Luận văn thạc sĩ sinh học phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

--------------------------

NGUYỄN HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG
VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014

Luận văn thạc sỹ Sinh học


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG
VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN CHÍ THUẬN
Học viên:

NGUYỄN HUYỀN TRANG

Hà Nội – 2014

Luận văn thạc sỹ Sinh học


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Chí Thuận Trưởng phịng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn
và dìu dắt tơi trong q trình nghiên cứu và hồn thành luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoàng Uyên, người đã giúp đỡ và tận
tình chỉ bảo tơi trong q trình thực hiện luận án của mình.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tơi
hồn thành luận văn này.
Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tơi có thể hồn
thành bản luận văn này.
Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014
Học viên

Nguyễn Huyền Trang

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Bảng chữ viết tắt

APW

Alkaline Pepton Water

bp

Base pair

CFU

Colony-Forming Unit

DNA

Deoxyribonucleic acid

IPTG

isopropyl-β-D-thiogalactoside

kb

Kilobase pair

LB

Luria - Bertani

NB

Nutrient broth

PCA

phenazine - 1carboxylic

PCN

Pyocyanin

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SAM

S-adenosylmethionine

TCA

Trichloroacetic acid

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ......................................... 6
1.1.1. Phân loại........................................................................................................ 6
1.1.2 Đặc điểm ........................................................................................................ 7
1.1.3. Cấu trúc gen .................................................................................................. 9
1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ....................... 10
1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống........................................... 10
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn ............................... 10
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .................................... 11
1.2. Hoạt chất pyocyanin....................................................................................... 12

1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen .......................................... 12
1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin ........................................................ 13
1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin ............................................................ 14
1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi............................................... 15
1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi ..................... 15
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm ................................................ 15
1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh:......................................................................... 15
1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ..................................................................................... 17
1.3.3. Các phương pháp phòng ngừa và điều trị ................................................... 18
1.3.2.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp ........................................................... 18
1.3.2.2. Điều trị................................................................................................... 19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 21
2.1 Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................... 21
1

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 21
2.1.2 Thiết bị ......................................................................................................... 21
2.1.3 Hóa chất ....................................................................................................... 22
2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: ................................................................ 22
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử:............................................. 24
2.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 25
2.2.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 25
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A..................... 25

2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn................. 26
2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn.......................... 26
2.2.1.4. Phương pháp lập kháng sinh đồ ............................................................ 27
2.2.1.5. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: ............................................... 27
2.2.1.6. Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32]....... 28
2.2.1.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối
và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn ..................................................................... 28
2.2.1.8. Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp: ............................... 28
2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 29
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 29
2.2.2.2. Phương pháp PRC khuếch đại gen........................................................ 30
2.2.2.3. Phương pháp điện di.............................................................................. 32
2.2.2.4. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR ................................................. 33
2.2.2.5. Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) ................................. 34
2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen ............................................................... 36
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 38
3.1 Kết quả phân lập và xác định P. aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật 38
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. aeruginosa trên môi trường King A ............ 38
2

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

3.1.2 Kết quả nhuộm Gram................................................................................... 39
3.1.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính enzyme ........................................................ 40
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh ..................................................... 41

3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử ..... 42
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................. 42
3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA): ........................................ 43
3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA ....................................................................... 44
3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA ............................ 45
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn .......................... 47
3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của
P.aeruginosa PS39 ................................................................................................. 51
3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn
và nồng độ hoạt chất. ............................................................................................ 51
3.3.2. Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt
chất PCN ............................................................................................................... 54
3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp ..................................... 56
3.3.4. Kết quả xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro
............................................................................................................................... 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 62
Phụ lục 1 ................................................................................................................. 74
Phụ lục 2 ................................................................................................................. 75

3

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy
sản nhằm phòng và hạn chế các bệnh do nhiễm khuẩn ngày càng trở nên phổ
biến. Vì vậy, đề kháng kháng sinh do vi sinh vật đã tăng lên rất nhiều, nhưng số
kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn. Hiện
tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của người ni mà
cịn của cả các nhà quản lý sức khỏe cộng đồng bởi nó khơng chỉ làm giảm hiệu
quả điều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người. Mặt khác,
vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi thủy sản nên
các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế có nguồn gốc thiên
nhiên, do các chất này không gây đề kháng khuẩn và tồn dư trong vật nuôi cũng
như ảnh hưởng tới mơi trường.
Pseudomonas sp là vi khuẩn phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi
sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Chúng là một trong
những vi sinh vật có giá trị thương mại và công nghệ sinh học. Trong các chế
phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotic kiểm soát sinh học đối
với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trong nuôi trồng
thủy sản. Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loại sắc tố là các
hợp chất có tính kháng khuẩn. Trong đó, các hợp chất phenazine do Pseudomonas
sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng.
Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyanin
PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) và phenazine1-carboxamide. Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằng
chloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh. Nghiên cứu tách chiết, tính chất và
ứng dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới:
4

