vơi có đặc điểm chung: dây leo, dài từ 2 – 6m, thân nhẵn hơi
xoắn vặn, sống lâu năm. Rễ củ đa dạng thay đổi tùy theo từng nơi phát triển, có thể
rất to và nặng tới gần 20kg, vỏ ngồi xù xì màu nâu – nâu đen. Lá mọc so le: phiến
lá hình bầu dục, hoặc hình tim hoặc hơi trịn, hai mặt nhẵn. Cụm hoa hình xim tán
mọc ở kẽ lá hoặc những cành đá rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có
6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị 2-6 thường là 4; hoa cái
có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu bình trứng. Quả hạch hơi dẹt, khi chín có màu đỏ tươi,
bên trong chứa một hạt hình móng ngựa có gai, hai mặt bên lõm ở giữa có lỗ thủng
hoặc khơng. Mùa hoa: tháng 4 – 6; mùa quả: tháng 8 – 10. (Đỗ Tất Lợi, 1991)
Đặc điểm hình thái của một số lồi bình vơi: (Tài nguyên cây thuốc Việt
Nam, 1993)
Stephania rotunda Lour: Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một nửa giống hình
củ bình vơi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ biến ở các rừng
thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,...
Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích
thước nhỏ hơn tất cả các lồi khác. Hoa đực khơng có cánh hoa.
Sepphania viridiflavens H.S.Lo et Yang: Lá có phiến hình tam giác, cuống lá
bằng hoặc dài hơn phiến lá.

S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu
trắng hoặc vàng nhạt.
S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các
lồi khác.
S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau
có màu tím hay tím hồng.
S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá nỗn có lỗ lệch
một bên.
S. cepharatha Hay: Giá nỗn khơng có lỗ.
S. sinica Diels: Giá nỗn khơng có lỗ.
Các loại bình vơi ở nước ta hiện nay có diện phân bố rất rộng trên cả ba
miền Bắc, Trung, Nam. Thường tập trung ở các vùng núi đá vôi như Tuyên Quang,
Cao Bằng, Thái Nguyên, Hà Giang, Phú Thọ, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Lâm Đồng,
Bà Rịa - Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh
học.
2.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị dược liệu của cây bình vơi
2.1.3.1. Giá trị kinh tế
Cây bình vơi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của
nước ta, là loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam.
Nó có thể phát triển rất tốt khi được trồng trong đất tơi xốp, nhiều mùn, thốt nước
mà khơng cần tốn cơng chăm sóc hay cần kỹ thuật cao nhưng vẫn mang lại giá trị
kinh tế cao cho người trồng.
Cây bình vơi được coi là cây có tiềm năng lớn trong y học, là nguồn nguyên
liệu cho ngành dược.
Hiện nay, trên thị trường củ bình vơi được bán với giá 200.000 – 250.000
VNĐ/kg. (Dược liệu Hồ Bình, 2021)
2.1.3.2. Giá trị dược liệu
Cây bình vơi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt
chất có giá trị về dược liệu. Cây bình vơi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc. Hoạt

chất được các nhà khoa học quan tâm và chiết xuất nhiều từ cây bình vơi là
rotundin – một hoạt chất rất cần trong y học.
Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, bình vôi được dùng dưới dạng
thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, sốt, đau bụng, kiết lỵ,...
liều dùng: 3 – 6 g/ngày. Thuốc ngâm rượu gồm bột bình vơi (1 phần) với rượu 40°
(5 phần); mỗi ngày uống 5 – 15 ml, có thể thêm đường cho dễ uống. Để tránh bị
ngộ độc, chỉ nên sử dụng với liều nhỏ: người lớn ngày uống 3 – 6g; trẻ nhỏ dùng
với liều lượng 0,02 – 0,023g đối với tẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10
tuổi,...(Bùi Thị Bằng, 2006)


Trong y học hiện đại, rotundin được dùng làm thuốc an thần, giảm đau, điều
trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trại thái căng thẳng thần kinh,
mất ngủ dai dẳng do nguyen nhân tâm tần. Liều dùng: 0.05 – 0,10g/ngày, dưới
dạng viên L-tetrahydropalmatin clohydrat, mỗi viên 0,05g. (Dược điển Việt Nam,
tập III)
Trong củ bình vơi chứa một lượng chất alkaloid bao gồm Ltetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất
này được sử dụng nhiều để điều chế thuốc, đặc biệt là thuốc an thần. Chất quan
trọng nhất là rotundin.
Các cơng trình khẳng định vai trị của Rotundin trong củ bình vơi đã được
cơng bố như sau:
Năm 1941, DS. Trần Xuân Thuyết cùng với GS. TS. Đỗ Tất Lợi, Bonnet và
Bùi Đình Sang đã chiết xuất thành cơng từ củ bình vơi Stephania. Rotunda một
hợp chất thuộc nhóm alkaloid và đặt tên là rotundin. Năm 1965, chất này được xác
định là L.tetrahydropalmatin. Đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới
chiết xuất được rotundin.
Năm 1962, Sm Fakhrudinov xác định roemerin gây tê niêm mạc và phong
bế. Đối với tim ếch cơ lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co
bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương. Roemerin đối kháng với
dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ương với liều

thấp moemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giâth dẫn
đến tử vong. Roemerin cịn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp.
Theo kết quả nghiên cứu của Mustuo Kozuka và cs (1984), Cepharanthin có
tác dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hồn, tăng cường sinh sản kháng
thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom
nguyên tử, chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng
hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như khơng có thay đổi khi dùng cepharanthin. Tác
dụng phụ do uống cenpharathin liều cao không thấy xuất hiện.
Năm 1999, theo Ngô Đại Quang tác dụng dược lý của rotundin đã được
nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và
được sử dụng trong suổt cuộc kháng chiến chống Pháp để điều trị có kết quả một
số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng; tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và
an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi trội như độc tính thấp,
sử dụng nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và
không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hóa chất.
Phạm Thị Kim và cs. (2021) đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột
(150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15
lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc – 1988) mà chuột không chết và hiện tại
không xác định được LS50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an tồn của chế
phẩm cao. Rotundin ít độc, khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật


đó tuy bị mệt nhưng lại khỏi sau 1 – 2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg
và 60mg, rotundin cịn có dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg),
dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, đau dây thần
kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh,...
2.1.4. Tình hình nghiên cứu cây bình vơi trên thế giới và Việt Nam
2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị bệnh trên thế giới ngày càng tăng. Theo
thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số thế

giới dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu,
trong đó chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Thế giới hiện nay có hơn 35.000 lồi thực vật
dùng làm thuốc, trong đó có khoảng 2.500 cây thuốc được bn bán trên thế giới.
Ở châu Âu, có ít nhất 2.000 cây thuốc được sử dụng. Ở châu Á, có khoảng 5.000
lồi ở Trung Quốc, 1,700 lồi ở Ấn Độ, trong đó có đến 90% thảo dược thu hái
hoang dại.7
Năm 1944, Kondo (Nhật Bản) đưa ra công thức của rotundin với công thức
thô là C13H19(OCH3)3CH3N.
Năm 1950 và 1952, Qiaudry và Siddiqui (Ấn Độ) đã nghiên cứu và chiết từ
củ cây Strephania Glabra (Roxb). Mier nhiều alkaloid và đặt tên là hyndarin
(C23H25O4N), Stefarin (C18H9O3N) và cyckanin (C38H42O6N); trong đó hyndarin
chiếm thành phần chủ yếu (khoảng 30%) và 15 – 18% là stefarin và rất ít cycknin.
Nghiên cứu cấu tạo hyndarin người ta thấy rằng hydarin thực ra cũng chỉ là một
alkaloid đã biết có tên là tetrahydropanmatin. (Đỗ Tất Lợi, 1991).
Trước năm 1965, người ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloid
khác nhau vì được chiết xuất từ hai cây khác nhau, mọc tại hai quốc gia khác nhau.
Nhưng đến năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu Liên bang Xơ
Viết vũ (VILAR) có dịp so sánh hai cây, một di thực từ Ấn Độ, một di thực từ Việt
Nam, thấy rằng hai cây chỉ là một lồi nên đã kiểm tra lại tính chất của rotundin và
xác định được rotundin và hyndarin chỉ là một chất và có cấu tạo của
tetrahydropanmatin.
Năm 1965 tại Liên Xơ cũ, Phan Quốc Kính và cs cũng chiết từ củ bình vôi
mang từ Việt Nam sang một số alkaloid và đặt tên là alkaloid A, C và D với tỷ lệ
0,08% mỗi chất. (Đỗ Tất Lợi, 1991).
2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ bình vơi mọc ở Việt Nam các chất
tinh bột, đường khử oxy, acid malic, men oxydaza và một alkaloid với tỷ lệ 1,2 –
1,5% (tính trên củ tươi) được đặt tên là rotundin. (Đỗ Tất Lợi, 1991).