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn
Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác
định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnh
trong nuôi trồng thủy sản [66]. Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tính
kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V. parahaemolyticus , V. vulnificus , V.
alginolyticus , V. fluvialis , V. Proteolyticus, V. harveyi và do đó nó có thể được
ứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.
Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh
hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằm mục đích
phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio gây
bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tôm nuôi ở Việt
Nam.
Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là:
1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vi
khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi.
2. Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn.
3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn.

5

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở
nhiều mơi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Vi
khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường khơng khí bình thường, mà cịn có
thể sống trong mơi trường có ít khí oxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi
trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp
chất hữu cơ ở động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những lồi
tiêu biểu có thể được sử dụng trong cơng nghệ sinh học. Một trong số đó là lồi
Pseudomonas aeruginosa.

Hình 1.1: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên mơi trường King A.
1.1.1. Phân loại
Giới (regnum)

Bacteria

Ngành (phylum)

Proteobacteria

6

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Lớp (class)

Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo)

Pseudomonadales

Họ (familia)

Pseudomonadaceae

Chi (genus)

Pseudomonas

Lồi (species)

Pseudomonas aeruginosa

1.1.2 Đặc điểm
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di động nhờ roi ở đầu và khơng có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng,
khơng lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
P. aeruginosa là lồi điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula) [13]. Tế
bào của chúng có dạng hình que, dài 1-1,5µm, rộng 0,5-1µm. P. aeruginosa sử
dụng hơ hấp hiếu khí (oxy) làm sự trao đổi chất tối ưu mặc dù chúng cũng có thể
hơ hấp kị khí trên nitrat hoặc nhận điện tử khác thay thế. P. aeruginosa có thể
chuyển hóa một loạt các phân tử hữu cơ, bao gồm các hợp chất hữu cơ như
benzoate, điều này đã giúp P. aeruginosa trở thành một vi sinh vật rất phổ biến vì

nó có thể được tìm thấy trong mơi trường như đất, nước, con người, động vật, thực
vật, nước thải và các bệnh viện [59]. Trong tất cả các hệ sinh thái thủy vực có chứa
hàm lượng oxy hịa tan cao nhưng chất dinh dưỡng thực vật thấp, P. aeruginosa là
sinh vật chiếm ưu thế và điều này biến nó trở thành loài sinh vật phong phú nhất
trên trái đất.
Pseudomonas sp có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố:
- Pyocyanin: là sắc tố phenazine, có màu xanh da trời, tan trong nước và tan
trong chloroform, 96% số chủng P. aeruginosa có khả năng sinh sắc tố này.
Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong mơi trường tiếp xúc nhiều với khơng khí, dễ
dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường hoặc
7

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

dùng môi trường King A để phát hiện sinh sắc tố. Chỉ có P. aeruginosa sinh sắc tố
pyocyanin.
- Pyoverdin (còn gọi là fluorescent): sắc tố có màu xanh lục, tan trong nước,
nhưng khơng tan trong chloroform. Môi trường King B được sử dụng để phát hiện
sắc tố pyoverdin. Ngồi P. aeruginosa cịn có các vi khuẩn như P. fluorecens, P.
pytida, P. veroni, P. monteilla cũng có khả năng sinh sắc tố này.
- Pyorubin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh ra sắc
tố này.
- Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng P. aeruginosa sinh sắc
tố này.
Tuy nhiên không phải tất cả các chủng Pseudomonas đều sinh sắc tố, khoảng

5- 10% số chủng Pseudomonas không sinh sắc tố. King, Ward, và Raney đã tìm ra
mơi trường thạch Pseudomonas Agar P (môi trường agar King A) để tạo điều kiện
cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường
agar King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein.[58]
P. aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngồi óng ánh như hạt trai
và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy in vitro. Các dấu
hiệu nhận biết sự có mặt của P. aeruginosa trong lâm sàng thường bao gồm khả
năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại
nhiệt độ 42°C. P. aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu
máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon, và gây
ra sự ăn mòn vi thể.[14]
Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa cịn được
xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong mơi
trường thiếu một phần hay tồn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng
cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat
8

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất [23, 24, 41,
94, 95].
1.1.3. Cấu trúc gen
P. aeruginosa có kích thước bộ gen khoảng 5,2 – 7.000.000 cặp bazơ với 65%
nucletide là loại Guanine và Cytosine, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các
phần phụ khác nhau. Bộ gen lõi của các dòng P. aeruginosa phần lớn là giống

nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định những tính trạnh
nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng thể O.
Những đoạn gen quy định các tính trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và khoảng
một phần ba trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay mRNA. Tính đa dạng di
truyền của vi khuẩn được hình thành bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các họ đảo gen
pKLC102/PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly. Các đảo gen riêng lẻ khác
nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương kề truyền
lại trực tiếp cho các chủng và các lồi. [25, 93].

Hình1.2: Gen P. aeruginosa PA01 [77]
P. aeruginosa có một nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất và siêu xoắn trong tế
bào chất [33]. Nó cũng mang rất nhiều plasmid nhiễm sắc thể huy động, điều này
9

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

rất quan trọng đối với tập tính sống của sinh vật. Ví dụ như các plasmid, TEM,
OXA, và PSE được mã hóa để sản xuất betalactamase, chất cần thiết cho sức đề
kháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh [28].
1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống
Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác
định các vi khuẩn nói chung. Trong phương pháp vi sinh vật học, người ta nghiên
cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các lồi vi khuẩn. Đặc điểm
hình thái của một lồi vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào (hình dạng, nội

bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc (màu sắc, đường
kính, hình dáng). Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sự phát triển của các vi
sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn năng lượng, hay các điều
kiện mơi trường khác. Tiếp đó là sự phát triển của chúng trên các kháng sinh khác
nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổi chất…
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác
cao. Phương pháp này có thể phát hiện mơ tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở
mức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1].
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so
sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu
phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của
các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các lồi vi sinh vật, có khả năng xác định,
có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy
nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát
sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật.
10

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S
rRNA thì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay.
Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, do có kích thước nhỏ
nên thơng tin chứa đựng ít, do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa
chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen

mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp q lớn cho nên khơng thuận lợi
cho tách dịng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có
kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi
sinh vật khơng gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên
chọn lựa trong phân loại vi khuẩn.
Cấu trúc của gen mã hóa 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ
và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng
như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho
nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [50].
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng làm suy giảm các hydrocacbon thơm
như methylbenzene - những sản phẩm của ngành cơng nghiệp dầu khí và thường
được sử dụng làm dung môi cho sơn men và sơn cũng như trong sản xuất thuốc và
hóa chất. Methylbenzene được coi là chất gây ô nhiễm môi trường đang hiện diện
trong không khí, đất và trên bề mặt nước [70]. P. aeruginosa có thể phá vỡ toluene,
hình thức đơn giản nhất của methylbenzene. P. aeruginosa thối hóa toluene thơng
qua q trình oxy hóa của các nhóm methyl cho aldehyde, rượu và một acid, sau
đó được chuyển đổi sang catechol (1,2-dihydroxybenzene). Do đó, P. aeruginosa
có thể được sử dụng trong kiểm sốt ơ nhiễm [51].
P. aeruginosa cũng được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học kiểm
sốt dịch bệnh trong ni trồng thủy sản. Vi khuẩn P. aeruginosa giúp gia tăng sức
11

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

khỏe và hệ miễn dịch của tôm bạc gân Penaeus latisulcatus khi cho tôm ăn với liều
lượng 105 CFU/ml. Vi khuẩn P. aeruginosa YC58 cũng liên kết hoạt động với hệ
vi sinh của ấu trùng hàu Cortez, C. Corteziensis, giúp gia tăng tỷ lệ sống và tăng
trưởng của hàu ngọc Pinctada mazatlanica. Ngoài ra, khi kết hợp vi khuẩn P.
aeruginosa và B. cepacia cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ
sống của điệp N. subnodosus[97].
1.2. Hoạt chất pyocyanin
1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen
Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trình ni
cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tố nâu,
Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khả năng
kháng khuẩn. Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tự nhiên
như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó được chuyển
đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuối cùng
đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37]. Việc sinh tổng hợp
phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42, 43, 45, 46].
Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thành phenazine.
Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểm phân nhánh
cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62].
Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước và
chloroform, khuếch tán ra mơi trường làm mơi trường có màu xanh. Các sắc tố
pyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine. Pyocyanin được
kết tinh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine. Trong quá trình
tổng hợp pyocyanin, bảy gen của P. aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC,
D, E , F, G , M và S. Locus sinh tổng hợp phenazine đã được tìm thấy trong tất cả
loài, phzM và phzS là các gen chịu trách nhiệm chính để chuyển đổi phenazine -112