Năm 1964, tại Bộ môn Dược liệu (trường Đại học Dược khoa, Hà Nội) Ngơ
Văn Thu cịn chiết thành cơng từ củ bình vơi Việt Nam một alkaloid mới là
roemerin. Từ rễ củ loài S.pierei Diels thu hái ở vùng ven biển Bình Định, Ngơ Thị
Tâm đã phân lập được cepharatin (1%).
Năm 1986, Ngô Vân Thu và Trần Hùng tiến hành nghiên cứu khảo sát các
cây mang tên bình vơi.
Năm 1988, Ngô Vân Thu và Trần Hùng tiến hành bước đầu nghiên cứu cây
bình vơi biển.
Năm 1997, Phạm Thanh Kỳ chiết từ rễ củ của loài S.brachyandra gồm các
chất: isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%), sinomenin
(0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%),
isoboldin (0,004%) và N-metyllaurotetanin (0,006%). Trong rễ củ loài
S.kwangsiensis có chứa: tetrahydropalmatin, capaurin, isocorydin, roemerin,
dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin và palmatin.
Trong rễ củ lồi S.sinica có alkaloid chính là Rotundin (1,2 – 1,5%). Từ rễ
củ loài S.cepharantha đã phân lập được alkaloid chính là cepharanthin và những
alkaloid phụ khác: isotetrandin, berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin,
crebanin, o-nornuciferin, stesakin, palmatin, cepharamin. Trong rễ củ lồi
S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin (0,2%), stephanin (0,2%),
tetrahydropalmatin (0,1%) và dehydrostephanin.
Theo Nguyễn Viết Thân (2003), hàm lượng alcaloid thu được trong dược
liệu ít nhất là 2% tính theo dược liệu khô.
Theo Bùi Thị Bằng (2006), hàm lượng rotundin đạt tới 3,35% ở loài
S.brachyandra Diels (thu thập ở dãy Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài S.sinica Diels
(thu thập ở Hà Nam Ninh), 1,31% ở loài S.kwangsiensis H.S.Lo (thu thập ở Quảng
Ninh), 0,72% ở loài S.hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong (thu thập tại Thanh Hóa),
0,62% ở lồi S.cambodia Gagnep (Lâm Đồng), 0,29% ở lồi S,cepharantha (thu
thập ở Hà Sơn Bình), 0,21% ở loài S.peirrei Diels (thu được ở Tây Nguyên).
Năm 2010, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh đã tiến hành nghiên cứu
nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất alkaloid rotundin từ cây bình vơi

(Stephania rotunda Lour).
2.2.
Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử trong phân tích
đa dạng di truyền
2.2.1. Khái niệm chỉ thị phân tử
Khái niệm: chỉ thị phân tử (molecular marker) hay chỉ thị di truyền (genetic
marker) là một đoạn DNA có liên quan tới một vị trí cụ thể trong hệ genome.
Đặc điểm của chỉ thị phân tử:


+ Chỉ thị DNA rất phong phú, đa dạng và có tính ổn định cao.
+ Chỉ thị DNA có thể sử dụng để nghiên cứu ở các mô khác nhau ở bất kỳ
giai đoạn phát triển nào của cá thể.
+ Chỉ thị có một bản copy: chỉ có ở vùng có trình tự duy nhất.
+ Chỉ thị có nhiều copy: là chỉ thị có trình tự được lặp lại trong genome và vì
vậy có nhiều vị trí trong genome.
+ Chỉ thị DNA có thể là đồng trội hoặc trội.
Kể từ khi chỉ thị DNA đầu tiên được phát triển và ứng dụng cho đến cuối
những năm 90 của thế kỉ XX, hàng loạt chỉ thị DNA hay còn gọi là chỉ thị phân tử
được ra đời đó là các chỉ thị: chỉ thị đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP –
restriction fragment length polymorphic DNA), đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc
(AFLP – amplified fragment length polymorphism), chuỗi lặp lại đơn giản (SSR –
simple sequence repeat), chuỗi lặp lại đơn giản giữa (ISSR- intersimple sequence
repeat), đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD – random amplified
polymorphic DNA),... Khơng có chỉ thị DNA nào hiện có thể đáp ứng đầy đủ tất cả
các yêu cầu của nhà nghiên cứu. Phụ thuộc vào vấn đề nghiên cứu, các nhà nghiên
cứu có thể chọn trong các kỹ thuật chỉ thị DNA khác nhau mà mỗi kỹ thuật có thể
có một số đặt tính cần thiết.
2.2.2. Chỉ thị RAPD
Vào đầu thập niên 90 của thế kỉ XX, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên

nguyên tắc PCR với tên gọi RAPD (Random Amplifed Polymorphic) đã ra đời một
cách độc lập tại hai phịng thí nghiệm khác nhau.
Cơ sở kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR các
mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở
vị trí bắt mồi. Mồi được sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên,
thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34 – 37°C). Mặc dù trình
tự mồi RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu
phải là 40% (thường là 50 – 80%) và không có trình tự bazo đầu xi và ngược
giống nhau. Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên
cứu và có thể sử dụng cho các loại khác nhau với các mồi chung. Kỹ thuật RAPD
đã được ứng dụng trong lập bản đồ gen, di truyền quần thể, di truyền tiến hóa phân
tử và nhân giống cây trồng và động vật. Điều này do kỹ thuật RAPD đơn giản và
dễ thực hiện. Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao
cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy
cao.


 Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng rộng rãi vì có những ưu điểm:
Khơng u cầu thơng tin trình tự DNA cho việc thiết kế các đoạn mồi cụ thể.
Kỹ thuật nhanh chóng, đơn giản, hiệu quả, tạo nhiều locus và cho đa hình
cao.
Chỉ cần một lượng nhỏ DNA và quy trình có thể được tự động hóa.
Các mồi ngẫu nhiên dễ dàng mua được, chi phí đơn vị cho mỗi xét nghiệm
thấp hơn so với các công nghệ khác.
 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD:
Sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, nhittj độ bắt mồi thấp.
Không phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp tử do kỹ
thuật này tạo ra các chỉ thị trội.
Độ tin cậy chưa cao.
Sự phù hợp giữa mồi và mẫu có thể dẫn đến sự không xuất hiện hoặc lượng