Luận văn thạc sỹ Sinh học

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

carboxylic acid thành pyocyanin. Có hai bước được cho là tham gia vào quá trình
tổng hợp pyocyanin từ PCA. Bước đầu tiên được xúc tác bởi các enzyme phzM, SAdenosylmethionine (SAM) methyltransferase, trong đó PCA được chuyển thành
5-methyl phenazine-1-carboxylic acid betaine bằng cách chuyển một nhóm methyl
vào các ngun tử nitơ của phenazine vịng phân nửa. Bước thứ hai được xúc tác
bởi các enzyme phzS, FAD-monooxygenase tham gia vào phản ứng khử carboxyl
hydroxylative 5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine để tạo thành pyocyanin
[67].
1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin
Pyocyanin là một chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt
tính kháng vi khuẩn của pyocyanin đã được báo cáo kể từ năm 1940 [92]. Các sắc
tố ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Escherichia coli và được đặt tên là Colicin.
Các phần protein được giải phóng khi chiết dịch của các vi khuẩn có tính chất của
pyocyanin [96]. Hình thức tinh khiết của pyocyanin cho thấy tùy thuộc vào nồng
độ của pyocyanin mà chúng cho tác dụng diệt khuẩn khác nhau [18]. Cơ chế ức
chế vi khuẩn phát triển của pyocyanin đã được nghiên cứu và kết luận rằng
pyocyanin tương tác với chuỗi hô hấp màng tế bào dẫn đến ức chế việc thực hiện
hoạt động trao đổi chất của các tế bào vi khuẩn [19]. Đối với E. coli, pyocyanin là
nguyên nhân gây cạn kiệt nguồn cung cấp oxy cho các tế bào, sản xuất H2O2 và
cũng chuyển hướng dòng chảy điện tử, gây ra độc tính đối với tế bào E. Coli [38].
Pyocyanin ảnh hưởng tiêu cực đến cơ chế vận chuyển tích cực của một số sinh vật
[19]. P. aeruginosa có trong đờm của bệnh nhân xơ nang (CF) ức chế sự phát triển
của Staphylococcus aureus.
Tính kháng sinh của pyocyanin từ P. aeruginosa phân lập từ môi trường biển
đã được nghiên cứu bởi Angell và cộng sự [12]. P. aeruginosa đã được phân lập từ
trầm tích đại dương thu thập từ quần đảo Hawaii và sàng lọc hoạt tính kháng
13

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

khuẩn. Gần 90-95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P. aeruginosa là do
pyocyanin. Nó cho thấy khả năng kháng lại các lồi vi khuẩn gây bệnh như
Salmonella paratyphi, E. coli và Klebsiella gây bệnh viêm phổi [81]. Pyocyanin
phân lập từ P. aeruginosa 4B cho thấy khả năng kháng sinh chống lại tác nhân gây
bệnh khác nhau và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như Bacillus cereus.
Các sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa pyocyanin trong mơi trường đã
được chọn lọc và chứng minh tác dụng kháng khuẩn trên các sinh vật như S.
aureus, Staphylococcus lớp biểu bì, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và
Saccharomyces cerevisiae. Các sắc tố được sản xuất cho thấy khả năng chống lại
các sinh vật như vi khuẩn E. coli, Acinetobacter , S. aureus và Streptococcus gây
bệnh viêm phổi rất hiệu quả (Thụy Điển năm 2010).
1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin
Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin được tiến hành ở
nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới: Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012);
Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat
Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75],
chống nấm [55] và các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66]. Tác giả
Prabhakaran Priyaja [74] đã thơng báo khi khảo sát tính kháng của PCN với
Vibrio sp cho thấy khả năng ức chế 7 loại Vibrio: V. harveyi, V. parahaemolyticus,
V. vulnificus, V. alginolyticus, V.fluvialis, V. mediterrani và V. nereis với vòng
kháng khuẩn từ 13,5 đến 31,0mm. Khi dùng dịch ni của P. aeruginosa có hàm
lượng PCN là 30mg/l cho vòng ức chế đạt 17,50 – 38,06mm. Nồng độ ức chế tối

thiểu của pyocyanin chống lại các vi khuẩn và nấm dao động ở 20-120 µg /ml PCN
[15, 31, 39, 40, 63]. Khả năng kháng E. ictalluri kém hơn. Mức dộ ảnh hưởng đối
với một số chủng không gây bệnh như LA5, B. clausii tương tự như khi sử dụng
kháng sinh TE.
14