sản phẩm bị giảm.
Chỉ thị RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền
giữa các loài thực vật, trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di
truyền, trong xác định loài và xác định con lai, lập bản đồ gen và nghiên cứu pháp
y.
2.3.
Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử (RAPD) trong phân tích
đa dạng di truyền các cây dược liệu trên thế giới và tại Việt Nam
2.3.1. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di
truyền cây dược liệu trên thế giới
Trên thế giới, các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng
di truyền cây dược liệu đã được thực hiện.
Năm 2007, Govinden và cs. đã sử dụng 11 mồi RAPD để đánh giá sự khác
biệt giữa hai loài quế (Cinnamomum camphora và cinnamomum verum). Kết quả
phân tích 11 mồi RAPD thu được ở mỗi mồi dao động 1- 14 băng, trung bình 8
băng/mồi. Tất cả mồi sử dụng đều cho số băng đa hình cao, điều này cho thấy sự
khác biệt giữa hai loài.
Năm 2012, Tripathi và cs. tiến hành đánh giá các biến thể di truyền giữa các
cây thuốc có nguy cơ tuyệt chủng cao Bacopa monnieri (trái) từ Trung Ấn Độ bằng
cách sử dụng kết hợp chỉ thị RAPD và ISSR. Kết quả phân tích 22 mồi RAPD thu
được 197 vạch băng, trong đó 187 băng cho đa hình, trung bình 8,95 băng/mồi.
Giá trị PIC dao động 0,363 – 0,908 (RAPD) và 0,419 – 0,836 (ISSR). Hệ số tương
đồng di truyền giữa các mẫu dao động 0,16 – 0,95 (RAPD), 0,18 – 0,98 (ISSR) và


0,179 – 0,945 (kết hợp hai chỉ thị RAPD và ISSR). Kết quả này góp phần cung cấp
các thơng tin có giá trị cho các chương trình bảo tồn và nhân giống loài cây này.
2.3.2. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di

truyền cây dược liệu tại Việt Nam

Bùi Thị Cẩm Hường và cs. (2016) tiến hành khảo sát sự đa dạng di truyền
của một số giống nghệ ở miền Nam Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử RAPD và
ISSR. Kết quả phân tích sử dụng 10 mồi RAPD cho tỉ lệ đa hình cao, trong tổng
156 băng khuếch đại có 140 băng đa hình (chiếm 89,7%). Khoảng cách liên kết từ
0 - 8,94 (trung bình 6,87) và chia 20 giống nghệ khảo sát thành 5 nhóm. Kết quả
phân tích trên 10 đoạn mồi ISSR cũng cho tỉ lệ đa hình cao trong tổng 136 băng
khuếch đại có 132 băng đa hình (chiếm 97,1%). Khoảng cách liên kết từ 1,73 8,54 (trung bình 6,75) và chia 20 giống nghệ được chia thành 5 nhóm. Phân tích
kết hợp hai chỉ thị phân tử RAPD và ISSR, trong tổng 291 băng khuếch đại có 272
băng đa hình (chiếm 93,2%). Khoảng cách liên kết từ 2,65 - 12,2 (trung bình 9,65)
và chia 20 giống nghệ thành 4 nhóm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, 20 giống nghệ
thu thập tại các tỉnh miền Nam Việt Nam có sự đa dạng di truyền cao.
Năm 2016, Khuất Hữu Trung và cs. tiến hành đánh giá đa dạng di truyền 32
mẫu giống quế Thanh Hoá bằng chỉ chị RAPD gồm 22 mồi ngẫu nhiên. Kết quả
phân tích PCR nhân lên được 3137 băng DNA, trong đó có 61 băng cho đa hình
(chiếm 48,41%) và 65 băng cho đơn hình (chiếm 51,59%). Hệ số tương đồng di
truyền của 32 mẫu giống quế dao động từ 0,67 – 0,97 và chia 32 mẫu giống nghiên
cứu thành 6 nhóm lớn.
Năm 2017, Đinh Đồn Long và cs. tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền
nguồn gen Đảng sâm. Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy
trong tổng cộng 106 băng RAPD-PCR thu được có 88 băng đa hình (83%) và 18
băng đồng hình (17%). 15 mẫu quần thể chia làm 2 nhóm lớn, tách biệt rõ rệt giữa
nhóm mẫu thu ở Tây Bắc và nhóm mẫu thu ở Tây Nguyên. Các mẫu thu thập ở vị
trí địa lý gần nhau có khác biệt di truyền nhỏ hơn cho thấy nhiều khả năng chúng
có nguồn gốc chung.
Lưu Th Hồ và vs. (2017) tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của 22
mẫu giống Hoàng liên thuộc chi Mahonia Nutt. được thu thập ở các vùng sinh thái
khác nhau cho thấy: Các mẫu giống/lồi Hồng liên ơ rơ thuộc chi Mahonia Nutt.
rất đa dạng. Kết quả phân tích với 374 phản ứng PCR nhân lên được tổng số 2185
băng DNA thuộc 211 loại băng khác nhau, trong đó có 193 băng đa hình (91,47 %)
và 18 băng đơn hình (8,53%). Giá trị PIC của 17 mồi RAPD với 22 mẫu giống