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi
1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là những lồi vi khuẩn Gram (-), hình
que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng khơng
sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi
khuẩn.
Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện,
vi khuẩn khơng phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S.
Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129.
Về cơ bản, các lồi vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt
là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và
là nhu cầu tuyệt đối với nhiều loài. Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm
ruột của tơm trưởng thành đều gặp lồi V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V.
anguillarum.

Hình 1.3: Khuẩn lạc của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm

1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh:
Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash
khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ >50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua
15

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

xanh (Callinectes sapidus). Đến năm 1977, Fisher đã thơng báo các lồi tơm hùm
châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus… hay tôm hùm châu Á
(Panulirus homarus, P. ornatus...) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio.
Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981.
Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ
thân có liên quan đến thức ăn thối rữa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu
và hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp
(công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độc trong ao.
Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do
tôm ăn Artemia và tảo giả. Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện ni trồng thủy sản
3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú.
Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt
Nam. Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes
irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h [3].
Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã phát
hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong cá trại sản
xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm [2]. Những năm gần đây khi mà
nghề nuôi các động vật thân mềm nước mặn phát triển thì bệnh Vibriosis đã trở

thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản.
Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều
gây ra một số dấu hiện bệnh lý nhất định. Cho đến nay, một số tác giả cho rằng
Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm. Ngược lại một số tác giả lại
cho rằng: Vibrio là tác nhân thứ hai. Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều
kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương
hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong nghiên cứu bệnh động vật thủy sản
phân lập Vibrio từ mẫu bệnh khơng khó nhưng xác định vai trị của chúng trong
16

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

một bệnh không đơn giản và cảm nhiễm trở lại khó thành cơng do khơng tạo được
các yếu tố điều kiện để bệnh bùng phát.
1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ
a, Đặc điểm phân bố
- Địa lý : Bệnh Vibriosis có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề ni
động vật thủy sản nước lợ và nước lặn. Sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế
giới, tập trung ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu
trùng và hậu ấu trùng, các tác giả đã phân lập được những loại khác nhau của
giống Vibrio. Như ở Philippine, C. L. Pilogo, M.C.L. Baticados, E.R. Crus và L. de
Lapena đã phân lập được 2 loài V. harveyi và V. splendidus. Trong khi đó ở Thái
Lan, người ta lại cho rằng tác nhân là V. parahaemolyticus. Ở Việt Nam, một số
cán bộ của trường Đại học Thủy sản đã phân lập từ tơm bệnh được hai lồi vi
khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus.

- Ký chủ : Hầu như các loài động vật thủy sản ni nước lợ, mặn đều có thể bị
nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis như : các lồi tơm he (Penaeus spp) và
tơm thẻ (Metapenaeus spp), các lồi tơm hùm châu Mỹ (Homarus spp) và tơm hùm
châu Á (Panulirus spp), các loài cua biển như cua xanh, cua đá…
- Giai đoạn phát triển : bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu
trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành, ở đàn bố mẹ của các lồi tơm, cua… Tuy vậy,
tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ
hơn ở giai đoạn kia. Ví dụ : Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiều
giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn ấu trùng Zoae và Mysis.
- Con đường lan truyền : Trong hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm
nhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm
giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở
thành bể hay dưới đáy ao.
17

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

b, Mùa vụ xuất hiện bệnh
Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo lồi và địa điểm
ni. Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp, tìm
thấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ương tảo
và bể ương Artemia.
Nhìn chung, vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 – 40ppt
(phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng),
phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7-9.

Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao
hơn tầng mặt. Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào
các thời điểm biến động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nước
của thủy triều (nước cường, nước ròng) [2].
c, Tác hại của bệnh
Bệnh do Vibrio sp. gây ra ở tơm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính,
trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể là 100%.
1.3.3. Các phương pháp phòng ngừa và điều trị
1.3.2.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp
a,Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi
Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc
rửa chua) và khử trùng ao ni với mục đích là:
- Diệt địch hại và sinh vật là vật nuôi trung gian sinh vật canh tranh thức ăn
của tơm như các lồi cá dữ, cá tạp, giáp xác, cơn trùng, nịng nọc, sinh vật đáy…
- Diệt sinh vật gây bệnh cho tơm như các giống lồi vi sinh vật: Vi khuẩn,
nấm và các loài ký sinh trùng.
- Cải tạo chất đáy làm tăng các muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ ở đáy
ao.
18

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

- Đắp lại lỗ rò rỉ, tránh thất thốt nước trong ao, xóa bỏ nơi ẩn nấp của sinh
vật hại tôm.
Vệ sinh môi trường ao ni trong q trình ni: vệ sinh mơi trường ni

bằng phương pháp cơ học, hóa học, sinh học.
b, Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh
- Khử trùng cơ thể con giống trước khi thả nuôi.
- Khử trùng thức ăn.
- Làm sạch nơi tơm đến ăn có thể dùng thuốc nào hay số lượng nhiều ít cịn
tùy thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn và tình hình
phát sinh bệnh.
- Khử trùng dụng cụ.
c, Tăng sức đề kháng bệnh
Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào những cơ thể có phát sinh ra bệnh hay
khơng cịn tùy thuộc vào yếu tố môi trường và bản thân cơ thể vật ni. Nếu vật
ni có sức đề kháng tốt có khả năng chống đỡ lại yếu tố gây bệnh thì sẽ khơng
mặc bệnh hoặc bệnh nhẹ, cịn ngược lại thì khả năng chống đỡ yếu, dễ dàng nhiễm
bệnh. Do đó một trong những khâu quan trọng để phịng bệnh cho vật nuôi là phải
tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách cho ăn theo phương pháp “4
định”: định chất lượng, số lượng thức ăn, vị trí và thời gian cho ăn.
1.3.2.2. Điều trị
- Khi tôm bị nhiễm bệnh có thể sử dụng các loại thuốc kháng sinh như
Furacin, Oxytetracylin, trộn vào thức ăn cho ăn liên tục 5-7 ngày.
- Dùng một số kháng sinh trị bệnh cho ấu trùng tôm: Oxytetracylin,
Bacitracin, Rifamycin, Erytromycin [4, 5, 7, 8].
Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn gây bệnh cho tôm đã có tính đa kháng thuốc
cao, việc sử dụng kháng sinh kém hiệu quả và hạn chế. Trong một nghiên cứu khả
19

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu
trùng tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy 100%
chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15% kháng
với trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol, nitrofurantoin và
norfloxacin. Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại kháng sinh. Số
chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15%. Có một chủng kháng 4 loại và một
chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [6]. Chính vì vậy, giải pháp tìm
kiếm các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên là vơ cùng quan trọng và cần thiết.

20

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng Pseudomonas aeruginosa là đối tượng nghiên cứu, được phân lập
từ môi trường nuôi thủy sản thu từ bể thí nghiệm tại phịng Cơng nghệ Phơi – Viện
Cơng nghệ Sinh học.
- Mẫu vi khuẩn Vibrio sp dùng trong nghiên cứu này do phịng Cơng nghệ
Phơi – Viện Cơng nghệ Sinh học cung cấp. Chúng tôi sử dụng các vi khuẩn này
như những vi sinh vật kiểm định để kiểm tra, đánh giá khả năng kháng khuẩn của
các chủng Pseudomonas sp phân lập được.

2.1.2 Thiết bị
- Máy PCR (Eppendorrf hoặc Techne)
- Máy khuấy trộn Vortex (IKA)
- Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Bio Clean Bench).
- Máy ly tâm lạnh Eppendorf (Sorvall R Biofege Freco).
- Bể ổn nhiệt (OSI)
- Bộ điện di DNA (Mupid R 2plus)
- Máy soi gel và chụp ảnh điện di GEL-DOC (pharmacia Biotech).
- Cân phân tích, cân điện (Precisa XT 220A)
- Tủ lạnh 4oC, tủ lạnh sâu -20oC, -80oC.
- Nồi hấp khử trùng.
- Máy tính và các phần mềm sử dụng trong phân tích và so sánh kết quả như:
Chromas, Blast…
- Các loại khác: ống falcon, đầu côn, que cấy, pipet, đĩa cấy, bình tam giác…
21

Luận văn thạc sỹ Sinh học