Hồng liên ơ rơ nghiên cứu dao động từ 0,7 đến 0,94 (trung bình là 0,85). Hệ số
tương đồng di truyền của 22 mẫu giống Hồng liên ơ rơ dao động trong khoảng
0,33 đến 0,97. Ở mức tương đồng di truyền 63%, 22 mẫu giống nghiên cứu được
chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền.
Năm 2018, Phạm Hồng Minh và Nguyễn Văn Khiêm tiến hành nghiên cứu
đa dạng di truyền của một số giống gấc. Kết quả thu được tổng cộng 680 băng
DNA đã thu được từ khuếch đại PCR 12 mẫu giống gấc bằng 12 mồi RAPD, trong
đó có 610 băng đa hình, chiếm tỷ lệ 89,71%. Hệ số tương đồng di truyền trong số
12 mẫu dao động từ 0,36 – 0,93 chứng tỏ các mẫu giống gấc có sự đa dạng di
truyền khá cao.
Trương Thị Hồng Hải và cs. (2020) tiến hành phân tích đa dạng di truyền
quẩn thể sâm ngọc linh 4 và 5 tuổi trồng tại trại sâm Tăk Ngo của xã Trà Linh,
huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam. Kết quả cho thấy sự đa dạng di truyền của
các cá thể trong quần thể sâm nghiên cứu khá cao. Với 7 mồi ngẫu nhiên qua PCR
thu được 132 băng DNA, trong đó mồi UBC#316 thể hiện sự đa dạng cao nhất với
giá trị Ho đạt trung bình 0,484, tiếp đến là mồi UBC#347 (H 0 = 0,446). Sự đa dạng
thấp nhất là ở mồi UBC#304 (H 0 = 0,350). UBC#315 là mồi tạo ra nhiều băng đa
hình nhất (27/27 băng), hệ số đa dạng trong từng mồi ngẫu nhiên dao động từ
khoảng 0,350 đến 0,484, trung bình là 0,410. Mồi UBC#304 cho sự đa hình các
băng khuếch đại ít nhất (13/16 băng DNA). Biến dị di truyền trong quần thể sâm
Ngọc Linh là ngẫu nhiên. Sự sai khác trong di truyền có thể là do ảnh hưởng chủ
yếu bởi điều kiện sinh sản và nguồn gốc hạt giống khác nhau. Hệ số tương đồng di
truyền giữa các mẫu sâm Ngọc Linh biến động từ 0,000-0,950 và chia thành hai
nhóm chính ở hệ số tương đồng di truyền 0.700.
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là mẫu lá của 32 mẫu cây bình vơi được thu thập tại các

tỉnh: Hồ Bình, Hà Giang, Điện Biên, Lai Châu, Thanh Hố.
Địa điểm: Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Thực vật, khoa Công nghệ sinh học
– Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian: tháng 3/2022 – 9/2022.
Bảng 3.1. Danh sách 32 mẫu giống bình vơi sử dụng trong nghiên cứu
ST
T

Địa điểm thu thập mẫu

STT

Địa điểm thu thập mẫu